JP4647597B2

JP4647597B2 - 可逆性不死化哺乳類肝臓細胞およびその用途

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Publication number: JP4647597B2
Application number: JP2006512172A
Authority: JP
Inventors: 直哉小林; 紀章田中; 道法小原
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Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2011-03-09
Anticipated expiration: 2024-03-31
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Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、可逆的に増殖可能であり、復帰後の細胞においても自殺遺伝子を含有する不死化哺乳類肝臓細胞および該肝臓細胞を用いたバイオ人工肝臓や細胞製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本におけるＣ型肝炎感染者数は200万人（米国では400万人）、Ｂ型肝炎の患者数は約150万人（中国ではＢ型肝炎に感染している患者は1億2000万人以上）と報告されている（日経サイエンス、2000年２月号、肝炎情報センター）。Ｃ型肝炎の合併症により日本では年間約9000人が死亡し、2010年までに死亡数は３倍に跳ね上がると予想されている。
【０００３】
このような予測から、肝細胞移植や肝不全治療用バイオ人工臓器に対するニーズは高く、代謝性肝疾患でのヒト肝細胞移植の有効例が報告されている（非特許文献１および２）。
【０００４】
また、欧米、中国では、すでにブタ肝細胞を使用したバイオ人工肝臓治験がヒトで行われているが、ブタ内因性レトロウイルス感染などの人畜共通感染症が問題視されており、今後の進展が厳しい現状にある。
【０００５】
こうした細胞移植やバイオ人工肝臓のソースとしては健常ヒト細胞が理想であるが、深刻なドナー不足から当該細胞の入手はきわめて困難である。
【０００６】
よって、胚性幹細胞（embryonic stem（ES）細胞）、幹細胞、異種動物の細胞が研究されている。しかしながら、幹細胞や前駆細胞を利用する際には、こうした細胞の多分化能と活発な増殖能自体に由来する制御の困難さが本質的に内包されており、肝細胞への分化誘導に関しての報告があるものの充分ではない（非特許文献３）。また、異種動物の細胞では、移植細胞が最終的に拒絶される保証は無く、異種動物との安定なキメラ状態やＨＬＡ非適合の同種腫瘍の偶発的な生着がヒトにおいて報告されている（非特許文献４）。
【０００７】
一方、癌遺伝子を導入して細胞を不死化することにより、適度な分化機能を保持した細胞株を産出できることが知られている（非特許文献５）が、不死化細胞株を、生体内に注入することにより、またはバイオ人工肝臓などの体外循環補助装置に使用することにより、予期せぬ癌化の危険性に患者を曝す可能性がある。
【０００８】
不死化遺伝子を導入して細胞を不死化し、増殖した後に該不死化遺伝子を切り出すことができる可逆性不死化細胞も研究されている（非特許文献６）。しかしながら、レトロウイルスベクターを使用する際には、ウイルスの構造上のＬＴＲが腫瘍性を引き起こすなどの問題点や、導入されるコピー数が多くなるといった欠点がある。また、不死化遺伝子を部位特異的組換え酵素により切り出したとしても、遺伝子操作を行なった細胞が残留し、こうした細胞が宿主に対して悪影響（腫瘍を形成してくるなど）を及ぼす可能性がゼロではないことから、治療を受ける患者に不安を与える可能性があると指摘されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】
Strom SC, Fisher RA, Thompson MT, Sanyal AJ, Cole PE, Ham JM, Posner MP., Transplantation (1997) 63: 559-569
【非特許文献２】
Fox IJ, Roy Chowdhury J, Kaufman SS, et al., New Eng. J. Med. (1998) 338: 1422-1426
【非特許文献３】
Rambhatla L, Chiu CP, Kundu P, et al., Cell Transplant. 2003; 12: 1-11; Schwartz RE, Reyes M, Koodie L, et al., J. Clin. Invest. 109; 1291-1302, 2002
【非特許文献４】
Gartner et al., N. Eng. J. Med., 335, 1494, (1996); K. Paradis et al., Science, 285, 1236, (1999)
【非特許文献５】
Kobayashi N, et al., Transplantation 69: 202-207, 2000
【非特許文献６】
Westerman KA, Leboulch P., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93: 8971-8976, 1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来の問題点を解消し、健常ヒト肝臓細胞に替わる、大量に増殖可能で、その生存を制御することのできる、より安全性の高い可逆性不死化哺乳類肝臓細胞およびそれを用いたバイオ人工肝臓や細胞製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、我々は、一対の部位特異的組換え配列に挟まれた不死化遺伝子の外側に自殺遺伝子をコードするベクターを哺乳類の肝臓細胞に導入することにより、可逆的に増殖可能な不死化細胞であって、かつ不死化遺伝子を除去したのちに自殺遺伝子が作動し得るという特徴を有する安全な肝臓細胞株を樹立できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、一対の部位特異的組換え配列に挟まれた不死化遺伝子を含有し、かつ該一対の部位特異的組換え配列外に自殺遺伝子を含有する可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株であって、該一対の部位特異的組換え配列を切り出したのちに自殺遺伝子が作動し得ることを特徴とする可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株またはその継代株に関する。
【００１３】
前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞において、哺乳類がヒトであることが好ましい。
【００１４】
前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞がウイルス由来のプロモーターを含有しないことが好ましい。
【００１５】
前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株がＣＹＮＫ−１（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）であることが好ましい。
