JP4649954B2

JP4649954B2 - Albumin with enhanced antibacterial activity

Info

Publication number: JP4649954B2
Application number: JP2004318429A
Authority: JP
Inventors: 優樹小田切; 孝章赤池
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 2003-12-26
Filing date: 2004-11-01
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2024-11-01
Also published as: JP2005206577A

Description

本発明は、抗菌作用を有するニトロソ化されたアルブミンに関する。さらに詳細には、天然のアルブミンと同様の生物活性を有するアルブミン変異体をニトロソ化することにより、抗菌作用が増強されたアルブミンに関する。 The present invention relates to nitrosated albumin having antibacterial action. More specifically, the present invention relates to albumin whose antibacterial action is enhanced by nitrosating an albumin variant having the same biological activity as natural albumin.

一酸化窒素（ＮＯ）は、ガス状の無機ラジカルであり、生体内において細胞膜を自由に拡散し、細胞内、あるいは細胞間情報伝達因子として働いている。
現在までにＮＯの生理作用は幅広く研究され、血管機能の制御、神経伝達物質、炎症反応・免疫反応等の生体防御機能など多岐にわたっている。一方で、感染・炎症病態においては、ＮＯ由来の活性酸化窒素種によりタンパク質、核酸などの生体分子の酸化やニトロ化反応を介して細胞・組織障害の主たる要因となる。
最近では、このようなＮＯの種々の生理活性により、臨床で用いる薬剤として、様々なＮＯ供与剤が開発され使用されている。実際に、低分子のニトロソチオールであるＳ−ニトロソグルタチオン（以下、ＧＳ−ＮＯ）は、血小板凝集は阻害するが血圧は低下させないといった性質があることが知られており、経皮経管的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）の際の血小板凝集阻害剤として、また、妊娠女性の子癇前症の治療に応用されている Nitric oxide (NO) is a gaseous inorganic radical that freely diffuses in the cell membrane in the living body and functions as an intracellular or intercellular signal transduction factor.
To date, the physiological effects of NO have been extensively studied, and have a wide variety of functions such as control of blood vessel functions, neurotransmitters, and biological defense functions such as inflammatory and immune reactions. On the other hand, in infection / inflammatory pathologies, NO-derived active nitric oxide species are a major cause of cell / tissue damage through oxidation and nitration of biomolecules such as proteins and nucleic acids.
Recently, various NO donors have been developed and used as clinical drugs due to the various physiological activities of NO. Actually, S-nitrosoglutathione (hereinafter referred to as GS-NO), which is a low molecular weight nitrosothiol, is known to have the property of inhibiting platelet aggregation but not lowering blood pressure. It is used as an inhibitor of platelet aggregation during plastic surgery (PTCA) and in the treatment of preeclampsia in pregnant women

また、ＮＯ由来の活性酸化窒素種は抗菌性を有することも知られており、例えば、ＧＳ-ＮＯが抗菌作用を持つことが知られている。しかしながらＧＳ−ＮＯなど低分子のニトロソチオールの抗菌作用は数ｍＭという高濃度でしか認められず、血中半減期が短かかったり、ＮＯの放出と同時に生成する副産物が悪影響を与えたりして、ＮＯ供与剤としては未だ不十分な点や多くの問題点が残されている。 Moreover, it is also known that the NO-derived activated nitric oxide species has antibacterial properties, and for example, it is known that GS-NO has an antibacterial effect. However, the antibacterial action of low molecular weight nitrosothiol such as GS-NO is only observed at a high concentration of several mM, the blood half-life is short, or the by-product generated simultaneously with the release of NO has an adverse effect. There are still insufficient points and many problems as NO donors.

一方で、ニトロソ化された高分子についても報告されており、例えば、ニトロソ化されたヘモグロビン等のニトロソ化タンパク質について、Stamler J.S.ら(特許文献１及び２参照)はそれらの有用性について報告している。しかしながら、彼らの用いたタンパク質には複数のシステイン残基が存在するために、ニトロソ基の導入率が不均一であることが容易に予測される。また、ヘモグロビン自体が血管内皮細胞に対して障害的に働いたり、腎臓組織への鉄成分の沈着により、むしろ腎機能を低下させる等の問題が危惧される。 On the other hand, nitrosated macromolecules have also been reported. For example, regarding nitrosated proteins such as nitrosated hemoglobin, Stammer JS et al. (See Patent Documents 1 and 2) have reported on their usefulness. Yes. However, due to the presence of multiple cysteine residues in the proteins used, it is easily predicted that the rate of introduction of nitroso groups is non-uniform. In addition, there are concerns about problems such as hemoglobin itself acting in a damaging manner on vascular endothelial cells, or rather a decrease in renal function due to deposition of iron components in kidney tissue.

