JP4705697B2

JP4705697B2 - MN / CA9-derived HLA-A24 restricted tumor antigen peptide

Info

Publication number: JP4705697B2
Application number: JP2001125363A
Authority: JP
Inventors: 吉川　　和宏
Original assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Current assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Priority date: 2001-04-24
Filing date: 2001-04-24
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2021-04-24
Also published as: JP2002360251A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＭＮ／ＣＡ９由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチドに関する。さらに詳しくは、本発明は、ＭＮ／ＣＡ９由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチドおよび機能的に同等の特性を有するその誘導体、これらの腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体をイン・ビボもしくはイン・ビトロで利用した腫瘍の治療剤、予防剤、または診断薬などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体による腫瘍の排除には、免疫系、特にＴ細胞が重要な役割を果たしていることが知られている。実際、ヒトの腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示すリンパ球の浸潤が認められ（Arch.Surg.，126:200 ，1990）、メラノーマからは自己の腫瘍細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が比較的容易に分離されている（Immunol.Today ，8:385 ，1987、J.Immunol.，138:989 ，1987、Int.J.Cancer，52:52 ，1992等）。また、該ＣＴＬの移入によるメラノーマ治療の臨床結果からも、腫瘍排除におけるＴ細胞の重要性が示唆されている（J.Natl.Cancer.Inst. ，86:1159 ，1994）。
【０００３】
自己の腫瘍細胞を攻撃するＣＴＬが標的とする分子については長い間不明であったが、最近の免疫学および分子生物学の進歩により次第に明らかになってきた。すなわちＣＴＬは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて、腫瘍抗原ペプチドと呼ばれるペプチドと主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原（ＭＨＣクラスＩ抗原、ＨＬＡ抗原とも呼ばれる）との複合体を認識することにより、自己の腫瘍細胞を攻撃していることが明らかとなった。
【０００４】
腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特有のタンパク質、すなわち腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアソームにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡ抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示された複合体を腫瘍特異的なＣＴＬが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を示す。このような一連の作用の解明に伴い、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドをいわゆる癌ワクチンとして利用することにより、腫瘍患者の体内の腫瘍特異的ＣＴＬを増強させる治療法が可能となった。
【０００５】
腫瘍抗原タンパク質としては、1991年にT.Boonらが初めてＭＡＧＥと名付けたタンパク質をヒトメラノーマ細胞から同定した（Science ，254:1643，1991）。その後、いくつかの腫瘍抗原タンパク質が、主にメラノーマ細胞から同定されている。メラノーマ抗原としては、メラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００（J.Exp.Med.，179:1005，1994）、ＭＡＲＴ−１（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91:3515 ，1994）、チロシナーゼ（J.Exp.Med.，178:489 ，1993）などのメラノソームタンパク質、メラノーマだけでなく各種癌細胞と正常精巣細胞に発現するMAGE関連タンパク質群（J.Exp.Med.，179:921 ，1994）、腫瘍特異的なアミノ酸変異を持つβ−カテニン（J.Exp.Med.，183:1185，1996）、ＣＤＫ４（Science ，269 ：1281，1995）などが同定されている。また、メラノーマ以外の腫瘍抗原タンパク質としては、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（J.Exp.Med.，181:2109，1995）、ｐ５３ (変異型) （Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93:14704，1996）などの癌遺伝子産物、ＣＥＡ（J.Natl.Cancer.Inst. ，87:982，1995）、ＰＳＡ（J.Natl.Cancer.Inst. ，89:293，1997）などの腫瘍マーカー、ＨＰＶ（J.Immunol.，154:5934，1995）、ＥＢＶ（Int.Immunol.，7:653 ，1995）などのウイルスタンパク質などが同定されている。これらについては、総説（Immunol.Today ，18:267，1997、J.Exp.Med.，183:725 ，1996、Curr.Opin.Immunol.，8:628 ，1996等）の記述に詳しい。
【０００６】
ＭＮ／ＣＡ９は、モノクロナール抗体Ｍ７５に認識される膜蛋白質として同定されたものであり（Virology 187:620-626,1992）、その遺伝子の塩基配列及び蛋白質のアミノ酸配列についても報告されている（Oncogene 9:2877−2888, 1994、NCBIデータベースAccession No. NP_001207）。ＭＮ／ＣＡ９は、モノクローナル抗体Ｇ２５０が認識する抗原と同一物質であることから、Ｇ２５０抗原とも呼ばれている。ＭＮ／ＣＡ９は、正常組識では胃や胆管の粘膜、小腸の増殖速度の高い細胞に発現が認められる。またＭＮ／ＣＡ９は、正常の腎臓組識では発現が認められないが、腎細胞癌の８割以上で発現が認められることから、腎細胞癌の腫瘍マーカーとして有用であると考えられている(Br. J. Cancer 81:741-746, 1999)。また近年、Vissersらは、ＭＮ／ＣＡ９のアミノ酸配列からHLA-A2.1拘束性にCTLを誘導する可能性のある抗原ペプチド配列を報告している（Cancer Res., 59:5554-5549, 1999）。しかしながら、日本人に最も多いHLAのタイプであるHLA-A24に拘束性の腫瘍抗原ペプチド配列の存在に関しては、これまで何ら報告されていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＭＮ／ＣＡ９由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチドを提供することを目的とする。さらに詳しくは、本発明は、ＭＮ／ＣＡ９由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチドおよび機能的に同等の特性を有するその誘導体、これらの腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体をイン・ビボもしくはイン・ビトロで利用した腫瘍の治療剤、予防剤、または診断薬などを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＭＮ／ＣＡ９がHLA-A24抗原に結合して提示される腫瘍抗原ペプチド部分を有しているか否か、すなわちＭＮ／ＣＡ９由来のHLA-A24拘束性腫瘍抗原ペプチドが存在しているか否かについて、鋭意検討を行った。
すなわちまず、ＭＮ／ＣＡ９を高発現する細胞株を樹立し、この細胞株でマウスを免疫して得られた脾臓細胞より、最終的にＭＮ／ＣＡ９を特異的に認識するＣＴＬクローンを単離・樹立することに成功した。次に、このＭＮ／ＣＡ９特異的ＣＴＬクローンを用いて、当該ＣＴＬを特異的に認識するHLA-A24拘束性抗原ペプチドの同定を試みた。その結果、ＭＮ／ＣＡ９にはHLA-A24拘束性の腫瘍抗原ペプチド部分が存在していること、そして、Ala-Tyr-Glu-Gln-Leu-Leu-Ser-Arg-Leu（配列番号：２）で代表されるペプチドが腫瘍抗原ペプチドとしての高い活性を有していることを、初めて明らかにした。
【０００９】
本発明のＭＮ／ＣＡ９由来腫瘍抗原ペプチドは、日本人に最も多く、その約6割に発現が認められるHLAのタイプであるHLA-A24に抗原提示される腫瘍抗原ペプチドであるため、多くの患者に適用可能である。
さらに、従来の技術に記載したように、ＭＮ／ＣＡ９は、もともと腎細胞癌(Renal cell carcinoma：RCC)の８割以上で発現が認められるタンパクとして知られていたものである。腎細胞癌は、成人の腎臓の腫瘍の80〜90％を占めている。腎細胞癌の予後は不良で、5年生存率は約40〜60％である。現在、手術以外に有効な治療法が少なく、化学療法剤の治療効果は期待できないため、新しい治療法の開発が望まれている。この観点からも、本発明の腫瘍抗原ペプチドは有用であると考えられる。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
【００１０】
即ち本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３に記載のアミノ酸配列よりなる腫瘍抗原ペプチド、あるいは機能的に同等の特性を有するその誘導体、
（２）配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３に記載のアミノ酸配列よりなる、前記（１）記載の腫瘍抗原ペプチド、
（３）配列番号：２に記載のアミノ酸配列よりなる、前記（２）記載の腫瘍抗原ペプチド、
（４）配列番号：４、配列番号：５又は配列番号：６に記載のアミノ酸配列よりなる、前記（１）記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体、
（５）配列番号：５に記載のアミノ酸配列よりなる、前記（４）記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体、
（６）前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体を有効成分として含有する、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、
（７）前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡ、
（８）配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードする、前記（７）記載のＤＮＡ、
（９）前記（７）又は（８）記載のいずれかのＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、
（１０）前記（９）記載の組換えＤＮＡを発現させて得られるポリペプチド、
（１１）前記（９）記載の組換えＤＮＡまたは前記（１０）記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、
（１２）前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体に特異的に結合する抗体、
（１３）ＨＬＡ−Ａ２４抗原と前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体の提示された抗原提示細胞、
（１４）前記（１３）記載の抗原提示細胞を有効成分として含有してなる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、
（１５）ＨＬＡ−Ａ２４抗原と前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を認識する細胞傷害性Ｔ細胞、
（１６）前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体、前記（９）記載の組換えＤＮＡ、前記（１０）記載のポリペプチド、前記（１３）記載の抗原提示細胞、あるいは前記（１５）記載の細胞傷害性Ｔ細胞を有効成分として含有してなる腫瘍の治療剤又は予防剤、ならびに
（１７）前記（１）〜（５）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を含有してなる腫瘍の診断薬。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の腫瘍抗原ペプチドとは、ＭＮ／ＣＡ９（Oncogene 9:2877−2888, 1994、NCBIデータベースAccession No. NP_001207）由来のアミノ酸配列である配列番号：１〜配列番号：３のいずれかに記載のアミノ酸配列よりなるペプチドを指す。好ましくは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列（Ala-Tyr-Glu-Gln-Leu-Leu-Ser-Arg-Leu）よりなるペプチドが挙げられる。
【００１２】
前記本発明の腫瘍抗原ペプチドは、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis ），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2 ，Academic Press Inc. ，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発続第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている方法が挙げられる。
【００１３】
前記本発明の腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）により認識されるという特性を有するものである。当該腫瘍抗原ペプチドとしての特性は、例えば、 J.Immunol.,154,p2257,1995に記載の測定方法により調べることができる。具体的には、ＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、イン・ビトロで本発明のペプチドを添加して刺激した場合に、該ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されることにより、測定することができる。ここでＣＴＬの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生したIFN-γの量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定することによって調べることができる。また、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生したTNF-αの量を、TNF-α感受性細胞株（例えばWEHI164S細胞）の生存率で測定することによっても、調べることができる（実施例参照）。
【００１４】
さらに、⁵¹Crで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するＣＴＬの傷害性を測定する方法（⁵¹Crリリースアッセイ、Int.J.Cancer,58:p317,1994 ）によっても調べることができる。また、ＨＬＡ−Ａ２４のｃＤＮＡ（Cancer Res.,55:4248-4252 (1995)、Genbank Accession No.M64740）を発現する発現プラスミドを、例えばCOS-7細胞（ATCC No. CRL1651）やVA-13細胞（理化学研究所細胞銀行）に導入した細胞に対して本発明のペプチドをパルスし、この細胞に対して、前記で調製したＣＴＬなどを反応させ、該ＣＴＬが産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γやTNF-α）の量を測定することによっても、調べることができる。
