JP4664516B2

JP4664516B2 - Detection method of Mycoplasma genitalium

Info

Publication number: JP4664516B2
Application number: JP2001092994A
Authority: JP
Inventors: 博昭石古; 隆史吉田
Original assignee: Mitsubishi Chemical Medience Corp
Current assignee: LSI Medience Corp
Priority date: 2001-03-28
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2021-03-28
Also published as: JP2002281980A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイコプラズマ・ジェニタリウム(M. genitalium)の細菌の検出方法及びその方法のためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
M. genitalimは、非淋菌性尿道炎（NGU)患者から初めて分離され、チンパンジーを用いた接種実験では、尿道炎症状が惹起され、尿道分泌物中の多核白血球の増加が認められ、抗体価も有意に上昇したことから、ヒトにおけるNGUの起炎菌である可能性が示唆されている。しかしながら、臨床検体からの培養法による検出が極めて困難なため、最近まで尿路性器感染症におけるその病原的意義は必ずしも明確にはされていなかった。
【０００３】
PCR法と遺伝子系統解析によるマイコプラズマ属およびウレアプラズマ属の検出および同定法の開発により、クラミジア陰性NGU患者の約20%の尿中からM. genitalimが検出されている（日本性感染症学会第１３回学術大会(平成12年12月2〜3日)において発表）。また、治療による尿道炎症状の推移をM. genitaliumの検出結果とあわせてみると、M. genitalium陽性NGUでは、キノロン系抗生物質の２週間投与により症状および尿道スメアの白血球数が一旦正常化した例でも、M. genitaliumは陰性化せず、その後４週間以内に症状が再発する症例が散見されている（日本性感染症学会第１３回学術大会(平成12年12月2〜3日)において発表）。これらのことから、M. genitaliumの尿路性器感染症における病原的意義は明確にされつつある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
尿道炎患者の尿中M. genitaliumの定量的な検出が容易になれば、治療によるM. genitaliumの消長が詳細にモニタリングでき、その結果得られる消長と臨床症状との相関は病原的意義の更なる解明につながることが期待される。
【０００５】
従って、本発明は、試料中のM. genitaliumの迅速で特異的な定量ができるM. genitaliumの検出方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、M. genitaliumのＤＮＡにおける特定の塩基配列に基づいて作成されたプローブとプライマー対とを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、上記課題が解決されることを見い出し、本発明を完成した。
従って、本発明は、以下のものを提供する。
【０００７】
（１）試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて、プローブを用いるリアルタイムＰＣＲを行うことを含む、M. genitaliumの検出方法であって、リアルタイムＰＣＲで用いられるプローブが、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号610〜664または792〜869に相当する領域の塩基配列に基づいて設定され、リアルタイムＰＣＲで用いられるプライマー対が、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定され、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定されている方法。
【０００８】
（２）プライマー対が、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜547、610〜664、792〜869及び1012〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定される（１）記載の方法。
【０００９】
（３）プローブが配列番号５または６に示す塩基配列を有する（１）または（２）記載の方法。
【００１０】
（４）プライマー対が、配列番号４に示す塩基配列を有するもの及び配列番号７に示す塩基配列を示すものからなる（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００１１】
（５）試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて、プローブを用いるリアルタイムＰＣＲを行うことによるM. genitaliumの検出用のキットであって、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号610〜664または792〜869に相当する領域の塩基配列に基づいて設定されたプローブ、及び、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定され、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定されたプライマー対を含むキット。
【００１２】
（６）プライマー対が、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜547、610〜664、792〜869及び1012〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定されたものである（５）記載のキット。
【００１３】
（７）プローブが配列番号５または６に示す塩基配列を有する（５）または（６）記載のキット。
