JP4635272B2

JP4635272B2 - 植物根の活性度定量測定方法、及び測定試薬

Info

Publication number: JP4635272B2
Application number: JP2004243029A
Authority: JP
Inventors: 親士上村
Original assignee: Information Science Research Institute
Current assignee: Information Science Research Institute
Priority date: 2004-07-26
Filing date: 2004-07-26
Publication date: 2011-02-23
Anticipated expiration: 2024-07-26
Also published as: JP2006034275A

Description

本発明は、植物根の活性を定量的に測定し、作物の生育状況を判定する植物根の活性度定量測定方法、及び測定試薬に関する。

根の活性測定には、根量、形状、根の色を見る方法、炭酸ガス測定装置で根の呼吸量を測定する方法があり、メチレンブルーやクロロテトラゾリウムブルーで根の琥珀酸脱水素酵素の活性を観る方法などの手段がある。

メチレンブルーを用い、根の琥珀酸脱水素酵素の活性を定性的に観る方法では、メチレンブルーの色が脱水素酵素による水素の放出によって脱色することは判っていたが、空中の酸素の影響を考慮して、通常は無酸素条件をつけるためツンベルク管を使用し、脱色時間の長さで酵素活性の強弱を判断し、定量的な精密さはなかった。
また、極めて薄いメチレンブルーを用いる場合に微小容量の容器内では組織の発生する水素の影響が支配的になることも知られていなかった。

しかし、いずれの方法も定性的で、生体の生きたままの自然な状態での定量的な測定法ではなく、仕掛けも煩雑な手法であった。
そこで簡便で根の活性を確実に定量できる測定法が要望されている。

かかる課題を解決するための本発明の植物根の活性度定量測定方法は、呼吸促進緩衝液であるｐＨ７の８×１０^−２ｍｏｌ／Ｌ燐酸ナトリウム、１×１０^−２ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、呼吸基質の２．５×１０^−３ｍｏｌ／Ｌ琥珀酸ナトリウム、及び（１〜５）×１０^−５ｍｏｌ／ＬのメチレンブルーからなるＣＫ反応試薬へ、植物の切断根を浸漬し、植物の根に含まれる琥珀酸脱水素酵素がＣＫ反応試薬に含まれる琥珀酸をフマル酸に変化させる際に放出する少量の水素をメチレンブルーと反応させ、メチレンブルーの色の濃さの比較によって、放出された水素量を測定することによって、植物の根の有する琥珀酸脱水素酵素活性を、植物根とＣＫ反応試薬を接触させるだけで比色測定することにより、植物根の活性度を簡便にかつ定量的に測定することを特徴とする。

また本発明の植物根の活性度測定用ＣＫ反応試薬は、請求項１に記載の植物根の活性度定量測定方法において、植物根に含まれる琥珀酸脱水素酵素が琥珀酸をフマル酸に変化させる際に放出する少量の水素をメチレンブルーと反応させるため、メチレンブルーの濃度を（１〜５）×１０ ^−５ｍｏｌ／Ｌの範囲になるように定め、８×１０ ^−２ｍｏｌ／Ｌ燐酸ナトリウム及び１×１０ ^−２ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムから成るｐＨ７の緩衝液と、呼吸基質の２．５×１０ ^−３ｍｏｌ／Ｌ琥珀酸ナトリウムと、を含み、植物根の活性度定量に当たって、植物の切断根を浸漬するだけでメチレンブルーの色の変化が起って、植物根の活性度が測定できることが好ましい。

農業は作物根系の活性の相違によって、生育、収量、品質、耐病性に相違がある。従って、圃場において作物の根系が今どの様な状態にあるかを正確に把握することが重要である。
本根系活性度定量測定法は、圃場において簡便に作物の根系の呼吸状態を定量的に測って、どの様な栽培対策を取れば良いかを圃場で即座に判断する材料を与えることを可能としている。
また、従来は植物の根系の活性の正確な測定法がなかったので、本方法とＣＫ反応液を用いれば、植物の根の活性が、植物の種類、栽培法、樹齢または生育のステージ、気象の影響等でどの様な相違があるのか、従来誰も手を付けられなかった未知の事象を科学的に、学問的に解明することを可能としている。