以下、ここで述べたような測定法を「腫瘍抗原ペプチドの測定法」と称することもある。
【００１５】
本発明において「腫瘍抗原ペプチドと機能的に同等の特性を有する誘導体」（以下、腫瘍抗原ペプチド誘導体と略す場合がある）とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸残基を改変した改変体であって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識され得るという腫瘍抗原ペプチドとしての特性を有するものをいう。すなわち、本発明の腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸残基を改変した改変体であって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識され得るという腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するものは全て、本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体の範疇に含まれる。
【００１６】
ここで、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加（ペプチドのＮ末端、Ｃ末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数および位置は、腫瘍抗原ペプチドとしての活性が維持される限り任意である。
【００１７】
ところで、ＨＬＡ抗原に結合して提示される抗原ペプチドの配列には規則性（モチーフ）があり、ＨＬＡ−Ａ２４抗原の場合、８〜１１アミノ酸よりなるペプチドのうちのＮ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンであることが知られている（Immunogenetics,41:178,1995、J.Immunol., 152:p3913,1994、J.Immunol.,155:4307,1994）。より好ましくは、当該モチーフは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはトリプトファンである。また、該モチーフ上とり得るアミノ酸に類似の性質を持つアミノ酸残基も許容される可能性がある。
【００１８】
従って、本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体には、これらモチーフ上アミノ酸の置換が可能な位置、すなわち第２位および／またはＣ末端のアミノ酸を他のアミノ酸に置換し、かつ腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するものが含まれる。好ましくは、第２位および／またはＣ末端のアミノ酸を前記モチーフ上置換が可能なアミノ酸に置換し、かつ腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が挙げられる。ペプチドの長さは、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合して提示されるという観点から、８〜１１アミノ酸程度が好ましい。
【００１９】
具体的には、配列番号：１〜配列番号：３のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンのいずれかに置換し、および／またはＣ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンのいずれかに置換したアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するものが挙げられる。このような本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体の具体例としては、配列番号：４〜配列番号：６のいずれかに記載のアミノ酸配列よりなるペプチドが挙げられる。好ましくは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドが挙げられる。
【００２０】
本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体は、本発明の腫瘍抗原ペプチドと同様に、候補となるペプチドを前記ペプチド合成法に基づき合成し、これを前記腫瘍抗原ペプチドの測定法に供することにより、腫瘍抗原ペプチドと機能的に同等の特性を有するか否かを同定することができる。
【００２１】
本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体は、後述の実施例にも記載のようにＣＴＬの誘導能を有するものであり、誘導されたＣＴＬは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を発揮することができる。従って本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体は、腫瘍の治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。本発明は、腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分として含有する腫瘍の治療剤または予防剤を提供する。本発明の腫瘍の治療剤または予防剤をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＭＮ／ＣＡ９陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ−Ａ２４抗原に腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体が提示され、提示されたＨＬＡ−Ａ２４抗原複合体特異的ＣＴＬが増殖して腫瘍細胞を破壊することができ、従って、腫瘍の治療または予防が可能となる。ＭＮ／ＣＡ９は腎細胞癌において高頻度に発現しているので、本発明の腫瘍の治療剤または予防剤は、特に腎癌に対して有効に使用される。
【００２２】
本発明の腫瘍の治療剤または予防剤は、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994)に記載のものなどが応用可能である。また、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与、静脈注射などが考えられる。製剤中の本発明の腫瘍抗原ペプチドあるいはその誘導体の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg 〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００２３】
本発明はまた、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡをも提供するものである。本発明のＤＮＡは、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体のアミノ酸配列に基き、当業者であれば容易に合成することができる。本発明のＤＮＡの好適な例としては、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。
このような本発明のＤＮＡは、本発明の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体を製造する際に有効に用いられる。さらに以下に述べるように、本発明のＤＮＡはＣＴＬの誘導（腫瘍の治療又は予防）においても有効に用いることができる。
【００２４】
すなわち近年、複数のＣＴＬエピトープを連結させた、いわゆる"ポリトープ"をコードするＤＮＡを、ＤＮＡワクチンに利用する手法が用いられている（例えば Journal of Immunology, 160,p1717,1998などを参照のこと）。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡを少なくとも１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他の腫瘍抗原ペプチドをコードするＤＮＡも連結させることにより作製されたＤＮＡ（以下、当該連結されたＤＮＡを「組換えＤＮＡ」と称する）を、適当な発現ベクターに組み込むことにより、ＣＴＬの誘導剤（腫瘍の治療剤または予防剤）の有効成分とすることができる。また、前記の組換えＤＮＡを治療剤または予防剤として用いるのみならず、当該組換えＤＮＡを宿主細胞内で発現させて得られたポリペプチドも、腫瘍の治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。
【００２５】
ここで「組換えＤＮＡ」は、ＤＮＡ合成および通常の遺伝子工学的手法に基づき、例えば Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い容易に作製することができる。また、この組換えＤＮＡの発現ベクターへの組み込みも、前記基本書等に従い行うことができる。
作製された本発明の組換えＤＮＡが、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドを生じるか否かは、例えば以下の方法により測定することができる。
【００２６】
すなわちまず、COS-7細胞（ATCC CRL1651）やVA-13細胞（理化学研究所細胞開発銀行）といった細胞に対し、候補となる組換えＤＮＡを有する発現プラスミドと、HLA-A24抗原をコードするcＤＮＡ（Cancer Res.,55:4248-4252(1995)、Genbank Accession No.M64740）を有する発現プラスミドとをダブルトランスフェクトする。該トランスフェクトは、例えばリポフェクトアミン試薬（GIBCO BRL社製）を用いたリポフェクチン法などにより行うことができる。その後、HLA-A24に拘束性のCTLを加えて作用させ、該CTLが反応して産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γ、TNF-α）の量を、例えばＥＬＩＳＡ法や TNF releaseアッセイ法などで測定することによって、候補ＤＮＡが活性を有するか否かを調べることができる。
【００２７】
本発明の組換えＤＮＡを腫瘍の治療剤または予防剤として適用する際には、以下の方法が使用され得る。
すなわち、本発明の組換えＤＮＡを細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
【００２８】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００２９】
本発明の組換えＤＮＡを実際に医薬として作用させるには、当該ＤＮＡを直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外でＤＮＡを該細胞に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）。in vivo法がより好ましい。
【００３０】
in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。 in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明の組換えＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明の組換えＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明の組換えＤＮＡの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、0.0001mg〜100mg、好ましくは0.001mg〜10mgの本発明の組換えＤＮＡを、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００３１】
以上のような本発明の組換えＤＮＡの腫瘍患者への投与により、抗原提示細胞内で当該組換えＤＮＡに対応するポリペプチドが高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた個々の腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。本発明の組換えＤＮＡは、特に腎細胞癌の治療又は予防に有効である。
【００３２】
また、前記組換えＤＮＡを発現させることにより得られる「ポリペプチド」は、前記組換えＤＮＡを適当な発現ベクター（例えばｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１など）に組み込みこんで作製された発現プラスミドを宿主細胞に導入して形質転換体を得、この形質転換体を適当な培地で培養することにより、発現・生産することができる。ここで宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物、酵母のような単細胞真核生物、昆虫、動物などの多細胞真核生物の細胞などが挙げられる。また、宿主細胞への遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス法などがある。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。また、当該ポリペプチドがＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドを生じるか否かは、例えばマクロファージなどの食細胞に本発明のポリペプチドを取り込ませて細胞内でペプチド断片を生じさせ、その後、該ペプチド断片とＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体に対してHLA-A24拘束性のＣＴＬを加えて作用させ、該ＣＴＬが反応して産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γやTNF-α）の量を測定することなどによって調べることができる。
【００３３】
本発明のポリペプチドを腫瘍の治療剤または予防剤として適用する際には、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体と同様の投与形態、投与方法および投与量により、投与することができる。本発明のポリペプチドを腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。本発明のポリペプチドは、特に腎細胞癌の治療又は予防に有効である。
【００３４】
本発明はまた、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体に特異的に結合する抗体をも提供する。該抗体は、例えば、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989などに記載の方法により容易に作製される。すなわち、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を用いて常法により適宜動物を免疫することにより、腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は、特に腎細胞癌の診断において有効である。
【００３５】
本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体の提示された抗原提示細胞をも提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激により強い細胞傷害活性が認められたが、これは、末梢血単核球中に、本発明のペプチドとHLA-A24抗原（マウスにおいてはH-2K^d抗原）との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、そして、この抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導された結果に他ならない。このような、HLA-A24抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体の提示された抗原提示細胞は、以下に述べるような細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
【００３６】
細胞療法において用いられる抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を体外でパルスして、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を提示可能なＨＬＡ−Ａ２４抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされるものとしては、前記のようなペプチドの形態のみならず、本発明の組換えＤＮＡまたはそのＲＮＡの形態であっても、本発明のポリペプチドの形態であっても良い。