【００１４】
（８）プライマー対が、配列番号４に示す塩基配列を有するもの及び配列番号７に示す塩基配列を示すものからなる（５）〜（７）のいずれかに記載のキット。
【００１５】
なお、配列番号１に示す塩基配列は、Mycoplasma genitalim標準株の16S rRNA遺伝子の塩基配列（GenBank accession No. X77334）であり、当業者であれば、16S rRNA遺伝子に変異を有する株であっても、個体間等に存在し得る塩基配列の相違を考慮して、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号により特定された領域に相当する領域を容易に特定・認識することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明検出方法
本発明検出方法は、マイコプラズマ・ジェニタリウム(M. genitalium)を迅速かつ特異的に検出することを可能にする方法であり、試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて、プローブを用いるリアルタイムＰＣＲを行うことを含み、リアルタイムＰＣＲで用いられるプローブが、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号610〜664または792〜869に相当する領域の塩基配列に基づいて設定され、リアルタイムＰＣＲで用いられるプライマー対が、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定され、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定されていることを特徴とする。
【００１７】
試料は、M. genitaliumを含むか又は含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例としては、尿、尿道擦過物、子宮頚管擦過物などの尿路性器系材料を挙げることができる。これらの試料から、ＤＮＡの調製のための通常の方法によりＤＮＡを得ることができる。
【００１８】
本発明検出方法におけるリアルタイムＰＣＲは、試料から得られるＤＮＡを鋳型とし、特定のプローブ及びプライマー対を使用する他は、通常の、プローブを用いるリアルタイムＰＣＲの方法に従って行うことができる。プローブを用いるリアルタイムＰＣＲでは、一般に、増幅される領域の塩基配列の一部とアニールする、標識を付したプローブが使用され、ＰＣＲの伸長反応の際にポリメラーゼの5'エキソヌクレアーゼ活性により遊離する標識を検出することにより、目的の増幅産物が検出される（Christian A. Heid et al., Rear Time Quantitative PCR, GENOME RESEARCH, 6: 986-994）。標識の例としては、プローブの5'末端にリポーター蛍光色素、3'末端にクエンチャー蛍光色素を結合させることが挙げられる（Livak, k. J. et al., PCR Methods and Applications, 4: 357-362 (1995)）。リアルタイムＰＣＲにおけるＰＣＲの条件は、当業者であれば適宜最適化することができる。
【００１９】
本発明において用いられるプローブは、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号610〜664または792〜869に相当する領域（以下、便宜のため、それぞれＡ領域及びＢ領域ともいう）の塩基配列に基づいて設定される。Ａ領域及びＢ領域の塩基配列は、M. genitaliumに特異的なものであり、M. genitaliumに特異的なプローブを設計可能な領域である。本発明者らは、PCR法と遺伝子系統解析によるマイコプラズマ属およびウレアプラズマ属の同定法により17症例で、M. genitaliumを検出しており、うち12症例ではM. genitalium標準株G-37と同一の塩基配列を持つものが検出され、残り５症例では標準株と異なる塩基配列を持つものが検出されているが、上記Ａ領域及びＢ領域は、これら検出された全てのM. genitaliumの株で塩基配列が共通し、かつ、マイコプラズマ属およびウレアプラズマ属の、M. genitalium以外の菌種とは異なる塩基を含むことを確認している。
【００２０】
プローブは、通常には、この二つの領域のいずれかにおいて設定される。プローブの長さは通常には15〜35塩基である。プローブの具体例としては、配列番号５に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号819〜841に相当）またはその相補的塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号６に示す塩基配列に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号620〜654に相当）またはその相補的塩基配列を有するプローブが挙げられる。
【００２１】
本発明において用いられるプライマー対は、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定され、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定される。
【００２２】
プライマー対は、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜547、610〜664、792〜869及び1012〜1051に相当する領域（以下、便宜のため、それぞれ、Ｐ１領域、Ａ領域、Ｂ領域、Ｐ２領域ともいう）において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定されたものであることが好ましい。プライマーの長さは、通常には、15〜30塩基である。プライマーの具体例としては、配列番号４に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号520〜545に相当）またはその相補的塩基配列を有するプライマー、配列番号６に示す塩基配列に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号620〜654に相当）またはその相補的塩基配列を有するプライマー、配列番号５に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号819〜841に相当）またはその相補的塩基配列を有するプライマー、及び、配列番号７に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号1036〜1012に相当）またはその相補的塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【００２３】