他のニトロソ化タンパク質として、ヒト血清中の主要なセリンプロテアーゼ阻害タンパクとして知られるα1-プロテアーゼインヒビター（以下、α1-PI）のニトロソ化体（以下、S-NO-α1-PI)についても報告されている（特許文献３、非特許文献１参照）。このS-NO-α1-PIでは、数μＭで抗菌効果が現れ、ＧＳ−ＮＯなどと比べて約1000倍と強力な抗菌作用を示すことが報告されている。 As another nitrosated protein, a nitrosated form (hereinafter referred to as S-NO-α1-PI) of α1-protease inhibitor (hereinafter referred to as α1-PI), which is known as a major serine protease inhibitor protein in human serum, has also been reported. (See Patent Document 3 and Non-Patent Document 1). It has been reported that this S-NO-α1-PI exhibits an antibacterial effect at several μM and exhibits a strong antibacterial action about 1000 times that of GS-NO.

一方、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、成人の血清中に存在する主要なタンパク質であり、肝臓で生産され、種々の血清分子を運搬する担体としての機能をもっている。また、アルブミンは、毛細管の細孔を通過し得ない溶質（コロイド）によって起こる血漿コロイド浸透圧を正常に維持し、血中の液体含量を維持する上で重要な働きをする。従って、アルブミンは、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす低タンパク血症の場合の投与のように、血管からの液体の損失があるような状態を処置する際の様々な治療に用いられている。 On the other hand, human serum albumin (HSA) is a major protein present in the serum of adults, is produced in the liver, and functions as a carrier for transporting various serum molecules. In addition, albumin plays an important role in maintaining normal plasma colloid osmotic pressure caused by a solute (colloid) that cannot pass through the pores of capillaries and maintaining the fluid content in blood. Thus, albumin is used in a variety of therapies in treating conditions where there is a loss of fluid from blood vessels, such as administration in the case of surgery, shock, burns, hypoproteinemias that cause edema. Yes.

Stamlerらは、ヒトの血漿中にμＭオーダーのニトロソ化アルブミンを見出し、また、血中のヘモグロビンのシステイン残基がニトロソ化されていることを報告した。これらの結果から、生体内タンパク質のニトロソ化はＮＯの輸送や貯蔵に関与し、ＮＯの生理作用を制御していると考えられている（非特許文献２および３参照）。
従って、血清タンパクの中で最も多量に存在し、生体内で重要な役割を担っているアルブミンのニトロソ化体は有用性が高く、安定なニトロソ化アルブミンが提供できれば医療の現場において重要な意義を有する。しかしながら、このアルブミンのＳＨ基の反応性はα1-PI等と比べて著しく低く、これまでアルブミンのニトロソ化を人工的に効率良く行うことはできなかった。 Stamler et al. Found nitrosated albumin on the order of μM in human plasma and reported that the cysteine residue of hemoglobin in blood was nitrosated. From these results, it is considered that nitrosation of in vivo proteins is involved in the transport and storage of NO and controls the physiological action of NO (see Non-Patent Documents 2 and 3).
Therefore, the nitrosated form of albumin, which is the most abundant serum protein and plays an important role in the living body, is highly useful, and if stable nitrosated albumin can be provided, it has important significance in the medical field. Have. However, the reactivity of the SH group of albumin is significantly lower than that of α1-PI and the like, and so far, nitrosation of albumin has not been able to be performed artificially and efficiently.

