JP4782782B2

JP4782782B2 - オリゴマーペプチドおよびｈｉｖ感染症の治療のためのその使用

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Publication number: JP4782782B2
Application number: JP2007515966A
Authority: JP
Inventors: クヌートアーデルマン; フランクキルヒホッフ; ヤンミュンヒ; アクセルシュルツ; ヴォルフゲオルクフォルスマン
Original assignee: イーペーエフファルマシューティカルスゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 2004-06-18
Filing date: 2005-06-17
Publication date: 2011-09-28
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Description

本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)によるヒト細胞の感染症に対する阻害活性を示す、オリゴマーペプチドに関する。特にこれらは、アミノ酸配列(Z₁-LE-X₁-IP-X₂-X₃-X₄-P-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-K-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-Z₂)_nのモノマーペプチド鎖、および、その断片および／または誘導体、特に、アミド化、アルキル化、アシル化、硫酸化、ペギル化、ホルホリル化および／またはグリコシル化誘導体であるオリゴマーペプチド、およびそれらの変異体を含む、オリゴマーペプチドである：式中、nは、モノマーペプチド鎖の数を表し、従ってnは、２、３または４であり；X₁は、リシン、アラニン、またはアスパラギン酸であり；X₂は、システイン、メチオニンまたはイソロイシンであり；X₃は、セリン、システイン、リシンまたはグリシンであり；X₄は、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニンまたはシステインであり；X₅は、プロリン、D-プロリンまたは置換L-またはD-プロリンであり；X₆は、システインまたはグルタミン酸であり；X₇は、疎水性または芳香族側鎖を有するアミノ酸またはシステインであり；X₈は、疎水性または芳香族側鎖を有するアミノ酸またはシステインであり；X₉は、芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；X₁₀は、グリシン、アラニンまたはアスパラギンであり；X₁₁は、プロリン、アスパラギン酸、オクタヒドロインドリル-2-カルボン酸またはD-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸であり；X₁₂は、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、グルタミン酸またはD-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸であり；X₁₃は、疎水性または芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；X₁₄は、疎水性または芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；X₁₅は、フェニルアラニンまたは欠失部分であり；Z₁は、NH₂または１〜１０個のアミノ酸残基の配列であり；Z₂は、COOHまたは１〜１０個のアミノ酸残基の配列であり；ただし、(a)X₁₂がアラニン、グリシン、グルタミン酸、またはD-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸であるならば、X₁₃、X₁₄およびX₁₅はそれぞれ、フェニルアラニン、バリンおよびフェニルアラニンであり；および／または、(b)X₁₂がフェニルアラニンであるならば、X₁₃、X₁₄およびX₁₅はそれぞれ、バリン、フェニルアラニンおよび欠失部分であり；および、(c) オリゴマーペプチドのいずれのモノマーペプチド鎖にも、最大３個のシステイン残基があり；および、(d)該オリゴマーペプチドは、配列(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)₂(VIR-576)を有せず；および、(e)該モノマーペプチド鎖は、１つのペプチド鎖のN-末端ともう１つのペプチド鎖のC-末端との間がペプチド結合で結合されない。

本発明は、さらに、本発明によるオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖をコードする核酸分子に関するが、国際特許WO 2004/056871号に既に開示されたモノマーペプチド鎖をコードする核酸分子を除く。また、本発明は、前記オリゴマーペプチドに特異的に結合する抗体、および、前記のペプチド、核酸および／または抗体を含む医薬に関する。また、HIV感染症の治療用の医薬を製造するための、本発明のオリゴマーペプチドの使用も開示される。本発明は、また、本発明のオリゴマーペプチドの少なくとも１つを含む、HIVの融合ペプチドと相互作用する能力のある分子を見つけ出すためのアッセイに関する。さらに、本発明は、本発明のオリゴマーペプチドの少なくとも１つ、および／または、本発明の核酸分子少なくとも１つ、および／または、本発明の抗体の少なくとも１つを含有する、診断薬を開示する。また、言及したアッセイにおける本発明のオリゴマーペプチドの使用、および、単離した血漿、組織、尿、精液および／または髄液のHIV感染を試験するための前記診断薬の使用を開示する。

ここ数年、HIV感染症に対する活性を有する治療薬の独創的な研究が行われてきた。AIDSの発症を遅延および抑制し、血中のHIVレベルを低下させる、いくつかの医薬が開発・試験された。米国では、AIDS発症後のHIV感染患者の寿命が、1984年の11ヶ月から1997年には46ヶ月まで延びた。

治療薬の探索において、種々の方策が適用され、ウイルスの複製に必要なプロテアーゼを阻害するプロテアーゼブロッカー等の医薬、およびレトロウイルスの複製に必須のウイルスの逆転写酵素を阻害する医薬が数種類得られた。最近開発された活性薬剤群は融合阻害剤であり、これらはウイルスと宿主細胞との融合を阻害する。また、インターロイキン２と他の活性薬剤との組み合わせにより、免疫応答の強度を増すことができることも示された。

侵入阻害剤は、ウイルスが宿主へ付着し侵入する間に起こる、分子工程の１つを遮断することによって、HIVウイルス粒子の血液細胞への付着を遮断する。１つの重要な工程は、主要なケモカイン・コレセプターCCR5およびCXCR4（CCケモカイン受容体５およびCXCRケモカイン受容体４）の１つにHIVが結合することである。これらのコレセプターは、血液細胞の表面に位置し、ウイルスが侵入する前にHIVエンベロープへ結合することが必要である。侵入に必要なウイルスと細胞との相互作用のもう一つ工程は、HIVエンベローププロテインgp120が細胞CD4受容体へ結合することである。これらの工程はしばしば、ウイルス粒子の細胞標的への付着と見なされる。HIVのケモカイン・コレセプターへの結合を遮断することで、ウイルスの侵入を抑制することが示された(ストリズキ(Strizki)J.M.、Proc. Natl. Acad Sci.、米国、2001年、98巻、12718-12723頁)。gp120とCD4受容体との相互作用を遮断することによって、同じことが報告された(リン(Lin)ら、Proc. Natl. Acad Sci.、米国、2003年、100巻、11013-11018頁)。HIVのタンパク質gp41もまた、抗HIV薬開発の候補目的物と認められている(ゴードン(Gordon)ら、エイズ研究およびヒトレトロウイルス(AIDS Research and Human Retroviruses)11巻、677-686頁、1995年)。最初に認可された融合阻害剤はエンフビルチド(enfuvirtide)である(T-20、フゼオン(Fuzeon)、DP178)(国際特許WO 01/51673 A2号；国際特許WO 96/40191号；セルビア(Cervia)J.Sら、Clin. Infect. Dis、2003年、37巻、1102-1106頁；キルビー(Kilby)J.M.、ネイチャー・メディシン(Nature Medicine)、1998年、4巻、1302-1307頁)。この融合阻害剤は、HR-2と呼ばれるHIVエンベロープ・タンパク質gp41の一部と同一であり、gp41のHR-1セグメント（HR=7個の繰返し）に結合することによってHIV細胞の融合を阻害し、従ってHR-2がgp41のHR-1セグメントに結合するのを阻み、言い換えると、ウイルス粒子と血液細胞の融合に必要な６本のらせんの束の形成を阻む。T-20は、HIVのgp41のHR-1以外のタンパク質セグメント、またはウイルスまたは真核生物由来の他の分子にも結合することは示されていない。最近、HIVに対する生物活性を有するさらなる薬剤が、国際特許01/34640号に記載された。開示されたものは、VIRIP(ウイルス阻害ペプチド)と命名された20個のアミノ酸のペプチドであり、これはヒト血液濾液から単離され、ヒト細胞のHIV感染を阻害することが分かった。HIVに対する生物活性を有するVIRIPの合成誘導体が、国際特許2004/056871号に開示されている。

それらの努力および種々の入手可能な薬物にもかかわらず、知られている治療法は、体内のHIVレベルおよびHIV感染血液細胞のレベルを優位に低下させることは可能であるが、ウイルスを完全には除去しないので、なおAIDSに対する治療法がないという問題は解決されないままである。特有の難点は、HIVが特に変異しやすいことであり、それによりしばしばある治療薬に対し抵抗性が発現する。一般に、知られている治療薬は、他の治療薬と組み合わせて投与された場合のみ、充分な有効性がある。現在のところ、このような組み合わせた治療薬は、治癒はしないが標準的な患者の寿命を延ばし、一般に重篤な副作用を伴い、しばしば患者は「普通の」生活を送ることができない。

改良された治療薬となり、副作用がより少なく、かつAIDS発症前または発症後の、HIV感染者の平均余命を有意に延長する、新たな治療薬および改良された治療薬を提供する医学的必要性は大きい。

本発明は、この問題と向き合って新たな治療薬を提供するものであり、上述の通りの問題を克服し、効率的な療法を可能にするか、効率的な組み合わせの療法に貢献する。

［発明の要約］
驚くべきことに、上記の問題は、少なくともHIVのgp41の融合ペプチドと相互作用する、本発明によって提供されるオリゴマーペプチドによって解決される。この融合ペプチドは、約30個のアミノ酸残基からなるgp41のまさにアミノ末端部分である。現行モデルにおいて、gp41の疎水性融合ペプチドは、ウイルス粒子を宿主細胞膜と結合させるアンカー（いかり）となり(ディミトロフ(Dimitrov)A.S.ら、バイオケミストリー(Biochemistry)、2003年、42巻、14150-14158頁；モブレイ(Mobley)ら、Biochim. Biophys. Acta、1999年、1418巻、1-18頁)、本発明のペプチドは、HIV細胞の侵入プロセスを妨げて、ウイルスの侵入を防ぐ。