プライマー対は、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように、すなわち、プローブの塩基配列の両側に位置し、かつ、一方がセンスプライマーとなり他方がアンチセンスプライマーとなるように設定される。従って、プローブを、Ａ領域において場合には、一方のプライマーをＰ１領域において、他方のプライマーをＢ領域またはＰ２領域においてそれぞれ設定することが好ましい。また、プローブを、Ｂ領域に基づいて設定した場合には、一方のプライマーを、Ｐ１領域またはＡ領域において、他方のプライマーを、Ｐ２領域においてそれぞれ設定することが好ましい。例えば、プローブとして、配列番号５に示す塩基配列を有するものを用いた場合には、プライマー対として、配列番号４に示す塩基配列を有するものと配列番号７に示す塩基配列を有するものの対、または、配列番号６に示す塩基配列を有するものと配列番号７に示す塩基配列を有するものの対を用いることができる。
【００２４】
上記の特定の領域におけるプローブ及びプライマー対の設定は、リアルタイムＰＣＲに用いる条件を考慮して当業者に公知の方法に従って行えばよい。プローブ及びプライマー対の設定は、コンピューター検索に基づいて行うことでより効率的となる。
【００２５】
リアルタイムＰＣＲのプローブの設計に際しては、Tm値をプライマーのTm値よりも8〜10℃高く設定することが好ましいとされている。この条件を満たすようにプローブを設定した場合、Ａ領域はＧＣ含量が低いため、Ａ領域に設定したものはプローブ長がＢ領域に設定したものよりも10塩基程度長くなる。このようにプローブが長くなると、特異性および検出感度の低下が起こることがあるため、Ｂ領域にプローブを設定することが好ましい。
【００２６】
プライマーは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの一方又は両方について、複数のプライマーを混合したミックスプライマーとして設定してもよい。プライマー設定部分に塩基の変異が存在する場合には、ミックスプライマーを用いることで検出効率を上げることができる。
【００２７】
本発明検出方法によれば、検出感度が高く、培養を経ずに例えば尿等の臨床材料から直接にＤＮＡ増幅を行うことが可能であり、迅速な検出が可能となる。特に、プローブだけでなくプライマーも特定の領域に基づいて選択されているので、M. genitaliumに特異的な定量的検出を行うことができる。
【００２８】
＜２＞本発明キット
本発明キットは、本発明検出方法に用いることのできるキットであり、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号610〜664または792〜869に相当する領域の塩基配列に基づいて設定されたプローブ、及び、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定され、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定されたプライマー対を含むことを特徴とする。
【００２９】
プローブ及びプライマー対については、本発明検出方法に関し、上記に説明した通りである。
【００３０】
本発明キットにおいてプローブ及びプライマー対は、混合物とされていてもよいし、別個に収容されていてもよい。
【００３１】
本発明キットは、プローブ及びプライマー対の他に、リアルタイムＰＣＲを行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。
【００３２】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲が何ら限定されるものではない。
【００３３】
【参考例１】
M. genitalium陽性検体の選択
ヒトからの分離が報告されているマイコプラズマ属細菌１３種（M. buccale、M. faucium、M. fermentans、M. genitalium、M. hominis、M. lipophilum、M. orale、M. penetrans、M. pirum、M. pneumoniae、M. primatum、M. salivarium、M. spermatophilum）およびウレアプラズマ属細菌２種（U. parvum、U. urealyticum）を国立感染研究所またはAmerican Type Culture Collectionより入手した。また、男子尿道炎患者（148例）及び無症候性男子（42例）から尿を採取し、使用時まで-80℃で凍結保存した。
【００３４】
これらの試料からＤＮＡの抽出を以下の様に行った。凍結しておいた尿を37℃で30分加温した。尿1 mlを15,000×ｇで30分遠心し、上清を除去した。リン酸緩衝食塩水(pH 7.4)を1 ml加えて沈殿物を十分に懸濁し、再度同条件で遠心した。上清を除去した後、Lysis buffer（10 mM Tris-HCl[pH 8.0], 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.01%ゼラチン, 0.45% NP-40, 0.45% Tween 20, 0.5% SDS, 0.7 mg/ml Proteinase K）を500μl加え、55℃で２時間インキュベートした。フェノール/クロロホルム処理後、エタノールを加え-20℃に一晩放置した。遠心後、風乾させたＤＮＡを50μlのTE buffer（10 mM Tris-HCl[pH 8.0], 1 mM EDTA）に溶解した。標準株培養菌液からの抽出は、培養菌液５μlを直接Lysis bufferに添加し、以下同様に操作を行った。
【００３５】