国際公開第９６/３０００６号パンフレットInternational Publication No. 96/30006 Pamphlet 国際公開第９７/１０２６５号パンフレットWO 97/10265 pamphlet 特開平１１−１４７８３８号公報Japanese Patent Laid-Open No. 11-147838 Y. Miyamoto, T. Akaike, H. Maeda, Biochimica Biophysica Acta, 1477, p.90-97, (2000)Y. Miyamoto, T. Akaike, H. Maeda, Biochimica Biophysica Acta, 1477, p.90-97, (2000) Stamler J.S. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89, p.7674-7677,(1992)Stamler J.S. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89, p.7674-7677, (1992) Lia J et al., Nature, 380, p.221-226, (1996)Lia J et al., Nature, 380, p.221-226, (1996)

アルブミンを効率よくニトロソ化することによって、十分な抗菌性を有し、種々の有用な薬剤組成物として利用できるアルブミンの提供が望まれていた。 It has been desired to provide albumin that has sufficient antibacterial properties and can be used as various useful pharmaceutical compositions by efficiently nitrating albumin.

本発明者らは、上記課題を解決するために、構成アミノ酸配列のうち１つ以上のアミノ酸残基に変異を有するアルブミン変異体を用いて、ニトロソ化の効率、およびその抗菌活性を種々の細菌感染モデル動物を用いて解析した結果、該アルブミン変異体が効率的にニトロソ化され、そのニトロソ化体が、ＮＯや低分子のニトロソチオールに比べて、より強力な抗菌活性を示すことを見出し、本発明に到達した。 In order to solve the above problems, the present inventors have used various mutants of nitrosation efficiency and antibacterial activity using albumin mutants having mutations in one or more amino acid residues of the constituent amino acid sequences. As a result of analysis using an infection model animal, the albumin variant was efficiently nitrosated, and the nitrosated product was found to exhibit stronger antibacterial activity than NO and low-molecular nitrosothiol, The present invention has been reached.

すなわち、本発明は、
（１）構成アミノ酸配列のうち１つ以上のアミノ酸残基が置換されるか、あるいは構成アミノ酸配列の一部に他のアミノ酸残基が挿入され、かつニトロソ化されたことを特徴とするアルブミン変異体、
（２）構成アミノ酸配列のうち１つ以上のアミノ酸残基が硫黄含有アミノ酸残基で置換された、上記（１）記載のアルブミン変異体、
（３）構成アミノ酸配列のアルギニン残基が硫黄含有アミノ酸残基で置換された、上記（１）記載のアルブミン変異体、
（４）アルブミン変異体が、構成アミノ酸配列の約４１０位のアルギニン残基がシステイン残基で置換された、上記（１）記載のアルブミン変異体、
（５）置換または挿入されたアミノ酸残基数が約１〜１０残基である、上記（１）記載のアルブミン変異体、
（６）アルブミン変異体が、ヒト血清アルブミンの変異体である、上記（１）記載のアルブミン変異体、
（７）アルブミン変異体が、遺伝子組み換え技術により製造された、上記（１）記載のアルブミン変異体、
（８）アルブミン変異体が天然アルブミンと同様の生理活性を有する、上記（１）記載のアルブミン変異体、
（９）抗菌活性を有するニトロソ化されたアルブミン変異体、
（１０）上記（１）〜（９）のいずれかに記載のアルブミン変異体を含む薬剤、及び
（１１）上記（１）〜（９）のいずれかに記載のアルブミン変異体を含む一酸化窒素供与剤
に関する。 That is, the present invention
(1) Albumin mutation characterized by substitution of one or more amino acid residues in a constituent amino acid sequence, or insertion of another amino acid residue into a part of the constituent amino acid sequence and nitrosation body,
(2) The albumin variant according to (1) above, wherein one or more amino acid residues in the constituent amino acid sequences are substituted with sulfur-containing amino acid residues,
(3) The albumin variant according to (1) above, wherein an arginine residue in the constituent amino acid sequence is substituted with a sulfur-containing amino acid residue,
(4) The albumin variant according to (1) above, wherein the arginine residue at about position 410 of the constituent amino acid sequence is substituted with a cysteine residue,
(5) The albumin variant according to (1) above, wherein the number of substituted or inserted amino acid residues is about 1 to 10 residues,
(6) The albumin variant according to (1) above, wherein the albumin variant is a variant of human serum albumin,
(7) The albumin variant according to (1) above, wherein the albumin variant is produced by a gene recombination technique,
(8) The albumin variant according to (1), wherein the albumin variant has the same physiological activity as natural albumin,
(9) a nitrosated albumin variant having antibacterial activity,
(10) A drug containing the albumin variant according to any one of (1) to (9) above, and (11) nitric oxide containing the albumin variant according to any one of (1) to (9) above Concerning donors.