【００３７】
本発明の抗原提示細胞は、例えば腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは本発明のポリペプチドを体外でパルスしてＨＬＡ−Ａ２４抗原と前記ペプチドまたはその誘導体との複合体を作製することにより得られる(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、J.Immunol.,158:p1796,1997、Cancer Res.,59:p1184,1999）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM-CSFおよびIL-4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはポリペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
【００３８】
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明の組換えＤＮＡを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、 Cancer Res.,56:p5672,1996や J.Immunol.,161: p5607,1998などを参考にして行うことができる。また、ＤＮＡのみならずＲＮＡの形態でも同様に抗原提示細胞を調製することができるが、この場合は、 J.Exp.Med., 184: p465,1996などを参考にして行うことができる。
【００３９】
本発明は、前記抗原提示細胞を有効成分として含有するＣＴＬの誘導剤（腫瘍の治療剤）をも提供するものである。該治療剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。
また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。
前記治療剤を患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＭＮ／ＣＡ９陽性の患者の体内で効率良く特異的なＣＴＬが誘導され、腫瘍を治療することができる。本発明の抗原提示細胞は、特に腎細胞癌の治療に有効である。
【００４０】
本発明はさらに、HLA-A24抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体との複合体を認識するＣＴＬをも提供する。本発明のＣＴＬは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。
【００４１】
すなわちメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159 、1994）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン・ビトロで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J.Exp.Med.,185:453,1997 ）。これは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは本発明の組換えＤＮＡやポリペプチドを用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
【００４２】
さらに本発明は、本発明のＣＴＬを有効成分として含有する腫瘍の治療剤も提供する。該治療剤は、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文献記載の投与量が例示される。
前記治療剤を患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＭＮ／ＣＡ９陽性の患者の体内でＣＴＬによる腫瘍細胞の傷害作用が促進され、腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療することができる。本発明のＣＴＬは、特に腎細胞癌の治療に有効である。
【００４３】
本発明の腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体はまた、腫瘍を診断するための診断薬の有効成分とすることができる。すなわち、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体そのものを診断薬として用い、腫瘍が疑われる患者から得た試料（例えば血液、腫瘍組織など）中の抗体の存在を検出することにより、腫瘍の早期発見、再発、転移を診断することが可能である。また本発明の腫瘍抗原ペプチド等を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択にも利用できる。具体的には、イムノブロット法、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、蛍光または発光測定法などを用いることにより、当該診断を行うことができる。本発明の診断薬は、特に腎細胞癌の診断において有効に用いられる。
【００４４】
さらに近年、抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を用いて抗原特異的ＣＴＬを検出する新しい検出方法が確立された（Science,274:p94,1996）。本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体とＨＬＡ抗原との複合体を前記検出方法に供し、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出することにより、腫瘍の早期発見、再発、転移を診断することができる。また本発明の腫瘍抗原ペプチド等を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択や、当該医薬による治療効果の判定などにも利用できる。すなわち本発明においては、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分の一部として含有する、腫瘍の診断薬をも提供するものである。
具体的には、文献（Science,274:p94,1996）に記載の方法に従って蛍光標識したＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体の４量体を作製し、これを用いて腫瘍が疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬをフローサイトメーターにより定量することにより、前記診断を行うことができる。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００４６】
実施例１
ヒト MN/CA9 高発現 RenCa 細胞株及び BALB3T3 細胞株の樹立
ヒトMN/CA9 cDNA（Oncogene 9:2877−2888, 1994、NCBIデータベースAccession No. NP_001207）を、pBCMGSneoベクター（東京都立臨床医学総合研究所烏山一先生より供与）に組込んだ。構築した発現ベクターをエレクトロポレーション法を用いて、腎癌由来細胞株であるRenCa細胞（J.Immunopharmacol.,7:417-436(1985)）、及びマウス胎児由来細胞株である BALB3T3細胞(理研細胞バンク RCB0005)に導入し、高発現細胞株を作製した。樹立した各細胞を、それぞれMN-RenCa及びMN-3T3と命名して以下の実験に使用した。なお、各細胞での導入したMN/CA9 cDNAの発現については、抗MN/CA9モノクローナル抗体（mAbG250(IgG2a)；Int.J.Cancer, 38; 489-494(1986)）を用いたFACS解析、及びMixed haemoadsorption assay(MHA)法で確認した。
【００４７】
実施例２
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）株の樹立及びその性状解析
マイトマイシンC(MMC)で処理したMN-RenCa細胞（1×10⁵）とフロイントの不完全アジュバント(IFA)を乳化させ、これをBALB/cマウス（H-2K^d、4-6週令の雌、日本SLC）に2週間間隔で6回腹腔内投与することにより、免疫を行った。最終免疫操作１週間後、脾臓細胞を摘出・分散させた。この細胞分散液とマイトマイシン C(MMC)処理したMN-RenCa細胞を共培養（25cm²フラスコ内で培養、20ml RPMI1640(20% FBS, 50μM 2ME, 100IU/ml ペニシリン, 100mg/ml ストレプトマイシンを含む))することにより、in vitroにおける抗原再刺激を行った。1週間後、2 IU/mlのインターロイキン−２（IL-2）を加えた同様の培養液で1週間の培養を追加し、さらに放射線照射（50 Gy）したMN-3T3細胞（1×10⁶）を加え培養を行い再刺激を行った。上記再刺激操作を1回/週行った。以上によりMN/CA 9抗原特異的バルク CTL株を作製し、 MN/CA 9-CTL/bulkと命名して以下の実験に使用した。
【００４８】
MN/CA9-CTL/bulkのMN/CA 9抗原特異的反応性は、以下のTNF release assay法を用いて検討した。まず、96穴プレートにMN-RenCa細胞またはRenCa細胞を各2×10⁴個／穴植え込み、MN/CA 9-CTL/bulkを1×10⁵個／穴となるように添加した。更に24時間培養した後、50μｌの培養上清液を回収し、これを腫瘍壊死因子-α（TNF-α）感受性細胞株である WEHI164S細胞（ATCC Cat.No.CRL-1751）4×10³個／穴に加えた。その後、このWEHI164S細胞の生存率を、Cell Counting Kit（同仁化学）で検討することにより、MN/CA 9-CTL/bulkが産生した腫瘍壊死因子-α（TNF-α）量を間接的に評価した。図１に、上記細胞株に対するMN/CA 9-CTL/bulkの反応性を示した。
図１の結果より、 MN/CA 9-CTL/bulkは、MN/CA9抗原を発現しないRenCa細胞には反応しないが、MN/CA 9抗原を高発現する MN-RenCa細胞に強く反応してTNF-αを産生することが示された。よってMN/CA 9-CTL/bulkはMN/CA 9抗原を特異的に認識するCTLであることが示された。
【００４９】
次に MN/CA 9-CTL/bulkの細胞表現系を確認するために、抗CD8抗体（CD8a(Ly-2)モノクローナル抗体；ベクトンディキンソン）及び抗CD4抗体（GK1.5モノクローナル抗体；ベクトンディキンソン）を用いたFACS解析を行った。図２にFACS解析の結果を示した。
図２の結果より、 MN/CA 9-CTL/bulkはCD8陽性、 CD4陰性のCTL細胞であることを確認した。
【００５０】
実施例３
MN/CA 9 抗原特異的 CTL クローンの樹立及びその性状解析
MN/CA 9-CTL/bulk株よりクローン化したCTLを得ること目的として、限界希釈法を用いてクローニングを行い、得られたクローンをMN/CA 9-CTL/cloneと命名して以下の実験に使用した。さらにこのクローンのCTL活性を検討するために、ラクトースデヒドロゲナーゼ（LDH） release cytotoxicity assay法（プロメガ）を用いて、 MN-3T3及びBALB3T3に対する反応性を、キットの添付書に従い検討した。反応性の検討結果を図３に示した。
図３の結果より、 MN/CA 9-CTL/cloneはMN/CA 9抗原を発現しないBALB3T3には反応性を示さなかったが、 MN/CA 9抗原を高発現するMN-3T3には細胞傷害性活性を示した。従って、樹立したクローンはbulkのCTLと同様にMN/CA 9抗原特異的細胞傷害活性有していることが明らかとなった。
【００５１】
実施例４
MN/CA 9-CTL/clone が H-2K ^d 拘束性に認識するペプチドの同定
MN/CA 9-CTL/cloneがH-2K^d拘束性に認識するペプチドを同定するために、MN/CA 9タンパクアミノ酸配列中のマウスH-2K^d結合モチーフ（2番目のアミノ酸がチロシン（Y）又はフェニルアラニン（F）、 C末端のアミノ酸がロイシン（L）、イソロイシン（I）又はバリン（V）、なお当該マウスH-2K^d結合モチーフのうち2番目のアミノ酸:チロシン(Y)又はフェニルアラニン（F）、C末端のアミノ酸:ロイシン（L）又はイソロイシン（I）についてはHLA-A24結合モチーフに一致している）を有する配列を検索し、9アミノ酸よりなる3種の配列（ペプチドA:EYRALQLHL（配列番号：１）、ペプチドB:AYEQLLSRL（配列番号：２）、ペプチドC:RYFQYEGSL（配列番号：３）を選択した。なお、ペプチドAは MN/CA9のアミノ酸配列上の第219位〜227位の部分に該当し、ペプチドBは第288位〜296位の部分に該当し、ペプチドCは第323位〜331位の部分に該当するものである。これらのペプチドはBiogate社に依頼し、Fmoc法にて合成、精製を行った。
【００５２】
以下ペプチドBを例にとり、活性測定方法および結果を示す。
ペプチドＢをパルスしたBALB3T3細胞を標的細胞として、LDH release cytotoxicity assay法を用いて、 MN/CA 9-CTL/cloneがH-2K^d拘束性にペプチドＢを認識するか検討した。500μlのRPMI1640メディウムに懸濁した1×10⁵個のBALB3T3に10μｌのペプチド溶液(1mg/ml)を加え、室温で15分静置後、20％FBSを有した500μlのRPMI1640メディウムを加え、さらに室温で45分静置した後、37℃でさらに1.5時間静置した。このパルスした細胞をRPMI1640メディウムで２回洗浄後、cytotoxicity assayにおける標的細胞として用いた。図４にペプチドBをパルスした細胞に対するMN/CA 9-CTL/cloneの細胞傷害性活性の結果を示した。
図４の結果より、 MN/CA 9-CTL/cloneがペプチドBをパルスしたBALB3T3細胞特異的に細胞傷害性を示すことが明らかとなった。
【００５３】
実施例５
MN/CA 9 抗原ペプチドによる CTL 誘導
ペプチドＢを用いて、マウスにおいてin vitroで抗原特異的なCTLが誘導可能であるかを検討した。
ペプチドＢ（100μg/マウス）とフロイントの不完全アジュバント (IFA)を乳化させ、これをBALB/cマウス（H-2K^d陽性、日本SLC）に１週間間隔で３回皮下投与することにより免疫を行った。最終免疫操作1週間後、脾臓細胞を摘出・分散させた。この細胞分散液（2×10⁷細胞）とMMC処理したMN-RenCa細胞（1×10⁶細胞）を共培養（25cm²フラスコ内で培養、20ml RPMI(20% FBS, 50μM 2-ME, 100IU/ml ペニシリン, 100mg/ml ストレプトマイシンを含む)）することにより、in vitroにおける抗原再刺激を行った。4日後、これらの細胞をエフェクターCTL細胞として、実施例２で用いたTNF release assay法を用いて検討した。標的細胞としては、実施例４で示したペプチドBをパルスした細胞を同様に用いた。ペプチドBを用いて誘導したエフェクター細胞のペプチド特異的細胞傷害性活性の結果を図５に示した。
【００５４】
図５の結果より、ペプチドBを用いてCTL誘導を行ったマウス由来のエフェクター細胞は、ペプチドBをパルスしたBALB3T3細胞特異的な細胞傷害性を示すことが明らかとなった。
【００５５】
以上の結果より、MN/CA 9抗原によりBALB/c（H-2K^d）マウスにおいて誘導されるCTLがペプチドBを認識すること、またこのペプチドを用いてCTL誘導が可能であることが明らかとなった。
【００５６】
配列表フリーテキスト
配列番号：４に記載のアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、第９番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。
配列番号：５に記載のアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、第９番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、第９番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。
【００５７】
【発明の効果】
本発明により、 MN/CA9抗原由来のHLA-A24拘束性腫瘍抗原ペプチドおよび機能的に同等の特性を有するその誘導体、またはこれらの腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体を in vivoまたはin vitroで利用した腫瘍の治療剤、予防剤または診断薬などが提供される。本発明の腫瘍の治療剤または予防剤は、多くの患者に適用可能であり、さらに、発生頻度の高い腎細胞癌等に応用できるものであるため、抗腫瘍剤としての有用性が期待される。
【００５８】
【配列表】

