JP4763259B2

JP4763259B2 - 魚パルブアルブミンに基づく低アレルギー誘発性ポリペプチド

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Publication number: JP4763259B2
Application number: JP2004256454A
Authority: JP
Inventors: バレンテルドルフ; バルネペーター; スピッツザウアースーザン; スウォボダイネス
Original assignee: バイオメイアクツィエンゲゼルシャフト
Priority date: 2003-09-04
Filing date: 2004-09-03
Publication date: 2011-08-31
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Description

本発明は、主要な魚のアレルゲンであるコイのパルブアルブミンに由来するポリペプチドに関する。ポリペプチドは、低下したアレルギー誘発活性を示し、感作されたアレルギー患者の治療、および予防的ワクチン接種のための、アレルギーワクチンとして有用である。

牛乳、卵、ピーナッツ、木の実、および甲殻類と共に、魚はIgE媒介食物過敏症の誘導において最も重要なアレルゲン源である（非特許文献1〜3参照）。全世界で見れば一般的な健康問題でないとはいえ、魚アレルギーは、魚を食べるおよび魚を加工する国々において1000人あたり1人の発生率に達しうる（非特許文献4参照）。感作された個体では、魚との接触および消費のみならず、調理時に発生する蒸気の吸入によって、皮膚、気道、および消化管に影響を及ぼす多様なIgE媒介臨床症状を引き起こしうる（非特許文献5〜7参照）。

小さなカルシウム結合タンパク質であるパルブアルブミンは、下等脊椎動物の白筋において非常に豊富に存在し（非特許文献8参照）、高等脊椎動物の単収縮速筋において少量存在して（非特許文献9参照）、主要な魚アレルゲンとして同定された。これらのタンパク質は、カルシウム結合タンパク質のEF-ハンドスーパーファミリーに属し、ヘリックス-ループ-ヘリックス金属結合ドメインが存在することを特徴として、EFハンドと命名された（非特許文献10参照）。パルブアルブミンは、そのようなEFハンドモチーフ3個（AB、CD、およびEF部位）を含む（非特許文献11〜13参照）。これらの部位のうちの2つ（CDおよびEF）は対になり、2つの陽イオン、すなわちCa²⁺またはMg²⁺を結合することができる安定なドメインを形成する。第1の部位（AB）は陽イオンを結合することができないが、機能的ドメイン対の疎水性表面を覆い、それによって要素を安定化させるように作用するキャップを形成する（非特許文献14〜16参照）。アミノ酸配列データに基づき、パルブアルブミンタンパク質ファミリーは、進化的に異なる2つの系列に分割することができる：等電点がpI 5.0またはそれ以上の酸性度の低いパルブアルブミンからなるαグループ、および等電点がpI 4.5またはそれ以下のより酸性度の高いパルブアルブミンからなるβグループ（非特許文献17参照）。

パルブアルブミンは、熱、変性化学物質、およびタンパク質分解酵素に対して著しい抵抗性を示し、本特徴のために95％より多い魚アレルギー患者に対する強力な感作物質として作用することができる（非特許文献18〜22参照）。

本発明者らは、魚の1つの種のパルブアルブミンに対するIgE抗体を有する患者が他の魚の種の相同なタンパク質もまた認識することを発見した（非特許文献23参照）。精製コイパルブアルブミンによって実施したIgE競合実験において、コイのパルブアルブミンに様々な種の魚タンパク質抽出物に存在するIgEエピトープの大多数が含まれることがさらに示された（非特許文献24参照）。このことは、交叉反応性の魚アレルゲンとしてのパルブアルブミンの重要性を証明し、アレルギーの個人が様々な魚種との接触時に臨床症状を示す理由を説明した。

現在まで、I型アレルギーに対する唯一の治癒的アプローチは、アレルゲン特異的免疫療法であり、これは、患者においてアレルゲン特異的無反応状態を誘導することを目的として、アレルゲン含有抽出物の形で疾患誘発アレルゲンの増加量を全身投与することに基づく（非特許文献25参照）。しかし、アレルゲン特異的免疫療法は呼吸性および毒物性のアレルギーの治療に最も広く用いられているが、食物アレルギーの場合に応用するには危険すぎる。これは、食物アレルゲンの全身投与によって、ならびに食物抽出物（および特に魚抽出物）中の定義の不十分ないくつかの成分の存在によって引き起こされる重度のアナフィラキシー反応のリスクが極めて高いためである。

過去数年間に、アレルギー学の分野への組換えDNA技術の応用により、異種宿主におけるcDNAクローニングおよび発現によって生物学的に活性な組換え型アレルゲンがますます産生されるようになった（非特許文献26参照）。その天然の相対物のアレルゲン活性を厳密に模倣する組換え型アレルゲンによって、個々の患者の反応性プロフィールを決定し、患者に合わせた特異的免疫療法のための成分に基づいたワクチン接種戦略を開発することが可能となった（非特許文献27参照）。

コイの筋cDNA発現ライブラリを、魚アレルギー患者の血清IgEによってスクリーニングすることによって、本発明者らは、IgE反応性パルブアルブミンイソ型（Cyp c 1.01およびCyp c 1.02）をコードするcDNAクローンを単離し、天然のアレルゲンと同等の免疫学的特徴を有する最初の組換え型魚パルブアルブミン（rCyp c 1.01）を産生した（非特許文献28参照）。rCyp c 1.01は、調べた全ての魚アレルギー患者からのIgEと反応し、特異的かつ用量依存的な好塩基球ヒスタミン放出を誘導し、様々な魚種からの天然のアレルゲン抽出物に存在するIgEエピトープのほとんど（70％）を含んだ。

野生型rCyp c 1.01分子は、治療目的に用いることができない。非常に低用量であっても、投与は、生命に危険があるアナフィラキシー副作用を誘導するリスクが非常に高いと考えられる。本発明の目的は、アレルギー誘発活性が低下したrCyp c 1.01の変異体または変種を提供することである。本発明者らは、そのような低アレルギー誘発性のパルブアルブミン誘導体を得る1つの可能性は、タンパク質の襞を変化させてタンパク質の二次構造含有量を減少させるようにIgEエピトープの内部または外部のいずれかの重要なアミノ酸の部位特異的変異誘発であると考えられると提言する。しかし、熱、変性化学物質、またはタンパク質分解酵素のような脱安定化因子に対するパルブアルブミンの抵抗性（非特許文献29参照）は、ごく少数のアミノ酸の変化によって分子のアレルギー誘発活性を改変する劇的な構造変化を得ることが難しいことを示唆している。

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本発明は、魚アレルゲンに対する食物アレルギーの予防的または治療的な治療のための手段を提供することを目的とする。

コイのパルブアルブミン、例えば、Cyp c 1.01の変異体は、IgE結合が大きく減少し、したがって低アレルギー誘発性物質として有用であることが判明した。Cyp c 1.01のアミノ酸配列を配列番号：1に示す。本発明は、以下からなる群より選択される、魚パルブアルブミンに由来する天然に存在しないまたは変異したポリペプチドに関する：
（a）配列番号：1に示すアミノ酸配列に関して、アミノ酸残基1〜15個が欠失、置換、および／または付加されているアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（b）断片が少なくともアミノ酸15個の長さであって、断片のアミノ酸残基の少なくとも90％が、配列番号：1に示されるアミノ酸配列の対応する残基と同一である、（a）の断片を含むポリペプチド；
（c）断片が少なくともアミノ酸15個の長さである、配列番号：1に示されるアミノ酸配列の断片を含むポリペプチド；
（d）断片が少なくともアミノ酸10個の長さであって、断片のアミノ酸残基の少なくとも80％が配列番号：1に示されるアミノ酸配列の対応する残基と同一である、（a）の断片からなるポリペプチド；および
（e）断片が少なくともアミノ酸10個の長さである、配列番号：1に示されるアミノ酸配列の断片からなるポリペプチド。