本発明のニトロソ化アルブミン変異体は、従来の抗菌剤よりも低い濃度で、抗菌活性を示すため、わずかなニトロソ化アルブミン変異体を含有する薬剤組成物を投与するだけで、生体内で有効な抗菌活性を発揮することができる。
また、本発明のニトロソ化アルブミン変異体はＮＯ (ニトロソ)ドナーとして、医薬品の一成分として用いることもできる。
さらに、本発明のニトロソ化アルブミン変異体は、ニトロソ基が凍結乾燥後も安定に存在することから、凍結乾燥による保存が可能である。
さらに、本発明のニトロソ化アルブミン変異体は、ニトロソ化するアルブミン変異体を遺伝子組み換え技術を用いて製造することにより、ウィルス等の感染の恐れがなく、安全に使用することができる。 Since the nitrosated albumin variant of the present invention exhibits antibacterial activity at a lower concentration than conventional antibacterial agents, it is effective in vivo only by administering a pharmaceutical composition containing a small amount of nitrosated albumin variant. It can exhibit antibacterial activity.
The nitrosated albumin variant of the present invention can also be used as a NO (nitroso) donor and as a component of a pharmaceutical product.
Furthermore, the nitrosated albumin variant of the present invention can be stored by lyophilization because the nitroso group is stably present after lyophilization.
Furthermore, the nitrosated albumin variant of the present invention can be safely used without the risk of infection by viruses, etc., by producing the nitrosated albumin variant using a gene recombination technique.

本発明において、ニトロソ化とは、ニトロソ基（−ＮＯ）が付加されることである。アルブミン変異体のニトロソ化は、アルブミン変異体中のチオール基へニトロソ基が付加されることが好ましく、亜硝酸塩と反応させる等の公知の方法によって達成することができる。しかし、ヘモグロビンのようにタンパク質のニトロソ化に成功している例もあるが、一般的には、タンパク質にとってニトロソ化は厳しい条件での反応である。従って、より穏和な条件でのチオール基へのＮＯの導入が可能な方法を用いることが好ましく、イソアミルナイトライトを用いた方法（De Master E.G. et al., Biochemistry, 34, p.11494-11499, 1995）やｎ−ブチルナイトライトと反応させる方法（Meyer D.J. et al., FEBS Letters, 345, p.177-180, 1994）を好適に使用することができる。 In the present invention, nitrosation is the addition of a nitroso group (—NO). Nitrosation of an albumin variant is preferably achieved by adding a nitroso group to a thiol group in the albumin variant, and can be achieved by a known method such as reacting with nitrite. However, there are examples of successful nitrosation of proteins such as hemoglobin, but in general, nitrosation is a reaction under severe conditions for proteins. Therefore, it is preferable to use a method capable of introducing NO into a thiol group under milder conditions, and a method using isoamyl nitrite (De Master EG et al., Biochemistry, 34, p.11494-11499, 1995) and a method of reacting with n-butyl nitrite (Meyer DJ et al., FEBS Letters, 345, p. 177-180, 1994) can be preferably used.

本発明のアルブミン変異体は、構成アミノ酸配列のうち１つ以上のアミノ酸残基が置換または挿入されたアルブミンである。好ましいアルブミン変異体は、構成アミノ酸配列のうち、一つ以上のアミノ酸残基が硫黄含有アミノ酸残基に変換された変異体である。硫黄含有アミノ酸残基としては、システイン残基、シスチン残基およびメチオニン残基が挙げられ、特にシステイン残基が好ましい。また、構成アミノ酸配列のアルギニン残基が硫黄含有アミノ酸残基で置換されたアルブミン変異体が好ましく、さらに、構成アミノ酸配列の約４１０位のアルギニン残基が硫黄含有アミノ酸残基で置換されたアルブミン変異体が好ましい。本発明のアルブミン変異体としては、ヒトでの変異体の生存が確認されている、構成アミノ酸配列の約４１０位のアルギニン残基をシステイン残基に変異させたアルブミン変異体（以下、ＨＳＡ-R410C)を好適に用いることができる。
本発明のアルブミン変異体において、置換または挿入されたアミノ酸残基数は約１〜１０残基が好ましく、さらに好ましくは約１〜５残基である。 The albumin variant of the present invention is albumin in which one or more amino acid residues are substituted or inserted in the constituent amino acid sequences. A preferred albumin variant is a variant in which one or more amino acid residues are converted to sulfur-containing amino acid residues in the constituent amino acid sequences. Sulfur-containing amino acid residues include cysteine residues, cystine residues and methionine residues, with cysteine residues being particularly preferred. Further, an albumin variant in which the arginine residue of the constituent amino acid sequence is substituted with a sulfur-containing amino acid residue is preferred, and an albumin variant in which the arginine residue at about position 410 of the constituent amino acid sequence is substituted with a sulfur-containing amino acid residue The body is preferred. As the albumin variant of the present invention, an albumin variant (hereinafter referred to as HSA-R410C) in which the arginine residue at about position 410 of the constituent amino acid sequence has been mutated to a cysteine residue has been confirmed to survive in humans. ) Can be suitably used.
In the variant of albumin of the present invention, the number of substituted or inserted amino acid residues is preferably about 1 to 10 residues, more preferably about 1 to 5 residues.