本発明のペプチドは、HIV感染症に対して生物活性を有するものであり、アミノ酸配列
(Z₁-LE-X₁-IP-X₂-X₃-X₄-P-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-K-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-Z₂)_n
のモノマーペプチド鎖、および、断片および／または誘導体、特に、アミド化、アルキル化、アシル化、硫酸化、ペギル化、ホルホリル化および／またはグリコシル化誘導体であるオリゴマーペプチド、およびそれらの変異体を含む。
式中、
nは、モノマーペプチド鎖の数を表し、従ってnは、２、３または４であり；
X₁は、リシン、アラニン、またはアスパラギン酸であり；
X₂は、システイン、メチオニンまたはイソロイシンであり；
X₃は、セリン、システイン、リシンまたはグリシンであり；
X₄は、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニンまたはシステインであり；
X₅は、プロリン、D-プロリンまたは置換L-またはD-プロリンであり；
X₆は、システインまたはグルタミン酸であり；
X₇は、疎水性または芳香族側鎖を有するアミノ酸またはシステインであり；
X₈は、疎水性または芳香族側鎖を有するアミノ酸またはシステインであり；
X₉は、芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；
X₁₀は、グリシン、アラニンまたはアスパラギンであり；
X₁₁は、プロリン、アスパラギン酸、オクタヒドロインドリル-2-カルボン酸またはD-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸であり；
X₁₂は、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、グルタミン酸またはD-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸であり；
X₁₃は、疎水性または芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；
X₁₄は、疎水性または芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；
X₁₅は、フェニルアラニンまたは欠失部分であり；
Z₁は、NH₂または１〜１０個のアミノ酸残基の配列であり；
Z₂は、COOHまたは１〜１０個のアミノ酸残基の配列であり；
ただし、
(a)X₁₂がアラニン、グリシン、グルタミン酸、またはD-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸であるならば、X₁₃、X₁₄およびX₁₅はそれぞれ、フェニルアラニン、バリンおよびフェニルアラニンであり；および／または
(b)X₁₂がフェニルアラニンであるならば、X₁₃、X₁₄およびX₁₅はそれぞれ、バリン、フェニルアラニンおよび欠失部分であり；および
(c) ペプチド中に、最大３個のシステイン残基があり；および
(d)該オリゴマーペプチドは(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)₂(VIR-576)ではなく；および
(e)該モノマーペプチド鎖は、１つのペプチド鎖のN-末端ともう１つのペプチド鎖のC-末端との間がペプチド結合で結合されない。

一般式
(Z₁-LE-X₁-IP-X₂-X₃-X₄-P-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-K-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-Z₂)_n
を有する上記のペプチドの好ましい具体例において、
X₇は、フェニルアラニン、システイン、バリン、イソロイシン、ロイシン、3,3-ジフェニルアラニン、1-ナフチルアラニン、またはp-フルオロフェニルアラニンであり；X₈は、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン、トリプトファン、グリシン、システイン、D-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸またはL-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸であり；X₉は、フェニルアラニンまたはD-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸であり；かつ、Z₁は好ましくはNH₂または１〜３個のアミノ酸残基の配列であり、かつ、Z₂は好ましくはCOOHまたは１〜３個のアミノ酸残基の配列である。上記のペプチドのHIV感染症に対する生物活性は、IC₅₀として測定すると、6500nM以下である。

HIVによる感染症に対する生物活性を有する、本発明のペプチドのさらなる具体例は、アミノ酸配列
(Z₁-LE-X₁-IP-X₂-X₃-X₄-P-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-K-X₁₁-FVF-Z₂)_n
を有するもの、および、断片および／または誘導体、特にアミド化、アルキル化、アシル化、硫酸化、ペギル化、ホルホリル化および／またはグリコシル化誘導体であるオリゴマーペプチド、およびそれらの変異体である。
式中、
nは、モノマーペプチド鎖の数を表し、従ってnは、２、３または４であり；
X₁は、リシン、アラニン、またはアスパラギン酸であり；
X₂は、システイン、メチオニンまたはイソロイシンであり；
X₃は、セリン、システインまたはグリシンであり；
X₄は、イソロイシンまたはシステインであり；
X₅は、プロリン、D-プロリンまたはあらゆる置換L-またはD-プロリンであり；
X₆は、システインまたはグルタミン酸であり；
X₇は、フェニルアラニン、システイン、バリン、イソロイシンまたは3,3-ジフェニルアラニンであり；
X₈は、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン、グリシン、システイン、D-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸またはL-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸であり；
X₉は、芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；
X₁₀は、グリシンまたはアスパラギンであり；
X₁₁は、プロリンまたはD-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸であり；
Z₁は、NH₂または１〜１０個のアミノ酸残基の配列であり；
Z₂は、COOHまたは１〜１０個のアミノ酸残基の配列である。

一般式(Z₁-LE-X₁-IP-X₂-X₃-X₄-P-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-K-X₁₁-FVF-Z₂)_n を有する上記のオリゴマーペプチドの好ましい具体例において、X₉はフェニルアラニンまたはD-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸であり、Z₁は好ましくはNH₂または１〜３個のアミノ酸残基の配列であり、Z₂は好ましくはCOOHまたは１〜３個のアミノ酸残基の配列である。上記のオリゴマーペプチドのHIV感染症に対する生物活性は、IC₅₀として測定する場合、2000nM以下である。

HIVによる感染症に対する生物活性を有する本発明のオリゴマーペプチドのさらなる具体例は、アミノ酸配列
(Z₁-LE-X₁-IP-X₂-X₃-IP-X₅-X₆-X₇-X₈-F-X₁₀-KPFVF-Z₂)_n
を有するもの、および、断片および／または誘導体、特に、アミド化、アルキル化、アシル化、硫酸化、ペギル化、ホルホリル化および／またはグリコシル化誘導体であるオリゴマーペプチド、およびそれらの変異体である。
式中、
nは、モノマーペプチド鎖の数を表し、従ってnは、２、３または４であり；
X₁は、リシン、アラニンまたはアスパラギン酸であり；
X₂は、システイン、メチオニンまたはイソロイシンであり；
X₃は、セリンまたはグリシンであり；
X₅は、L-プロリン、D-プロリンまたはあらゆる置換L-またはD-プロリンであり；
X₆は、システインまたはグルタミン酸であり；
X₇は、フェニルアラニンまたはバリンであり；
X₈は、フェニルアラニン、ロイシン、アラニンまたはL-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸であり；
X₁₀は、グリシンまたはアスパラギンであり；
Z₁は、NH₂または１〜１０個のアミノ酸残基の配列であり；
Z₂は、COOHまたは１〜１０個のアミノ酸残基の配列である。

一般式(Z₁-LE-X₁-IP-X₂-X₃-IP-X₅-X₆-X₇-X₈-F-X₁₀-KPFVF-Z₂)_nを有するオリゴマーペプチドの好ましい具体例において、Z₁は好ましくはNH₂または１〜３個のアミノ酸残基の配列であり、Z₂は好ましくはCOOHまたは１〜３個のアミノ酸残基の配列である。該ペプチドのHIV感染症に対する生物活性は、IC₅₀として測定する場合、800nM以下である。

HIVによる感染症に対する生物活性を有する本発明のオリゴマーペプチドのさらなる具体例は、アミノ酸配列
(Z₁-LEAIP-X₂-SIP-X₅-X₆-V-X₈-FNKPFVF-Z₂)_n
を有するもの、および、断片および／または誘導体、特に、アミド化、アルキル化、アシル化、硫酸化、ペギル化、ホルホリル化および／またはグリコシル化誘導体であるオリゴマーペプチド、およびそれらの変異体である。
式中、
nは、モノマーペプチド鎖の数を表し、従ってnは、２、３または４であり；
X₂およびX₆は、システインであるか、または、X₂がメチオニンであり、かつX₆がグルタミン酸であり；
X₅は、D-プロリンまたはL-プロリンであり；
X₈は、疎水性または芳香族側鎖を有するアミノ酸またはリシンであり；
Z₁は、NH₂または１〜１０個のアミノ酸残基の配列であり；
Z₂は、COOHまたは１〜１０個のアミノ酸残基の配列であり；
ただし、以下のうち、少なくとも１つが当てはまる：
X₂およびX₆がシステインである；
X₅がD-プロリンである；または
X₈がリシンではない。

一般式(Z₁-LEAIP-X₂-SIP-X₅-X₆-V-X₈-FNKPFVF-Z₂)_nを有するペプチドの好ましい具体例においては、Z₁は好ましくはNH₂または１〜３個のアミノ酸残基の配列であり、Z₂は好ましくはCOOHまたは１〜３個のアミノ酸残基の配列である。

好ましくは、本発明のオリゴマーペプチドにおいて、モノマーペプチド鎖は架橋される。モノマーペプチド鎖は、２つのモノマーペプチドの２つのアミノ酸側鎖の間、または、１つのモノマーペプチドのアミノ酸側鎖と別のモノマーペプチドのN-またはC-末端との間で、直接の分子間結合によって架橋されてもよい。本発明の別の具体例においては、結合はニ官能性のリンカー分子による間接的結合である。