【００１６】
本発明はまた、前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株またはその継代株から不死化遺伝子を除去することにより得られる哺乳類肝臓細胞（以下、復帰細胞という）に関する。
【００１７】
本発明はさらに、前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株もしくはその継代株またはそれらの復帰細胞を含有するバイオ人工肝臓に関する。
【００１８】
本発明はまた、前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株もしくはその継代株またはそれらの復帰細胞を含有する細胞製剤に関する。
【００１９】
本発明は、非ウイルス性プロモーターを含有し、一対の部位特異的組換え配列間に不死化遺伝子をコードし、かつ該一対の部位特異的組替え配列外に自殺遺伝子をコードする非ウイルスベクターに関する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞は、需要に見合った数だけ容易に確保することができ、さらに安全性に優れ、患者に不安感を与えることなく、バイオ人工肝臓や細胞製剤の材料として使用することができる。また、本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞は、アルブミンや血液凝固因子といった生理活性物質を製造することができるため、細胞性医薬品の開発にも応用可能である。また、復帰細胞は、さらに安全性に優れており、かつ、肝臓細胞の能力を保持し、肝臓疾患の治療において非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、非ウイルスベクターｐＹＫ１を示す模式図である。ここで、ＡＴＧは開始コドン、ＣＡＧはＣＡＧプロモーター配列、ＬｏｘＰはＬｏｘＰ配列、ＨｙｇＲはハイグロマイシン耐性遺伝子、ＨＳＶＴＫは単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ、ＥＭＣＶＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス内リボゾームエントリー部位、ＳＶ４０Ｔはシミアンウイルス４０ラージＴ抗原遺伝子、ＺｅｏＲはゼオシン耐性遺伝子、ｐＡはポリＡシグナルをそれぞれ示す。
【図２】図２は、非ウイルスベクターｐＹＫ１の製造方法の一例を示す図である。ここで、ＡＴＧは開始コドン、ＣＡＧはＣＡＧプロモーター配列、ＬｏｘＰはＬｏｘＰ配列、ＨｙｇＲはハイグロマイシン耐性遺伝子、ＨＳＶＴＫは単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ、ＥＭＣＶＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス内リボゾームエントリー部位、ＳＶ４０Ｔはシミアンウイルス４０ラージＴ抗原遺伝子、ＺｅｏＲはゼオシン耐性遺伝子、ｐＡはポリＡシグナルをそれぞれ示す。
【図３】図３は、ＣｒｅＤＮＡ組換え酵素によるＬｏｘＰ配列の切り出し機構を示す図である。ここで、ＡＴＧは開始コドン、ＬｏｘＰはＬｏｘＰ配列、ＨｙｇＲはハイグロマイシン耐性遺伝子、ＨＳＶＴＫは単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ、ＥＭＣＶＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス内リボゾームエントリー部位、ＳＶ４０Ｔはシミアンウイルス４０ラージＴ抗原遺伝子、ＺｅｏＲはゼオシン耐性遺伝子、ｐＡはポリＡシグナルをそれぞれ示す。
【図４】図４は、可逆性不死化ヒト肝細胞ＣＹＮＫ−１（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）の位相差顕微鏡写真である。部分１は核小体を示し、部分２は核小体を有する大きな核を示し、部分３は細胞内顆粒を示す。
【図５】図５は、本発明のバイオ人工肝臓リアクターの一実施態様を例に、作製過程の一実施態様を示す図である。図５（ａ）は裏打ち４が施された不織布５の上に中空糸膜６を並べた図である。ここで、裏打ち４が施された不織布５にはスリット７が設けられている。図５（ｂ）は、図５（ａ）をロール状に巻く過程を示す図である。図５（ｃ）は、図５（ｂ）のＸ−Ｘ線断面拡大図である。図５（ｄ）は、両端に液漏れ防止部材８を設けた筒状容器９に中空糸膜６と不織布５からなるロールを組み込んだバイオ人工肝臓リアクター１０を表わす概略図である。リアクターには細胞注入口１１および細胞のサンプル採取を行なうことが可能な取り出し口１２が設けられており、スリット７は、細胞注入口１１と連絡するように配置される。
【図６】図６（ａ）は、ＣＹＮＫ−１（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）における肝特異的遺伝子およびＳＶ４０Ｔ遺伝子の発現を示す写真である。レーン１から７は、それぞれアルブミン遺伝子、アシアログリコプロテイン受容体（以下、ＡＳＧＰＲという）遺伝子、肝臓性ビリルビン−ウリジンジフォスフェートグルクロノシルトランスフェラーゼ（以下、ビリルビン−ＵＧＴという）遺伝子、グルタミンシンセターゼ（以下、ＧＳという）遺伝子、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼπ（以下、ＧＳＴ−πという）遺伝子、ヒト血液凝固因子Ｘ（以下、ＨＢＣＦ−Ｘという）遺伝子およびＳＶ４０Ｔ遺伝子の発現を示す。Ｍはマーカーを示す。図６（ｂ）は、復帰ＣＹＮＫ−１細胞における肝特異的遺伝子およびＳＶ４０Ｔ遺伝子の発現を示す写真である。レーン１から７は、それぞれアルブミン遺伝子、ＡＳＧＰＲ遺伝子、ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子、ＧＳ遺伝子、ＧＳＴ−π遺伝子、ＨＢＣＦ−Ｘ遺伝子およびＳＶ４０Ｔ遺伝子の発現を示す。Ｍはマーカーを示す。
【図７】図７は、可逆性不死化ヒト肝細胞ＣＹＮＫ−１（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号ＦＥＲＭ：ＢＰ−０８６５７）のガンシクロビル感受性を示すグラフである。
【図８】図８は、ガンシクロビルで処理した可逆性不死化ヒト肝細胞ＣＹＮＫ−１（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）の位相差顕微鏡写真である。死滅した細胞１３が観察される。
【図９】図９は、ガンシクロビルで処理した復帰ＣＹＮＫ−１細胞の位相差顕微鏡写真である。死滅した細胞１３が観察される。
【図１０】図１０は、Ｄ−ガラクトサミン投与後のブタの生存曲線を示すグラフである。
【図１１】図１１は、バイオ人工肝臓治療にて可動後の、ＢＡＬ−１の不織布の走査電子顕微鏡写真である。細胞１４は、不織布の繊維１５に良好に付着している。
【図１２】図１２は、バイオ人工肝臓治療にて可動後の、ＢＡＬ−１の中空糸膜の走査電子顕微鏡写真である。中空糸膜１６の表面には、細胞が一切付着していない。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明において、「可逆性不死化」または「可逆的に増殖可能な」とは、不死化遺伝子を細胞に形質導入して、当該細胞を無限に増殖可能な状態にしたものであって、目的の細胞数まで増殖させた後、当該不死化遺伝子を取り除くことで、細胞増殖を停止し、元の安全性の高い状態に復帰させることのできる状態を意味する。