ＨＳＡの完全なタンパク質配列は既に公表されているが（特許文献特開平８−２２８７９０等参照）、これまで発表されているＨＳＡのタンパク質配列は、約２０残基が一致しておらず、成熟タンパク質のアミノ酸総数も異なった複数のものがある。上記のアルブミン変異体であるＨＳＡ-R410Cもこれらの一種として天然にわずかに存在する。本発明においては、このように天然にわずかに存在するアルブミンであっても、天然に最も多く存在するアルブミン（本発明ではこれを天然アルブミンと呼んでいる）以外はアルブミン変異体に含まれる。また、本発明の１例として用いられるＨＳＡ-R410Cは、アミノ酸残基変異位置（Arg→Cys）は、アミノ酸総数の違いによって４１０位から１位以上ずれる場合もある。 Although the complete protein sequence of HSA has already been published (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-228790, etc.), the protein sequence of HSA that has been published so far does not match about 20 residues, and is a mature protein There are several different amino acid numbers. HSA-R410C, which is the above-described albumin variant, is also present in nature as a kind of these. In the present invention, even albumin slightly present in nature is included in the albumin variant except albumin that is most abundant in nature (in the present invention, this is called natural albumin). In addition, the amino acid residue mutation position (Arg → Cys) of HSA-R410C used as an example of the present invention may deviate from 410 to 1 or more depending on the total number of amino acids.

本発明のアルブミン変異体は、ヒト血清アルブミンの変異体であることが好ましく、また、遺伝子組み換えアルブミンであることが好ましい。全血の分画によって生産された血清アルブミンは、合理的な価格で多量に得ることはできないが、遺伝子組換え技術を応用し、アルブミンを効率よく生産するように遺伝子操作した微生物を使えば、上記アルブミン変異体等も豊富に生産することが可能である。ＨＳＡの完全なタンパク質配列は既に公表されており（特許文献特開平８−２２８７９０等参照）、本発明のアルブミン変異体は、種々公知の遺伝子組換え技術を応用した方法等により製造することができる。 The albumin variant of the present invention is preferably a variant of human serum albumin, and is preferably a recombinant albumin. Serum albumin produced by fractionation of whole blood cannot be obtained in large quantities at a reasonable price, but if genetically engineered microorganisms are used to efficiently produce albumin by applying genetic recombination technology, The above albumin mutants can also be produced in abundance. The complete protein sequence of HSA has already been published (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-228790, etc.), and the albumin variant of the present invention can be produced by methods using various known gene recombination techniques. .

また、本発明のアルブミン変異体は、天然アルブミンと同様の生理活性を有することが好ましい。天然アルブミンと同様の生理活性とは、生体内で拒絶反応等を惹起せず、血流中で正常な浸透圧を維持する役目を果たし、また種々の血清分子を運搬する担体としての機能等の天然アルブミンと実質的に同じ機能を有することである。 The albumin variant of the present invention preferably has the same physiological activity as natural albumin. The physiological activity similar to that of natural albumin does not cause rejection in vivo, functions to maintain normal osmotic pressure in the bloodstream, and functions as a carrier for transporting various serum molecules. It has substantially the same function as natural albumin.