本発明に係るポリペプチドにおいては、（１）以下からなる群より選択される、魚パルブアルブミンに由来する天然に存在しないポリペプチドであることを特徴とする：
（a）配列番号：1に示すアミノ酸配列に関して、アミノ酸残基1〜15個が欠失、置換、および／または付加されているアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（b）断片が少なくともアミノ酸15個の長さであって、断片のアミノ酸残基の少なくとも90％が、配列番号：1に示されるアミノ酸配列の対応する残基と同一である、（a）の断片を含むポリペプチド；
（c）断片が少なくともアミノ酸15個の長さである、配列番号：1に示されるアミノ酸配列の断片を含むポリペプチド；
（d）断片が少なくともアミノ酸10個の長さであって、断片のアミノ酸残基の少なくとも80％が配列番号：1に示されるアミノ酸配列の対応する残基と同一である、（a）の断片からなるポリペプチド；ならびに
（e）断片が少なくともアミノ酸10個の長さである、配列番号：1に示されるアミノ酸配列の断片からなるポリペプチド。

また、本発明に係るポリペプチドにおいては、（２）野生型Cyp c 1.01と比較して低下したアレルギー誘発活性を有する、上記(1)記載のポリペプチドであることを特徴とする。

また、本発明に係るポリペプチドにおいては、（３）哺乳類においてIgG反応を誘導することができる、上記(1)または(2)に記載のポリペプチドであることを特徴とする。

また、本発明に係るポリペプチドにおいては、（４）野生型Cyp c 1.01と比較して有意に減少したヒスタミン放出を誘導する、上記(1)〜(3)のいずれか一項に記載のポリペプチドであることを特徴とする。

また、本発明に係るポリペプチドにおいては、（５）野生型Cyp c 1.01と比較して低下したIgE結合活性を有する、上記(1)〜(4)のいずれか一項に記載のポリペプチドであることを特徴とする。

また、本発明に係るポリペプチドにおいては、（６）配列番号：1に示すアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換を1、2、3、4、5、または6個有する、請求項上記(1)〜(5)のいずれか一項に記載のポリペプチドであることを特徴とする。

また、本発明に係るポリペプチドにおいては、（７）配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、および配列番号：6に示す配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む変異ポリペプチドであることを特徴とする。

また、本発明に係るポリペプチドにおいては、（８）魚パルブアルブミンの野生型配列に関して、配列番号：1に関して置換または欠失しているアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置が、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、または配列番号：6において置換または欠失している、魚パルブアルブミンに由来する変異ポリペプチドであることを特徴とする。

また、本発明に係るポリペプチドにおいては、（９）上記(1)〜(8)のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする。

また、本発明に係るベクターまたはプラスミドにおいては、（１０）上記(9)記載のポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミドであることを特徴とする。

また、本発明に係る宿主細胞においては、（１１）上記(10)記載のベクターまたはプラスミドによって形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１２）ポリペプチドが発現される条件で、上記(11)記載の宿主細胞を培養する段階、および選択的に宿主細胞からポリペプチドを回収する段階を含む、上記(1)〜(8)のいずれか一項に記載のポリペプチドを調製する方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１３）ポリペプチドを化学合成する段階を含む、上記(1)〜(8)のいずれか一項に記載のポリペプチドを調製する方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る使用においては、（１４）アレルギー障害を治療および／または予防する薬剤を製造するための、上記(1)〜(8)のいずれか一項に記載のポリペプチド、上記(9)記載のポリヌクレオチド、または上記(11)記載の宿主細胞の使用であることを特徴とする。

また、本発明に係る使用においては、（１５）アレルギー障害が魚アレルギーである、上記(14)記載の使用であることを特徴とする。

また、本発明に係る使用においては、（１６）アレルギー障害がCyp c 1.01に対するアレルギーである、上記(15)記載の使用であることを特徴とする。

また、本発明に係る使用においては、（１７）薬剤が予防的ワクチン接種に用いられる、請求項14〜16のいずれか一項に記載の使用であることを特徴とする。

また、本発明に係る薬学的組成物においては、（１８）上記(1)〜(8)のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項上記(9)記載のポリヌクレオチド、または上記(11)記載の宿主細胞と薬学的に許容される担体もしくは希釈剤とを含む、薬学的組成物であることを特徴とする。

また、本発明に係る薬学的キットにおいては、（１９）上記(1)〜(8)のいずれか一項に記載のポリペプチド、上記(9)記載のポリヌクレオチド、上記(11)記載の宿主細胞、または上記(18)記載の薬学的組成物を含む薬学的キットであることを特徴とする。

本発明により、アレルギー障害、特に魚アレルギーを治療および／または予防するためのDNAワクチン接種において有用なポリヌクレオチドが提供された。

本明細書において用いられるように、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結合している少なくともアミノ酸7個を含む化合物を指す。ポリペプチドは、好ましくはアミノ酸のみを含むが、非タンパク質様成分を含んでもよい。ポリペプチドの長さは好ましくは少なくともアミノ酸10個、より好ましくは少なくともアミノ酸15個である。ポリペプチドはまた、Cyp c 1.01に由来する部分と融合パートナーとを含む融合タンパク質であってもよい。Cyp c 1.01に由来する部分はさらに、担体分子、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）に結合してもよい。

本明細書において用いられる「魚パルブアルブミン」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号：1に示すアミノ酸配列と少なくとも60％同一であるカルシウム結合ポリペプチドを指す。これらのポリペプチドは、それぞれの天然に存在する魚アレルゲンと同一のアミノ酸配列を有する。

本発明に従う「変異した」ポリペプチドは、野生型魚パルブアルブミンのような天然に存在するポリペプチドに変異（置換、付加、または欠失）を導入することによって操作されているポリペプチドである。

本発明に従う「天然に存在しない」ポリペプチドは、野生型の魚パルブアルブミンのような天然において認められうるポリペプチドとは構造的に異なるポリペプチドである。

アミノ酸置換は、1つのアミノ酸を異なるアミノ酸に置き換えることを指す。好ましくは、酸性残基（グルタミン酸、アスパラギン酸）を置換する。置換するアミノ酸は、任意の種類のアミノ酸であってもよいが、好ましくは酸性アミノ酸ではなく、より好ましくは疎水性アミノ酸であり、さらにより好ましくは、置換アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、およびロイシンからなる群より選択され、最も好ましくはアラニンである。

1つの態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号：1に示すアミノ酸配列に関して、アミノ酸1〜15個の欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、アミノ酸の欠失、置換、および／または付加の数は、1〜10個、より好ましくは1〜6個、さらにより好ましくは2〜6個、最も好ましくは2〜4個、例えば約4個である。本態様のポリペプチドは少なくともアミノ酸約94個の長さであり、好ましい長さはアミノ酸約109個である。好ましいポリペプチドは、配列番号：1に示すアミノ酸配列に関してアミノ酸置換を1、2、3、4、5または6個有する。