また、本発明のオリゴマーペプチドの１つの具体例は、６位と１１位、６位と１２位、７位と１２位、または８位と１３位のモノマーペプチド鎖におけるシステイン残基が、分子内ジスルフィド結合によって結合されているものである。従って、これらの位置にシステイン残基を有するオリゴマーペプチドは、１つのモノマーペプチド鎖のこれらの残基の間の分子内架橋で生じてもよく、または、モノマーペプチド鎖の間のジスルフィド結合で生じる、即ち、オリゴマー化がジスルフィド結合で達成されてもよい。従って、１つの具体例は、それぞれのモノマーペプチド鎖が２つのシステイン残基を含み、第二のモノマーペプチド鎖の２つのシステイン残基にジスルフィド結合で結合する２つのシステイン残基によってオリゴマー化がなされて、２つのジスルフィド結合で結合される２つのモノマーペプチド鎖を含むホモ二量体となるような、オリゴマーペプチドである。また、１つの具体例は、それぞれのモノマーペプチド鎖に３つのシステインを有するオリゴマーペプチドであって、それぞれのモノマーユニットにおける２つのシステイン残基は、分子内ジスルフィド結合に関与し、分子内ジスルフィド結合に関与しないモノマー鎖のシステイン残基へのジスルフィド結合を形成することによって、それぞれのモノマーペプチド鎖における第三のシステインがオリゴマー化に関与する、オリゴマーペプチドである。さらなる具体例は、それぞれのモノマーペプチド鎖に１つのシステイン残基を有するオリゴマーペプチドであって、該システイン残基が互いにジスルフィド結合で結合されて、オリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖を結合する、オリゴマーペプチドである。このように形成されるホモ二量体は好ましい。それぞれのモノマーペプチド鎖においてシステイン残基を有するオリゴマーペプチドのさらなる具体例において、それぞれのモノマーペプチド鎖の少なくとも１つのシステイン残基は、オリゴマーペプチドの他のモノマーペプチド鎖の１つのシステイン残基へ向かう２つのチオール基を含む、ニ官能性の小さな有機スペーサー基によって架橋される。二量体は、少なくとも１つのシステイン残基を含むオリゴマーペプチドの好ましい具体例である。

さらなる具体例は、少なくとも１つの上述の特徴を含むオリゴマーペプチドであって、オリゴマーペプチドの少なくとも１つのモノマーペプチド鎖において、１位のアミノ酸のロイシン残基と２位のアミノ酸のグルタミン酸が、N-アルキル化アミド結合またはエステル結合または還元ペプチド結合またはretro-inverso型ペプチド結合またはN-アルキル化retro-inverso型ペプチド結合によって、共有結合で結合されているオリゴマーペプチドである。好ましいものは二量体であって、１位のアミノ酸のロイシン残基と２位のアミノ酸のグルタミン酸が、N-アルキル化アミド結合またはエステル結合または還元ペプチド結合またはretro-inverso型ペプチド結合またはN-アルキル化retro-inverso型ペプチド結合によって、共有結合で結合されている二量体である。

また、１つの具体例は、少なくとも１つの上述の特徴を有し、線形順序にモノマーペプチド鎖の2、3または4つの繰り返し単位を含むオリゴマーペプチドであって、それによって、モノマーペプチド鎖は、連続したモノマーペプチド鎖のZ₂とZ₁の間の間接的ペプチド結合によって、共有結合で結合される。アミノ基とカルボキシル基を有する小さな有機ニ官能性スペーサーが連続したモノマーペプチド鎖のZ₂とZ₁を結合する場合に、間接的ペプチド結合が生じる。間接的ペプチド結合を有するこのような線状オリゴマーペプチドにおいて、繰り返し単位は、全て同一のモノマーペプチド鎖であって、均一のオリゴマーペプチドを得るか、または、繰り返し単位は、四量体が1、2、3または4つの非同一のモノマーペプチド鎖を含み得るか、三量体が1、2または3つの非同一のモノマーペプチド鎖を含み得るか、または、二量体が2つの非同一のモノマーペプチド鎖を含み得るように、異なるモノマーペプチド鎖から選択されて、不均一のオリゴマーペプチドを得る。間接的ペプチド結合を有する好ましい線状オリゴマーペプチドは、２つの繰り返し単位を有するようなものであって、即ち、二量体である。また、１つの具体例は、環状オリゴマーペプチドであって、特に、2、3または4つのモノマーペプチド鎖を有するものである。環状オリゴマーペプチドの１つの形態は、モノマーペプチド鎖の繰り返し単位を含み、それによって、最初および全ての連続したモノマーペプチド鎖は、連続したモノマーペプチド鎖のZ₂とZ₁との間での直接的または間接的ペプチド結合によって共有結合で結合され、第一と第二のモノマーペプチド鎖の間および／または第一と第三のモノマーペプチド鎖の間および／または第一と第四のモノマーペプチド鎖の間に、および／または第二と第三のモノマーペプチド鎖の間および／または第二と第四のモノマーペプチド鎖の間に、および／または第三と第四のモノマーペプチド鎖の間に、少なくとも１つのさらなる共有結合が生じる。少なくとも１つのさらなる共有結合は、アミド結合の群から選択されてもよく、特に、アミノ酸残基の側鎖と酸性および塩基性アミノ酸との間、または第一のモノマーペプチド鎖のアミノ末端と最後のモノマーペプチド鎖のカルボキシ末端との間に生じるようなペプチド結合、オキシム結合、ヒドラゾン結合、チアゾリジン結合、チオエステル結合、エーテル結合およびシステイン残基間のジスルフィド結合等から選択されてもよい。

本発明のさらなる具体例は、少なくとも１つのシステイン残基を含む、あらゆる上述の線状オリゴマーペプチドであって、システイン残基によって、線状オリゴマーペプチドを含む、少なくとも１つのシステイン残基を有する別のオリゴマーペプチドのシステイン残基への直接的ジスルフィド結合が形成されるか、または、前記のシステイン残基が、２つのチオール基を有する短い有機ニ官能性スペーサーで互いに結合する、オリゴマーペプチドである。上述の線状オリゴマーペプチドと他のオリゴマーペプチドとの間のジスルフィド結合の代わりに、またはそれに加えて、これらのペプチド間の結合は、それぞれ、酸性および塩基性側鎖を有するアミノ酸残基の１つのカルボキシル基および１つのアミノ基との間に形成される、少なくとも１つのアミド結合によって形成される。あるいは、前記の酸性および塩基性側鎖は、アミノ基およびカルボキシル基を含む、短い有機ニ官能性スペーサーによって結合されてもよい。

本発明のオリゴマーペプチドのさらなる具体例は、モノマーペプチド鎖が、２つのモノマーペプチド鎖の間の少なくとも１つのアミド結合によって互いに共有結合で結合されるものであって、これは、１つのモノマーペプチド鎖における塩基性アミノ酸の側鎖のアミノ基と、別のモノマーペプチド鎖における酸性アミノ酸の側鎖のカルボキシル基との間の共有結合によって得られる。特に、このようなアミド結合は、リシン残基の側鎖とアスパラギン酸塩残基の側鎖との間、および／またはリシン残基の側鎖とグルタミン酸塩残基との間に形成することができる。さらなる具体例において、これらのペプチド鎖のオリゴマー化は、１つのアミノ基と１つのカルボキシル基を含有する二官能性の小さな有機スペーサーを用いて間接的に得られるが、このスペーサーは、そのアミノ基を１つのペプチド鎖の酸性アミノ酸のカルボキシル側鎖に、および、そのカルボキシル基を第二のペプチド鎖の塩基性アミノ酸の側鎖のアミノ基に共有結合で結合することによって、これらのモノマーペプチド鎖を架橋する。四量体、三量体および二量体は、モノマーペプチド鎖の酸性および塩基性アミノ酸の側鎖間での直接的または間接的アミド結合によって形成することができ、それによる二量体は好ましい具体例である。また、１つの具体例は、リシンおよび低級リシン誘導体等の、２個のアミノ基を含有するアミノ酸のアミノ官能基とカルボキシ末端のペプチド結合による共有結合で結合された、４個以下のペプチド鎖を含有するオリゴマーペプチドである。さらなる具体例は、オリゴマーペプチドであって、２個または４個のモノマーペプチド鎖および少なくとも１個のリシンコアを含み、モノマーペプチド鎖を共有結合で結合するものである。リシンコアは、結合分子（スペーサーとして記載することもできる）として機能し、式「KX」を有するが、式中、「X」はアミノ酸、ペギル基または欠失部分、即ち「X」は欠落である。リシンコアは、２個のモノマーペプチド鎖のそれぞれのカルボキシ末端と２つのペプチド結合を形成することによって、２個のモノマーペプチド鎖に結合する。リシンコアにおける好ましいアミノ酸はアラニンであり、好ましいペギル基は小型PEGである。リシンコアは、リシン残基または低級リシン同族体等の側鎖にアミノ基を有するアミノ酸を越えて、他のリシンコアとペプチド結合によって結合することができる。両リシンコアが２つのモノマーペプチド鎖に共有結合で結合する場合、得られるオリゴマーペプチドは４つのモノマーペプチド鎖を含む。リシンコアは、デンドリマー構造とも呼ばれ、モノマーペプチド鎖は、デンドリマーリシンコア構造に結合されると考えられる。さらなる具体例は、本発明のオリゴマーペプチドであって、該モノマーペプチド鎖が、天然および非天然アミノ酸の反応性側鎖を用いて、少なくとも１つのオキシム、ヒドラゾンおよびチアゾリジン結合によって結合される、オリゴマーペプチドである。オキシムおよびヒドラゾン結合は、セリン等の側鎖中にヒドロキシ基を有するアミノ酸から産生されるアルデヒド官能基と、ヒドロキシルアミンまたはヒドラジン側鎖との間に生じ、アミノオキシ酢酸、アミノセリンまたはヒドラジノカルボン酸等の特別なアミノ酸を介して導入することができる。チアゾリジン形成は、N-末端システイン残基とアルデヒド側鎖との間に起こり得る（例：チャン(Chan)W.C.ら(編者)、Fmoc固相ペプチド合成：実践的アプローチ(Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach)、オックスフォード大学出版局(Oxford University Press)、オックスフォード、2000年、p243-263；ノヴァバイオケム(Novabiochem) 2004/5カタログ、ペプチドおよび高処理量合成用試薬(Reagents for Peptide and High-Throughput Synthesis)、p.5.2-5.3）。また、本発明の具体例は、オリゴマーペプチドであって、それぞれのモノマーペプチド鎖が、側鎖に硫黄原子を有する少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、チオエーテル・ブリッジによってモノマーペプチド鎖の間を共有結合することができる、オリゴマーペプチドである。少なくとも１つのチオエーテル・ブリッジによって連結されるオリゴマーペプチドの中で、２つのモノマーペプチド鎖が連結されるもの、即ち、二量体が好ましい。モノマーペプチド鎖が、２つのチオール基を有する有機スペーサー、２つのアミノ基を有する有機スペーサー、２つのカルボキシル基を有する有機スペーサー、および１つのカルボキシル基と１つのアミノ基を有する有機スペーサーの群から選択されるニ官能性スペーサー分子によって互いに結合されるオリゴマーペプチドが、さらに好ましい具体例である。特に、２つのモノマーペプチド鎖、即ち二量体を有するオリゴマーペプチドが好ましい。