【００２３】
本発明で用いられる哺乳類の肝臓細胞は、たとえば豚、猿、類人猿、ヒトの肝臓細胞などであり、好ましくはヒトの肝臓細胞である。たとえば、ヒトの成人肝臓細胞およびヒトの胎児肝臓細胞などを本発明に使用することができる。
【００２４】
本発明に用いられる「肝臓細胞」とは、たとえば肝機能の指標であるアルブミンや各種凝固因子などのタンパク質の産生能、糖新生能、尿素産生能、血液の解毒および浄化能、ならびに、アミノ酸、糖質、および脂質代謝能を有する細胞である。具体的には、肝細胞、肝類洞内皮細胞、肝星状細胞、ピット細胞およびクッパー細胞などがあげられる。
【００２５】
本発明に使用する肝臓細胞は、商業的に入手可能である（たとえば、三光純薬株式会社、大日本製薬株式会社など）。
【００２６】
本発明において「部位特異的組換え配列」とは、部位特異的組換え酵素によって認識される特異的な塩基配列であり、同一のＤＮＡ分子上に同方向の一対の配列が存在する場合は、この配列間でＤＮＡ鎖の切断が行なわれる。
【００２７】
部位特異的組換え配列としては、ＬｏｘＰ配列やＦＲＴ配列などがあるが、ＬｏｘＰ配列が好ましい。ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ組換え酵素によって認識される公知の部位特異的組換え配列であり、同一のＤＮＡ分子上に同方向の一対のＬｏｘＰ配列が存在する場合は、大腸菌のＰ１ファージ由来であるＣｒｅ組換え酵素が、１）３４塩基からなるＬｏｘＰ配列を認識し、２）その部位に結合してＬｏｘＰ配列間にコードされるＤＮＡを切り出すという一連の反応を単独で行なうことが出来る。
【００２８】
したがって、一対のＬｏｘＰ配列間にコードさせた遺伝子は、後にＣｒｅ組換え酵素を作用させることで切り出すことができる。
【００２９】
本発明において「不死化遺伝子」とは、ヒト体細胞を無限分裂寿命化する遺伝子を意味し、たとえば、ＳＶ４０Ｔ遺伝子およびヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子などがあげられる。
【００３０】
前記ＳＶ４０Ｔ遺伝子は、公知のＤＮＡ型腫瘍ウイルスの腫瘍抗原（Ｔ抗原）遺伝子である。
【００３１】
前記ｈＴＥＲＴ遺伝子は、正常細胞のＴＥＲＴ遺伝子由来である。ｈＴＥＲＴ遺伝子は、血液、皮膚、腸管粘膜、子宮内膜など、生涯にわたり再生を繰り返している臓器の幹・前駆細胞、および特定の抗原に暴露するたびにクローン増殖しているリンパ球では自然と発現増強している遺伝子である。
【００３２】
本発明において「自殺遺伝子」とは、細菌やウイルス由来の酵素であって、活性の低いプロドラッグを代謝して強い細胞障害活性のある物質に変換させる働きを有する酵素をコードする遺伝子を意味し、このような自殺遺伝子が導入された細胞は、プロドラッグの投与により選択的に死滅する。
【００３３】
したがって、自殺遺伝子を標的とする細胞に導入した場合、プロドラッグの投与により目的に応じて標的細胞を選択的に除去することができる。代表的な自殺遺伝子とプロドラッグとの組み合わせとしては、単純ヘルペスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）遺伝子と抗ウイルス剤として臨床で用いられているガンシクロビルとの組み合わせ、大腸菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子と抗菌剤である５−フルオロシトシンとの組み合わせなどがあげられる（Elion GB. Am. J. Med. 73, 7, 1982; Craig AM. Proc. Acad. Sci. USA 89, 33, 1992）。本発明で使用する自殺遺伝子としては、その有効性が既に動物実験にて証明されおり（Moolten FL, Wells JM: J Natl Cancer Inst. 82: 297-300, 1990; Culver KW, Ram Z, Wallbridge S, Ishii H, Oldfield EH. Science 1992; 256: 1550）、さらに、ヒト前立腺癌の遺伝子治療の臨床応用においてもその有効性が確認されている点からＨＳＶＴＫ遺伝子が好ましい。
【００３４】
本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞は、一対の部位特異的組換え配列に挟まれた不死化遺伝子と、該一対の部位特異的組換え配列外に自殺遺伝子とをコードするＤＮＡ配列を、ベクターにより哺乳類肝臓細胞に導入することにより作製することができる。
【００３５】
ベクターとしては、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターのいずれも使用することができるが、ウイルスベクターは、組み換えウイルスベクター産生細胞の培養上清をろ過し、目的とする細胞に添加するだけで効率よく遺伝子導入が可能である点では好ましいが、ウイルスの構造上のＬＴＲが腫瘍性を引き起こすなどの問題点があり、また、導入されるコピー数も多くなるといった欠点も有する。したがって、非ウイルスベクターを使用することが好ましい。
【００３６】
このようなベクターとしては、たとえば、非ウイルス性プロモーターＣＡＧを含有し、Ｃｒｅ組換え酵素の標的となる一対のｌｏｘＰ配列間にＳＶ４０Ｔ遺伝子とハイグロマイシン耐性（ＨｙｇＲ）・単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）融合遺伝子とをコードし、さらに該ＬｏｘＰ配列外にゼオシン耐性（ＺｅｏＲ）・ＨＳＶＴＫ融合遺伝子を同時にコードする非ウイルスベクターｐＹＫ１（図１）が使用できる。ここで、非ウイルス性プロモーターとしては、ＣＡＧプロモーターなどが使用できるが、発現の強さからＣＡＧプロモーターが好ましい。なお、ＣＡＧプロモーターは、サイトメガロウイルスＩＥエンハンサー（cytomegalovirus IE enhancer）、チキンβ−アクチンプロモーター（chicken β-actin promoter）およびウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナル（rabbit β-globin polyadenylation signal）から構成されており、以下の論文を参照することで当業者なら製造可能である（Kanegae Y, Takamori K, Sato Y, et al., Gene (1996) 181: 207-212.）。
【００３７】
非ウイルスベクターの導入方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ヌクレオフェクターなどを用いたエレクトロポレーション法があげられる。遺伝子の導入効率の面からは、ヌクレオフェクターなどを用いたエレクトロポレーション法が好ましい。
【００３８】
当該遺伝子導入及びその後の不死化株の樹立、継代に関しては、無血清培地での細胞培養が好ましい。無血清培地としては、ＣＳ−Ｃ無血清培地やＩＳＥ−ＲＰＭＩやＨＧＭ (hepatocyte growth medium)などがある。調達の面から、たとえば、セルシステムズ（Cell System）社（シアトル、ワシントン州、米国）や大日本製薬株式会社より入手可能なＣＳ−Ｃ無血清培地が好ましい。
【００３９】