1つまたは複数のアミノ酸置換には、配列番号：1のアミノ酸52、54、91、および／または93位での置換が含まれてもよい。本発明のポリペプチドは、配列番号：1に示すアミノ酸配列に関して、少なくとも1つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでもよく、この少なくとも1つのアミノ酸置換は、配列番号：1のアミノ酸52、54、91、または93位から選択される配列番号：1の位置で起こる。本発明のポリペプチドは、配列番号：1に示されるアミノ酸配列に関して少なくとも2つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでもよく、この少なくとも2つのアミノ酸置換は、配列番号：1のアミノ酸52、54、91、または93位から選択される配列番号：1の位置で起こる。本発明のポリペプチドは、配列番号：1に示されるアミノ酸配列に関して少なくとも3つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでもよく、この少なくとも3つのアミノ酸置換は、配列番号：1のアミノ酸52、54、91、または93位から選択される配列番号：1の位置で起こる。本発明のポリペプチドは、配列番号：1に示されるアミノ酸配列に関して少なくとも四つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでもよく、この少なくとも四つのアミノ酸置換は、配列番号：1のアミノ酸52、54、91、または93位から選択される配列番号：1の位置で起こる。

本局面の最も好ましいポリペプチドは、配列番号：2、配列番号：3、または配列番号：4に示すアミノ酸配列を含む。配列番号：2によって示されるポリペプチドは、配列番号：1に示すアミノ酸配列と比較して2つの変異、すなわちD52AとD54Aとを有する。配列番号：3によって示されるポリペプチドは、配列番号：1と比較して変異D91AおよびD93Aを有する。配列番号：4に示されるポリペプチドは、配列番号：1と比較して変異D52A、D54A、D91A、およびD93Aを有する。本発明のさらなる局面は、配列番号：4のアミノ酸52〜93位、52〜102位、40〜102位、30〜105位、20〜105位、10〜109位、または2〜109位を含むポリペプチドである。それぞれの下限および上限を交互に組み合わせてもよい。これらのアミノ酸位置は、他の魚パルブアルブミンにも適用することができる（下記参照）。

本発明はさらに、上記（a）のポリペプチドの断片を含むポリペプチドに関する。断片は少なくともアミノ酸15個の長さを有し、すなわち上記（a）のポリペプチドの少なくとも15連続アミノ酸からなる。好ましくは、断片の長さは少なくともアミノ酸20個、より好ましくは少なくともアミノ酸25個、さらにより好ましくは少なくともアミノ酸30個である。断片のアミノ酸残基の少なくとも90％、好ましくは少なくとも92％、最も好ましくは少なくとも95％が配列番号：1に示すアミノ酸配列の対応する残基と同一である。配列同一性の割合（%）は、通常の方法によって決定される。配列番号：1に対する断片のアミノ酸配列の同一性の程度は、プログラム「Blast 2配列」（Tatusovaら、1999、FEMS Microbiol. Lett. 174：247〜250）を用いて、断片のアミノ酸配列と配列番号：1とを比較することによって決定してもよい。本状況において用いられるパラメータは
行列：BLOSUM 62；ギャップオープン：11；ギャップ伸長：1；Xドロップオフ：50；期待値：10；ワードサイズ：3；フィルター：なし
である。

もう1つの態様において、本発明のポリペプチドは、長さが少なくともアミノ酸15個の配列番号：1に示されるアミノ酸配列の断片を含む。断片は、配列番号：1に示すアミノ酸配列の少なくとも15連続アミノ酸、好ましくは少なくとも20連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも25連続アミノ酸、最も好ましくは30連続アミノ酸からなる。

本発明のポリペプチドは、本質的に上記（a）のポリペプチドの断片からなってもよい。本断片は、本質的に上記（a）のポリペプチドの少なくとも10連続アミノ酸からなり、好ましくは少なくとも15連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも20連続アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも25連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも30連続アミノ酸からなる。断片のアミノ酸配列は、配列番号：1に示すアミノ酸配列の対応する残基と少なくとも80％同一である。アミノ酸配列同一性の程度は上記のように決定される。配列番号：1のアミノ酸配列に対する断片の配列同一性は、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％である。

もう1つの態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号：1に示すアミノ酸配列の断片からなる。本断片は、配列番号：1に示すアミノ酸配列の少なくとも10連続アミノ酸、好ましくは少なくとも15連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも20連続アミノ酸、さらにより好ましくは25連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも30連続アミノ酸からなる。好ましいポリペプチドは、EFハンドモチーフの1つを形成するアミノ酸を少なくとも含む（配列番号：1に示すアミノ酸配列のアミノ酸D52-E63またはD91-E102）。例は、選択的にキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）のような担体分子にカップリングさせた配列番号：5（第1のEFハンドモチーフ）または配列番号：6（第2のEFハンドモチーフ）にそれぞれ示されるアミノ酸配列から実質的になるポリペプチドである。

本発明のポリペプチドは通常、野生型Cyp c 1.01と比較して低下したアレルギー誘発活性を有する。本発明に従って、「アレルギー誘発活性」という用語は、感作された哺乳類、例えば魚アレルギー患者における化合物または組成物のアレルギー反応誘導能を意味する。アレルギー反応は、肥満細胞の脱顆粒、陽性皮膚反応および／または陽性鼻反応であってもよい。アレルギー誘発活性は、好ましくは適したインビトロまたはインビボ試験において定義される。アレルギー誘発活性は、van Hage-Hamstenら、1999、J. Allergy Clin. Immunol.、104：969〜977またはPauliら、Clin. Exp. Allergy 2000、30：1076〜1084に記載されるように皮膚試験において決定してもよい。野生型Cyp c 1.01のアレルギー誘発活性は、本質的に配列番号：1に示されるアミノ酸配列からなる組換えによって産生されたCyp c 1.01を用いて決定してもよい。

好ましくは、ポリペプチドのアレルギー誘発活性は、野生型Cyp c 1.01のアレルギー誘発活性の50％未満である。より好ましくは、ポリペプチドのアレルギー誘発活性は、野生型タンパク質の25％未満である。最も好ましい態様において、ポリペプチドは、実質的にアレルギー誘発活性を有しない。一般的に、本発明のポリペプチドによって誘導されたヒスタミン放出は、Cyp c 1.01によって誘導されたヒスタミン放出と比較して有意に減少する。ヒスタミン放出を決定するための好ましいインビトロ試験は、Vrtalaら、1997、J. Clin. Invest.、99：1673〜1681に記載される好塩基球ヒスタミン放出アッセイ法である。好ましくは、ヒスタミン放出は、Cyp c 1.01が最大ヒスタミン放出を示すアレルゲン濃度で決定した場合に、少なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％、最も好ましくは少なくとも75％減少する。

先に言及したアレルギー誘発活性は、調べる血清または患者に応じて変化してもよい。上記の値は、アレルギー誘発活性の平均値、例えば少なくとも20例の無作為に選択された魚アレルギー患者またはその血清の試験によって決定された値を指す。

本発明のポリペプチドは通常、野生型Cyp c 1.01（配列番号：1）と比較して魚アレルギー患者からのIgE抗体に対する結合の減少を示す。IgE結合活性は、好ましくは、少なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％、最も好ましくは少なくとも75％減少する。本質的に配列番号：1に示すアミノ酸配列からなる組換え型Cyp c 1.01を用いて、野生型Cyp c 1.01のIgE結合活性を決定することができる。ポリペプチドのIgE結合は、魚アレルギー患者からの血清を用いて、ELISA、ウェスタンブロット分析、またはドットブロット実験において決定してもよい。魚アレルギーは、魚アレルギーを示す病歴、魚アレルゲンに対する陽性皮膚試験反応、および／または血清中の魚アレルゲンに対する特異的IgE抗体の検出に従って診断する。ドットブロットは、記述のように¹²⁵I標識抗ヒトIgE抗体の量をγ計数によって測定することによって定量することができる（Niederbergerら、1998、J. Allergy Clin. Immunol. 102：579〜591）。