【００５９】

【００６０】

【００６１】

【００６２】

【００６３】

【００６４】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、MN-RenCa細胞またはRenCa細胞に対するMN/CA9-CTL/bulkの反応性を示すグラフである。図中、黒塗りはTNF(100U)の結果を、斜線はMN/CA9-CTL/bulkとMN-RenCAの混合培養上清の結果を、横線はMN/CA9-CTL/bulkとRenCAの混合培養上清の結果を示す。
【図２】図２は、抗CD8抗体及び抗CD4抗体を用いてFACS解析を行った結果を示すグラフである。
【図３】図３は、MN-3T3及びBALB3T3に対するMN/CA 9-CTL/cloneの反応性を示すグラフである。図中、斜線はMN-3T3の結果を、黒塗りは3T3の結果を示す。また図中、E/T比は効果細胞（E）であるMN/CA9-CTL/cloneと標的細胞(T)であるMN-3T3又はBALB3T3の細胞数の比を示す。
【図４】図４は、ペプチドBをパルスしたBALB3T3細胞に対するMN/CA 9-CTL/cloneの細胞傷害性活性の結果を示すグラフである。図中、斜線はペプチドをパルスしたBALB3T3の結果を、黒塗りはBALB3T3の結果を示す。
【図５】図５は、ぺプチドBを用いて誘導したエフェクター細胞のペプチド特異的細胞傷害性活性の結果を示すグラフである。図中、黒塗りはペプチドをIFAエマルションで免疫し、in vitroでMN-RENCAで刺激したリンパ球の結果を、横線はペプチドなしのIFAエマルションで免疫し、in vitroでMN-RENCAで刺激したリンパ球の結果を、ドットはペプチドをIFAエマルションで免疫し、in vitroでRENCAで刺激したリンパ球の結果を、斜線はペプチドなしのIFAエマルションで免疫し、in vitroでRENCAで刺激したリンパ球の結果を示す。
[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an HLA-A24-restricted tumor antigen peptide derived from MN / CA9. More particularly, the present invention relates to HLA-A24-restricted tumor antigen peptides derived from MN / CA9 and derivatives thereof having functionally equivalent properties, these tumor antigen peptides and derivatives thereof in vivo or in vitro. The present invention relates to a therapeutic agent, preventive agent, diagnostic agent, etc. for the tumor used.
[0002]
[Prior art]
It is known that the immune system, particularly T cells, play an important role in eliminating tumors by living bodies. In fact, infiltration of lymphocytes with cytotoxic activity against tumor cells is observed in human tumors (Arch. Surg., 126: 200, 1990), and cytotoxicity that recognizes tumor cells from melanoma T cells (CTL) are isolated relatively easily (Immunol. Today, 8: 385, 1987, J. Immunol., 138: 989, 1987, Int. J. Cancer, 52:52, 1992, etc.). Moreover, the importance of T cells in tumor elimination is also suggested from the clinical results of melanoma treatment by CTL transfer (J. Natl. Cancer. Inst., 86: 1159, 1994).
[0003]
Molecules targeted by CTLs that attack their own tumor cells have been unknown for a long time, but have become increasingly clear with recent advances in immunology and molecular biology. That is, CTL recognizes the complex of peptide called tumor antigen peptide and major histocompatibility complex class I antigen (also called MHC class I antigen, also called HLA antigen) using T cell receptor (TCR). It became clear that they attacked their own tumor cells.
[0004]
Tumor antigen peptides are produced by degrading intracellularly by proteasomes after proteins unique to tumors, ie, tumor antigen proteins, are synthesized in the cells. The produced tumor antigen peptide binds to the MHC class I antigen (HLA antigen) in the endoplasmic reticulum to form a complex, and is carried to the cell surface to present the antigen. This antigen-presented complex is recognized by a tumor-specific CTL and exhibits an antitumor effect through cytotoxicity and lymphokine production. With the elucidation of such a series of actions, the use of tumor antigen protein or tumor antigen peptide as a so-called cancer vaccine has enabled a therapeutic method for enhancing tumor-specific CTL in the body of a tumor patient.
[0005]
As a tumor antigen protein, T. Boon et al. First identified a protein named MAGE from human melanoma cells in 1991 (Science, 254: 1643, 1991). Since then, several tumor antigen proteins have been identified mainly from melanoma cells. The melanoma antigen includes gp100 (J. Exp. Med., 179: 1005, 1994), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3515, 1994), tyrosinase, which are melanocyte tissue specific proteins. (J.Exp.Med., 178: 489, 1993) and other MAGE-related proteins (J.Exp.Med., 179: 921, 1994) expressed in various cancer cells and normal testis cells as well as melanoma ), Β-catenin (J. Exp. Med., 183: 1185, 1996), CDK4 (Science, 269: 1281, 1995) having tumor-specific amino acid mutations have been identified. As tumor antigen proteins other than melanoma, HER2 / neu (J. Exp. Med., 181: 2109, 1995), p53 (mutant) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14704, 1996) ) And other oncogene products, tumor markers such as CEA (J.Natl. Cancer. Inst., 87: 982, 1995), PSA (J. Natl. Cancer. Inst., 89: 293, 1997), HPV (J .Immunol., 154: 5934, 1995) and EBV (Int.Immunol., 7: 653, 1995) have been identified. These are detailed in the description of reviews (Immunol. Today, 18: 267, 1997, J. Exp. Med., 183: 725, 1996, Curr. Opin. Immunol., 8: 628, 1996, etc.).
[0006]
MN / CA9 was identified as a membrane protein recognized by the monoclonal antibody M75 (Virology 187: 620-626, 1992), and the nucleotide sequence of the gene and the amino acid sequence of the protein have also been reported ( Oncogene 9: 2877-2888, 1994, NCBI database Accession No. NP_001207). MN / CA9 is also called G250 antigen because it is the same substance as the antigen recognized by monoclonal antibody G250. In normal tissues, MN / CA9 is expressed in cells having a high growth rate in the stomach, bile duct mucosa, and small intestine. In addition, MN / CA9 is not expressed in normal kidney tissues, but is expressed in 80% or more of renal cell carcinomas. Therefore, MN / CA9 is considered useful as a tumor marker for renal cell carcinomas ( Br. J. Cancer 81: 741-746, 1999). Recently, Vissers et al. Have reported an antigen peptide sequence that can induce CTL in an HLA-A2.1-restricted manner from the amino acid sequence of MN / CA9 (Cancer Res., 59: 5554-5549, 1999). ). However, there has been no report so far regarding the presence of tumor antigen peptide sequences restricted to HLA-A24, which is the most common type of HLA in Japanese.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an HLA-A24-restricted tumor antigen peptide derived from MN / CA9. More particularly, the present invention relates to HLA-A24-restricted tumor antigen peptides derived from MN / CA9 and derivatives thereof having functionally equivalent properties, these tumor antigen peptides and derivatives thereof in vivo or in vitro. It aims at providing the therapeutic agent, preventive agent, diagnostic agent, etc. of the utilized tumor.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have determined whether or not MN / CA9 has a tumor antigen peptide portion that is presented by binding to HLA-A24 antigen, that is, there is an HLA-A24-restricted tumor antigen peptide derived from MN / CA9. Whether or not it has been earnestly examined.
That is, first, a cell line that highly expresses MN / CA9 is established, and a CTL clone that specifically recognizes MN / CA9 is finally isolated from spleen cells obtained by immunizing mice with this cell line. Successfully established. Next, using this MN / CA9-specific CTL clone, an attempt was made to identify an HLA-A24-restricted antigen peptide that specifically recognizes the CTL. As a result, HLA-A24-restricted tumor antigen peptide portion exists in MN / CA9, and Ala-Tyr-Glu-Gln-Leu-Leu-Ser-Arg-Leu (SEQ ID NO: 2) It has been clarified for the first time that the peptide represented by (2) has high activity as a tumor antigen peptide.
[0009]
Since the MN / CA9-derived tumor antigen peptide of the present invention is a tumor antigen peptide that is presented to HLA-A24, which is the type of HLA that is most abundant in Japanese and about 60% of which is expressed, many patients. It is applicable to.
Furthermore, as described in the prior art, MN / CA9 was originally known as a protein whose expression is recognized in 80% or more of renal cell carcinoma (RCC). Renal cell carcinoma accounts for 80-90% of adult kidney tumors. The prognosis for renal cell carcinoma is poor and the 5-year survival rate is about 40-60%. Currently, there are few effective therapies other than surgery, and the therapeutic effect of chemotherapeutic agents cannot be expected, so the development of new therapies is desired. Also from this viewpoint, the tumor antigen peptide of the present invention is considered useful.
The present invention has been completed based on the above findings.
[0010]
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) a tumor antigen peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or a derivative thereof having functionally equivalent properties,
(2) The tumor antigen peptide according to (1), comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3,
(3) The tumor antigen peptide according to (2) above, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(4) The tumor antigen peptide derivative according to (1), comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6,
(5) The tumor antigen peptide derivative according to (4), comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5,
(6) A cytotoxic T cell inducer comprising the tumor antigen peptide or derivative thereof according to any one of (1) to (5) as an active ingredient,
(7) DNA encoding the tumor antigen peptide or derivative thereof according to any one of (1) to (5),
(8) the DNA according to (7), which encodes the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3,
(9) Recombinant DNA containing the DNA according to (7) or (8),
(10) A polypeptide obtained by expressing the recombinant DNA according to (9),
(11) A cytotoxic T cell inducer comprising the recombinant DNA according to (9) or the polypeptide according to (10) as an active ingredient,
(12) an antibody that specifically binds to the tumor antigen peptide or derivative thereof according to any one of (1) to (5),
(13) An antigen-presenting cell in which a complex of the HLA-A24 antigen and the tumor antigen peptide or derivative thereof according to any one of (1) to (5) above is presented,
(14) A cytotoxic T cell inducer comprising the antigen-presenting cell according to (13) as an active ingredient,
(15) A cytotoxic T cell that recognizes a complex of the HLA-A24 antigen and the tumor antigen peptide or derivative thereof according to any one of (1) to (5),
(16) The tumor antigen peptide or derivative thereof according to any one of (1) to (5), the recombinant DNA according to (9), the polypeptide according to (10), and the antigen-presenting cell according to (13) Or a therapeutic or prophylactic agent for a tumor comprising the cytotoxic T cell according to (15) as an active ingredient, and
(17) A tumor diagnostic agent comprising the tumor antigen peptide or derivative thereof according to any one of (1) to (5).
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The tumor antigen peptide of the present invention is an amino acid sequence derived from MN / CA9 (Oncogene 9: 2877-2888, 1994, NCBI database Accession No. NP — 001207), described in any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3. A peptide consisting of an amino acid sequence. Preferably, a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (Ala-Tyr-Glu-Gln-Leu-Leu-Ser-Arg-Leu) can be mentioned.
[0012]
The tumor antigen peptide of the present invention can be synthesized according to a method used in ordinary peptide chemistry. As a synthesis method, literature (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; peptide synthesis, Maruzen (stock) ), 1975; Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985; Drug Development Continued, Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991).
[0013]