以上より、本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞のなかでも、正常ヒト肝細胞に非ウイルス性ベクターであるｐＹＫ１を導入することにより樹立したＣＹＮＫ−１細胞株（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）およびその継代株が最も好ましい。また、本発明の可逆性不死化肝臓細胞は、図２（ＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１５年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７））に示すように、数個の核小体１を有する大きな核２をもった細胞内顆粒３に富んだ、いわゆる肝臓の実質細胞の形態学的特徴を有する。
【００４０】
本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞は、前述したように部位特異的組換え酵素を作用させることにより不死化遺伝子を除去することができる。組換え酵素は、前述したように使用する部位特異的組替え配列に合わせて、当業者が容易に選択し得る。
【００４１】
部位特異的組換え酵素を作用させる方法としては、たとえば、Ｃｒｅ組換え酵素の場合、（１）遺伝子導入効率の良好なアデノウイルスベクターによりＣｒｅ組換え酵素を形質導入する方法、（２）リン酸カルシウム法にて、Ｃｒｅ組換え酵素ＤＮＡを細胞培養液中に添加する方法、（３）培養上清中に、ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus）（ＨＩＶ）由来のＴＡＴタンパク質とＣｒｅ組み換え酵素との融合タンパク質を添加する方法、（４）Ｃｒｅ組換え酵素タンパク質をカチオニック化して、細胞培養液中に添加する方法、さらに（５）薬剤誘導性Ｃｒｅ組み換え酵素発現ベクターを導入することにより、薬剤を添加することで該遺伝子の除去を自由に起こさせるシステムを付加する方法などがあげられる。
【００４２】
本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株またはその継代株から不死化遺伝子を除去することにより得られる復帰細胞は、復帰前の細胞よりやや大型化し、数個の核小体を有する核をもった細胞内顆粒に富んだ、いわゆる肝臓の実質細胞の形態学的特徴を維持している。
【００４３】
一方、肝機能不全を改善するための肝臓細胞としては、いくつかの生化学的な要求を満たさなければならない。すなわち、ｉ）ビリルビン血漿や黄疸を軽減する、ii）高アンモニア血症に起因する肝性脳症の改善、iii）血液の解毒と浄化作用、iv）アルブミンや血液凝固因子の補給、などである。高アンモニア血症の軽減はとりわけ、肝性脳症および脳死の進展防止に重要である（Strom SC. Transplantation 63, 559, 1997）。グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）は、アンモニア除去の主要な酵素であり、肝機能不全を改善するための樹立肝細胞株としては、この酵素の発現が重要である（Strom SC. Transplantation 63, 559, 1997）。
【００４４】
したがって、可逆性不死化哺乳類肝臓細胞およびその継代細胞ならびにそれらの復帰細胞は、少なくともアルブミン遺伝子、ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子、ＧＳ遺伝子、ＧＳＴ−π遺伝子およびＨＢＣＦ−Ｘ遺伝子のいずれかが発現していることが好ましく、これらすべての遺伝子が発現していることがより好ましい。
【００４５】
このような、本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞およびその継代細胞ならびにそれらの復帰細胞は、バイオ人工肝臓や細胞製剤として種々の肝疾患の治療に使用することができる。
【００４６】
本発明における「肝疾患」としては、たとえばウイルス、薬剤、そして中毒（キノコ等）による急性肝不全などの肝不全、血友病、α１−抗トリプシン欠損症、ガラクトース血症、肝腎性チロシン血症、カエデシロップ尿症、糖原病１ａ型、肝性ポルフィリン症、低ベータリポ蛋白血症、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症１型、クリグラー−ナジャー症候群１型、高フェニルアラニン血症などの代謝性肝疾患、慢性肝疾患の急性増悪などが含まれる。本発明の治療剤は、肝不全および代謝性肝疾患の治療に用いられることが好ましい。
【００４７】
本発明の細胞製剤は、前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞もしくはその継代細胞またはそれらの復帰細胞を、培地、等張液、または緩衝液に懸濁した懸濁液、もしくは遠心などにより濃縮したペレットなどの細胞塊などがあげられる。培地、等張液、または緩衝液は、前記肝臓細胞に適合するよう適宜選択される。さらに、前記細胞製剤は、ＤＭＳＯなどの保護剤を加え、凍結保存することもできる。また、前記細胞製剤としては、ヒト体内に接種されることを考慮して、不死化遺伝子を除去した復帰細胞を使用することが好ましい。細胞製剤は、より安全に利用するために、加熱処理、放射線処理、あるいはマイトマイシンＣ処理など、細胞製剤としての機能を残しつつ、病原細胞のタンパク質が変性する程度の条件下で処理をすることができる。
【００４８】
細胞製剤の投与形態（移植方法）としては、経門脈的投与、腹くう内投与、脾臓内投与などが使用できる。なかでも、経門脈的投与や脾臓内投与がさらに好ましく、経門脈的投与が最も好ましい。細胞製剤の投与量（移植量）は、１億個〜１００億個／固体が好ましく、５億個〜１００億個／固体がさらに好ましく、１０億個から１００億個／固体が最も好ましい。また、投与量（移植量）は、投与される患者の年齢、体重、症状などによって適宜変更することができる。
【００４９】
バイオ人工肝臓としては、中空糸型のリアクター（デバイス）と分離・培養細胞を組み合わせたバイブリッド型の人工肝臓などが挙げられる。バイオ人工肝臓は、体外に装着して血管に接続するもの、体内に留置して血管に接続するもの、または血管に接続せずに腹腔内に留置するものの三つの形態がある。本発明の可逆性不死化肝臓細胞および復帰肝臓細胞はどちらも、いずれの形態のバイオ人工肝臓にも使用可能である。
【００５０】
バイオ人工肝臓の開発においては、リアクターの設計・開発も重要な要素である。バイオリアクターとしては、サーシバイオメディカル社（Circe Biomedical Inc.）（レキシントン、マサチューセッツ州、米国）の支援下でシダーズサイナイ医療センター（Cedars-Sinai Medical Center）（ロサンジェルス、カリフォルニア州、米国）のディメトリュー（Demetriou）らを中心としたブタ肝細胞を用いたバイオ人工肝臓治療用のヘパトアシスト（HepatAssist）（Hui T, Rozga J, Demetriou AA. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2001; 8: 1-15.）や、ブタ肝細胞を使用したドイツのGerlachらのＭＥＬＳ（モジュラー体外肝臓システム（Modular Extracorporeal Liver System））など、様々なタイプが知られている。これらのリアクターは、もちろん本発明において使用することができるが、肝細胞が付着するための足場が無いため、細胞はただ単に、中空糸内スペースか、中空糸外スペースに充填されるのみで浮遊した状態となる傾向がある。肝細胞は、浮遊状態では、分化機能が充分に発現されない傾向があり、さらに周りの細胞と衝突し、ストレス刺激を受けやすい。