上記で言及したIgE結合活性は、調べた血清または患者に応じて変化してもよい。上記の値は、平均IgE結合活性、例えば少なくとも20例の無作為に選択された魚アレルギー患者またはその血清の試験によって決定された値を指す（表3を参照されたい）。

場合によっては、本発明の所定のポリペプチドは、何人かの魚アレルギー患者のIgE抗体に対する結合活性の減少を示しうるが、他の魚アレルギー患者のIgE抗体に対する結合は変化しないかまたは増加さえ示す。そのようなポリペプチドは、結合が減少したIgE抗体が得られた患者の治療において有用であることから、同様に本発明の範囲内である。

本発明はさらに、（a）患者の血清からのIgE抗体に対する本発明のポリペプチドの結合活性を決定する段階、（b）本IgE抗体に対するCyp c 1.01の結合活性を決定する段階；および（c）（a）において決定されたIgE結合活性が（b）において決定されたIgE結合活性より有意に低ければ、本発明のポリペプチドを用いて患者を治療する段階を含む、魚アレルギー患者を治療する方法に関する。好ましくは、（a）において決定されたIgE結合活性は、（b）において決定された活性の75％未満、好ましくは50％未満、より好ましくは25％未満、最も好ましくは10％未満である。

本発明はさらに、（a）患者の血清からのIgE抗体に対する本発明のポリペプチドのインビトロ結合活性を決定する段階；（b）本IgE抗体に対するCyp c 1.01のインビトロ結合活性を決定する段階；および（c）（a）において決定されたIgE結合活性が（b）において決定されたIgE結合活性より有意に低ければ、本発明のポリペプチドを選択してこれを薬学的に許容される担体または希釈剤と混合する段階を含む、魚アレルギー患者を治療するための薬剤を製造する方法に関する。好ましくは、（a）において決定されたIgE結合活性は、（b）において決定された活性の75％未満、好ましくは50％未満、より好ましくは25％未満、最も好ましくは10％未満である。

好ましくは、本発明の魚パルブアルブミン由来ポリペプチドは、インビボでIgG抗体反応を誘導する。したがって、上記のポリペプチドは一般的に、少なくとも1つのIgGエピトープを含む。ポリペプチドは、個体または試験動物においてIgG抗体反応を誘発することができる場合に、少なくとも1つのIgGエピトープを含む。IgG反応を決定するための対応する試験は、花粉アレルゲンに基づく低アレルギー誘発性ポリペプチドに関する欧州特許出願第02021837号に記述される。より好ましくは、これらのIgG抗体は、IgE抗体がCyp c 1.01に結合しないようにする「遮断抗体」または「保護抗体」である。アレルギー症状の有意な減少はこのようにして達成してもよい。

本発明はさらに、本質的に、異なる魚パルブアルブミンおよび／または上記の異なるポリペプチドの断片2または3個からなるハイブリッドポリペプチドに関する。ハイブリッドポリペプチドは、好ましくは少なくともアミノ酸90個の長さである。

配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、または配列番号：6のアミノ酸配列によって示される変異に対応する変異を有する本発明のポリペプチドは、予想外に有利な特性を有すると予想されることが判明した。これらのアミノ酸配列において標的とされるアミノ酸の位置はまた、他の魚パルブアルブミンにおいても置換または欠失させることができる。したがって、本発明は、魚パルブアルブミンの野生型配列に関して、配列番号：1に関して置換または欠失しているアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置が配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、または配列番号：6において置換または欠失している、魚パルブアルブミンに由来する変異ポリペプチドに関する。配列番号：2〜6のいずれかにおいて変異しているアミノ酸位置に対応する他の魚アルブミンにおけるアミノ酸位置の同定は、当業者のレベル内である。例えば、当業者は、先に記述したプログラム「Blast 2配列」を用いて、配列番号：1〜6に示される配列のいずれかを、所定の魚パルブアルブミンのアミノ酸配列と整列化させてもよい。アラインメントから、変異させるべき対応するアミノ酸位置を容易に誘導することができる。例として、図6は、Cyp c 1.01パルブアルブミンおよびイクタルルス・パンクタツス（Ictalurus punctatus）からのパルブアルブミン（配列番号：10）のアラインメントを示す。置換または欠失すべきアミノ酸の位置は、配列番号：1のD52、D54、D91、および／またはD93に対応する。これらの位置は、イクタルルス・パンクタツスからのパルブアルブミン（配列番号：10）のアミノ酸配列のD68、D70、D107、およびD109に対応する。魚パルブアルブミンに由来するポリペプチドは、より大きいポリペプチドに含まれてもよく、またはKLHのような適した担体タンパク質とカップリングさせてもよい。それらはまた、それぞれの野生型と比較して低下したアレルギー誘発活性およびIgE結合能を有してもよく、上記のようなIgG反応を誘導することができる。いくつかの魚パルブアルブミンのアミノ酸配列は公知である。

（表１）天然に存在する魚パルブアルブミンの例

Cyp c 1.01以外の魚パルブアルブミンに由来するポリペプチドは、好ましくは、配列番号：2〜6のいずれか1つにおいて置換された位置に対応するアミノ酸位置で置換または欠失を含む。

本発明は、野生型魚パルブアルブミンのアミノ酸に関して、配列番号：1の52位および54位に対応する位置でアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含む、野生型魚パルブアルブミンに由来する天然に存在しないポリペプチドに関する。

本発明はさらに、野生型魚パルブアルブミンのアミノ酸に関して、配列番号：1の91位および93位に対応する位置でアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含む、野生型魚パルブアルブミンに由来する天然に存在しないポリペプチドにも関する。

本発明はさらに、野生型魚パルブアルブミンのアミノ酸に関して、配列番号：1の52位、54位、91位、および93位に対応する位置でアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含む、野生型魚パルブアルブミンに由来する天然に存在しないポリペプチドにも関する。

例は、配列番号：7に示すアミノ酸配列に関して、52位および54位のアミノ酸；91および93位；または好ましくは52位、54位、91位、および93位のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含む、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）のパルブアルブミンイソ型に由来する天然に存在しないポリペプチドである。もう1つの例は、配列番号：8に示すアミノ酸配列に関して、51位および53位のアミノ酸；90位および92位のアミノ酸；または好ましくは51位、53位、90位、および92位のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含む、コイ（Cyprinus carpio）のパルブアルブミンα（A1）に由来する天然に存在しないポリペプチドである。

配列番号：1に示すアミノ酸配列によって表される野生型Cyp c 1.01および本質的に野生型Cyp c 1.01からなるタンパク質は、本発明のポリペプチドではない。天然に存在する魚パルブアルブミンまたは同じアミノ酸からなる組換え型タンパク質は、本出願のポリペプチドではない（例えば、上記の表1に記載のパルブアルブミン等）。

低アレルギー誘発性パルブアルブミンは、必ずしもパルブアルブミンタンパク質に由来するアミノ酸配列のみからなる必要はない。それらはまた、宿主細胞における発現後にタンパク質の精製を促進する「タグ」配列を含むことが可能である。そのような「タグ」の例は、Ni²⁺キレートクロマトグラフィーによってタンパク質の精製を可能にするヘキサヒスチジンタグ（hexahistidine tag）である。しかし、他の多くのタグも同様に公知であり、当技術分野において用いられる。