本発明のさらなる具体例は、HIV融合ペプチドであるgp41と相互作用するオリゴマーペプチドであって、VIR-574(配列番号2)またはVIR-577(配列番号3)等の、IC₅₀が6500nM以下、好ましくはIC₅₀が2000nM以下、最も好ましくは、IC₅₀が607nMであるVIR-673 (配列番号4)等の、IC₅₀が800nM以下であることを特徴とするものである。また、本発明の具体例は、本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖をコードする核酸であって、国際特許WO 2004/056871号に既に開示された核酸を除くものである。従って、国際特許WO 2004/056871号における、VIR-166、VIR-175、VIR-261、VIR-273、VIR-274、VIR-344、VIR-345、VIR-348、VIR-352、VIR-353、VIR357、VIR-358、VIR-448、VIR-449、VIR-454、VIR-455、VIR-483、VIR-484、VIR-512、VIR-568およびVIR-580にそれぞれ対応する、モノマーペプチド鎖VIR-674、VIR-675、VIR-676、VIR-677、VIR-678、VIR-679、VIR-680、VIR-681、VIR-682、VIR-683、VIR-684、VIR-685、VIR-686、VIR-687、VIR-688、VIR-689、VIR-690、VIR-691、VIR-692、VIR-693およびVIR-694をコードする核酸は、本発明の一部ではない。さらなる具体例は、これらの本発明のオリゴマーペプチドに特異的に結合する抗体である。該抗体は、オリゴマーペプチドを認識するが、単離したモノマーペプチド鎖を認識しないので、特異的である。従って、抗体結合部位は分子の一部を含むが、これは単独のモノマー鎖とは異なる。例えば、結合部位は、２つのモノマーペプチド鎖の間の結合を含む可能性がある。

さらなる具体例は、これらのオリゴマーペプチド、これらのオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖をコードする核酸であって特許請求しないもの以外のもの、またはこれらのオリゴマーペプチドに対する特異的な抗体のいずれかを含む、医薬である。１つの具体例において、該医薬は、経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内、皮下および／またはくも膜下投与のための製剤である。さらなる具体例は、少なくとも１つのさらなる治療薬を含む前記医薬である。また、１つの具体例は、前記の少なくとも１つのさらなる治療薬が、ウイルス・プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、融合阻害剤、サイトカイン、サイトカイン阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、グリコシル化阻害剤またはウイルスmRNA阻害剤等である、医薬である。HIV感染症の治療用医薬の製造のためのこれらのオリゴマーペプチドの使用は、さらなる具体例である。また、１つの具体例は、本発明の上述のオリゴマーペプチドのいずれかを含む、HIVの融合ペプチドと相互作用する能力のある分子を見つけ出すためのアッセイである。前記アッセイにおけるこれらのオリゴマーペプチドの使用もまた、１つの具体例である。さらなる具体例は、特許請求をしないもの以外の、上述のオリゴマーペプチド、核酸または抗体を含む診断薬である。もう１つの具体例は、HIV感染について、単離した血漿、組織、尿、精液および／または髄液のレベルを試験するためのアッセイシステムのための、診断薬の使用である。

本発明のオリゴマーペプチドは、国際特許WO 01/34640号に開示および記載された通りの、血液濾液由来ペプチドVIRIP（配列番号１）、およびPCT/EP03/15654号に開示および記載されたペプチドに関連し、それらはHIVによる感染症を防ぐ生物活性を有する。本発明のペプチドは、国際特許01/34640号およびPCT/EP03/15654号に開示および記載されたペプチドとは異なるが、それらは全て少なくとも２本の単独のモノマーペプチド鎖よりなるオリゴマー構造である。

モノマーペプチド鎖は、少なくとも１つの共有結合によって結合される。共有結合は、ジスルフィド結合、アミド結合であり得、特に、ペプチド結合、チオエーテル結合、エーテル結合またはオキシム、ヒドラゾンまたはチアゾリジン結合であり得る。本発明のオリゴマーペプチドを産生するため、モノマーペプチド鎖を、アミノ酸側鎖の反応基または末端官能基を用いて、少なくとも２本の単独のモノマーペプチド鎖を結合することによってオリゴマー化する。単独のペプチド鎖は、化学的に合成されるか、または生物工学的に製造され、即ち、例えば大腸菌等の細菌類、例えば酵母菌等の菌類などの微生物、および／または培養哺乳類細胞において、これらの単独のペプチド鎖をコードする核酸を発現させ、その後、それらを共有結合で結合してオリゴマーとする。オリゴマーペプチドは、デンドリマー構造として製造することもでき、この構造はアミノ酸または少なくとも２個のアミノ基を含有する基を含有し、そこにモノマーペプチド鎖を固相ペプチド合成技術を用いて結合する。このような基の例は、オルニチン、リシン、ジアミノブタン酸およびジアミノプロピオン酸(ノヴァバイオケム(Novabiochem) 2004/5カタログ、ペプチドおよび高処理量合成用試薬(Reagents for Peptide and High-Throughput Synthesis)、p.26-29)である。

本発明のオリゴマーペプチドは、間接的なペプチド結合によるモノマーペプチド鎖の繰り返し単位から線状に集合したポリペプチドも含み、ここで繰り返し単位はモノマーペプチド鎖に対応する。アミノ基およびカルボキシル基を有する小さな有機ニ官能性スペーサーが連続したモノマーペプチド鎖のZ₂とZ₁を結合する場合に、間接的ペプチド結合が生じる。

PCT/EP03/15654号に開示された配列(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)₂(VIR-576)を有するオリゴマーペプチドであって、二量化が２つのモノマーペプチド鎖の６位のシステイン残基の間のジスルフィド結合によってなされるものは、本発明のオリゴマーペプチドではない。しかしながら、配列(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)₂(配列番号56)を有する二量体であって、二量化があらゆる他の方法、特にグルタミン酸塩残基のいずれか１つと２個のアミノ基を有する小さなニ官能性リンカーによってなされ、グルタミン酸塩残基で２つのアミド結合を形成することによって２つのモノマー鎖が結合されるものは、本発明の一部である。また、本発明の一部は、配列(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)₂(配列番号57)を有する二量体であって、二量化が１６位のアミノ酸のリシン残基と２つのカルボキシル基を有する小さなニ官能性リンカーによってなされ、２つのリシン残基で２つのアミド結合を形成することによって２つのモノマー鎖が結合されるものである。

本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖は、少なくとも１３位のアミノ酸において野生型のVIRIP (配列番号1)と全く異なり、VIRIPはリシン残基を含有するが、本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖は１３位のアミノ酸にリシン残基を含有しない。そのことに加え、本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖は、VIRIP (配列番号1)と比較して、20または21個のアミノ酸にわたってさらにアミノ酸が変化している。本発明のオリゴマーペプチドは全て、VIRIP (配列番号1)より有意に高い抗HIV活性(2つのHIV-1株に対するIC₅₀として測定)を有する。本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖は、20または21個のアミノ酸のアミノ酸配列に基づいており、Z₁およびZ₂による両末端で1〜10個のアミノ酸の伸長が可能であり、3個のアミノ酸の伸長が好ましい。ここで使用するアミノ酸の番号は、残基Z₁による可能なN-末端の伸長にかかわらず、1位のアミノ酸がロイシンに対応し、21位のアミノ酸がフェニルアラニンまたは欠失部分に対応するように、基本的配列の1〜21位のアミノ酸に常に対応する。通常のアミノ酸の１文字表記および３文字表記が使用される。他に示されない場合、アミノ酸のL-光学異性体を使用した。小文字の「ｐ」はD-プロリンの略である。他のD-光学異性体は、前に「D-」を付けて示す。「Tic」はテトラヒドロイソキノリンカルボン酸の略である。「Oic」はオクタヒドロインドールカルボン酸の略である。

「オリゴマーペプチド」という用語は、特に２、３または４個のモノマーペプチド鎖を含むペプチドであって、互いに共有結合で結合しているペプチドを言う。共有結合で結合された2つのモノマーペプチド鎖で形成されるオリゴマーペプチドである、二量体が好ましい。前記二量体は、モノマーペプチド鎖の間に少なくとも１つの共有結合を含むが、より多くの共有結合を有していてもよい。３つのモノマーペプチド鎖を有するオリゴマーペプチドは、三量体と呼ばれる。４つのモノマーペプチド鎖を有するオリゴマーペプチドは、四量体と呼ばれる。三量体において、結合している共有結合の最小数は、少なくとも２であるが、もっと大きくてもよく、四量体は少なくとも３つの共有結合を含む。