The tumor antigen peptide of the present invention has a characteristic that it binds to the HLA-A24 antigen and is recognized by CTL (cytotoxic T cells). The characteristics as the tumor antigen peptide can be examined by, for example, the measurement method described in J. Immunol., 154, p2257, 1995. Specifically, when peripheral blood lymphocytes are isolated from a human positive for HLA-A24 antigen and stimulated by adding the peptide of the present invention in vitro, the HLA-A24 positive cells pulsed with the peptide are specifically identified. Measurement can be performed by inducing a CTL to be recognized automatically. Here, the presence or absence of CTL induction can be examined, for example, by measuring the amount of IFN-γ produced by CTL in response to antigen peptide-presenting cells by enzyme immunoassay (ELISA). In addition, the amount of TNF-α produced by CTL in response to antigen peptide-presenting cells can be examined by measuring the survival rate of a TNF-α-sensitive cell line (for example, WEHI164S cells) (see Examples). ).
[0014]
further,⁵¹Method for measuring CTL toxicity to antigen peptide-presenting cells labeled with Cr (⁵¹Cr release assay, Int. J. Cancer, 58: p317,1994). In addition, expression plasmids that express HLA-A24 cDNA (Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995), Genbank Accession No. M64740), such as COS-7 cells (ATCC No. CRL1651) and VA-13 cells, are used. The peptide of the present invention is pulsed to cells introduced into (Riken Laboratories Cell Bank), and the CTLs prepared above are reacted with the cells, and various cytokines produced by the CTLs (for example, IFN- It can also be examined by measuring the amount of γ or TNF-α).
Hereinafter, the measurement method as described herein may be referred to as “tumor antigen peptide measurement method”.
[0015]
In the present invention, “a derivative having functionally equivalent properties to a tumor antigen peptide” (hereinafter sometimes abbreviated as a tumor antigen peptide derivative) means one or several amino acids of the amino acid sequence of the tumor antigen peptide of the present invention. It is a modified form of a modified residue and has characteristics as a tumor antigen peptide that can be recognized by CTL by binding to HLA-A24 antigen. That is, as a tumor antigen peptide that is a modified form in which one or several amino acid residues are modified with respect to the amino acid sequence of the tumor antigen peptide of the present invention and that can be recognized by CTL by binding to the HLA-A24 antigen Those having the activity are included in the category of tumor antigen peptide derivatives of the present invention.
[0016]
Here, “modification” of an amino acid residue means substitution, deletion, and / or addition of an amino acid residue (including addition of an amino acid to the N-terminus and C-terminus of a peptide). Substituent substitution is mentioned. In the modification related to amino acid residue substitution, the number and position of amino acid residues to be substituted are arbitrary as long as the activity as a tumor antigen peptide is maintained.
[0017]
By the way, there is regularity (motif) in the sequence of the antigen peptide presented by binding to the HLA antigen. In the case of the HLA-A24 antigen, the second amino acid from the N-terminal of the peptide consisting of 8 to 11 amino acids is It is known that it is phenylalanine, tyrosine, methionine or tryptophan and the C-terminal amino acid is phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine (Immunogenetics, 41: 178,1995, J. Immunol., 152: p3913, 1994, J. Immunol., 155: 4307, 1994). More preferably, in the motif, the second amino acid from the N-terminus is phenylalanine, tyrosine or tryptophan, and the C-terminal amino acid is phenylalanine, leucine, isoleucine or tryptophan. In addition, amino acid residues having properties similar to the amino acids that can be taken on the motif may be allowed.
[0018]
Therefore, the tumor antigen peptide derivative of the present invention has an activity as a tumor antigen peptide by substituting the amino acid at the position where the amino acid can be substituted on these motifs, that is, the amino acid at the second position and / or the C-terminal with another amino acid. What you have is included. Preferred examples include tumor antigen peptide derivatives in which the amino acid at the second position and / or the C-terminal is substituted with an amino acid that can be substituted on the motif and has activity as a tumor antigen peptide. The length of the peptide is preferably about 8 to 11 amino acids from the viewpoint that it is presented by binding to the HLA-A24 antigen.
[0019]
Specifically, the amino acid at the second position of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3 is substituted with any of phenylalanine, tyrosine, methionine or tryptophan, and / or the C-terminal amino acid. In which amino acid sequence is substituted with any of phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan, and methionine, and has activity as a tumor antigen peptide. Specific examples of such tumor antigen peptide derivatives of the present invention include peptides consisting of the amino acid sequences set forth in any one of SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 6. Preferably, the peptide which consists of an amino acid sequence of sequence number: 5 is mentioned.
[0020]
Similar to the tumor antigen peptide of the present invention, the tumor antigen peptide derivative of the present invention is prepared by synthesizing a candidate peptide based on the peptide synthesis method and subjecting it to the method for measuring the tumor antigen peptide. And whether it has functionally equivalent characteristics.
[0021]
The tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof has an ability to induce CTL as described in Examples below, and the induced CTL has an antitumor effect through cytotoxicity and lymphokine production. Can be demonstrated. Therefore, the tumor antigen peptide or derivative thereof of the present invention can be used as an active ingredient of a therapeutic or prophylactic agent for tumors. The present invention provides a therapeutic or prophylactic agent for tumors containing a tumor antigen peptide or a derivative thereof as an active ingredient. When the therapeutic or prophylactic agent for tumor of the present invention is administered to an HLA-A24-positive and MN / CA9-positive patient, a tumor antigen peptide or a derivative thereof is presented to the HLA-A24 antigen of the antigen-presenting cell, and the presented HLA- A24 antigen complex-specific CTL can proliferate and destroy tumor cells, thus allowing tumor treatment or prevention. Since MN / CA9 is frequently expressed in renal cell carcinoma, the therapeutic or preventive agent for tumors of the present invention is particularly effective for renal cancer.
[0022]
The therapeutic or preventive agent for tumors of the present invention can be administered together with an adjuvant so that cellular immunity is effectively established, or can be administered in a particulate dosage form. As the adjuvant, those described in the literature (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) can be applied. Further, a liposome preparation, a particulate preparation bound to beads having a diameter of several μm, a preparation bound to lipid, and the like are also conceivable. As the administration method, intradermal administration, subcutaneous administration, intravenous injection and the like can be considered. The dosage of the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, but is usually 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.001 mg to 1000 mg. More preferably, the dose is 0.1 mg to 10 mg, which is preferably administered once every several days to several months.
[0023]
The present invention also provides a DNA encoding the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof. The DNA of the present invention can be easily synthesized by those skilled in the art based on the amino acid sequence of the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof. Preferable examples of the DNA of the present invention include DNA encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
Such DNA of the present invention is effectively used in producing the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof. Furthermore, as described below, the DNA of the present invention can also be used effectively in CTL induction (treatment or prevention of tumors).
[0024]
That is, in recent years, a technique of using DNA encoding a so-called “polytope” in which a plurality of CTL epitopes are linked to a DNA vaccine has been used (see, for example, Journal of Immunology, 160, p1717, 1998). . Accordingly, DNA prepared by linking at least one or more of the DNA encoding the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof, and, in some cases, by linking DNA encoding another tumor antigen peptide. (Hereinafter, the ligated DNA is referred to as “recombinant DNA”) can be used as an active ingredient of a CTL inducer (tumor therapeutic or preventive agent) by incorporating it into an appropriate expression vector. In addition to using the above-mentioned recombinant DNA as a therapeutic or prophylactic agent, a polypeptide obtained by expressing the recombinant DNA in a host cell is also used as an active ingredient of a tumor therapeutic or prophylactic agent. be able to.
[0025]
Here, the “recombinant DNA” can be easily prepared according to a basic book such as Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) based on DNA synthesis and general genetic engineering techniques. In addition, this recombinant DNA can be incorporated into an expression vector in accordance with the above-mentioned basic manual.
Whether or not the produced recombinant DNA of the present invention binds to the HLA-A24 antigen to produce a tumor antigen peptide that can be recognized by CTLs can be measured, for example, by the following method.
[0026]
That is, first, for cells such as COS-7 cells (ATCC CRL1651) and VA-13 cells (RIKEN Cell Development Bank), an expression plasmid having a candidate recombinant DNA and a cDNA encoding an HLA-A24 antigen ( Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995), Genbank Accession No. M64740) is double transfected. The transfection can be performed, for example, by a lipofectin method using a lipofectamine reagent (GIBCO BRL). After that, restrictive CTL is added to HLA-A24 and allowed to act, and the amount of various cytokines (for example, IFN-γ, TNF-α) produced by the reaction of the CTL is determined by, for example, ELISA or TNF release assay. It is possible to examine whether the candidate DNA has activity by measuring in (1).
[0027]
When the recombinant DNA of the present invention is applied as a therapeutic or prophylactic agent for tumors, the following method can be used.
That is, methods for introducing the recombinant DNA of the present invention into cells include viral vector methods and other methods (Nikkei Science, April 1994, pages 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23 -48 (1994), experimental medicine extra number, 12 (15), (1994), and cited references thereof, etc.) can be applied.
[0028]
As a method using a viral vector, for example, the DNA of the present invention is incorporated into a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a pox virus, a poliovirus, a simbis virus, or the like, and introduced. A method is mentioned. Of these, methods using retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses and the like are particularly preferred.
Examples of other methods include a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and the like. The method is preferred.
[0029]