本発明はまた、本明細書に開示のポリペプチドをコードするDNAおよびRNA分子を含む、ポリヌクレオチド分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重に関して、これらのポリヌクレオチド分子においてかなりの配列変化が可能であることを容易に認識するであろう。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよい。本発明に従って、ポリヌクレオチドが本発明において記述される通りである場合、センス鎖、アンチセンス鎖、およびセンス鎖とアンチセンス鎖の双方がそれぞれの水素結合を通して互いにアニーリングした二本鎖としてのDNAが特許請求の範囲であると理解されると認識される。同様に、本発明のポリペプチドをコードするメッセンジャーRNA（mRNA）も請求の範囲である。メッセンジャーRNAは、それぞれのチミジンヌクレオチド（T）がウラシルヌクレオチド（U）によって置換されていることを除き、DNAによって用いられる同じコドンを用いてポリペプチドをコードすると考えられる。

DNAおよびRNAを調製する方法は、当技術分野において周知である。Cyp c 1.01をコードする完全長のクローンは、通常のクローニング法によって得ることができる。Cyp c 1.01をコードするDNAは、適した特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅してもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、例えばホスホラミダイト法を用いて化学合成してもよい。Cyp c 1.01 cDNAのコード配列を配列番号：18に示す。

本発明はさらに、上記のポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミドに関する。一般的に、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、発現ベクターにおいて、一般的に転写プロモーターおよびターミネータのようなその発現のために必要な他の遺伝子要素に機能的に連結する。当業者は特定のシステム内で選択可能マーカーを異なるベクターにおいて提供してもよいことおよび外因性のDNAの複製は宿主細胞ゲノムへの組み込みによって提供してもよいことを認識すると考えられるが、ベクターはまた、1つもしくは複数の選択可能マーカー（例えば、抗生物質（antiviotic）耐性をコードする遺伝子）または1つもしくは複数の複製開始点を含むと考えられる。プロモーター、ターミネータ、選択可能マーカー、ベクター、および他の要素の選択は、当業者のレベル内の日常的な設計の問題である。そのような多くの要素が文献に記述されており、購入することができる。

本発明のもう1つの局面は、本発明に従うベクターまたはプラスミドによって形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞である。宿主細胞は原核細胞または真核細胞であってもよい。大腸菌、バシラス、および他の属の細菌株を含む原核宿主細胞は、本発明において有用な宿主細胞である。酵母、昆虫細胞、またはCHO細胞のような哺乳類細胞株を、真核宿主細胞として用いることができる。これらの宿主を形質転換して、そこでクローニングされた外来DNA配列を発現させる技術は当技術分野において周知である（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, a Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1989を参照されたい）。

本発明の宿主細胞は、本発明のポリペプチドを産生するために用いてもよい。したがって、本発明のさらにもう1つの局面は、ポリペプチドが発現される条件で上記の宿主細胞を培養する段階、および選択的に宿主細胞から本ポリペプチドを回収する段階を含む、本発明に従うポリペプチドを調製する方法である。大腸菌のような細菌において本発明のポリペプチドを発現させる場合、ポリペプチドは、細胞質において、おそらく不溶性の封入体として保持されてもよい。この場合、細胞を溶解して封入体を回収し、例えばグアニジンイソチオシアネートまたは尿素を用いて変性させる。次に、変性したポリペプチドを、尿素溶液ならびに還元および酸化グルタチオンの組み合わせに対する透析、ならびにそれに続く緩衝生理食塩液に対する透析によるような、変性剤を希釈することによってリフォールディングさせることができる。

形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞は、選択した宿主細胞の増殖にとって必要な栄養および他の成分を含む培養培地において通常の方法に従って培養される。合成培地および天然培地を含む多様な適した培地が当技術分野において公知であり、一般的にこれらには炭素源、窒素源、および無機質が含まれる。本発明のペプチドは純度80％以上に精製することが好ましく、より好ましくは純度95％以上、および高分子、特に他のタンパク質および核酸の混入に関して99.9％より大きい純度であって、感染物質および発熱物質を含まない薬学的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、本発明の精製ポリペプチドは、他のポリペプチドを実質的に含まない。発現された本発明の組換え型ポリペプチドは、分画および／または通常の精製法および媒体を用いて精製することができる。硫酸アンモニウム沈殿および酸またはカオトロープ抽出を、試料の分画のために用いてもよい。本発明のポリペプチドはまた、ポリペプチドに対する抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーによって単離してもよい。より短いポリペプチドは、好ましくはHPLCを用いて精製する。タンパク質を精製する方法は、例えば、Methods in Enzymology、182巻、Guide to Protein Purification、Academic Press New York、1990、およびScopes、Protein Purification、Springer Verlag, Heidelberg 1994に記載されている。

本発明のポリペプチドはまた、例えば、Merrifieldら、1963、J. Am. Chem. Soc. 85:2149、およびEthertonら、Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach、IRL Press、Oxford 1989に記述されるように、化学合成によって調製してもよい。

本発明はさらに、アレルギー障害を治療および／または予防する薬剤を製造するために本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または細胞を用いることに関する。障害は通常、1つまたは複数の魚アレルゲン、例えばCyp c 1.01に対するアレルギーである。好ましくは、障害はIgE媒介魚過敏症である。Cyp c 1.01は、異なる魚アレルゲンの関連するIgEエピトープのほとんどを含むことが判明した。したがって、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、ほとんどの任意の魚アレルギーの治療に用いてもよい。好ましくは、治療すべきアレルギー障害は、Cyp c 1.01に対するアレルギーまたは上記の表1に記載のタンパク質の少なくとも1つに対するアレルギーである。薬剤は、アレルギー障害の治療的治療のために、または障害の発症を予防するための予防的ワクチン接種のために用いてもよい。

本発明はまた、本発明の少なくとも1つのポリペプチドまたは少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む薬学的組成物にも関する。組成物はさらに、薬学的に許容される担体または希釈剤を含んでもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは、KLHのような担体分子にカップリングしている。

本発明のもう1つの局面は、本発明の少なくとも1つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む薬学的キットである。キットは、本発明に従う2つもしくはそれ以上の異なるポリペプチドまたは2つもしくはそれ以上の異なるポリヌクレオチドを含んでもよい。1つの態様において、キットは、Cyp c 1.01に由来する少なくとも1つの変異ポリペプチド、および他の魚アレルゲンに由来する少なくとも1つの変異ポリペプチドを含む。コイまたは他の魚に由来する他のアレルゲンおよびそのエピトープを含んでもよい。

薬学的に用いるために、本発明のポリペプチドは、通常の方法に従って経口送達、または非経口送達、特に皮下送達のために処方される。一般的に、薬学的製剤には、生理食塩液、緩衝生理食塩液、5％デキストロース水溶液等のような薬学的に許容される媒体と配合した本発明のポリペプチドが含まれると考えられる。製剤にはさらに、バイアル表面のタンパク質喪失等を防止するために、1つまたは複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、アルブミンが含まれてもよい。処方法は当技術分野において周知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro編、Mack Publishing社、Easton, PA, 第19版、1995に開示される。治療的または予防的用量は一般的に、容量100〜200 μlでの注射あたり0.1〜100 μgの範囲であると考えられるが、正確な用量は、容認された標準に従って、治療すべき病態の特性および重症度、患者の体質等を考慮に入れて医師によって決定される。用量の決定は当業者のレベルの範囲内である。量は、治療様式に応じて変化してもよい。免疫治療の場合、約25μg〜75μgの1回量を、約100 μl/注射の容量で投与することができる。経口投与の場合、用量0.1 μg〜50 mgを想定することができる。ワクチン接種の場合、患者は通常、「急速な免疫療法（rush immunotherapy）」を除き1日に何度も処置されない。一般的な免疫治療には、1〜2週間の間隔で投与され、2〜3年間のあいだ継続される約8回のワクチン接種が含まれる。好ましくは3〜5年にわたる3ヶ月間隔の年に4回の注射が適用される。特定の態様において、1つより多いポリペプチドが薬学的組成物に含まれる。