【００５１】
したがって、本発明においては、肝細胞に足場が提供できるよう、中空糸と不織布からなるリアクターが好ましい。
【００５２】
中空糸膜としては、膜表面に細胞が付着して物質交換が妨げられることがなければどのようなものでも使用することができ、具体的には、従来医療用に用いられている市販の物、たとえば、ポリスルフォン膜、エチレン−酢酸ビニルランダム共重合体けん化物膜（たとえば、商品名：エバール、クラレメディカル株式会社製など）などが好ましい。市販の中空糸膜のポアサイズは、その用途から透析膜（〜５ｎｍ）、血漿成分分離膜（２０〜３０ｎｍ）、血漿分離膜（３０〜２００ｎｍ）などがある。物質の透過性の点からは、血漿分離膜（３０〜２００ｎｍ）が好ましい。
【００５３】
不織布としては、細胞が接着することが出来るように加工・修飾されているものが好ましい。なかでも、その加工のしやすさの点から、ポリ四フッ化エチレン（ＰＴＦＥ）にポリアミノ酸ウレタン（ＰＡＵ）加工を施したものが好ましい。
【００５４】
本発明のバイオ人工肝臓リアクターの一実施態様を例に、ハウジングまでの過程を図５に示す。裏打４を施した不織布５上に中空糸膜６を置く（図５（ａ））。ここで、裏打ち４を施した不織布５にはスリット７が設けられている。これをロール状に巻く（図５（ｂ））。そのＸ−Ｘ線断面が図５（ｃ）である。これを両端に液漏れ防止部材８を設けた筒状容器９に組み込む。リアクターには細胞注入口１１および細胞のサンプル採取を行なうことができる取り出し口１２が設けられており、スリット７は、細胞注入口１１と連絡するように配置される。
【００５５】
また、バイオ人工肝臓治療は、安全かつ科学的に施行するために、１）人工肝臓リアクターの流入圧と流出圧のリアルタイムでのモニタリング、２）気泡が発生した際のアラームの作動、３）リアクターの温暖化（３７度）などができる機能を一体化した装置で実施されることが好ましい。
【００５６】
以下、具体的な実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５７】
実施例１
非ウイルスベクターｐＹＫ−１の製造
非ウイルスベクターｐＹＫ−１（図１）を以下の手順で作製した（図２参照）。
【００５８】
（１）ゼオシン耐性遺伝子（ＺｅｏＲ）フラグメントを得るために、ｐＣＭＶ／Ｚｅｏ（インビトロジェン社製）を鋳型にし、５′側にＸｈｏＩを組み込んだプライマーＰ３、３′側にＨＳＶＴＫを組み込んだプライマーＰ５′をゼオシン領域の両端に設定し、これを用いて反応条件、９５℃、５分、（９５℃、３０秒、６０℃、３０秒、７２℃、２分）×３０サイクル、７２℃、１５分でＰＣＲ反応を行なった。Ｐ３プライマーは、ゼオシン開始コドンを抜き、ゼオシンが発現できないようにした。
【００５９】
（２）ＨＳＶＴＫフラグメントを得るためにＳＳＲ＃６９（Westerman KA, Leboulch P., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93: 8971-8976, 1996）を鋳型にし、プライマーＰ６′、Ｐ７をＨＳＶＴＫ領域の両端に設定し、これを用いて反応条件、９５℃、５分、（９５℃、３０秒、６０℃、３０秒、７２℃、２分）×３０サイクル、７２℃、１５分でＰＣＲ反応を行なった。
【００６０】
（３）ゼオシン、ＨＳＶＴＫ結合フラグメントを得るために前記（１）で回収したゼオシン、前記（２）で回収したＴＫフラグメントのミックスを鋳型にし、プライマーＰ３、Ｐ７を用いて反応条件、９５℃、５分、（９５℃、３０秒、６１℃、１分、７２℃、３分）×３０サイクル、７２℃、１５分でＰＣＲ反応を行なった。プライマーＰ５′の３′側とＰ６′の５′側は相補的に設計してあるため、このＰＣＲによりゼオシンおよびＨＳＶＴＫフラグメントは結合された。
【００６１】
（４）ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＨＳＶＴＫ遺伝子、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ遺伝子、ＳＶ４０Ｔ遺伝子を含むフラグメントを得るために、ＳＳＲ６９を鋳型にし、この領域の両端に設定したプライマーＰ１、Ｐ２を用いて反応条件、９５℃、５分、（９５℃、３０秒、６０℃、１分、７２℃、５分）×３０サイクル、７２℃、１５分でＰＣＲ反応を行なった。
【００６２】
なお、Ｐ１プライマーの５′側にはＨＣＶ５′ＵＴＲとＬｏｘＰが、Ｐ２プライマーの３′側にはＬｏｘＰおよびＸｈｏＩが組み込んである。
【００６３】
得られたＰＣＲ産物は、ＮｕＳｉｅｖｅアガロースとＳｅａＫｅｍアガロースとを３：１の割合で混合したものを１．２％含有するゲルで電気泳動した後、ＤＮＡＣＥＬＬ（第一化学薬品株式会社製）で精製し、回収した。
【００６４】
次いで、ゼオシン、ＨＳＶＴＫ結合フラグメントをＸｈｏＩ、Ｔ４ＰＮＫ処理し、ＸｈｏＩ、ＳｍａＩ処理したＬｏｘＰスイッチング発現ベクターであるｐＣＡＬＮＬ５／ｐＢＲ３２２Ｈに、ＬｉｇａＦａｓｔＲａｐｉｄＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（プロメガ（Promega）社）を用いて挿入ライゲーションした。なお、ｐＣＡＬＮＬ５／ｐＢＲ３２２Ｈは、ｐＣＡＬＮＬ５（理研バンクＲＤＢ−１８６２）のｐＵＣＯｒｉをｐＢＲ３２２Ｏｒｉに交換することにより作製した。エレクトロポレーションによりコンピテントセル（ＪＭ１０９）に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢプレートで選抜した。得られたクローンをＭｌｕＩ、Ｔ４ｐｏｌ、ＸｈｏＩで処理したものに、ＸｈｏＩ、Ｔ４Ｋ処理したハイグロマイシン耐性遺伝子、ＨＳＶＴＫ遺伝子、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ遺伝子、ＳＶ４０Ｔ遺伝子を含むフラグメントを挿入し、コンピテントセル（ＪＭ１０９）に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢプレートで選抜し、ｐＹＫ１を製造した。
【００６５】
実施例２
可逆性不死化ヒト肝細胞株ＣＹＮＫ−１（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）の樹立
Ｔ−２５フラスコ内で８０％コンフルエントの状態の継代数１の正常ヒト肝細胞（CS-ABI-3716、大日本製薬株式会社販売）をトリプシン処理し、１００万個のヒト肝細胞を得た。これを、ヌクレオフェクターシステム用緩衝液（Nucleofector^TM Solution、和光純薬工業株式会社製）１ｍｌで希釈し、そこにｐＹＫ−１のプラスミドＤＮＡのＴＥ緩衝液（TE buffer、シグマ社製）の懸濁液（１μｇ／μｌ）２μｌを添加して、ヌクレオフェクターシステム（Nucleofector^TMシステム、和光純薬工業株式会社製）により、該システムのプロトコールにしたがって遺伝子導入した。得られた細胞をＴ−２５フラスコに播種し、ＣＳ−Ｃ無血清培地（CS-SF-4Z0-500、大日本製薬株式会社販売）にて培養を継続した。遺伝導入して４８時間後に、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン含有ＣＳ−Ｃ無血清培地にて、耐性クローンの選択を行なった。選択開始から２週間後に耐性クローンの出現を認め、４週間後にクローニングリングを使用し、ＣＹＮＫ−１細胞株（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）を樹立した。