In order for the recombinant DNA of the present invention to actually act as a medicine, an in vivo method in which the DNA is directly introduced into the body, and certain cells from human beings are collected and introduced into the cells outside the body. There is an ex vivo method to return it to the body (Nikkei Science, April 1994, 20-45 pages, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine Extra Number, 12 (15), (1994) , And references cited therein). In vivo methods are more preferred.
[0030]
When administered by an in vivo method, it can be administered by an appropriate administration route according to the disease, symptom or the like for treatment. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, intradermally, intramuscularly. When administered by an in vivo method, for example, it can be in the form of a preparation such as a solution, but is generally an injection containing the recombinant DNA of the present invention, which is an active ingredient, and is used as necessary. May be added. In addition, in the liposome or membrane fusion liposome (Sendai virus (HVJ) -liposome etc.) containing the recombinant DNA of the present invention, it should be in the form of a liposome preparation such as a suspension, a freezing agent, and a centrifugal concentrated freezing agent. Can do.
The content of the recombinant DNA of the present invention in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, but is usually 0.0001 mg to 100 mg, preferably 0.001 mg to 10 mg of the present invention. Recombinant DNA is preferably administered once every few days to several months.
[0031]
By administering the recombinant DNA of the present invention as described above to a tumor patient, the polypeptide corresponding to the recombinant DNA is highly expressed in the antigen-presenting cells. Thereafter, individual tumor antigen peptides generated by intracellular degradation bind to HLA antigens to form a complex, and the complex is displayed at a high density on the surface of the antigen-presenting cell. This complex-specific CTL Grows efficiently in the body and destroys tumor cells. As described above, treatment or prevention of a tumor is achieved. The recombinant DNA of the present invention is particularly effective for the treatment or prevention of renal cell carcinoma.
[0032]
The “polypeptide” obtained by expressing the recombinant DNA is obtained by introducing an expression plasmid prepared by incorporating the recombinant DNA into an appropriate expression vector (for example, pSV-SPORT1) into a host cell. Thus, a transformant is obtained, and the transformant can be expressed and produced by culturing the transformant in an appropriate medium. Examples of host cells include prokaryotes such as E. coli, unicellular eukaryotes such as yeast, and multicellular eukaryote cells such as insects and animals. Examples of methods for introducing genes into host cells include the calcium phosphate method, the DEAE-dextran method, and the electric pulse method. The polypeptide obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method. Whether or not the polypeptide binds to the HLA-A24 antigen to produce a tumor antigen peptide that can be recognized by CTLs is determined by incorporating the polypeptide of the present invention into a phagocytic cell such as macrophage, for example. Then, HLA-A24-restricted CTL is added to the complex of the peptide fragment and the HLA-A24 antigen to act, and various cytokines produced by the reaction of the CTL (for example, IFN-γ) Or by measuring the amount of TNF-α).
[0033]
When the polypeptide of the present invention is applied as a therapeutic or prophylactic agent for tumors, it can be administered by the same administration form, administration method and dosage as those of the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof. When the polypeptide of the present invention is administered to a tumor patient, it is taken up into antigen-presenting cells, and then each tumor antigen peptide generated by intracellular degradation binds to an HLA antigen to form a complex. The body is presented at high density on the surface of antigen-presenting cells, and CTLs specific for this complex grow efficiently in the body and destroy tumor cells. As described above, treatment or prevention of a tumor is achieved. The polypeptide of the present invention is particularly effective for treating or preventing renal cell carcinoma.
[0034]
The present invention also provides an antibody that specifically binds to the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof. The antibody is easily prepared by the method described in, for example, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. et al., Cold Spring Harber Laboratory Press published New York 1989. That is, an antibody that recognizes a tumor antigen peptide or a derivative thereof, and further an antibody that neutralizes the activity can be easily prepared by immunizing an animal appropriately with a conventional method using the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof. . Examples of the use of the antibody include affinity chromatography and immunological diagnosis. The immunological diagnosis can be appropriately selected from immunoblotting, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), fluorescence or luminescence assay. Such immunological diagnosis is particularly effective in the diagnosis of renal cell carcinoma.
[0035]
The present invention also provides an antigen-presenting cell in which a complex of the HLA-A24 antigen and the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof is presented.
In the examples described below, strong cytotoxic activity was observed by stimulation with the peptide of the present invention. This was caused by the fact that the peptide of the present invention and the HLA-A24 antigen (H-2K in mice) were present in peripheral blood mononuclear cells.^dThis is nothing but the result of inducing CTLs that specifically recognize the antigen-presenting cells. Such an antigen-presenting cell in which a complex of the HLA-A24 antigen and the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof is presented is effectively used in cell therapy (DC therapy) as described below.
[0036]
Antigen-presenting cells used in cell therapy are obtained by isolating cells having antigen-presenting ability from tumor patients, and pulsing the cells with the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof outside the body to produce HLA-A24 antigen and the present invention. It is produced by presenting a complex with a tumor antigen peptide or a derivative thereof on the cell surface. Here, the “cell having antigen-presenting ability” is not particularly limited as long as it is a cell expressing the HLA-A24 antigen capable of presenting the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof on the cell surface. Dendritic cells that are said to be high are preferred.
In addition, not only the peptide form as described above but also the recombinant DNA of the present invention or its RNA form may be pulsed to the cells having the antigen-presenting ability. Form may be sufficient.
[0037]
The antigen-presenting cells of the present invention are isolated from cells having antigen-presenting ability, for example, from a tumor patient, and the cells are pulsed with the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof, or the polypeptide of the present invention in vitro to produce HLA-A24. It is obtained by preparing a complex of an antigen and the peptide or a derivative thereof (Cancer Immunol.Immunother., 46: 82,1998, J. Immunol., 158: p1796,1997, Cancer Res., 59: p1184, 1999). When using dendritic cells, for example, lymphocytes are isolated from the peripheral blood of tumor patients by Ficoll method, then non-adherent cells are removed, and adherent cells are cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 to form dendritic cells. The antigen-presenting cell of the present invention can be prepared by inducing cells, culturing the dendritic cell with the tumor antigen peptide or polypeptide of the present invention, and pulsing.
[0038]
In addition, when preparing the antigen-presenting cell of the present invention by introducing the recombinant DNA of the present invention into a cell having the antigen-presenting ability, Cancer Res., 56: p5672, 1996 and J. Immunol., 161: p5607,1998 can be used as a reference. Further, antigen-presenting cells can be prepared similarly in the form of RNA as well as DNA, but in this case, it can be performed with reference to J. Exp. Med., 184: p465, 1996 and the like.
[0039]
The present invention also provides a CTL inducer (tumor therapeutic agent) containing the antigen-presenting cell as an active ingredient. The therapeutic agent preferably contains physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), a medium, or the like in order to stably maintain antigen-presenting cells. Examples of the administration method include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration.
The dosage is exemplified by the dosage described in the literature.
By returning the therapeutic agent to the body of the patient, specific CTLs are efficiently induced in the body of the HLA-A24 positive and MN / CA9 positive patient, and the tumor can be treated. The antigen-presenting cell of the present invention is particularly effective for the treatment of renal cell carcinoma.
[0040]
The present invention further provides a CTL that recognizes a complex of the HLA-A24 antigen and the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof. The CTL of the present invention is effectively used in the following adoptive immunotherapy.
[0041]
That is, in melanoma, a therapeutic effect is observed in adoptive immunotherapy in which a patient's own tumor-infiltrating T cells are cultured in large quantities outside the body and then returned to the patient (J. Natl. Cancer. Inst., 86: 1159, 1994). In mouse melanoma, splenocytes were stimulated in vitro with tumor antigen peptide TRP-2, CTL specific for the tumor antigen peptide was propagated, and the CTL was administered to melanoma transplanted mice to suppress metastasis. Is recognized (J. Exp. Med., 185: 453, 1997). This is based on the result of in vitro growth of CTL that specifically recognizes a complex of an antigen-presenting cell HLA antigen and a tumor antigen peptide. Therefore, the tumor-specific CTL is increased by stimulating a patient's peripheral blood lymphocytes in vitro using the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof, or the recombinant DNA or polypeptide of the present invention. Therapies that return the patient to the patient are considered useful.
[0042]
Furthermore, the present invention also provides a therapeutic agent for tumors containing the CTL of the present invention as an active ingredient. The therapeutic agent preferably contains physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), culture medium, etc. in order to maintain CTL stably. Examples of the administration method include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration. Moreover, as a dosage, the dosage of the said literature description is illustrated.
By returning the therapeutic agent to the body of the patient, the cytotoxic effect of CTLs on the tumor cells is promoted in the HLA-A24 positive and MN / CA9 positive patients, and the tumors are destroyed to treat the tumor. Can do. The CTL of the present invention is particularly effective for the treatment of renal cell carcinoma.
[0043]