抽出されたＤＮＡを鋳型として以下のようにＰＣＲを行った。16S rRNA領域のセミネステッド(semi-nested)PCRを行うため、Kuppeveldら（Appl. Environ. Microbiol., 58, 2606-2615, 1992）により16S rRNA領域内に設計されたプライマーGPO-1（配列番号２）およびMGSO（配列番号３）、並びに、プライマーMy-ins（配列番号４）を使用した。
【００３６】
第１段階のＰＣＲ（1st PCR）は、PCR反応液（10 mM Tris-HCl[pH 8.0], 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.001%ゼラチン, 0.2 mM dNTPs, プライマー[GPO-1, MGSO]各0.5μM, Ampli Taq DNA polymerase[Roche Diagnostic Systems] 1.25 units）40μlに抽出ＤＮＡ10μlを加えて、GeneAmp PCR Systems 9600(PERKIN ELMER)を使用し、94℃30秒で変性、64℃30秒でアニーリング、72℃60秒で伸長の条件で40サイクル行った。第２段階のＰＣＲ（2nd PCR）は、プライマーにMy-insおよびMGSOを使用したPCR反応液48μlに1st PCRの産物２μlを加え、94℃30秒で変性、60℃30秒でアニーリング、72℃60秒で伸長の条件で35サイクル行った。反応後、PCR産物10μlを３％アガロースゲル電気泳動に付し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射により約500 bpのバンドを確認した。
【００３７】
得られたPCR産物はスピンカラムで精製し、その塩基配列を、Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（PE Biosystems）を使用したダイレクトシークエンス反応後、373A DNAオートシークエンサー（PE Biosystems）で解読した。
【００３８】
解読した標準菌株の塩基配列について、2-パラメータを用いた近隣結合法（SINCA,富士通）で系統解析を行い、系統樹を得た。系統樹の分岐の信頼性は、1000回繰り返しのブートストラップ法を用いて確認した。得られた系統樹により臨床分離株（尿道炎患者の尿から検出されたもの）の菌種を同定した。
【００３９】
この結果、男子クラミジア陰性NGU患者46名中９名（19.6％）がM. genitalium陽性であった。
【００４０】
【実施例１】
M. genitaliumの定量
以下のようにリアルタイムＰＣＲを行った。TaqManプローブとしてMgen-P1（配列番号５）を使用し、プライマーとしてMGSO-2（配列番号７）及びMy-ins（配列番号４）を使用した。
【００４１】
マスターミクスチャー（１×TaqMan buffer A 5.0μl, MgCl₂ 5.0 mM, dNTPs各0.2 mM, プライマー各200 nM, TaqManプローブ100 nM, AmpliTaq Gold 1.25 unit, AmpErase 0.5 unit）40μlにＤＮＡ溶液10μlを加えて、Prism7700を使用し、50℃２分＋95℃10分＋（95℃15秒／66℃60秒）×60サイクルの条件で増幅反応を行い、反応中経時的に蛍光を測定し、コントロールとの比較からM. genitaliumを定量した。定量コントロールとしては、M. genitaliumおよびM. pneumoniae 16S rRNA遺伝子の一部を挿入した組換えプラスミドをそれぞれ構築し、吸光度（260 nm）からコピー数を算出した。
【００４２】
定量性について検討したところ、M. genitaliumコントロールを10²〜10⁸コピー／チューブの測定レンジで定量的に検出することができた。M. genitaliumと塩基配列の相同性が高いM. pneumoniaeのコントロールを用いて、上記定量の特異性を評価した結果、交差反応は認められず、M. genitaliumの特異的な定量が可能なことが確認された。
【００４３】
さらに、参考例１でM. genitalium陽性とされた患者の尿を検査材料として上記のリアルタイムＰＣＲを行った。検査材料からのＤＮＡの抽出は参考例１に記載の方法で行った。
【００４４】
NGU患者の治療開始時およびその後の来院時に採取した尿中M. genitaliumを定量した結果、治療経過とともに菌量が減少する、治療開始から菌量に変化が見られない、あるいは一度菌量が減少した後に再び増加するというような症例が見られた。これらは概ね臨床症状との相関がみられ、尿道炎におけるM. genitaliumの病原的意義につながる興味深いデータであると思われる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、M. genitaliumに特異的なＤＮＡを迅速に高感度で定量的に検出することが可能になる。抗菌剤投与による治療効果の迅速のモニタリングなどに、本発明の方法は極めて有用である。
【００４６】
【配列表】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting bacteria of Mycoplasma genitalium and a kit for the method.
[0002]
[Prior art]
M. genitalim was first isolated from a nongonococcal urethritis (NGU) patient, and inoculation experiments with chimpanzees caused urethral inflammation, increased polynuclear leukocytes in urethral secretions, and antibody titers The significant increase suggests the possibility of causing NGU in humans. However, its pathogenic significance in urogenital infections has not necessarily been clarified until recently because it is extremely difficult to detect from clinical specimens by culture methods.