前記の問題を解決するために、発明者は、植物の根に含まれる琥珀酸脱水素酵素が前記ＣＫ反応試薬に含まれる琥珀酸をフマル酸に変化させる際に放出する少量の水素をメチレンブルーと反応させ、メチレンブルーの色の濃さの比較によって、放出された水素量を測定することと、メチレンブルーを極めて希薄な状態にした場合に根の活性が強く現われ溶存酸素があまり影響しないこと、を利用して、根の琥珀酸脱水素酵素活性の変化から根の活性を定量的に測定する方法を提案した。

分析方法の全容は、比色可能な透明キューベット容器内で、植物の根と定濃度のメチレンブルーを含むＣＫ反応試薬を接触反応させるだけで測定できる簡便な方法である。
基準溶液は、容積３ｍｌの、比色可能で透明な微小溶液を容れる容器群を用意し、これに標準濃度の１〜５０×１０^−６ｍｏｌ／Ｌのメチレンブルー溶液を容れて濃度基準を作成する。
次ぎに、同じく容積３ｍｌの、比色可能で透明な微小溶液を容れる透明キューベット容器群を用い、琥珀酸脱水素酵素反応容器とする。

透明キューベット反応容器内に、注射器でＣＫ反応試薬をいれ、次いで植物の根を入れて琥珀酸脱水素酵素を作用させ、ＣＫ反応試薬に含まれるメチレンブルーが脱色して濃度基準と比較する。ＣＫ反応試薬は、植物の根の活性度に合わせ、１０、２０、又は５０×１０^−６ｍｏｌ／Ｌのメチレンブルーを含み、反応基質の琥珀酸塩溶液、緩衝能を高めるクエン酸塩溶液、呼吸酵素を活性化するリン酸塩溶液から成っている。

測定に必要な器材
１分光光度計または比色計
２上皿天秤
３透明キューベット（＝セミミクロデイスポセル）サイズ３．０ｍｌ２０個
４セルラックサイズ２０９×７０×３５
５注射器
６カッターナイフ
７ハサミ
８ピンセット

（ＣＫ反応試薬の調製）
１）基質緩衝液の調整
２．５×１０^−３ｍｏｌ／Ｌ琥珀酸ナトリウム、１０^−２ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、０．８×１０^−２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウムの調整。
琥珀酸ナトリウムを０．２７０ｇ秤量し、結晶クエン酸ナトリウム０．３７１ｇを秤量し、リン酸ナトリウム粉末５．８５ｇを秤量し、およそ８０ｍｌの水に溶かしてｐＨ７〜８に調整し、容量を１００ｍｌにする。

２）メチレンブルーの調整
植物の根の酵素活性の強さに応じてメチレンブルー濃度を変更する。
メチレンブルーの濃度は、１０^−４ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、４×１０^−５ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、及び２×１０^−５ｍｏｌ／Ｌメチレンブルーの３段階を設ける。
１０^−２ｍｏｌ／Ｌメチレンブルーは、メチレンブルー０．３７４ｇを秤量し、水に溶かして１００ｍｌにする。
１０^−４ｍｏｌ／Ｌメチレンブルーは、１０^−２ｍｏｌ／Ｌメチレンブルーを１０ｍｌ採って１００ｍｌに薄め、更に１０ｍｌ採って１００ｍｌに薄める。
５×１０^−５ｍｏｌ／Ｌメチレンブルーは、１０^−４ｍｏｌ／Ｌメチレンブルーを５０ｍｌ採って１００ｍｌに薄め使用する。
２×１０^−５ｍｏｌ／Ｌメチレンブルーは、１０^−４ｍｏｌ／Ｌメチレンブルーを２０ｍｌ採って１００ｍｌに薄め使用する。
１０^−５ｍｏｌ／Ｌメチレンブルーは、１０^−４ｍｏｌ／Ｌメチレンブルーを１０ｍｌ採って１００ｍｌに薄め使用する。

３）ＣＫ反応試薬の調整
反応試薬は作物の酵素活性の強さに応じてメチレンブルー濃度を選び、
１０×１０^−６ｍｏｌ／ＬのＣＫ反応試薬は、基質緩衝液１００ｍｌと２×１０^−５ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー１００ｍｌ、２×１０^−５ｍｏｌ／ＬのＣＫ反応試薬は、基質緩衝液１００ｍｌと４×１０^−５ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー１００ｍｌ、５×１０^−５ｍｏｌ／ＬのＣＫ反応試薬は、基質緩衝液１００ｍｌと１×１０^−４ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー１００ｍｌ、をそれぞれ混合して冷蔵庫に貯蔵する。