「モノマーペプチド鎖」という用語は、オリゴマーペプチドのペプチド単位を言い、かつ20または21個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、Z₁およびZ₂による両末端で１〜１０個のアミノ酸の伸長が可能であり、3個のアミノ酸の伸長が好ましい。本発明のオリゴマーペプチドは、ｎ個のモノマーペプチド鎖を含む。

式（配列）_nで表される「オリゴマーペプチド」という用語は、互いに共有結合で結合されたｎ個のペプチドで形成される分子を言う。ここで使用される場合、「オリゴマーペプチド」は、モノマーペプチド鎖の間の特別な型の結合に制限されないことは明らかである。結合は、例えば、システイン架橋またはリシン側鎖を含む結合であってもよい。従って、本発明の文脈において、「オリゴマーペプチド」という用語および式（配列）_nは、ｎ個のアミノ酸モノマーが全て、N-およびC-末端の間で慣用のペプチド結合で結合されるという意味には解釈されない。

「架橋された」という用語は、１つのモノマーペプチドのN-末端と別のモノマーペプチドのC-末端との間の慣用のペプチド結合とは異なる、２つのモノマーペプチドの間のあらゆる分子間共有結合を言う。

「共有結合で結合した」という用語は、当業者には用意に理解され、オリゴマーペプチドを産生するために導入される、アミド、チオール−チオエステル、エーテル−オキシム、ヒドラゾンおよびチアゾリジン結合のような結合を言う。特に、このオリゴマーペプチドは、互いに共有結合で結合した２、３または４個のモノマーペプチド鎖を言い、それぞれ二量体、三量体および四量体を生じる。本発明のオリゴマーペプチドは「共有結合で結合した」と記載されるが、これは、オリゴマーペプチドのそれぞれのモノマーペプチド鎖が、オリゴマーペプチド中の他の全てのモノマーペプチド鎖に結合することを必要とせず；二量体は上記に列挙した化学的結合の少なくとも１つによって共有結合で結合しており；三量体は上記に列挙した化学的結合の少なくとも２つによって共有結合で結合しており、従って、第一のモノマーペプチド鎖が第二のモノマーペプチド鎖に結合し、第二のものが第三のモノマーペプチド鎖に結合するに充分であり；四量体は上記に列挙した化学的結合の少なくとも３つによって共有結合で結合しており、従って、第一のモノマーペプチド鎖が第二のモノマーペプチド鎖に結合し、第二のものが第三のモノマーペプチド鎖に結合し、第三のモノマーペプチド鎖が第四のモノマーペプチド鎖に結合するに充分である。オリゴマーペプチド中のモノマーペプチド鎖は、同一または異なるアミノ酸配列を有することができる。同一のモノマーペプチド鎖から作られたオリゴマーペプチドは、「均一の(homogeneous)」オリゴマーペプチドとも言い、二量体の場合、「ホモ二量体」とも言う。オリゴマーペプチド中のモノマーペプチド鎖が異なる場合は、「ヘテロ(heterologous)」という用語が、オリゴマーペプチドおよびそのモノマーペプチド鎖に用いられる。共有結合は、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、エーテル結合、アミド結合、オキシム結合、チアゾリジン結合、ヒドラゾン結合等の、それぞれのペプチド鎖の間の「直接結合」であり得、即ち、架橋スペーサー分子がない。また、ペプチド鎖は、あらゆる化学的性質のスペーサーによって共有結合で結合することもでき(ハーベン−ウェイル(Houben-Weyl)、有機化学法、ペプチドおよびペプチド模倣薬の合成(Methods of organic chemistry, Synthesis of peptides and peptidomimetics)、ジョージ・ティーメ出版(Georg Thieme Verlag)、シュトゥットガルト(Stuttgart) 2002年)、ひいてはモノマーペプチド鎖は「間接的結合」によって結合されると言う。好ましいものは、２個のチオール基、２個のアミノ基、２個のカルボキシル基を有するもの、および１個のカルボキシル基および１個のアミノ基を有するもの等の、小さい有機ニ官能性スペーサーである。

ここで使用される「疎水性アミノ酸」という用語は、当業者には用意に理解される。特に、あらゆる自然発生アミノ酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、および非内因性疎水性アミノ酸を言う。自然発生アミノ酸の性質を模倣する類似の合成非内因性アミノ酸も、HIVに対する生物活性が有意に低下しない限り、同様に使用することができる。

ここで使用される「芳香族アミノ酸」という用語は、当業者には用意に理解される。特に、あらゆるアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、および、1-ナフチルアラニン、3,3-ジフェニルアラニン、p-フルオロフェニルアラニン,またはD-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸またはL-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸等の、非内因性芳香族アミノ酸を言う。このようなアミノ酸の性質を模倣する類似の合成非内因性アミノ酸も、HIVに対する生物活性が有意に低下しない限り、同様に使用することができる。

「酸性アミノ酸側鎖」という用語は、当業者には用意に理解される。特に、グルタミン酸およびアスパラギン酸、および、2-アミノアジピン酸等の側鎖官能基としてカルボン酸を持つあらゆる他の天然および非天然アミノ酸の、カルボン酸側鎖を言う。

「塩基性アミノ酸側鎖」という用語は、当業者には用意に理解される。特に、リシン、オルニチン、またはジアミノプロピオン酸等の側鎖としてアミノ官能基を持つあらゆる他の天然および非天然アミノ酸の、側鎖アミノ基を言う。また、本発明が言及する塩基性側鎖を有するアミノ酸は、低級リシン誘導体であり、それは炭素が３個だけ、２個または１個だけの、短くなった側鎖（リシンと比較して）を有し、アミノ基を持つ。

「非天然アミノ酸」という用語は、当業者には用意に理解される。特に、20の内因発生アミノ酸：グリシン、システイン、アラニン、バリン、リシン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、プロリンおよびメチオニン：に属しない、あらゆるアミノ酸を言う。

「変異体」という用語は、当業者には用意に理解される。特に、開示された１以上のアミノ酸が変化し、即ち、１以上のアミノ酸が他のもので置換された、配列変異体を言う。特に、１以上のアミノ酸置換体は、置換アミノ酸のD-体であり、オリゴマーペプチドの生物活性は、非置換オリゴマーペプチドに比較して有意に低下しない。D-アミノ酸の導入は、例えば、タンパク分解酵素の作用に対する抵抗性を改善するのに有用であるかもしれない。本発明の変異体は、好ましくは、請求項１のオリゴマーペプチドから、１、２、３または４個のアミノ酸が変化する。好ましい具体例において、変異は保存的であり、変化したアミノ酸の側鎖の特性は元のアミノ酸と実質的には変わらない。変異体は、１以上のアミノ酸が配列から除かれるかまたは配列に挿入される、配列変化も含む。

「断片」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、配列がN-またはC-末端で切断された配列変異体を言う。好ましい具体例において、オリゴマーペプチドは、N-および／またはC-末端で、２、４または６個以下のアミノ酸が欠落する。

「誘導体」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、化学的に修飾されたオリゴマーペプチドを言う。この修飾は、N-およびC-末端、ペプチドの側鎖、ペプチド骨格のC(-およびN(-原子、および骨格のペプチド結合を形成する原子における、ペプチドの、１個のアミノ酸の置換、多数の置換、または種々の化学的修飾であり得る。

「アミド化」という用語は、当業者には用意に理解される。特に、C-末端カルボキシル基がCONR₂-基で置換されるオリゴマーペプチドの修飾を言い、ここでRは水素原子または、少なくとも１個の水素原子を置換することができる、あらゆる官能基である。

「アシル化」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、N-末端のアミノ基および／またはアミノ基の側鎖におけるアミノ酸以外に、共有結合で結合されたカルボン酸残基を含有する、オリゴマーペプチドについて言及する。

「アルキル化」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、N-末端アミノ基、あらゆる骨格原子および／または側鎖のあらゆる官能基において、種々の長さおよび構造のアルキル基で修飾されたオリゴマーペプチドについて言及する。

「硫酸化」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、チロシンまたは置換チロシン誘導体残基の水酸基に、硫酸成分を持つオリゴマーペプチドについて言及する。

「ペギル化」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、共有結合で結合された、ポリエチレングリコールに特有の少なくとも２つの繰り返し単位-CH₂-CH₂-O-よりなるポリエチレングリコール(PEG)部分を含有するペプチドについて言及する。好ましいものは、いわゆる小型（ミニ）PEG基である。ペギル基は、分子量が20kDa以下であってもよく、ペプチド配列において異なる官能基に直接結合することができ、または、N-および／またはC-末端および／または側鎖官能基でスペーサー基によって結合することができる。スペーサー基は、２、３、４、５、６、７、８または９個の炭素原子の骨格、および２個のアミノ基、２個のカルボキシル基または１個のアミノ基と１個のカルボキシル基等の２個の官能基によって特徴づけられる、ニ官能性炭化水素鎖の群から選択される。１以上のペギル基がペプチドの種々の部位に含有され得る。特に、好ましいものは、システイン残基に続く、ペプチドのC-末端側の小型PEGである。

「ホルホリル化」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、トレオニン、セリン、ヒドロプロリン、ヒドロキシリシン、チロシン、および／または、あらゆる他の非天然のヒドロキシアミノ酸の側鎖の水酸基が、リン酸基でエステル化されたオリゴマーペプチドについて言及する。

「グリコシル化」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、および／または非天然のアミノ酸の側鎖に、グリコシルまたはアルコール性水酸基で結合するモノマーおよび／またはオリゴマー炭水化物成分を含有する、オリゴマーペプチドについて言及する。