[0003]
M. genitalim has been detected in the urine of approximately 20% of Chlamydia-negative NGU patients by the development of detection and identification methods of Mycoplasma and Ureaplasma by PCR and gene phylogenetic analysis (Japan Society for Infectious Diseases 13th) Announced at the 1st Annual Scientific Meeting (December 2-3, 2000). In addition, when the changes in urethral inflammation due to treatment were combined with the detection results of M. genitalium, the symptom and white blood cell count of urethral smears were once normalized in M. genitalium-positive NGU after administration of quinolone antibiotics for 2 weeks. In some cases, M. genitalium does not become negative, and there are some cases in which symptoms recur within 4 weeks thereafter (in the 13th Annual Meeting of the Japanese Society of Infectious Diseases (December 2-3, 2000)) Presentation). From these facts, the pathogenic significance of M. genitalium in urogenital infections is being clarified.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
If quantitative detection of urinary M. genitalium in patients with urethritis is facilitated, the development of M. genitalium due to treatment can be monitored in detail, and the correlation between the resulting fate and clinical symptoms is more of pathogenic significance. It is expected to lead to elucidation.
[0005]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for detecting M. genitalium, which enables rapid and specific quantification of M. genitalium in a sample.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that the above-mentioned problems can be solved by performing real-time PCR using a probe and a primer pair created based on a specific base sequence in M. genitalium DNA. completed.
Accordingly, the present invention provides the following.
[0007]
(1) A method for detecting M. genitalium, comprising performing real-time PCR using a probe using DNA obtained from a sample as a template, wherein the probe used in real-time PCR is a sequence number of 16S rRNA gene 1 is set based on the base sequence of the region corresponding to base numbers 610 to 664 or 792 to 869 of the base sequence shown in FIG. 1, and the primer pair used in real-time PCR is the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene. A method which is set based on at least a base sequence stored in M. genitalium in a region corresponding to base numbers 497 to 1051, and is set so that a region containing the base sequence of the probe can be amplified.
[0008]
(2) The primer pair is conserved in at least M. genitalium in the region corresponding to base numbers 497 to 547, 610 to 664, 792 to 869, and 1012 to 1051 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene. The method according to (1), which is set on the basis of the existing nucleotide sequence.
[0009]
(3) The method according to (1) or (2), wherein the probe has the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6.
[0010]
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the primer pair consists of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a base sequence shown in SEQ ID NO: 7.
[0011]
(5) A kit for detection of M. genitalium by performing real-time PCR using a DNA obtained from a sample as a template, the base number of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene A probe set based on the base sequence of the region corresponding to 610 to 664 or 792 to 869, and at least M. in the region corresponding to base numbers 497 to 1051 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene. A kit comprising a primer pair set based on a base sequence stored in genitalium and set so that a region containing the base sequence of the probe can be amplified.
[0012]
(6) The primer pair is conserved in at least M. genitalium in the region corresponding to base numbers 497 to 547, 610 to 664, 792 to 869, and 1012 to 1051 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene. The kit according to (5), which is set on the basis of the existing nucleotide sequence.
[0013]
(7) The kit according to (5) or (6), wherein the probe has the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6.
[0014]
(8) The kit according to any one of (5) to (7), wherein the primer pair consists of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a base sequence shown in SEQ ID NO: 7.
[0015]
The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the base sequence of the 16S rRNA gene of the Mycoplasma genitalim standard strain (GenBank accession No. X77334), and those skilled in the art may use a strain having a mutation in the 16S rRNA gene. In consideration of differences in base sequences that may exist among individuals, a region corresponding to the region specified by the base number of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be easily identified and recognized.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
<1> Detection method of the present invention The detection method of the present invention is a method that enables rapid and specific detection of Mycoplasma genitalium (M. genitalium), using DNA obtained from a sample as a template, Including performing a real-time PCR using a probe, wherein the probe used in the real-time PCR is based on the base sequence of the region corresponding to base numbers 610 to 664 or 792 to 869 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene The primer pair used in real-time PCR is based on the base sequence conserved in at least M. genitalium in the region corresponding to base numbers 497 to 1051 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene. It is set and set so that the region including the probe base sequence can be amplified.
[0017]
The sample is not particularly limited as long as it contains or may contain M. genitalium, and examples include urinary tract materials such as urine, urethral scrapings, and cervical scrapings. it can. From these samples, DNA can be obtained by conventional methods for DNA preparation.