４）メチレンブルー比色標準液（時間の経過によって変色することはない）
１×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、２×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、３×１０^−６メチレンブルー、４×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、５×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、６×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、７×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、８×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、９×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、１０×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、１５×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、２０×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、２５×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、３０×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、３５×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、４０×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、４５×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルー、５０×１０^−６ｍｏｌ／Ｌメチレンブルーのシリーズで低濃度の場合は、１０^−５ｍｏｌ／Ｌメチレンブルーをそれぞれ１０ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、６０ｍｌ、７０ｍｌ、８０ｍｌ、９０ｍｌ、を採取して１００ｍｌに希釈する。
高濃度の場合は、１０^−４ｍｏｌ／Ｌメチレンブルーをそれぞれ１０ｍｌ、１５ｍｌ、２０ｍｌ、２５ｍｌ、３０ｍｌ、３５ｍｌ、４０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌを採取して１００ｍｌに希釈する。
これらを標準液として比色に供し、デヒドロゲナーゼ活性を測定する。

（測定方法）
透明キューベットに予め定温にしたＣＫ反応試薬を２ｍｌ注射器で注入する。
この反応試薬へ先に用意した植物根の切片０．１ｇを加え、温度センサーで温度を確認しながら、５分から１０分で一定時間振盪浸漬し、反応する。
デヒドロゲナーゼによるメチレンブルーの脱色の後、一定時間後に、ＣＫ反応試薬の色相を比較調査する。色相調査は、透明キューベットにメチレンブルー標準液０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０×１０ｍｏｌ／Ｌの溶液２ｍｌを注射器で注入し、比色標準とする。
低濃度は現場で肉眼比色し、高濃度は比色計で精密比色する。

（測定例）
サニーレタスを水耕栽培し、根の活性に相違を生ずる様に、一方を通常的な通気をさせるためにエジェクターで空気の泡通気を行い、一方を非常に効率の高いマイクロバブル通気を行い、根の活性を比較した。

（結果）
本根系活性度定量測定法による測定の結果、琥珀酸脱水素酵素活性を定量的に比色測定することにより、微細な量の根の呼吸量も数値として捕捉された。すなわち、マイクロバブル通気区がエジェクター通気区の２倍活性が高いことが測定された。

以上述べたように、本技術では透明なキューベットにＣＫ反応液と試験用の切断根を入れ、温度を確認しながら、緩やかに振るだけで、還元反応が進み、開始５〜１０分には根の活性を定量的に測定することが可能であった。

Claims

呼吸促進緩衝液であるｐＨ７の８×１０^−２ｍｏｌ／Ｌ燐酸ナトリウム、１×１０^−２ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、呼吸基質の２．５×１０^−３ｍｏｌ／Ｌ琥珀酸ナトリウム、及び（１〜５）×１０^−５ｍｏｌ／ＬのメチレンブルーからなるＣＫ反応試薬へ、植物の切断根を浸漬し、前記植物の根に含まれる琥珀酸脱水素酵素が前記ＣＫ反応試薬に含まれる琥珀酸をフマル酸に変化させる際に放出する少量の水素をメチレンブルーと反応させ、メチレンブルーの色の濃さの比較によって、放出された水素量を測定することによって、前記植物の根の有する琥珀酸脱水素酵素活性を、前記植物根とＣＫ反応試薬を接触させるだけで比色測定することにより、前記植物根の活性度を簡便にかつ定量的に測定することを特徴とする植物根の活性度定量測定方法。
請求項１に記載の植物根の活性度定量測定方法において、前記植物根に含まれる琥珀酸脱水素酵素が琥珀酸をフマル酸に変化させる際に放出する少量の水素をメチレンブルーと反応させるため、メチレンブルーの濃度を（１〜５）×１０ ^−５ｍｏｌ／Ｌの範囲になるように定め、８×１０^−２ｍｏｌ／Ｌ燐酸ナトリウム及び１×１０^−２ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなるｐＨ７の緩衝液と、呼吸基質の２．５×１０^−３ｍｏｌ／Ｌ琥珀酸ナトリウムと、を含み、前記植物根の活性度定量に当たって、前記植物の切断根を浸漬するだけでメチレンブルーの色の変化が起って、前記植物根の活性度が測定できることを特徴とする植物根の活性度測定用ＣＫ反応試薬。