【００６６】
この細胞を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）。
【００６７】
得られたＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）は、数個の核小体１を有する大きな核２をもった細胞内顆粒３に富んだ、いわゆる肝臓の実質細胞の形態学的特徴を示した（図４）。ＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）は、増殖が停止する危機（クライシス）もなく不死化し、無血清のＣＳ−Ｃ培地下に単層に増殖し、約４８時間でその数が倍加した。
【００６８】
実施例３
Ｃｒｅ組換え酵素によるＳＶ４０Ｔ遺伝子の切り出し（図３参照）
核内限局信号（ＮＬＳ）標識されたＣｒｅ組換え酵素を産生する複製不可能な組換えアデノベクターＡｘＣＡＮＣｒｅ（３×１０⁸ｐｆｕ／ｍｌ）（理研ジーンバンク、日本、ＲＤＢＮｏ．１７４８）をＭＯＩ（感染多重度）＝５でＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）に感染させた。ＡｘＣＡＮＣｒｅで１時間感染したのち、細胞をトリプシンで処理して回収し、５日間のゼオシン選択（５μｇ／ｍｌゼオシン（シグマ社）含有ＣＳ−Ｃ無血清培地で培養）により完全なるＳＶ４０Ｔ遺伝子発現細胞の排除が達成された。一過性のＣｒｅ組換え酵素の発現で、ＬｏｘＰ配列間のＤＮＡの切り出しが生じた。
【００６９】
得られた細胞は、復帰前の細胞よりやや大型化し、数個の核小体を有する核をもった細胞内顆粒に富んだ、いわゆる肝臓の実質細胞の形態学的特徴を維持していた。
【００７０】
試験例１
ＳＶ４０Ｔ遺伝子除去前後のＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）における遺伝子発現
ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＳＶ４０Ｔ遺伝子切り出し前後のＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）において、肝臓代謝に関わる重要な遺伝子、すなわち、アルブミン遺伝子、アルブミン遺伝子、ＡＳＧＰＲ遺伝子、ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子、ＧＳ遺伝子、ＧＳＴ−π遺伝子およびＨＢＣＦ−Ｘ遺伝子、ならびにＳＶ４０Ｔ遺伝子の発現を調べた。ＲＴ−ＰＣＲ法では、ＲＮＡｚｏｌ（シンナ／バイオテックス社、フレンズウッド、テキサス州、米国）を用いてＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）からＲＮＡを抽出し、１μｇの総ＲＮＡを２２℃で１０分間、さらに４２℃で２０分間、ＲＮＡ逆転写酵素を用いて逆転写反応させた。
【００７１】
得られた２μｇの逆転写産物を、各プライマー２０ｐｍｏｌ／ｍｌで、ＡｍｐｌｉＴａｇＧｏｌｄキット（パーキン−エルマー／シータス社、ノーウォーク、コネチカット州、米国）を用い、そのプロトコールにしたがってＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲは９５℃で１０分間インキュベーションし、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒からなるインキュベーションを３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間インキュベーションして実施した。各遺伝子に対するプライマーには下記のものを使用した。
【００７２】
アルブミン遺伝子（５７６ｂｐ）
５′プライマー：ＡＡＡＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣ（配列番号１）
３′プライマー：ＣＡＡＡＧＣＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号２）
ＡＳＧＰＲ遺伝子（４９５ｂｐ）
５′プライマー：ＴＡＧＧＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＡ（配列番号３）
３′プライマー：ＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＴＣ（配列番号４）
ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子（４９５ｂｐ）
５′ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＡＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＴＡＴＣＡＣ（配列番号５）
３′ｐｒｉｍｅｒ：ＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＴＴＣ（配列番号６）
ＧＳＴ−π遺伝子（４９６ｂｐ）
５′ｐｒｉｍｅｒ：ＧＣＣＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＧＴＣＴＡＴＴ（配列番号７）
３′ｐｒｉｍｅｒ：ＧＧＣＴＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＡＴＣＡ（配列番号８）
ＧＳ遺伝子（５３５ｂｐ）
５′ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＣＴＧＧＡＧＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＧ（配列番号９）
３′ｐｒｉｍｅｒ：ＴＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＡＣＧＴＧＣＧ（配列番号１０）
ＨＢＣＦ−Ｘ遺伝子（４９３ｂｐ）
５′プライマー：ＧＴＧＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣＣＴＧＣＴ（配列番号１１）
３′プライマー：ＧＡＡＧＴＣＡＡＧＣＡＧＧＴＣＧＡＡＧＧ（配列番号１２）
ＳＶ４０Ｔ遺伝子（４２２ｂｐ）
５′プライマー：ＣＡＧＧＣＡＴＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＣ（配列番号１３）
３′プライマー：ＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＴＧＧＣＡＴＡＴＧ（配列番号１４）
【００７３】
可逆性不死化の前後でこうした肝機能遺伝子の発現は保存され、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組み替えによるＳＶ４０Ｔ遺伝子除去が認められた（図６（ａ）および図６（ｂ）参照）。また、当該結果は、ＳＶ４０Ｔ遺伝子の除去前後のＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）にアルブミンや血液凝固因子といった生理活性物質を製造させ、細胞性医薬品の開発に応用することが可能であることを示唆するデータである。