[0018]
The real-time PCR in the detection method of the present invention can be performed according to a normal real-time PCR method using a probe, except that DNA obtained from a sample is used as a template and a specific probe and primer pair are used. In real-time PCR using a probe, a labeled probe that anneals to a part of the base sequence of the region to be amplified is generally used, and the label is released by the 5 'exonuclease activity of the polymerase during the PCR extension reaction. The target amplification product is detected by detecting (Christian A. Heid et al., Rear Time Quantitative PCR, GENOME RESEARCH, 6: 986-994). An example of a label is the attachment of a reporter fluorescent dye at the 5 ′ end of the probe and a quencher fluorescent dye at the 3 ′ end (Livak, k. J. et al., PCR Methods and Applications, 4: 357). -362 (1995)). Those skilled in the art can appropriately optimize the PCR conditions in real-time PCR.
[0019]
The probe used in the present invention is a region corresponding to base numbers 610 to 664 or 792 to 869 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene (hereinafter also referred to as A region and B region for convenience). It is set based on the base sequence. The base sequences of the A region and the B region are specific to M. genitalium, and are regions in which probes specific to M. genitalium can be designed. The present inventors have detected M. genitalium in 17 cases by the PCR method and the identification method of Mycoplasma and Ureaplasma by gene phylogenetic analysis, of which 12 cases are the same as M. genitalium standard strain G-37 In the remaining 5 cases, those having a different base sequence from the standard strain were detected, but the above A region and B region are all detected M. genitalium strains. It has been confirmed that the base sequence is common and contains a base different from Mycoplasma and Ureaplasma species other than M. genitalium.
[0020]
The probe is usually set in either of these two areas. The length of the probe is usually 15 to 35 bases. Specific examples of the probe include a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (corresponding to base numbers 819 to 841 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1) or its complementary base sequence, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 Or a probe having a complementary base sequence thereof (corresponding to base numbers 620 to 654 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1).
[0021]
The primer pair used in the present invention is set based on a base sequence conserved in at least M. genitalium in a region corresponding to base numbers 497 to 1051 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene, and The region including the base sequence of the probe is set to be amplified.
[0022]
The primer pair is a region corresponding to base numbers 497 to 547, 610 to 664, 792 to 869 and 1012 to 1051 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene (hereinafter referred to as P1 region, for convenience, respectively) (It is also referred to as A region, B region, or P2 region) and is preferably set based on at least the base sequence conserved in M. genitalium. The length of the primer is usually 15 to 30 bases. Specific examples of the primer include a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 (corresponding to base numbers 520 to 545 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1) or its complementary base sequence, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 6. A primer having a base sequence (corresponding to base numbers 620 to 654 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1) or a complementary base sequence thereof, a base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (base numbers 819 to 841 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1) Or a primer having a complementary base sequence thereof, and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 (corresponding to base numbers 1036 to 1012 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1) or a complementary base sequence thereof. It is done.
[0023]
The primer pair is set so that a region containing the probe base sequence can be amplified, that is, located on both sides of the probe base sequence, and one is a sense primer and the other is an antisense primer. Therefore, when the probe is in the A region, it is preferable to set one primer in the P1 region and the other primer in the B region or the P2 region. When the probe is set based on the B region, it is preferable to set one primer in the P1 region or the A region and the other primer in the P2 region. For example, when a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 is used as a probe, a primer pair having a base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a pair having a base sequence shown in SEQ ID NO: 7 or A pair of those having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and those having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 can be used.
[0024]
The probe and primer pair in the specific region may be set according to a method known to those skilled in the art in consideration of conditions used for real-time PCR. The probe and primer pair can be set more efficiently by performing a computer search.
[0025]
In designing a probe for real-time PCR, it is preferable to set the Tm value 8 to 10 ° C. higher than the Tm value of the primer. When the probe is set to satisfy this condition, the GC content in the A region is low, so that the probe length set in the A region is about 10 bases longer than that set in the B region. When the probe becomes long in this way, the specificity and detection sensitivity may be lowered. Therefore, it is preferable to set the probe in the B region.
[0026]
The primer may be set as a mixed primer obtained by mixing a plurality of primers with respect to one or both of the sense primer and the antisense primer. When a base mutation exists in the primer setting part, the detection efficiency can be increased by using a mixed primer.
[0027]
According to the detection method of the present invention, detection sensitivity is high, DNA amplification can be performed directly from clinical material such as urine without culturing, and rapid detection is possible. In particular, since not only probes but also primers are selected based on specific regions, quantitative detection specific to M. genitalium can be performed.