α1-PI の活性中心であるメチオニン（Met）を化学的に酸化したα1-PI（以下、α1-PIox）を、さらにＳ−ニトロソ化したα1-PIoxのＳ−ニトロソ化体（以下、S-NO-α1-PIox）について、そのin vitroにおけるネズミチフス菌 (Salmonella typhimurium)の増殖阻害活性を検討したところ、その抗菌活性はS-NO-α1-PIの約100倍強力で、数十ｎＭで菌の増殖を阻害することが報告されている（特許文献３、非特許文献１参照）。これは、感染局所で産生されるS-NO-α1-PIが、NOと同時に産生される活性酸素種により酸化 (Metの酸化)されることで、その活性体の抗菌活性がさらに増強される可能性を示しており、本発明においても、ニトロソ化の前段階でアルブミン変異体のメチオニン（Met）残基等を酸化しておくことによって、さらに抗菌活性が増強されると考えられる。 α1-PI (hereinafter referred to as α1-PIox) obtained by chemically oxidizing methionine (Met), which is the active center of α1-PI, and S-nitrosated form of α1-PIox (hereinafter referred to as S-nitrosated). NO-α1-PIox) was examined for its growth inhibitory activity against Salmonella typhimurium in vitro. Its antibacterial activity was about 100 times stronger than S-NO-α1-PI, and the bacterium was tens of nM. It has been reported to inhibit the growth of the cells (see Patent Document 3 and Non-Patent Document 1). This is because S-NO-α1-PI produced locally is oxidized by reactive oxygen species produced simultaneously with NO (oxidation of Met), thereby further enhancing the antibacterial activity of the active form. In the present invention, it is considered that the antibacterial activity is further enhanced by oxidizing the methionine (Met) residue and the like of the albumin mutant before the nitrosation.

本発明のアルブミン変異体を含む一酸化窒素供与剤は、それらを主要構成成分とする抗菌剤、血管循環不全改善剤、抗血小板剤、虚血・再潅流障害抑制剤等として使用することができる。 The nitric oxide donor comprising the albumin variant of the present invention can be used as an antibacterial agent comprising them as a main constituent, an agent for improving vascular circulatory failure, an antiplatelet agent, an ischemia / reperfusion disorder inhibitor, etc. .

以下に、実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples.

ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡ）のアミノ酸配列で410番目のアルギニン（Arg）がシステイン（Cys）に変異したＨＳＡ変異体 (以下、ＨＳＡ-R410C)の組み換えタンパクを作製し、変異体の10倍モル量の1,4-dithiothreitol（以下、ＤＴＴ）を加え、37℃、５分間反応させ、ＨＳＡ中に存在する遊離型Cys残基のＳＨ基の還元を行った。ＤＴＴ処理によるＨＳＡのＳＨ基還元を確認するため、ＨＳＡとＤＴＴ等の不純物を分離した後、5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid（ＤＴＮＢ）法を用い、ＳＨ基の定量を行い、全ての遊離型Cys残基のＳＨ基が還元されていることを確認した。次に、ＤＴＴ処理ＨＳＡの100倍量の0.1M 硝酸イソアミルを加え、37℃で１時間反応させニトロソ化し、ニトロソ化ＨＳＡ（S-NO-ＨＳＡ）を得た。 A recombinant protein of HSA mutant (hereinafter referred to as HSA-R410C) in which the 410th arginine (Arg) is mutated to cysteine (Cys) in the amino acid sequence of human serum albumin (hereinafter referred to as HSA) is prepared. An amount of 1,4-dithiothreitol (hereinafter referred to as DTT) was added and reacted at 37 ° C. for 5 minutes to reduce SH groups of free Cys residues present in HSA. In order to confirm the SH group reduction of HSA by DTT treatment, after separating impurities such as HSA and DTT, the SH group was quantified using the 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) method. It was confirmed that the SH group of the free Cys residue was reduced. Next, 0.1M isoamyl nitrate, 100 times the amount of DTT-treated HSA, was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour to nitrosate to obtain nitrosated HSA (S-NO-HSA).

（比較例１）
native ＨＳＡ（以下、ｎＨＳＡ）を用いて、実施例１と同様の反応を行い、ニトロソ化ＨＳＡ（S-NO-ｎＨＳＡ）を得た。 (Comparative Example 1)
Using native HSA (hereinafter, nHSA), the same reaction as in Example 1 was performed to obtain nitrosated HSA (S-NO-nHSA).