「環状」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、モノマーペプチド鎖の少なくとも１つに環状構造モチーフを含有するか、少なくとも２つのモノマーペプチド鎖を含む環状構造モチーフを含有する、オリゴマーペプチドについて言及する。環化は、骨格の環化、または、アミノ酸の側鎖が同一分子に存在する別のアミノ酸の側鎖に結合することによって達成することができる。本発明の好ましい具体例では、２つのシステイン残基、または、１つのカルボン酸側鎖および１つのアミノ基を含有する側鎖が、それぞれジスルフィド結合またはアミド結合によって環状モチーフを形成する。

「HIVによる感染症に対する生物活性」という表現は、ウイルスの哺乳類細胞への侵入を少なくとも妨害し、または阻止する、オリゴマーペプチドの能力を言う。より具体的には、HIVのgp41の融合ペプチドと相互作用する能力を言う。HIVによる感染症に対する生物活性の尺度は、IC₅₀の値である。好ましくは、本発明のオリゴマーペプチドのHIV感染症に対する生物活性は、そのIC₅₀値が野生型のVIRIPのIC₅₀ 値よりも低いものである。

本発明のオリゴマーペプチドは、原型のVIRIP(配列番号1)またはモノマー類似物と比較した場合、HIVによる感染症に対する抗ウイルス活性および血漿中の安定性に関して、有利な特性を示す。特に、二量体ペプチドは優れた特質を有するので好ましい。本発明の二量体ペプチドを得るために、モノマーペプチド鎖を化学的に結合させ、２つのペプチド鎖の間に共有結合を導入する。共有結合は、システインのチオール基等の側鎖官能基の間の直接結合であってもよく、または、ペプチドの２つの同一の鎖がリシン残基の２つのアミノ基に結合する場合に存在するような、ペプチド鎖の間にスペーサーを含む結合であってもよい。後者はしばしばリシンコアデンドリマーの最小形態と見なされる(サドラー(Sadler)K.、J. バイオテクノロジー(Biotechnology)、2002年、90巻、195-229頁)。２つのペプチド鎖は、２つの単独のペプチド鎖の間のアミド結合によって結合することもでき、これは1つのペプチド鎖の側鎖アミノ基と第二の鎖の側鎖カルボキシル基との間の共有結合によって達成される。この結合は、１つのペプチド鎖のカルボキシル側鎖および第二のペプチド鎖の側鎖アミノ基への共有結合によって２つのペプチド鎖を架橋する、小さなニ官能性の有機スペーサー分子を用いて達成することもできる。さらに、この有機スペーサー分子は、２つの酸官能基を含有する場合、アミノ官能基による２つの同一のペプチド鎖の架橋に用いることができ、または、スペーサー分子が２つのアミノ官能基を含有する場合、１つのカルボキシル官能基による２つの同一のペプチド鎖の架橋に用いることができる(ペニングトン(Pennington)ら(編者)、ペプチド合成プロトコル(Peptide synthesis protocols)、フマナ・プレス(Humana Press)、トトワ(Totowa) 1994年)。モノマーの２つのペプチド鎖は、天然または非天然アミノ酸の反応性側鎖を用いる、オキシム、ヒドラゾンおよびチアゾリジン形成によって結合することもできる(ローズ(Rose)K.、米国化学会誌(J. Am. Chem. Soc.)、1994年、116巻、30-33頁；シャオ(Shao)、J.およびタム(Tam)J.P.、1995年、米国化学会誌(J. Am. Chem. Soc.)、117巻、3893-3899頁；フィッシュ(Fisch)I.ら、生物複合体化学(Bioconjugate Chem.)、1992年、3巻、147-153頁；リュー(Liu)C.-F.およびタム(Tam)J.P.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1994年、91巻、6584-6588頁)。加えて、本発明のオリゴマーペプチドは、モノマーペプチド鎖の繰り返し単位を含有する線状オリゴマーペプチドの固相ペプチド合成によって得られる。

本発明のオリゴマーペプチド、特に、本発明の二量体ペプチドは、野生型VIRIP(配列番号1)と比較して、構造的および生物学的により安定であり、かつ活性がより高い。それらでは半減期の延長が見られ、それにより血漿中の濃度がより高くなる。加えて、それらにより作用部位で抗ウイルス活性のあるペプチド鎖の局所濃度が上昇する。故に、本発明のオリゴマーペプチドは、ウイルス受容体分子とより有利に相互作用する分子であり、ウイルスの侵入をより効果的に遮断する。

野生型VIRIP(配列番号1)と比較して、モノマーペプチド鎖のアミノ酸配列を特異的に変化させることによって、HIVに対する活性が有意に上昇したオリゴマーペプチドが得られることもわかった。モノマーペプチド鎖において１０位のL-プロリンをD-プロリンで置換し、および／または２つのシステインを６位および１１位のアミノ酸に導入した場合、および／または１３位の正に荷電したリシンを疎水性または芳香族側鎖を有するアミノ酸と交換した場合に、オリゴマーペプチドにおいて活性の最も顕著な上昇が観察される。野生型VIRIP(配列番号1)と比較した活性の上昇は構造の変化によるものと考えられる。システイン架橋は、構造に影響を与え、D-プロリンの導入と同様に、ペプチドの柔軟性を有意に低下させることが知られており、それによってペプチドの二次構造要素を変化させ、故にペプチドの種々の部分の互いの位置を変化させる。さらに、荷電していない疎水性または芳香族アミノ酸でリシンを交換することによって、正に荷電したリシン側鎖の、同一分子の２位および１１位の負に荷電したアミノ酸または受容体分子の負に荷電した部分との可能な相互作用が変化することから、構造が変わるであろう。オリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖の３位のアラニン残基が、リシンまたはアスパラギン酸残基での置換によって正または負に荷電した残基に交換される場合、抗HVI活性の有意な上昇がさらに観察される。３位に荷電した残基を導入することによって、静電力または双極子力が増加して、受容体分子の対応部分への結合強度を増強することができる。オリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖の７位および／または１５位のアミノ酸残基を、小さなアミノ酸残基、特にグリシンと交換することによって、本発明のオリゴマーペプチドの抗HIV活性が上昇することもわかった。グリシン残基は立体障害が最小の残基であり、受容体分子に結合する場合、または受容体分子との結合に必要な自身の凝集体を形成する場合、ペプチドを最適な内部構造に配列することが可能である。記載した置換は、本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖において、組み合わせてもよい。

本発明のペプチドのモノマー鎖は、化学的に合成することができ、または、本発明のモノマーペプチド鎖をコードする核酸の組み換え発現によって産生することができる。サイズが小さいこと、即ち、本発明のオリゴマーペプチドに含有されるモノマーペプチド中のアミノ酸の数が少ないことから、全体のペプチド合成技術は、そのようなモノマーペプチド鎖の化学的合成に利用することができる。HIV融合阻害剤T-20の合成は、３つの個別の断片の合成と、続いて、最終産物T-20を生じる３つの断片の結合が必要であり、この合成と比較して、本発明のモノマーペプチド鎖は、段階的固相法または液相化学によって大規模に合成することができる。故に、本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖を得る方法は複雑でないので、本発明のオリゴマーペプチド製品のコストは低い。また、モノマーペプチドの共有結合も複雑ではなく、即ち、困難な化学反応を必要としないので、結合反応はオリゴマーペプチドを含む最終産物のコストの大きな要因にはならない。

本発明のオリゴマーペプチドのさらなる有利点は、種々のイオン強度の溶液中、広範なpH(pH2〜8.5)にわたる溶解性と安定性である。特に、血漿中の安定性は重視されなければならない。化学合成は、固相技術を用いた固体支持体上で、または液相中で実施することができるが、両者は当業者に知られた標準的方法である。本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖もまた、当業者に知られた標準的方法である、２以上の側鎖の保護または非保護断片の連結によって合成することができる(タム(Tam)J.P.、バイオポリマーズ(Biopolymers)、2001年、60巻、194-205頁)。本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖またはその断片の固相合成は、アミノ酸のFmoc/tBu-またはBoc/Bzl-保護パターンを用いて実施することができる。標準的なFmoc-保護スキームにない、他の保護基を使用することができる。合成モノマーペプチド鎖およびオリゴマーペプチドの精製は、逆相、イオン交換またはサイズ排除等のクロマトグラフィー法によって達成される。ここに記した本発明のモノマーペプチド鎖およびオリゴマーペプチドの化学的合成方法は、いくつかの概説刊行物で調べられる(例：チャン(Chan)W.C.ら(編者)、Fmoc固相ペプチド合成：実践的アプローチ(Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach)、オックスフォード大学出版局(Oxford University Press)、オックスフォード(Oxford)、2000年；スィーワルド(Seewald)N.ら、ペプチド：生物学および化学(Peptides: biology and chemistry)、ウィレイ(Wiley)-VCH、ワインハイム(Weinheim)、2002年；グッドマン(Goodman)M.、ハーベン−ウェイル(Houben-Weyl)、有機化学法、ペプチドおよびペプチド模倣薬の合成(Methods of organic chemistry, Synthesis of peptides and peptidomimetics)、ジョージ・ティーメ出版(Georg Thieme Verlag)、シュトゥットガルト(Stuttgart) 2002年)。