[0028]
<2> Kit of the Present Invention The kit of the present invention is a kit that can be used in the detection method of the present invention, and is a region corresponding to base numbers 610 to 664 or 792 to 869 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene. Based on the base sequence conserved in at least M. genitalium in the region corresponding to base numbers 497 to 1051 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the probe set based on the base sequence of It includes a primer pair that is set and set so as to amplify a region including the base sequence of the probe.
[0029]
The probe and primer pair are as described above for the detection method of the present invention.
[0030]
In the kit of the present invention, the probe and primer pair may be a mixture or may be accommodated separately.
[0031]
The kit of the present invention may further contain reagents necessary for performing real-time PCR in addition to the probe and primer pair.
[0032]
【Example】
EXAMPLES Next, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are given only as an aid for obtaining specific recognition about the present invention, and thereby the scope of the present invention is limited in any way. It is not a thing.
[0033]
[Reference Example 1]
Selection of M. genitalium positive specimens 13 species of Mycoplasma bacteria that have been reported to be isolated from humans (M. buccale, M. faucium, M. fermentans, M. genitalium, M. hominis, M. lipophilum, M. orale, M. penetrans, M. pirum, M. pneumoniae, M. primatum, M. salivarium, M. spermatophilum) and two species of Ureaplasma bacteria (U. parvum, U. urealyticum) from National Institute of Infection or American Type Culture Collection Obtained from. Urine was collected from male urethritis patients (148 cases) and asymptomatic boys (42 cases) and stored frozen at -80 ° C. until use.
[0034]
DNA was extracted from these samples as follows. The frozen urine was warmed at 37 ° C. for 30 minutes. 1 ml of urine was centrifuged at 15,000 × g for 30 minutes, and the supernatant was removed. 1 ml of phosphate buffered saline (pH 7.4) was added to sufficiently suspend the precipitate, and centrifuged again under the same conditions. After removing the supernatant, Lysis buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.01% gelatin, 0.45% NP-40, 0.45% Tween 20, 0.5% SDS, 0.7 mg 500 μl of / ml Proteinase K) was added and incubated at 55 ° C. for 2 hours. After phenol / chloroform treatment, ethanol was added and the mixture was allowed to stand at −20 ° C. overnight. After centrifugation, the air-dried DNA was dissolved in 50 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA). Extraction from the standard strain culture solution was performed by adding 5 μl of the culture solution directly to the lysis buffer, and the same operation.
[0035]
PCR was performed as follows using the extracted DNA as a template. Primer GPO-1 (SEQ ID NO: designed in the 16S rRNA region by Kuppeveld et al. (Appl. Environ. Microbiol., 58, 2606-2615, 1992) for semi-nested PCR of the 16S rRNA region. 2) and MGSO (SEQ ID NO: 3) and the primer My-ins (SEQ ID NO: 4) were used.
[0036]
The first stage PCR (1st PCR) consists of PCR reaction solution (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.001% gelatin, 0.2 mM dNTPs, primer [GPO-1, MGSO]. 0.5μM, Ampli Taq DNA polymerase [Roche Diagnostic Systems] 1.25 units) Add 10μl of extracted DNA to 40μl, use GeneAmp PCR Systems 9600 (PERKIN ELMER), denature at 94 ° C for 30 seconds, anneal at 64 ° C for 30 seconds, 40 cycles were performed under the conditions of elongation at 72 ° C. for 60 seconds. In the second stage PCR (2nd PCR), 2 μl of 1st PCR product was added to 48 μl of PCR reaction solution using My-ins and MGSO as primers, denatured at 94 ° C. for 30 seconds, annealed at 60 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. 35 cycles were performed under the conditions of extension in 60 seconds. After the reaction, 10 μl of the PCR product was subjected to 3% agarose gel electrophoresis, stained with ethidium bromide, and a band of about 500 bp was confirmed by ultraviolet irradiation.
[0037]
The obtained PCR product was purified with a spin column, and the base sequence was decoded with a 373A DNA autosequencer (PE Biosystems) after direct sequencing using Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (PE Biosystems).
[0038]
With respect to the base sequence of the decoded standard strain, a phylogenetic analysis was performed by the neighborhood joining method using two parameters (SINCA, Fujitsu) to obtain a phylogenetic tree. The reliability of the branching of the phylogenetic tree was confirmed using a bootstrap method repeated 1000 times. The bacterial strains of clinical isolates (detected from the urine of urethritis patients) were identified from the obtained phylogenetic tree.
[0039]
As a result, 9 (46%) of 46 Chlamydia negative NGU patients were M. genitalium positive.