（比較例２）
α1-protease inhibitor（α1-PI）を用いて、実施例１と同様の反応を行い、ニトロソ化α1-PI（S-NO-α1-PI）を得た。 (Comparative Example 2)
Using α1-protease inhibitor (α1-PI), the same reaction as in Example 1 was performed to obtain nitrosated α1-PI (S-NO-α1-PI).

（試験例１）ＨＰＬＣによるＳ−ニトロソ化タンパクのＮＯ付加率の定量
ニトロソ化タンパクのＮＯ付加率の定量は、Akaikeら（T. Akaike, et al., J. Biochemistry, 122, 459-466, 1997）の方法により行った。すなわち、図１に示すＨＰＬＣによって分離した実施例１、比較例２及び比較例３で得られた各種Ｓ−ニトロソ化タンパクに溶出回路中で、Ｈｇ²⁺を加えてＮＯ₂ ^-とし、更に、Griess試薬を混和し、flow reactorを構築し、ＮＯ₂ ^-とGriess試薬との反応生成物であるアゾ色素を540nmで測定することにより、各種Ｓ−ニトロソ化タンパクを分離・定量した。 (Test Example 1) Quantification of NO addition rate of S-nitrosated protein by HPLC The quantification of NO addition rate of nitrosated protein was determined by Akaike et al. (T. Akaike, et al., J. Biochemistry, 122, 459-466, 1997). That is, Hg ²⁺ was added to NO ₂ ⁻ by adding Hg ²⁺ to various S-nitrosated proteins obtained in Example 1, Comparative Example 2 and Comparative Example 3 separated by HPLC shown in FIG. Griess reagent was mixed, a flow reactor was constructed, and azo dye, which is a reaction product of NO ₂ ^- and Griess reagent, was measured at 540 nm to separate and quantify various S-nitrosated proteins.

S-NO-proteinのＮＯ付加率をＨＰＬＣで測定した結果を表１に示す。
比較例２（S-NO-a1-PI）はＮＯ導入効率が約1.0 (mol/分子)であるのに対し、比較例１（S-NO-ｎＨＳＡ）では約0.3 (mol/分子)と極めて低かった。
これに対して、実施例１（S-NO-ＨＳＡ-R410C）のＮＯ導入効率は、約1.30 (mol/分子)と効率良くニトロソ化することが確認された。 The results of measuring the NO addition rate of S-NO-protein by HPLC are shown in Table 1.
Comparative Example 2 (S-NO-a1-PI) has an NO introduction efficiency of about 1.0 (mol / molecule), whereas Comparative Example 1 (S-NO-nHSA) has an extremely high value of about 0.3 (mol / molecule). It was low.
In contrast, it was confirmed that the NO introduction efficiency of Example 1 (S-NO-HSA-R410C) was efficiently nitrosated to about 1.30 (mol / molecule).

（表１）各種Ｓ−ニトロソ化タンパクのＮＯ付加率

(Table 1) NO addition rate of various S-nitrosated proteins

（試験例２）
凍結乾燥前後でのＳ−ニトロソ化タンパクのニトロソ基残存率を測定した。
実施例１、比較例２及び比較例３で得られた各種Ｓ−ニトロソ化タンパクを、１ｍＭ diethilenetriamine pentaacetic acid（DTPA）を添加したリン酸緩衝液（ｐＨ7.4）に溶かし、ＨＰＬＣによりニトロソ基の残存量を測定し，そのpeak area を０時間のニトロソ基残存量として100%とし、経時的にニトロソ基を定量することにより残存量を評価した。また、同様に、凍結乾燥前後のニトロソ基量をＨＰＬＣで測定し、凍結乾燥前のピーク面積値を100％とし残存ニトロソ基量の評価を行った。結果を図２に示す。 (Test Example 2)
The residual ratio of nitroso group of S-nitrosated protein before and after lyophilization was measured.
Various S-nitrosated proteins obtained in Example 1, Comparative Example 2 and Comparative Example 3 were dissolved in a phosphate buffer (pH 7.4) to which 1 mM diethilenetriamine pentaacetic acid (DTPA) was added, and the nitroso group was analyzed by HPLC. The residual amount was measured, the peak area was taken as 100% as the residual amount of nitroso group for 0 hours, and the residual amount was evaluated by quantifying the nitroso group over time. Similarly, the amount of nitroso groups before and after lyophilization was measured by HPLC, and the amount of residual nitroso groups was evaluated with the peak area value before lyophilization being 100%. The results are shown in FIG.