The tumor antigen peptide and derivatives thereof of the present invention can also be used as an active ingredient of a diagnostic agent for diagnosing a tumor. That is, the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof itself is used as a diagnostic agent, and early detection of a tumor is detected by detecting the presence of an antibody in a sample obtained from a patient suspected of having a tumor (for example, blood, tumor tissue, etc.). It is possible to diagnose recurrence and metastasis. Moreover, it can utilize also for selection of the tumor patient who can apply the medicine which uses the tumor antigen peptide of this invention, etc. as an active ingredient. Specifically, the diagnosis can be performed by using an immunoblot method, RIA, ELISA, fluorescence or luminescence measurement method or the like. The diagnostic agent of the present invention is effectively used particularly in the diagnosis of renal cell carcinoma.
[0044]
Furthermore, in recent years, a new detection method for detecting antigen-specific CTL using a complex of an antigen peptide and an HLA antigen has been established (Science, 274: p94, 1996). Early detection, recurrence, and metastasis of a tumor can be diagnosed by using the complex of the tumor antigen peptide or derivative thereof of the present invention and the HLA antigen for the detection method and detecting the tumor antigen-specific CTL. Further, it can be used for selection of a tumor patient to whom a medicine containing the tumor antigen peptide or the like of the present invention as an active ingredient can be applied, and determination of a therapeutic effect by the medicine. That is, the present invention also provides a tumor diagnostic agent containing the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof as part of an active ingredient.
Specifically, a tetramer of a complex of a fluorescently labeled HLA antigen and a tumor antigen peptide was prepared according to the method described in the literature (Science, 274: p94, 1996), and this was used to suspect a tumor. The above-mentioned diagnosis can be carried out by quantifying antigen peptide-specific CTL in peripheral blood lymphocytes using a flow cytometer.
[0045]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited at all by these Examples.
[0046]
Example 1
Human MN / CA9 High expression RenCa Cell lines and BALB3T3 Establishment of cell lines
Human MN / CA9 cDNA (Oncogene 9: 2877-2888, 1994, NCBI database Accession No. NP_001207) was incorporated into the pBCMGSneo vector (provided by Dr. Hajime Isayama, Tokyo Metropolitan Institute of Clinical Medicine). Using the electroporation method, the constructed expression vectors were RenCa cells (J. Immunopharmacol., 7: 417-436 (1985)), a kidney cancer-derived cell line, and BALB3T3 cells (RIKEN), a mouse embryo-derived cell line. Introduced into cell bank RCB0005), a high expression cell line was prepared. The established cells were named MN-RenCa and MN-3T3, respectively, and used for the following experiments. For the expression of the introduced MN / CA9 cDNA in each cell, FACS analysis using an anti-MN / CA9 monoclonal antibody (mAbG250 (IgG2a); Int. J. Cancer, 38; 489-494 (1986)), And it confirmed by Mixed haemoadsorption assay (MHA) method.
[0047]
Example 2
Establishment of cytotoxic T cell (CTL) strain and analysis of its properties
MN-RenCa cells treated with mitomycin C (MMC) (1 × 10^Five) And Freund's incomplete adjuvant (IFA) are emulsified, and then mixed with BALB / c mice (H-2K).^d4-6 week old females, Japan SLC) were immunized by intraperitoneal administration 6 times at 2-week intervals. One week after the final immunization, spleen cells were removed and dispersed. This cell dispersion and mitomycin C (MMC) -treated MN-RenCa cells were cocultured (25 cm²In vitro antigen re-stimulation was performed by culturing in a flask and 20 ml RPMI1640 (containing 20% FBS, 50 μM 2ME, 100 IU / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin). One week later, MN-3T3 cells (1 x 10) were added with 1 week of culture in the same culture medium supplemented with 2 IU / ml interleukin-2 (IL-2) and then irradiated (50 Gy).⁶) Was added and cultured for restimulation. The restimulation operation was performed once / week. Thus, a MN / CA 9 antigen-specific bulk CTL line was prepared and named MN / CA 9-CTL / bulk and used in the following experiments.
[0048]
The MN / CA9-CTL / bulk MN / CA9 antigen-specific reactivity was examined using the following TNF release assay. First, add 2 x 10 MN-RenCa cells or RenCa cells to a 96-well plate.^Four1/10 holes / planting MN / CA 9-CTL / bulk^FiveIt added so that it might become a piece / hole. After further culturing for 24 hours, 50 μl of the culture supernatant was collected and used as a tumor necrosis factor-α (TNF-α) sensitive cell line, WEHI164S cells (ATCC Cat. No. CRL-1751) 4 × 10^ThreeAdded to piece / hole. Then, by examining the survival rate of this WEHI164S cell with Cell Counting Kit (Dojin Chemical), the amount of tumor necrosis factor-α (TNF-α) produced by MN / CA 9-CTL / bulk was indirectly evaluated. did. FIG. 1 shows the reactivity of MN / CA 9-CTL / bulk against the above cell lines.
From the results in FIG. 1, MN / CA 9-CTL / bulk does not react with RenCa cells that do not express MN / CA9 antigen, but reacts strongly with MN-RenCa cells that highly express MN / CA 9 antigen. It was shown to produce -α. Thus, MN / CA 9-CTL / bulk was shown to be a CTL that specifically recognizes the MN / CA 9 antigen.
[0049]
Next, to confirm the cell expression system of MN / CA 9-CTL / bulk, anti-CD8 antibody (CD8a (Ly-2) monoclonal antibody; Becton Dickinson) and anti-CD4 antibody (GK1.5 monoclonal antibody; Becton Dickinson) FACS analysis using was performed. FIG. 2 shows the results of FACS analysis.
From the results of FIG. 2, it was confirmed that MN / CA 9-CTL / bulk is a CD8-positive and CD4-negative CTL cell.
[0050]
Example 3
MN / CA 9 Antigen-specific CTL Establishment and characterization of clones
In order to obtain CTL cloned from the MN / CA 9-CTL / bulk strain, cloning was performed using the limiting dilution method, and the obtained clone was named MN / CA 9-CTL / clone and the following experiment was performed. Used for. Furthermore, in order to examine the CTL activity of this clone, the reactivity to MN-3T3 and BALB3T3 was examined according to the kit attachment using a lactose dehydrogenase (LDH) release cytotoxicity assay (Promega). The results of the examination of reactivity are shown in FIG.
From the results of FIG. 3, MN / CA 9-CTL / clone did not show reactivity to BALB3T3 that does not express MN / CA 9 antigen, but cytotoxicity to MN-3T3 that highly expresses MN / CA 9 antigen. Showed sexual activity. Therefore, it was clarified that the established clone had MN / CA 9 antigen-specific cytotoxic activity as well as bulk CTL.
[0051]
Example 4
MN / CA 9-CTL / clone But H-2K ^d Identification of peptides that recognize in a restrictive manner
MN / CA 9-CTL / clone is H-2K^dMouse H-2K in the MN / CA 9 protein amino acid sequence to identify peptides that recognize in a restrictive manner^dBinding motif (the second amino acid is tyrosine (Y) or phenylalanine (F), the C-terminal amino acid is leucine (L), isoleucine (I) or valine (V), and the mouse H-2K^dThe sequence having the second amino acid of the binding motif: tyrosine (Y) or phenylalanine (F), and the C-terminal amino acid: leucine (L) or isoleucine (I) is identical to the HLA-A24 binding motif) By searching, three types of sequences consisting of 9 amino acids (peptide A: EYRALQLHL (SEQ ID NO: 1), peptide B: AYEQLLSRL (SEQ ID NO: 2)) and peptide C: RYFQYEGSL (SEQ ID NO: 3) were selected. Peptide A corresponds to the portion of positions 219 to 227 on the amino acid sequence of MN / CA9, peptide B corresponds to the portion of positions 288 to 296, and peptide C corresponds to the portion of positions 323 to 331. These peptides were requested from Biogate and synthesized and purified by the Fmoc method.
[0052]
Hereinafter, taking the peptide B as an example, the activity measurement method and the results are shown.
Using BALB3T3 cells pulsed with peptide B as target cells, MN / CA 9-CTL / clone is H-2K using LDH release cytotoxicity assay.^dWhether peptide B was recognized in a restrictive manner was examined. 1 × 10 suspended in 500 μl RPMI1640 medium^Five10 μl of peptide solution (1 mg / ml) was added to each BALB3T3, allowed to stand at room temperature for 15 minutes, then added with 500 μl of RPMI1640 medium with 20% FBS, and further allowed to stand at room temperature for 45 minutes. It was allowed to stand for an additional 1.5 hours. The pulsed cells were washed twice with RPMI1640 medium and used as target cells in a cytotoxicity assay. FIG. 4 shows the results of cytotoxic activity of MN / CA 9-CTL / clone against cells pulsed with peptide B.
From the results of FIG. 4, it was revealed that MN / CA 9-CTL / clone shows cytotoxicity specifically in BALB3T3 cells pulsed with peptide B.
[0053]
Example 5
MN / CA 9 By antigen peptide CTL Guidance
Peptide B was used to examine whether antigen-specific CTL can be induced in vitro in mice.
Peptide B (100 μg / mouse) and Freund's incomplete adjuvant (IFA) are emulsified, and this is used in BALB / c mice (H-2K^dPositive, Japan SLC) was immunized by subcutaneous administration three times at weekly intervals. One week after the final immunization, spleen cells were removed and dispersed. This cell dispersion (2 × 10⁷Cells) and MMC-treated MN-RenCa cells (1 × 10⁶Cells) (25cm)²In vitro antigen re-stimulation was performed by culturing in a flask and carrying out 20 ml RPMI (containing 20% FBS, 50 μM 2-ME, 100 IU / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin). Four days later, these cells were used as effector CTL cells and examined using the TNF release assay method used in Example 2. As target cells, cells pulsed with peptide B shown in Example 4 were similarly used. The results of the peptide-specific cytotoxic activity of effector cells induced with peptide B are shown in FIG.
[0054]
From the results of FIG. 5, it became clear that the effector cells derived from mice in which CTL induction was performed using peptide B exhibited cytotoxicity specific to BALB3T3 cells pulsed with peptide B.
[0055]
Based on the above results, BALB / c (H-2K^dIt was revealed that CTLs induced in mice recognize peptide B, and that this peptide can be used to induce CTLs.
[0056]
Sequence listing free text
The second amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is phenylalanine, tyrosine, methionine or tryptophan, and the ninth amino acid is phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine.
The second amino acid of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is phenylalanine, tyrosine, methionine or tryptophan, and the ninth amino acid is phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine.
The second amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is phenylalanine, tyrosine, methionine or tryptophan, and the ninth amino acid is phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine.
[0057]
【The invention's effect】
According to the present invention, HLA-A24-restricted tumor antigen peptides derived from MN / CA9 antigen and derivatives having functionally equivalent characteristics, or tumors using these tumor antigen peptides and derivatives thereof in vivo or in vitro are used. A therapeutic, prophylactic or diagnostic agent is provided. The therapeutic or prophylactic agent for tumors of the present invention can be applied to many patients, and further, can be applied to renal cell cancer and the like with high frequency of occurrence, so it is expected to be useful as an antitumor agent .
[0058]
[Sequence Listing]