【００７４】
試験例２
ＳＶ４０Ｔ遺伝子除去前後のＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）のガンシクロビル感受性
２００個のＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）を９６ウェルプレートに播種し、ＣＳ−Ｃ無血清培地のみ、または種々の濃度のガンシクロビル（５、１０、２０、５０および１００μＭ）を添加したＣＳ−Ｃ無血清培地にて培養し、ＭＴＴアッセイ（Mcsmann T.J., Immunol. Methods, 65, 55, 1983）にて細胞増殖を検討した。
【００７５】
細胞の生存率を、相対的感受性として図７に示す。ＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）のガンシクロビルに対する感受性は、ガンシクロビルの濃度に依存し、５μＭのＧＣＶで１週間培養することで増殖を停止し、一部の細胞は死滅した（図７および８）。
【００７６】
復帰ＣＹＮＫ−１細胞も同様にＧＣＶに対して感受性を示し、５μＭのＧＣＶ存在下で１週間培養することにより増殖を停止し、一部の細胞は死滅し（図９）、１０日以内にすべての細胞が死滅した。
【００７７】
これらのデータは、細胞の増殖がガンシクロビルの投与にて制御可能であることを示す。
【００７８】
試験例３
復帰ＣＹＮＫ−１細胞による肝不全治療効果
Ｔ２２５の細胞培養フラスコ（コーニング社（Corning）、ニューヨーク州、米国)を使用して、ＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）を、培養液Ａ（ＣＳ−Ｃ無血清培地（CS-SF-4Z0-500、大日本製薬株式会社販売）に、０．１ｍｇ／Ｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧを加えたもの）を用い、室温３７℃、二酸化炭素濃度５％のインキュベーターで培養した。ＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）が増殖し、１個のフラスコにて２千万個の細胞を調達した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に０．０２％ＥＤＴＡを加えた０．２５％トリプシン液８ｍｌを使用して、細胞をフラスコの表面から剥がし、さらに培養液Ａを４０ｍｌ加えたて撹拌した後、４℃、８００ｒｐｍ、７ｍｉｎで遠心分離器にかけ細胞を回収した。得られたＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）（３個のＴ２２５細胞培養フラスコ分、計６千万個）に培養液Ａ３０ｍｌを加え撹拌後、ローラーボトル（正式名：１７００ｃｍ² Expanded Surface Roller Bottle、コーニング社）に播種し、培養液Ａ５００ｍｌを加えて培養を行なった。４本のローラーボトルを、細胞製造ローラー装置（Cell preparation roller apparatus）（ベルコ（Bellco）社）を利用して、大量培養を施行した。細胞がコンフルエントになった状態で、アデノウイルスベクターＡｘＣＡＮＣｒｅを添加し、組み換え反応を起こした。ＡｘＣＡＮＣｒｅを添加４８時間後から５日間ゼオシン含有培地にて培養した後、同様にトリプシン処理して細胞を回収した。１本のローラーボトルから３億個、計４本で、１２億個の復帰細胞が入手できた。
【００７９】
岡山県美星町農協より購入したランドレースホワイト（Landrace White）種の雌性ブタ(５ｋｇ)１０頭を使用し、術前１２時間絶食とした。硫酸アトロピン（扶桑薬品工業株式会社製、大阪、日本）０．５ｍｇおよび動物用ケタラール（塩酸ケタミン）（三共株式会社製、東京、日本）３ｍｇを筋肉注射し、鎮静後、ドロレプタン（ドロペリドール）（三共株式会社製、東京、日本）１ｍｇ、ミオブロック（臭化パンクロニウム）（オルガノン社製、オランダ）２ｍｇを静脈内注射し、気管内挿管を行った。酸素、笑気、セボフルレンを使用し、人工呼吸器にて麻酔を維持し左外頸静脈を露出し、６Ｆｒアトムチューブ（アトムメディカル株式会社製、東京、日本）のカニュレーションを行った。そして、腹部正中切開にて開腹後、脾静脈から６Ｆｒアトムチューブ（アトムメディカル株式会社製、東京、日本）のカニュレーションを行い、先端を門脈本幹に留置した。先端が門脈本幹に位置していることを触診にて確認した。各々のアトムチューブの末端は、皮下トンネルを形成後、皮膚表面に縫合固定した。術前、術後にセパトレン（セファロスポリン系抗生物質）（住友製薬株式会社製、大阪、日本）０．５ｇを静脈内注射した。術後、完全に覚醒したのを確認し気管内チューブを抜去した。その後直ちに、左外頸静脈へ挿入されているアトムチューブから０．５ｇ／ｋｇのＤ−ガラクトサミン（シグマ社製）を生理食塩水５０ｍｌに溶解した後１０分かけて静注し、薬剤性肝障害を誘導した。
【００８０】
各アトムチューブは血栓形成を防止するため、ヘパリン１ｍｌ（１０００単位）にてロックした。Ｄ−ガラクトサミン投与１８時間後に、ローラーボトル培養にて調達した１０億個の復帰ＣＹＮＫ−１細胞をリンゲル液１００ｍｌに希釈して、脾静脈に挿入されている６Ｆｒアトムチューブから経門脈的に約３０分かけて移植した（移植群、ｎ＝５）。コントロール実験として、残りの５匹は細胞を移植しなかった（コントロール群、ｎ＝５）。
【００８１】
ブタの全身状態の把握のため、心電図、心拍数、動脈圧のモニタリングを行った。移植群では、移植時に一過性の門脈圧の上昇（２５ｃｍＨ₂０）を認めたが、ブタは肝細胞移植に耐えることが出来た。
【００８２】
結果を図１０に示す。コントロール群は全例肝不全にて死亡したが、復帰ＣＹＮＫ−１細胞移植群では５例中４例が１ヵ月以上生存し、統計学的に有意差を認めた。当該データは、復帰ＣＹＮＫ−１細胞の移植がヒト肝不全でも有効であることを示唆するものである。
【００８３】
実施例４
バイオ人工肝臓の作製
中空糸と不織布からなる全血還流型システムのバイオ人工肝臓（ＢＡＬ）（図５参照）を以下の手順に従い作製した。中空糸膜の種類により、表１に示すように、それぞれＢＡＬ−１〜ＢＡＬ−６とした。
【００８４】
【表１】

【００８５】
１０ｃｍの中空糸膜５５０本をレーヨンで裏打ちした不織布（１０×１０ｃｍ）の上に規則正しく置き（図５（ａ）参照）、これをロール状に巻き込んだ（図５（ｂ）参照）。断面の模式図を図５（ｃ）に示す。この不織布と中空糸膜からなるロールを、両端に液漏れ防止部材を設けた筒状容器に組み込んだ（図５（ｄ）参照）。こうして作製されたリアクターに可逆性不死化肝細胞ＣＹＮＫ−１（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）約１０億個をＣＳ−Ｃ無血清培地（CS-SF-4Z0-500、大日本製薬株式会社販売）１０ｍｌに懸濁して充填した。
【００８６】
なお、不織布としては、細胞接着性を有するポリアミノ酸ウレタン（PAU）加工のＰＴＦＥ（polytetrafluoroethylene）不織布（クラレメディカル株式会社製）を使用した。
【００８７】