[0040]
[Example 1]
Quantification of M. genitalium Real-time PCR was performed as follows. Mgen-P1 (SEQ ID NO: 5) was used as a TaqMan probe, and MGSO-2 (SEQ ID NO: 7) and My-ins (SEQ ID NO: 4) were used as primers.
[0041]
Add 10 μl of DNA solution to 40 μl of master mix (1 × TaqMan buffer A 5.0 μl, MgCl ₂ 5.0 mM, dNTPs 0.2 mM each, primer 200 nM, TaqMan probe 100 nM, AmpliTaq Gold 1.25 unit, AmpErase 0.5 unit), and Prism7700 The amplification reaction was performed under the conditions of 50 ° C for 2 minutes + 95 ° C for 10 minutes + (95 ° C for 15 seconds / 66 ° C for 60 seconds) x 60 cycles, and the fluorescence was measured over time during the reaction. M. genitalium was quantified. As quantitative controls, recombinant plasmids into which part of the M. genitalium and M. pneumoniae 16S rRNA genes were inserted were constructed, and the copy number was calculated from the absorbance (260 nm).
[0042]
When the quantitative property was examined, the M. genitalium control was quantitatively detected in the measurement range of 10 ² to 10 ⁸ copies / tube. As a result of evaluating the specificity of the above quantification using the control of M. pneumoniae, which has high base sequence homology with M. genitalium, no cross-reaction was observed and specific quantification of M. genitalium was possible. confirmed.
[0043]
Furthermore, the above-mentioned real-time PCR was performed using the urine of a patient who was positive for M. genitalium in Reference Example 1 as a test material. Extraction of DNA from the test material was performed by the method described in Reference Example 1.
[0044]
As a result of quantification of urinary M. genitalium collected at the start of treatment of NGU patients and subsequent visits, the amount of bacteria decreased with the progress of treatment, the amount of bacteria did not change from the start of treatment, or the amount of bacteria once decreased In some cases, it increased again. These are generally correlated with clinical symptoms and may be interesting data leading to the pathogenic significance of M. genitalium in urethritis.
[0045]
【The invention's effect】
According to the present invention, DNA specific to M. genitalium can be rapidly and quantitatively detected with high sensitivity. The method of the present invention is extremely useful for, for example, rapid monitoring of therapeutic effect by administration of an antibacterial agent.
[0046]
[Sequence Listing]

Claims

A method for detecting Mycoplasma genitalium, comprising performing real-time PCR using a probe using DNA obtained from a sample as a template,
The probe used in real-time PCR is set based on the nucleotide sequence of the region corresponding to nucleotide numbers 610 to 664 or 792 to 869 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 All of the base sequence corresponding to base numbers 819 to 841, or a base sequence containing at least 15 bases or a complementary base sequence thereof, or all of the base sequences corresponding to base numbers 620 to 654 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or Having a base sequence comprising at least 15 bases or a complementary base sequence thereof, and the length of the probe is 15 to 35 bases;
The primer pair used in real-time PCR is at least Mycoplasma genitalium in the region corresponding to base numbers 497 to 547 , 610 to 664 , 792 to 869, and 1012 to 1051 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene. A method that is set based on a conserved base sequence and is set so that a region containing the base sequence of the probe can be amplified.

The method of claim 1, wherein the probe consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6.

Primer pairs A method according to claim 1 or 2 consisting of those having the nucleotide sequences of those and SEQ ID NO: 7 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.

A kit for detecting Mycoplasma genitalium by performing real-time PCR using a probe using DNA obtained from a sample as a template,
A probe set based on the base sequence of the region corresponding to base numbers 610 to 664 or 792 to 869 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene, wherein the base number of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 All of the base sequence corresponding to 819 to 841 or a base sequence including at least 15 bases or a complementary base sequence thereof, or all or at least 15 bases of the base sequence corresponding to base numbers 620 to 654 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. A probe having a base sequence comprising or a complementary base sequence thereof and a length of 15 to 35 bases , and
Based on the base sequence conserved in at least Mycoplasma genitalium in the region corresponding to base numbers 497 to 547 , 610 to 664 , 792 to 869, and 1012 to 1051 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the 16S rRNA gene A kit comprising a primer pair which is set and set so as to amplify a region containing the base sequence of the probe.

4. The kit according to which the probe comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6.

Primer pair A kit according to claim 4 or 5 consisting of those having the nucleotide sequences of those and SEQ ID NO: 7 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.