本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖へのジスルフィド結合の導入は、少なくとも２つのシステイン残基を含有するモノマーペプチド鎖に酸化的化学法を適用することによって達成されてもよく、この方法は当業者に知られている(ペニングトン(Pennington)ら(編者)、ペプチド合成プロトコル(Peptide synthesis protocols)、フマナ出版(Humana Press)、トトワ(Totowa) 1994年；チャン(Chan)W.C.ら(編者)、Fmoc固相ペプチド合成：実践的アプローチ(Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach)、オックスフォード大学出版局(Oxford University Press)、オックスフォード(Oxford)、2000年)。本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖の間のジスルフィド結合は、酸化的処置によって固相または溶液合成から得られる、少なくとも１つの非保護システイン残基を含有する還元前駆体モノマーペプチド鎖から産生されてもよい。酸化剤として、酸素、ジメチルスルホキシド、鉄(III)塩、ヨウ素、またはその他を使用してもよい。あるいは本発明のオリゴマーのモノマーペプチド鎖のジスルフィドは、対応するシステイン残基に保護基を含有する前駆体からペプチドへ導入されてもよい。保護基としては、アセトアミドメチル、tert-ブチル、S-tert-ブチルまたはその他を使用してもよい。保護基の切断および鎖内ジスルフィド結合の形成は、ヨウ素、ホスフィン等の試薬、またはその他を使用して実施してもよい。

ジスルフィド結合を有するもの以外のオリゴマーペプチドの環状モノマーペプチド鎖は、モノマーペプチド鎖の骨格の環化によって、または、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシまたはチオ等の少なくとも１つの反応性側鎖基と、同一の分子中に存在するあらゆる他の反応基との間の化学結合によって得ることができ、これらは当業者に知られている通りである (リ(Li)ら、Curr. Top. Med. Chem.、2002年、2巻、325-341頁；タム(Tam)J.P.、バイオポリマーズ(Biopolymers)、2001年、60巻、194-205頁；グッドマン(Goodman)M.、ハーベン・ウェイル(Houben-Weyl)、有機化学法、ペプチドおよびペプチド模倣薬の合成(Methods of organic chemistry, Synthesis of peptides and peptidomimetics)、ジョージ・ティーメ出版(Georg Thieme Verlag)、シュトゥットガルト(Stuttgart) 2002年)。

モノマーペプチドが共有結合したオリゴマーは、種々のタイプの化学結合によって２つのペプチド鎖を結合することによって得られる。ジスルフィド結合したオリゴマーは、活性化したシステインによるか、または、システインを全く前活性化せず、２つのペプチド鎖を連結することによって合成される(サッカ(Sacca)B.ら、J. Pept. Sci.、2002年、8巻、192-204頁；スィーワルド(Seewald)N.ら、ペプチド：生物学および化学(Peptides: biology and chemistry)、ウィレイ(Wiley)-VCH、ワインハイム(Weinheim)、2002年)。２つのペプチド鎖の間のチオエーテル結合とエーテル結合とペプチド結合は、当業者に知られており文献に記載の様々な方法によって導入することができる (スィーワルド(Seewald)N.ら、ペプチド：生物学および化学(Peptides: biology and chemistry)、ウィレイ(Wiley)-VCH、ワインハイム(Weinheim)、2002年)。リシンコアデンドリマーは、Fmoc-Lys(Fmoc)-OHを固体の支持体に連結することによって合成することができる。アミノ酸の脱保護の後、固相ペプチド合成により、オリゴマーペプチドを得る(スィーワルド(Seewald)N.ら、ペプチド：生物学および化学(Peptides: biology and chemistry)、ウィレイ(Wiley)-VCH、ワインハイム(Weinheim)、2002年；チャン(Chan)W.C.ら(編者)、Fmoc固相ペプチド合成：実践的アプローチ(Fmoc solid phase peptide synthesis:A practical approach)、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス(Oxford University Press)、オックスフォード、2000年)。カルボキシ末端のリシン残基とペプチド鎖との間に、さらなるリシン残基を置くことができる。リシンは、オルニチン等の２つのアミノ基を含有するあらゆる他のアミノ酸、および、ジアミノプロピオン酸等の側鎖に１つのアミノ基を有するあらゆる非天然のアミノ酸によって置換することができる。

本発明の好ましいオリゴマーペプチドにおいて、２つの単独のペプチド鎖の間のアミド結合による２つのペプチド鎖の結合は、１つのペプチド鎖の側鎖アミノ基と第二の鎖の側鎖カルボキシル基との間の共有結合によって達成される。また、この結合は、１つのペプチド鎖のカルボキシ側鎖および第二のペプチド鎖の側鎖アミノ基への共有結合によって２つのペプチド鎖を架橋する、小さなニ官能性の有機スペーサー分子を使用することによっても達成することができる。さらに、この有機スペーサー分子は、スペーサー分子が２つの酸官能基を有する場合は、アミノ官能基によって２つの同一のペプチド鎖を架橋するために用いることができ、または、スペーサー分子が２つのアミノ官能基を含有する場合は、カルボキシル官能基によって２つ同一のペプチド鎖を結合するために用いることができる。この方法は、当業者に知られており、文献に記載されている(ペニングトン(Pennington)ら(編者)、ペプチド合成プロトコル(Peptide synthesis protocols)、フマナ・プレス(Humana Press)、トトワ(Totowa) 1994年)。

天然または非天然のアミノ酸の反応性側鎖を使用する、オキシム、ヒドラゾンまたはチアゾリジン形成を含む２つのモノマーペプチド鎖の結合は、ヒドロキシルアミンまたはヒドラジン基を有するモノマーペプチドをアルデヒド基を有するペプチドに結合することによって、または、N-末端システインを有するペプチドをペプチドのアルデヒドに結合することによって達成することができ、これらの方法は当業者に知られており、文献に記載されている(チャン(Chan)W.C.ら(編者)、Fmoc固相ペプチド合成：実践的アプローチ(Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach)、オックスフォード大学出版局(Oxford University Press)、オックスフォード、2000年、p243-263；ノヴァバイオケム(Novabiochem) 2004/5カタログ、ペプチドおよび高処理量合成用試薬(Reagents for Peptide and High-Throughput Synthesis)、p.5.2-5.3；ローズ (Rose)K.、米国化学会誌(J. Am. Chem. Soc.)、1994年、116巻、30-33頁；シャオ(Shao)、J.およびタム(Tam)J.P.、1995年、米国化学会誌(J. Am. Chem. Soc.)、117巻、3893-3899頁；フィッシュ(Fisch)I.ら、生物複合体化学(Bioconjugate Chem.)、1992年、3巻、147-153頁；リュー(Liu)C.-F.およびタム(Tam)J.P.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1994年、91巻、6584-6588頁)。

以下の段落において、本発明の種々のオリゴマーペプチドがいかに共有結合しているかを簡単に記載する。これらのペプチドは全て二量体である。

VIR-674:１つのモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11と、それぞれ、２つ目の同一のモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11との間の、２つのシステイン架橋による結合。
VIR-675:１つのモノマーペプチド鎖のGlu11と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のLys16との間の、１つのアミド結合による結合。
VIR-676:１つのモノマーペプチド鎖のGlu11と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のLys16との間の、１つのアミド結合による結合。
VIR-677:１つのモノマーペプチド鎖のCys7およびCys12と、それぞれ、２つ目の同一のモノマーペプチド鎖のCys7およびCys12との間の、２つのシステイン架橋による結合。
VIR-678:１つのモノマーペプチド鎖のCys7およびCys12と、それぞれ、２つ目の同一のモノマーペプチド鎖のCys7およびCys12との間の、２つのシステイン架橋による結合。
VIR-679:１つのモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11と、それぞれ、２つ目の同一のモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11との間の、２つのシステイン架橋による結合。
VIR-680:１つのモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11と、それぞれ、２つ目の同一のモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11との間の、２つのシステイン架橋による結合。

VIR-681:１つのモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11と、それぞれ、２つ目の同一のモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11との間の、２つのシステイン架橋による結合。
VIR-682:１つのモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11と、それぞれ、２つ目の同一のモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11との間の、２つのシステイン架橋による結合。
VIR-683:１つのモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11と、それぞれ、２つ目の同一のモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11との間の、２つのシステイン架橋による結合。
VIR-684:１つのモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11と、それぞれ、２つ目の同一のモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11との間の、２つのシステイン架橋による結合。
VIR-685: １つのモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11と、それぞれ、２つ目の同一のモノマーペプチド鎖のCys6およびCys11との間の、２つのシステイン架橋による結合。

VIR-686: １つのモノマーペプチド鎖のGlu11と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のLys16との間の、１つのアミド結合による結合。
VIR-687:１つの単位のGlu11と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のLys16との間の、１つのアミド結合による結合。
VIR-689:１つのモノマーペプチド鎖のGlu11と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のLys16との間の、１つのアミド結合による結合。
VIR-690:１つのモノマーペプチド鎖のGlu11と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のLys16との間の、１つのアミド結合による結合。

VIR-691:１つのモノマーペプチド鎖のGlu11と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のLys16との間の、１つのアミド結合による結合。
VIR-692:１つのモノマーペプチド鎖のGlu11と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のLys16との間の、１つのアミド結合による結合。
VIR-693: １つのモノマーペプチド鎖のCys8およびCys13と、それぞれ、２つ目の同一のモノマーペプチド鎖のCys8およびCys13との間の、２つのシステイン架橋による結合。
VIR-694:１つのモノマーペプチド鎖のGlu11と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のLys16との間の、１つのアミド結合による結合。
VIR-695:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。

VIR-696:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-697:１つのモノマーペプチド鎖のCys7と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys7との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-698:１つのモノマーペプチド鎖のCys7と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys7との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-699:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-700:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。

VIR-701:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-702:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-703:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-704:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-705:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。

VIR-706:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-707:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-708:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-709:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-710:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。

VIR-711:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-712:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-713:１つのモノマーペプチド鎖のCys8と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys8との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-714:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-715:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。

VIR-716:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-717:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-718:リシンコアデンドリマーによる結合。
VIR-719:１つのモノマーペプチド鎖のCys6と、第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys6との間の、１つのシステイン架橋による結合。
VIR-720: ２つのモノマーペプチド鎖のカルボキシル末端Cys残基の間の、システイン架橋による結合。