得られたリアクターの生体適合性を判定するために、各リアクターをそれぞれ健常ブタの頚部動静脈間に装着して作動させたところ、２４時間循環動態に悪影響なく無事に稼働させることができた。また、赤血球・血小板などの血球成分の減少も認めなかった。
【００８８】
また、ＢＡＬ治療を安全かつ科学的に施行するために、１）ＢＡＬリアクターの流入圧と流出圧のリアルタイムでのモニタリング、２）気泡が発生した際のアラームの作動、３）リアクターの温暖化（37度）できる機能を一体化した装置を開発し、システムが良好に作動することをブタ実験にて検証した。
【００８９】
試験例４
バイオ人工肝臓の肝不全治療効果
施設動物実験取り扱い指針に従い、検疫済みのカニクイザル（日本クレアから購入）を用いて実施例４において作製したバイオ人工肝臓の安全性と有効性を検討した。
【００９０】
雄性カニクイザル（４ｋｇ、ｎ＝６）に、０．５ｇ／ｋｇのＤ−ガラクトサミン（シグマ社から購入）を静注して薬剤性肝障害を誘導した。
【００９１】
Ｄ−ガラクトサミン投与１８時間後に、全身麻酔下に治療群のサル（ｎ＝２）の左内頚動脈にアトム６Ｆｒのカテーテル（アトムメディカル株式会社、東京、日本）を挿入し、そして左外頚静脈にアトム６Ｆｒのカテーテルを挿入してその間に、実施例４で作製したリアクターＢＡＬ−１を接続した。ポンプにPERISTA BIO-MINIPUNP（ATTO、東京、日本）を用い、流量１０ｍｌ/分で６時間、体外循環させた。麻酔は、静脈麻酔として、デュプリバンを使用した（５ｍｌ/時間）。抗血栓療法として、血液がリアクターを通過する直前に、リアクターの中枢側よりヘパリン１０００単位を注入し、以後体外循環中はヘパリンの持続注入（ヘパリン５００単位/時間）により、全身ヘパリン化を行なった。
【００９２】
ポジティブ・コントロール群（ｎ＝２）として、ＣＹＮＫ−１細胞（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）の代わりに約１０億個の新鮮分離ブタ肝細胞（生存率＞９０％）を充填したリアクターにより、治療群と同様にして６時間のＢＡＬ治療を施行した。新鮮分離ブタ肝細胞は、外科的に切除した肝臓外側区域をディスパーゼとコラーゲナーゼを用いた４段階還流法にて分離した（丸山昌伸，小林直哉，都津川敏範ら、Organ Biology、Vol.9, No.3. 295-301, 2002）。
【００９３】
ネガティブ・コントロール群（ｎ＝２）として、細胞を充填していない空リアクターを用いて、同様の試験を行なった。
【００９４】
結果は、ネガティブ・コントロール群では、２例のサルはいずれもＤ−ガラクトサミン投与後１週間以内に肝不全で死亡した。剖検では、肝臓の出血壊死、著名な萎縮、黄疸性の胸・腹水の貯留を認め、組織学的にも肝細胞の広範な壊死を認めた。一方、約１０億個のブタ肝臓細胞を装填したポジティブ・コントロール群はいずれも３週間以上生存し、剖検所見でも一切の異常を認めなかった。
【００９５】
治療群では、２例とも３週間以上生存した。肝臓は肉眼的にも組織学的にも全く正常化していた。また、治療群では、フィシャー比（分岐鎖アミノ酸／芳香族アミノ酸の比）の改善を認めた。
【００９６】
治療後、リアクターを固定して細胞の付着の程度を走査電子顕微鏡下に観察した。細胞は不織布の繊維に良好に付着しており（図１１）、さらには数個の細胞からなる集塊が観察された。このような集塊は、細胞の分化機能の発揮に好ましい。一方、中空糸膜の表面には、細胞が一切付着しておらず（図１２）、中空糸膜を介した物質交換を鑑みると非常に好ましい所見を得た。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：アルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′ｐｒｉｍｅｒ
配列番号２：アルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′ｐｒｉｍｅｒ
配列番号３：ＡＳＧＰＲ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′ｐｒｉｍｅｒ
配列番号４：ＡＳＧＰＲ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′ｐｒｉｍｅｒ
配列番号５：ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′ｐｒｉｍｅｒ
配列番号６：ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′ｐｒｉｍｅｒ
配列番号７：ＧＳＴ−π遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′ｐｒｉｍｅｒ
配列番号８：ＧＳＴ−π遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′ｐｒｉｍｅｒ
配列番号９：ＧＳ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１０：ＧＳ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１１：ＨＢＣＦ−Ｘ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１２：ＨＢＣＦ−Ｘ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１３：ＳＶ４０Ｔ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１４：ＳＶ４０Ｔ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′ｐｒｉｍｅｒ

Claims

一対の部位特異的組換え配列に挟まれた不死化遺伝子を含有し、かつ該一対の部位特異的組換え配列外に自殺遺伝子を含有し、ウイルス由来のプロモーターを含有しない可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株であって、該一対の部位特異的組換え配列を切り出したのちに自殺遺伝子が作動し得ることを特徴とする可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株またはその継代株。
哺乳類がヒトである請求項１記載の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株またはその継代株。
可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株がＣＹＮＫ−１（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１６年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−０８６５７）である請求項１記載の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株またはその継代株。
請求項１記載の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株またはその継代株から不死化遺伝子を除去することにより得られる哺乳類肝臓細胞。
請求項１記載の可逆性不死化哺乳類細胞株もしくはその継代株または請求項４記載の哺乳類肝臓細胞を含有するバイオ人工肝臓。
請求項１記載の可逆性不死化哺乳類細胞株もしくはその継代株または請求項４記載の哺乳類肝臓細胞を有効成分として含有する細胞製剤。