本発明はまた、IgE媒介魚過敏症を治療する薬剤を調製するために、低アレルギー誘発性のパルブアルブミンポリペプチド、低アレルギー誘発性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または低アレルギー誘発性のパルブアルブミンを発現する細胞を用いることに関する。そのような薬剤は、魚アレルギーに対するDNAに基づくワクチン接種のために直接用いることができるポリヌクレオチドからなってもよい。または、低アレルギー誘発性ポリペプチドを用いて、I型アレルギー障害の経口、舌下、または非経口治療のための製剤を調製してもよい。非経口治療の適用様式は、低アレルギー誘発性のパルブアルブミンの鼻腔内投与、またはアジュバントに結合させた低アレルギー誘発性ポリペプチドの皮下注射であってもよい。さらに、可能性がある応用はまた、細胞に基づく型の免疫治療を含む。この場合、抗原提示細胞を、低アレルギー誘発性のポリヌクレオチド配列を含むベクターによって形質転換して、それらは次いでインビボで低いアレルギー誘発を発現する。

本発明はまた、本発明に従うポリペプチド、ポリヌクレオチド、または細胞を含む、薬剤の薬学的組成物にも関する。これには、緩衝剤または塩溶液のような薬学的に許容される担体または希釈剤が含まれる。特定の態様において、薬学的組成物はまたアジュバントを含む。

rCyp c 1.01の機能的カルシウム結合部位の1つまたは双方を、2つの酸性アミノ酸を非極性残基に置換することによって改変した。意外にも、カルシウム結合ドメインの1つのみにそのような点突然変異を導入すると、アレルゲンのIgE反応性に対して既に重度の作用を示した。しかし、用いる血清によってIgE結合能の多様な変化が認められ、患者によっては野生型タンパク質よりもそのようなパルブアルブミン変異体に対してより高いIgE反応性が示された。対照的に、カルシウム結合ドメインの双方を改変すると、調べた全ての血清においてIgE反応性が完全に消失したことから、明らかに重要なIgEエピトープが全て破壊された。このように、数個のアミノ酸の変化によって、本発明者らは、高い反応性の食物アレルゲン（rCyp c 1.01）を低アレルギー誘発性分子に変換することに成功し、これは魚アレルギーのアレルゲン特異的免疫治療のために用いることができる。

パルブアルブミンの安定性を考慮すると、低下したアレルギー誘発活性を示すポリペプチドを産生するために、ごくわずかな点突然変異（アミノ酸置換）で十分であろうとは予測できなかった。

一般的に消費される魚種のパルブアルブミンにおける顕著なIgE交叉反応性、および組換え型コイパルブアルブミン（rCyp c 1.01）がいくつかの魚種のアレルゲン抽出物に存在するIgEエピトープのほとんどを含むという事実は（Swoboda, I.、A. Bugajska-Schretter、P. Verdino、W. Keller、W. R. Sperr、P. Valent、R. Valenta、およびS. Spitzauer、2002、Recombinant carp parvalbumin, the major cross-reactive fish allergen: A tool for diagnosis and therapy of fish allergy、J. Immunol. 168:4576）、rCyp c 1.01に基づく低アレルギー誘発性分子を用いて、魚アレルギー患者の大多数を治療できることを示唆している。

したがって、低アレルギー誘発性パルブアルブミン分子は、IgE媒介魚過敏症の免疫治療のための新しい道を開くと考えられる。低アレルギー誘発性変種は既定の成分からなることから、ワクチン接種治療のために十分に規定された製剤を作製することが可能であると考えられる。さらに、アレルギー誘発活性を欠くことから、低アレルギー誘発性のパルブアルブミンはウイルス感染症の予防に定期的に用いられるワクチンと比較して高用量で投与することができ、これにより高い治療効率が得られると考えられる。この点において、まだ感作されていない人において予防的ワクチン接種または免疫寛容の導入のために、これらの分子を用いることを検討してもよい。

本明細書に記述した本発明の様々な態様は、特に本発明の局面の好ましい型と相互に組み合わせてもよい。

本発明は、以下の非制限的な実施例によってさらに説明する。

実施例1：定量的IgE阻害試験による、組換え型コイパルブアルブミンが様々な魚種に存在するIgEエピトープの大部分を含むことの証明
組換え型コイパルブアルブミンの交叉反応能を試験して定量するために、魚アレルギー患者16人からの血清を、組換え型野生型パルブアルブミンと共に予めインキュベートして、既に記述されているように（Swoboda, I.、A. Bugajska-Schretter、P. Verdino、W. Keller、W. R. Sperr、P. Valent、R. Valenta、およびS. Spitzauer、2002、Recombinant carp parvalbumin, the major cross-reactive fish allergen: A tool for diagnosis and therapy of fish allergy、J. Immunol. 168:4576Swoboda, I.、A. Bugajska-Schretter、P. Verdino、W. Keller、W. R. Sperr、P. Valent、R. Valenta、およびS. Spitzauer、2002、Recombinant carp parvalbumin, the major cross-reactive fish allergen: A tool for diagnosis and therapy of fish allergy、J. Immunol. 168:4576）発現および精製させてから、タラ、マグロ、およびサケからのアレルゲン抽出物に曝露した。CAP-FEIA測定による残留IgE反応性の定量から、タラ抽出物に対するIgE結合の62％〜96％の減少、マグロ抽出物に対する33％〜98％の減少、およびサケ抽出物に対する41％〜95％の減少が明らかになった（表2）。これらの知見は、組換え型コイパルブアルブミンが、様々な魚種のアレルゲン抽出物に存在するIgEエピトープの大部分を含む、高度に交叉反応性のアレルゲンを表すことを示した。

実験プロトコール：
魚アレルギー患者16人からの血清を、組換え型コイパルブアルブミン5 μg、または対照目的でBSA 5 μg と共に予めインキュベートした。タラ、マグロ、およびサケの魚抽出物に対する残留IgE反応性を、CAP-FEIAシステム（Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン）を用いて定量した。組換え型アレルゲンに予め吸収させた後の魚抽出物に対するIgE結合の阻害率は、（（cpm_BSA−cpm_parv）／cpm_BSA）×100として計算され、ここで、cpm_BSAおよびcpm_parvは、BSAおよび組換え型コイパルブアルブミンと共にそれぞれ予め吸収させた後のIgE結合を示す。

（表２）血清を組換え型コイパルブアルブミンと共に予め吸収させた後の、タラ、マグロ、およびサケのタンパク質抽出物に対するIgE反応性の阻害率（CAP-FEIAシステムによって測定）