[0059]

[0060]

[0061]

[0062]

[0063]

[0064]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the reactivity of MN / CA9-CTL / bulk to MN-RenCa cells or RenCa cells. In the figure, black is the result of TNF (100 U), the diagonal line is the result of the mixed culture supernatant of MN / CA9-CTL / bulk and MN-RenCA, and the horizontal line is the mixed culture of MN / CA9-CTL / bulk and RenCA. The result of the supernatant is shown.
FIG. 2 is a graph showing the results of FACS analysis using an anti-CD8 antibody and an anti-CD4 antibody.
FIG. 3 is a graph showing the reactivity of MN / CA 9-CTL / clone against MN-3T3 and BALB3T3. In the figure, diagonal lines indicate the results for MN-3T3, and black indicates the results for 3T3. In the figure, the E / T ratio indicates the ratio of the number of cells of MN / CA9-CTL / clone, which is an effect cell (E), and MN-3T3 or BALB3T3, which is a target cell (T).
FIG. 4 is a graph showing the results of cytotoxic activity of MN / CA 9-CTL / clone against BALB3T3 cells pulsed with peptide B. In the figure, the diagonal lines indicate the results of BALB3T3 pulsed with peptide, and the black lines indicate the results of BALB3T3.
FIG. 5 is a graph showing the results of peptide-specific cytotoxic activity of effector cells induced with peptide B. In the figure, black marks indicate the results of lymphocytes immunized with IFA emulsion and stimulated with MN-RENCA in vitro, and horizontal lines indicate lymphocytes immunized with IFA emulsion without peptide and stimulated with MN-RENCA in vitro. Results for spheres, dots for immunized peptides with IFA emulsion and lymphocytes stimulated with RENCA in vitro, hatched results for lymphocytes immunized with IFA emulsion without peptide and stimulated with RENCA in vitro Indicates.

Claims

SEQ ID NO: consisting of the amino acid sequence set forth in 2, tumor瘍抗original peptide.

As an active ingredient a tumor antigen peptide of claim 1 Symbol placement, inducer of cytotoxic T cells.

DNA encoding the tumor antigen peptide of claim 1 Symbol placement.

Recombinant DNA containing a D NA of claim 3 Symbol placement.

A polypeptide obtained by expressing the recombinant DNA according to claim 4 .

An inducer of cytotoxic T cells comprising the recombinant DNA according to claim 4 or the polypeptide according to claim 5 as an active ingredient.

Claim 1 Symbol placement of tumor antigen peptide to specifically bind to an antibody.

Claim 1 Symbol placement tumor antigen peptide, therapeutic agent or prophylactic agent for tumors comprising a recombinant DNA according to claim 4, or a polypeptide de of claim 5 as an active ingredient.

Diagnostic agent for tumors comprising a tumor antigen peptide of claim 1 Symbol placement.