その結果、実施例１、比較例１及び比較例２で得られた各種Ｓ−ニトロソ化合物は、いずれも凍結乾燥前に対して凍結乾燥後に80 %以上の高いニトロソ基の残存率を示した。
また、データには示していないが、溶液中におけるS-NO-protein の安定性を検討したところ、いずれのS-NO-proteinも半減期が20日前後と非常に安定であることが確認された。 As a result, the various S-nitroso compounds obtained in Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 all showed a high nitroso group residual rate of 80% or more after lyophilization compared to before lyophilization.
Although not shown in the data, the stability of S-NO-protein in solution was examined, and it was confirmed that all S-NO-proteins were very stable with a half-life of around 20 days. It was.

（試験例３）
Salmonella typhimurium LT2株を用いて、各種Ｓ−ニトロソ化合物の活性を比較した。
Salmonella typhimurium LT2株を、20重量％のグルコースを添加した M9培地（Na₂HPO₄ 64g、KH₂PO₄ 15g、NaCl 2.5g、NH₄Cl 5g ／1L）で、１晩培養したものをM9で３回洗浄し、M9培地中で、菌数を2×10⁶ cfu/mLに調整した。この培地に実施例１、比較例１または比較例２で得られた各種Ｓ−ニトロソ化タンパクや、比較例として一酸化窒素（ＮＯ）またはＳ−ニトロソグルタチオン（GS-NO）を加え、37℃で９時間反応後、波長655nmにおける吸光度を測定し、無添加のコントロール群の吸光度を100％としたときの比率を増殖率(％)として算出した。 (Test Example 3)
Using Salmonella typhimurium LT2 strain, the activities of various S-nitroso compounds were compared.
Salmonella typhimurium LT2 strain cultured in M9 medium (Na ₂ HPO ₄ 64g, KH ₂ PO ₄ 15g, NaCl 2.5g, NH ₄ Cl 5g / 1L) supplemented with 20% glucose by weight in M9 After washing 3 times, the number of bacteria was adjusted to 2 × 10 ⁶ cfu / mL in M9 medium. To this medium, various S-nitrosated proteins obtained in Example 1, Comparative Example 1 or Comparative Example 2, and nitric oxide (NO) or S-nitrosoglutathione (GS-NO) as a comparative example were added, and 37 ° C. After 9 hours of reaction, the absorbance at a wavelength of 655 nm was measured, and the ratio when the absorbance of the control group without addition was taken as 100% was calculated as the growth rate (%).

その結果を図３に示す。実施例１は、ＮＯや低分子のGS-NOと比較して強力な抗菌活性を示し、さらに比較例１および比較例２と比べても優位な抗菌活性を示した。
従って、本発明のＳ−ニトロソ化された血清タンパクが、ＮＯや低分子のGS-NO等と比較し、より強力な抗菌活性を有することが示された。 The result is shown in FIG. Example 1 showed strong antibacterial activity as compared with NO and low molecular weight GS-NO, and also showed superior antibacterial activity as compared with Comparative Example 1 and Comparative Example 2.
Therefore, it was shown that the S-nitrosated serum protein of the present invention has stronger antibacterial activity than NO, low molecular weight GS-NO, and the like.

ＨＰＬＣによるＳ−ニトロソ化タンパクのＮＯ付加率定量法の説明図である。It is explanatory drawing of the NO addition rate determination method of S-nitrosated protein by HPLC. 凍結前後でのＳ−ニトロソ化タンパクのニトロソ基残存率を示す図である。It is a figure which shows the nitroso group residual rate of S-nitrosated protein before and behind freezing. 各種Ｓ−ニトロソ化タンパクの抗菌活性を示す図である。It is a figure which shows the antibacterial activity of various S-nitrosated protein.

Claims

A variant of human serum albumin, wherein the arginine residue at position 410 of the constituent amino acid sequence is substituted with a cysteine residue and nitrosated.

The human serum albumin variant according to claim 1, wherein the human serum albumin variant was produced by a genetic recombination technique.

The variant of human serum albumin according to claim 1, wherein the albumin variant has the same physiological activity as natural albumin.

The antibacterial agent containing the human serum albumin variant in any one of Claims 1-3.