実施例2：パルブアルブミン変異体の構築
コイパルブアルブミンcDNA Cyp c 1.01（EMBLアクセッション番号AJ292211）を1つまたは双方の機能的カルシウム結合部位（CDドメインまたはEFドメイン）で改変するために、シャメロン二本鎖部位特異的変異誘発キット（Chameleon Double-Stranded, Site-Directed Mutagenesis Kit）（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ、カリフォルニア州）を用いて部位特異的変異誘発を行った。Ca²⁺結合ドメインは、カルシウム結合ループの第1および第3のアミノ酸（Asp）を非極性Ala残基に置き換えることによって変異させた。変異誘発実験は、2つの合成オリゴヌクレオチド（mutCDおよびmutEF）によって、発現ベクターpET-17bにクローニングしたCyp c 1.01 DNAを鋳型として用いて（Swoboda, I.、A. Bugajska-Schretter、P. Verdino、W. Keller、W. R. Sperr、P. Valent、R. Valenta、およびS. Spitzauer、2002、Recombinant carp parvalbumin, the major cross-reactive fish allergen: A tool for diagnosis and therapy of fish allergy、J. Immunol. 168:4576）製造元の説明書に従って実施した。双方のオリゴヌクレオチドは、パルブアルブミンcDNAの45 bpを含んだ。プライマーmutCD（5'-AAG GCC TTT GCT GTC ATT GCC CAA GCC AAG AGC GGC TTC ATT GAG-3'; 配列番号：16）は、コドン52（GAC→GCC）および54（GAC→GCC）に変化を導入し、mutEF (5'-GCC TTC CTG AAA GCT GGA GCC TCT GCT GGT GAT GGC AAG ATT GGA-3'; 配列番号：17）は、コドン90（GAC→GCC）および92（GAT→GCT）にそれぞれ変化を導入した。改変されたコドンは、オリゴヌクレオチド配列における下線で示す。改変は、T7シークエンシングキット（Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン）を用いてジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーションシークエンシング（Sanger, F.、S. Nicklen、およびA. R. Coulson、1977、DNA sequencing with chain terminating、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 74:5463）によって確認し、得られたタンパク質をMut-CD（CDドメインにおける変異）、Mut-EF（EFドメインにおける変異）、およびMut-CD/EF（双方のドメインにおける変異）と命名した。

実施例3：組換え型コイパルブアルブミンおよびパルブアルブミン変異体の発現と精製
組換え型野生型パルブアルブミンおよび3つのパルブアルブミン変異体を大腸菌株BL21（DE3）において発現させた。Mut-CDおよびMut-EFタンパク質のイソプロピルチオガラクトピラノシド（IPTG）誘導発現により、野生型タンパク質について認められたものと類似のタンパク質産生が得られ（Swoboda, I.、A. Bugajska-Schretter、P. Verdino、W. Keller、W. R. Sperr、P. Valent、R. Valenta、およびS. Spitzauer、2002、Recombinant carp parvalbumin, the major cross-reactive fish allergen: A tool for diagnosis and therapy of fish allergy、J. Immunol. 168:4576）、総大腸菌タンパク質あたり組換え型タンパク質は25〜30％であった。しかし、Mut-CD/EFを発現する細菌は増殖がより遅く、Mut-CD/EFタンパク質は総細菌タンパク質の約2〜3％に過ぎなかった。組換え型タンパク質は、細菌抽出物の可溶性細胞質分画から陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、15％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE；図2A）のクーマシーブリリアントブルー染色（Laemmli, U.K、1970、Cleavage of the structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4、Nature 227:680）による判定で約95％均一になるようにした。

実験プロトコール
組換え型タンパク質の発現は、100 mg/Lアンピシリンを含むLB培地においてOD₆₀₀が0.4となるまで増殖させておいた大腸菌BL21（DE3）細胞において誘導した。37℃で2時間誘導した後、タンパク質の大部分は、細菌抽出物の可溶性分画において認められた。細胞を回収して、10 mMトリス（pH 7.5）、1 mM PMSFにおいて再懸濁させ、液体窒素中で凍結して10〜15℃で融解する凍結融解サイクルを数回行うことによって溶解した。Mut-CD/EFの場合、融解した細胞は最終的にウルトラチュラックス（ultraturrax）（Polytron、Kinematica AG、スイス）によって機械的に破壊した。4℃、20,000×gで30分間遠心した後、透明にした上清をDEAEセルロース-セファロースカラム（DEAE Sepharose Fast Flow、Pharmacia Biotech、ウプサラ、スウェーデン）に載せた。精製タンパク質を含む分画を直線的な塩勾配（0〜0.5 M NaClの10 mMトリス、pH 7.5）によって溶出して、PBS（pH 7.4）に対して透析した。

実施例4：パルブアルブミン変異体の構造分析はによる、点突然変異によって有意な構造的変化が起こることの証明
組換え型野生型パルブアルブミンの遠紫外CDスペクトル（図1）は、208 nmおよび223 nmでの2つの広い最小値ならびに200 nm未満での強い最大値とを特徴とした。そのような形状は、αヘリックスがかなりの量存在する構造のしっかりしたタンパク質に典型的である。全体的に、カルシウム結合ドメインの1つが改変されている変異体（Mut-CDおよびMut-EF）のスペクトルは、野生型タンパク質の折りたたまれたタンパク質と同じ特徴を示した。しかし、双方のカルシウム結合ドメインに導入した変異（Mut-CD/EFの場合のような）によって、遠紫外スペクトルの形状に顕著な差が示された。約202 nmで認められた単一の広い最小値は、αヘリックス含有量および分子の二次構造の有意な減少、ならびにランダムコイルの折りたたまれていない構造に移行したことを示している。このように、少数の標的化点突然変異の導入によって、本発明者らは、この非常に安定なアレルゲンの構造を有意に改変することに成功した。

実験プロトコール
円二色性（CD）測定は、20℃で平衡にした光路1 mmの石英キュベット（Hellma、ムルハイム、バーデン、ドイツ）を用いて12.3〜24.0 μMのタンパク質濃度によって、Jasco（東京、日本）J-715分光偏光計によって行った。スペクトルは、解像度0.2 nm、スキャン速度50 nm/分で記録し、スキャン3回の平均値から得た。最終的なスペクトルは、同一の条件で得られた対応するベースラインスペクトルを差し引くことによって補正した。結果は、所定の波長での平均残基楕円率（Θ）として表記する。

実施例5：パルブアルブミン変異体はによるIgE結合能減少の証明
組換え型野生型および変異型のパルブアルブミンに対するIgE反応性を、イムノブロットおよびドットブロット実験において分析した。図2Bに示すイムノブロットは、魚アレルギー患者の血清によって探索して、変性した固定タンパク質のIgE結合能の例となる。血清は常に、野生型アレルゲンに対して強いIgE反応性を示し、Mut-CDまたはMut-EFに対してIgE結合の減少を示し、Mut-CD/EFに対しては結合を示さなかった。

さらに、本発明者らはまた、魚アレルギー患者23人の血清を用いて非変性のドットブロットパルブアルブミンタンパク質のIgE結合能を評価した（図3）。ドットブロットアッセイ法は、イムノブロット実験において得られたデータを確認し、カルシウム結合ドメインの1つにおける改変（Mut-CDまたはMut-EF）によって、用いた血清に応じてIgE反応性の様々な変化が起こることを示した。何人かの患者は、Mut-CDまたはMut-EFに対して野生型アレルゲンよりも高いIgE反応性を示しもした。一方、双方のカルシウム結合領域（Mut-CD/EF）における変異は、調べた血清の全てにおいてIgE結合能の完全な喪失を引き起こした。Mut-CD/EFの場合、γ計数によるIgE反応性の定量によって、IgE結合能は、パルブアルブミン野生型タンパク質のIgE結合能の0.5％〜67.6％であることが判明した（表3）。

（表３）ドットブロットした組換え型パルブアルブミン（野生型）およびパルブアルブミン変異体（Mut-EF、Mut-CD、Mut-CD/EF）に対する魚アレルギー患者のIgE反応性
IgE反応性はγ計数によって定量した。結果は1分間あたりの計数（cpm）で示す。

本発明者らはまた、イムノブロット競合アッセイ法を用いて、組換え型パルブアルブミン変種の、ニトロセルロースブロットした天然のコイパルブアルブミンに対するIgE結合阻害能を調べた（図4）。これらの実験において、患者の血清を過剰量の野生型または変異型のタンパク質に予め吸収させてから、固定した天然のアレルゲンに曝露した。プレインキュベーションの間、タンパク質とIgE抗体との反応が溶液中で起こり、それによってインビボでの状況を模倣した。図4に示すように、天然のアレルゲンに対するIgE結合は、組換え型野生型タンパク質を添加することによって完全に阻害された。Mut-CDおよびMut-EFは、野生型タンパク質より顕著に低い阻害能を示したが、Mut-CD/EFとのプレインキュベーションは、天然のパルブアルブミンに対するIgE結合に影響を及ぼさなかった。

これらの結果は、いずれのカルシウム結合部位におけるアミノ酸置換によっても、パルブアルブミン分子の全体的な構造は有意に変化しないことを示唆した。それにもかかわらず、Mut-CDまたはMut-EFが血清のいくつかにおいてIgE反応性の顕著な低下を引き起こしたことから、ドメインの1つにおける変異は、局所B細胞エピトープに対して影響を及ぼしたと結論づけることもできる。しかし、双方のカルシウム結合領域における改変は、調べたアレルギー患者の血清の全てにおいてIgE結合が完全に消失するように、タンパク質の構造的エピトープおよび／または変性に有意な変化を引き起こした。

実験プロトコール
イムノブロットおよびドットブロット分析：
魚アレルギー患者からの血清IgEに対する組換え型コイパルブアルブミン変種の反応性を、イムノブロットまたはドットブロット実験において決定した。イムノブロットの場合、精製タンパク質1.5 μgをSDS-PAGE（Laemmli, U.K、1970、Cleavage of the structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4、Nature 227:680）によって分離して、ニトロセルロースメンブレン（Schleicher & Schuell、ダッセル、ドイツ；Towbin, H.、T. Staehelin、およびJ. Gordon、1979、Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350）にブロッティングした。ドットブロット分析の場合、パルブアルブミンタンパク質のアリコート約0.5 μgをニトロセルロースメンブレンにドットした（Schleicher & Schuell）。いずれの場合も、フィルターを、PBST（0.5％v/vツイーン20を含むPBS、pH 7.5）によって1:10に希釈した患者血清によって探索して、結合したIgE抗体を、1:15に倍希釈した¹²⁵I標識抗ヒトIgE抗体（RAST、Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン）によって検出した。

イムノブロット競合実験：
イムノブロット阻害実験の場合、魚アレルギー患者からの血清を精製組換え型タンパク質と共に、かつ対照目的のために免疫学的に無関係なタンパク質（BSA）（1:10に希釈した血清の10 μg/ml溶液）と共に予めインキュベートした。その後、ニトロセルロースにブロットした精製天然パルブアルブミンを、予め吸収させた血清試料と共にインキュベートして、¹²⁵Iウサギ抗ヒトIgE抗体（Pharmacia）によって結合したIgEを検出した。

実施例6：組換え型パルブアルブミン変異体の好塩基球のヒスタミン放出誘導能の減少
パルブアルブミン変異体の生物活性を分析するために、魚アレルギー患者の末梢血好塩基球を、異なる濃度の組換え型野生型および変異型のタンパク質と共にインキュベートした（図5）。組換え型野生型タンパク質によって、好塩基性顆粒球からの強い用量依存的なヒスタミン放出が誘導された。放出されたヒスタミンの量は、顆粒球をMut-CDまたはMut-EFに曝露した場合にはより少なかったが、細胞をMu-CD/EFに暴露後は大きく減少した。Mut-CD/EFのこの有意に低下したアレルギー誘発活性は、変異したパルブアルブミン誘導体が、治療応用にとって適した候補分子であることを示唆している。

実験プロトコール：
好塩基球ヒスタミン放出アッセイ法
顆粒球をデキストラン沈降によって魚アレルギー患者のヘパリン加血液試料から単離した。細胞を、既に記述されているように（Valent, P.、J. Besemer、M. Muhm、O. Majdic、K. Lechner、およびP. Bettelheim、1989、Interleukin 3 activates human blood basophils via high-affinity binding sites、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5542）、増加した濃度の組換え型コイパルブアルブミン変種、抗ヒトIgE抗体、または緩衝液と共にインキュベートした。遊離したヒスタミンは、ラジオイムノアッセイ法（Immunotech、マルセイユ、フランス）によって無細胞上清において測定した。

精製組換え型パルブアルブミン（野生型）およびパルブアルブミン変異体（Mut-EF、Mut-CD、Mut-CD/EF）の遠紫外円二色性分析。結果は、所定の波長（x軸）での平均残基楕円率（Θ）（y軸）として表記する。精製組換え型パルブアルブミン（野生型）およびパルブアルブミン変異体（Mut-EF、Mut-CD、Mut-CD/EF）のSDS-PAGEおよびイムノブロット分析。A．クーマシーブリリアントブルー染色したSDS-PAGE。B．魚アレルギー患者の血清に対するIgE反応性を示すイムノブロット。分子量は左端に示す。組換え型パルブアルブミン（野生型）およびパルブアルブミン変異体（Mut-EF、Mut-CD、Mut-CD/EF）のニトロセルロースドットの2つ組に対する魚アレルギー患者4人のIgE反応性。魚アレルギー患者からの血清を、組換え型パルブアルブミン（野生型）、パルブアルブミン変異体（Mut-EF、Mut-CD、Mut-CD/EF）、またはウシ血清アルブミン（レーンBSA）と共に予めインキュベートした後の、ニトロセルロースドットした天然コイパルブアルブミンに対するIgE結合の阻害。分子量は左端に示す。精製組換え型パルブアルブミン（野生型）およびパルブアルブミン変異体（Mut-EF、Mut-CD、Mut-CD/EF）の生物活性。様々な濃度（μg/ml）の組換え型タンパク質（x-軸）によって刺激した魚アレルギー患者の好塩基球からのヒスタミン放出の誘導。上清に放出されたヒスタミンの割合をy軸に示す。 Cyp c 1.01とイクタルルス・パンクタツス由来のパルブアルブミンとのアラインメント。

Claims

以下からなる群より選択される、魚パルブアルブミンに由来する変異ポリペプチド：
（a）配列番号：1の52位、54位、91位および93位のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
（b）配列番号：4の2〜109位のアミノ酸を含むポリペプチド。
魚アレルギー患者において、配列番号：1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して低下したアレルギー反応誘導能を有する、請求項1記載のポリペプチド。
哺乳類においてIgG反応を誘導することができる、請求項1または2に記載のポリペプチド。
配列番号：1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して有意に減少したヒスタミン放出を誘導する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
配列番号：1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して低下したIgE結合活性を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
配列番号：4に示すアミノ酸配列を含む、変異ポリペプチド。
配列番号：1の52位、54位、91位および93位のアミノ酸に対応するアミノ酸位置で置換されている、魚パルブアルブミンに由来する変異ポリペプチド。
請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項8記載のポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミド。
請求項9記載のベクターまたはプラスミドによって形質転換またはトランスフェクトした単離宿主細胞。
ポリペプチドが発現される条件で、請求項10記載の単離宿主細胞を培養する段階、および任意で宿主細胞からポリペプチドを回収する段階を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチドを調製する方法。
ポリペプチドを化学合成する段階を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチドを調製する方法。
魚アレルギーを治療および／または予防する薬剤を製造するための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項8記載のポリヌクレオチド、または請求項10記載の単離宿主細胞の使用。
魚アレルギーが配列番号：1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対するアレルギーである、請求項13記載の使用。
薬剤が予防的ワクチン接種に用いられる、請求項13または14記載の使用。
請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項8記載のポリヌクレオチド、または請求項10記載の単離宿主細胞と、薬学的に許容される担体もしくは希釈剤とを含む、薬学的組成物。
請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項8記載のポリヌクレオチド、請求項10記載の単離宿主細胞、または請求項16記載の薬学的組成物を含む薬学的キット。