VIR-721:１つのシステイン架橋による結合であって、このシステイン架橋に加えてCys6およびCys11の間に分子内システイン架橋を含有する１つのモノマーペプチド鎖のCys7と、同様にCys6およびCys11の間に分子内システイン架橋を含有する第二の同一のモノマーペプチド鎖のCys7との間の、システイン架橋による結合。
VIR-722:２つのモノマーペプチド鎖のカルボキシ末端システイン残基の間の、１つのシステイン架橋による結合であって、両者がそれらのCys6およびCys11の間に分子内システイン架橋を含有する。
VIR-723:１つのモノマーペプチド鎖のCys6およびカルボキシ末端Cys残基と、それぞれ、２つ目の同一のモノマーペプチド鎖のCys6およびカルボキシ末端Cys残基との間の、２つのシステイン架橋による結合。これらのオリゴマーペプチドがさらなる修飾を有する場合、モノマーペプチド鎖は、二量化の前、またはより一般的な用語では、オリゴマー化の前に、以下に記載されるとおり修飾される。

アミド化ペプチドモノマーは、ペプチド鎖を集めるアミドリンカーを有する樹脂を用いた固相ペプチド合成によって得られる。対応する合成されたペプチドの酸開裂によって、ペプチドアミドを得る。溶液相合成において、C-末端アミノ酸が、実施されたカルボキサミドをC-末端に有するビルディングブロックとして用いられる場合、アミド化されたペプチドが得られる。(チャン(Chan)W.C.ら(編者)、Fmoc固相ペプチド合成：実践的アプローチ(Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach)、オックスフォード大学出版局(Oxford University Press)、オックスフォード(Oxford)、2000年)。

アシル化ペプチドモノマーは、当業者によれば、遊離型アミノ基またはヒドロキシ基を有するペプチドを、ハロゲン化アシルまたはカルボン酸無水物等のカルボン酸由来の活性化アシル化試薬、またはアシル化ペプチドに対応する他の反応性カルボニル化合物を用いて変化させて得られる。代わりに、アシル化は、ホスホニウム-またはウロニウム-型化合物による、in situ活性化された遊離カルボン酸を用いて達成することができる(グリーネ(Greene)T.W.、有機化学における保護基(Protective groups in organic chemistry)、ジョン・ウィレイ・アンド・サンズ(John Wiley & Sons)、ニューヨーク、1991年；コシエンスキ(Kocienski)P.、保護基(Protecting groups)、ティーメ出版(Thieme-Verlag)、シュトゥットガルト(Stuttgart) 1994年；スィーワルド(Seewald)N.ら、ペプチド：生物学および化学(Peptides: biology and chemistry)、ウィレイ(Wiley)-VCH、ワインハイム(Weinheim)、2002年)。

アルキル化ペプチドモノマーは、ペプチド合成を固体支持体上または溶液中で実施する場合、予めアルキル化したアミノ酸ビルディングブロックを組み入れることによって得ることができる。このようなアミノ酸は、当業者に知られた標準的な活性化プロトコルを用いて、ペプチド鎖上に連結される(チャン(Chan)W.C.ら(編者)、Fmoc固相ペプチド合成：実践的アプローチ(Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach)、オックスフォード大学出版局(Oxford University Press)、オックスフォード(Oxford)、2000年)。また、アルキル化は、当業者に知られた適当なアルキル化法を用いてペプチド鎖を集めた後に達成されてもよい(グリーネ(Greene)T.W.、有機化学における保護基(Protective groups in organic chemistry)、ジョン・ウィレイ・アンド・サンズ(John Wiley & Sons)、ニューヨーク、1991年；コシエンスキ(Kocienski)P.、保護基(Protecting groups)、ティーメ出版(Thieme-Verlag)、シュトゥットガルト(Stuttgart) 1994年)。このような方法は、部分的に保護されたペプチドにおいて、ペプチド骨格のアミノ-、ヒドロキシル-、チオ-等の反応基およびペプチド結合に適用してもよい。

硫酸化ペプチドは、固相または溶液ペプチド合成において、チロシンまたはチロシン誘導体を予め硫酸化したビルディングブロックを用いることによって得られる。2-クロロトリチル樹脂等の高度に酸不安定な樹脂を合成に使用した場合、O-硫酸化物は、樹脂からのペプチド開裂の間、ヒドロキシル基に結合したままである(スィーワルド(Seewald)N.ら、ペプチド：生物学および化学(Peptides: biology and chemistry)、ウィレイ(Wiley)-VCH、ワインハイム(Weinheim)、2002年)。

ペギル化ペプチドは、ペプチドの官能基に結合するペギル残基を含有する。ペギル残基は、繰り返し単位-CH₂-CH₂O-有する親水性の線状または分枝状ポリマー鎖であることを特徴とする。ペギル残基は、好適な、機能的に修飾された反応性ペギル含有物質を用いて、ペプチド鎖を集めた後、ペプチド中に導入される。当業者は、様々な活性化方法によって、種々の活性化ペギル基をペプチドの様々な側鎖または、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシルおよびチオ等の末端官能基に結合させることができる(ヴェロンス(Veronese)F.M.ら、Bioconjug. Chem.、2001年、12巻、62-70頁；ヴェロンス(Veronese)F.M.、バイオマテリアルズ(Biomaterials)、2001年、22巻、405-417頁)。

ホスホリル化ペプチドは、固相または溶液相ペプチド合成によって合成することができる。通常、ホスホリル化ペプチドの合成は、当業者によれば、ホルホリル化ヒドロキシアミノ酸ビルディングブロックを利用して、および／または、１以上の遊離型ヒドロキシ官能基を有する保護ペプチドの鎖集合後のホスホリル化によって達成される(ムッレイ(Murray)J.S.、バイオポリマーズ(Biopolymers)、2001年、60巻、3-31頁；チャン(Chan)W.C.ら(編者)、Fmoc固相ペプチド合成：実践的アプローチ(Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach)、オックスフォード大学出版局(Oxford University Press)、オックスフォード(Oxford)、2000年；スィーワルド(Seewald)N.ら、ペプチド：生物学および化学(Peptides: biology and chemistry)、ウィレイ(Wiley)-VCH、ワインハイム(Weinheim)、2002年)。

グリコシル化ペプチドは、当業者によれば、ペプチドの固相または溶液相合成に組み込むことができる、グリコシル化アミノ酸ビルディングブロックを用いて、または、国際的な鎖集合後グリコシル化アプローチによって得ることができる(デイビス(Davis)B.G.、Chem. Rev.、2002年、102巻、579-602頁；チャン(Chan)W.C.ら(編者)、Fmoc固相ペプチド合成：実践的アプローチ(Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach)、オックスフォード大学出版局(Oxford University Press)、オックスフォード(Oxford)、2000年；スィーワルド(Seewald)N.ら、ペプチド：生物学および化学(Peptides: biology and chemistry)、ウィレイ(Wiley)-VCH、ワインハイム(Weinheim)、2002年)。

本発明は、本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖をコードする核酸分子にも関する。好ましい核酸は、DNAおよびRNAであり、特にcDNAおよびmRNAである。

また、本発明の主題は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体でもある。「特異的に」という用語は、当業者に容易に理解される。特に、本発明のペプチドではない、VIRIPのような関連するペプチドに結合しないか、または実質的に結合しない抗体を意味する。当業者は、慣用法によって本発明のペプチドに対する抗体を得、知られているスクリーニング法によって本発明の特異的抗体を選択するであろう。

本発明は、HIVのエンベロープタンパク質gp41のN-末端領域と特異的に相互作用し結合するオリゴマーペプチドに関する。「相互作用する」および「結合する」という用語は、当業者に容易に理解される。このような結合および相互作用によって、本発明のオリゴマーペプチドは、HIV粒子による宿主細胞の感染を阻止する。また、本発明は、HIVのgp41の融合ペプチドに対応する合成ペプチドに結合する、オリゴマーペプチドにも関する。当業者は、定量的構造活性相関(QSAR)アッセイを適用することによって、HIVのgp41の合成融合ペプチドへの、本発明のオリゴマーペプチドのいずれかの結合および相互作用を検出する。これらのアッセイは、限定されないが、合成融合ペプチドの溶血作用の抑制の検出(モブレイ(Mobley)P.W.ら、Biochim. Biophys. Acta、1992年、1139巻、251-256頁；ゴードン(Gordon)L.、Biochim. Biophys. Acta、1992年、1139巻、257-274頁)、微小熱量測定(ゴールケ(Gohlke)H.ら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、2002年、41巻、2644-2676頁)、または化学シフト滴定実験、飽和移動差スペクトル法または二次元技術であり得るNMR-分光技術(メイヤー(Meyer)ら、Ernst Schering Res. Found. ワークショップ、2004年、44巻、149-167頁)を含む。

また、本発明は、本発明のオリゴマーペプチド、核酸または抗体を含有する医薬にも関する。この医薬は好ましくは、経口、静脈内、筋肉内、皮内、皮下および／またはくも膜下投与のための製剤において提供される。

好ましい具体例において、この医薬は、少なくとも１つのさらなる治療薬を含む。この少なくとも１つのさらなる治療薬は、ウイルス・プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、融合阻害剤、サイトカイン、サイトカイン阻害剤、グリコシル化阻害剤またはウイルス・mRNA阻害剤等であり得る。好ましくは、このような阻害剤は、HIVをターゲットにする。このような組み合わせの療法は、AIDSの治療に非常に適切である。本発明のペプチド、核酸および抗体は、好ましくは、HIV感染症の治療用医薬の製造に使用される。これは、レトロウイルスHIV（ヒト免疫不全ウイルス）の知られている全ての型、特に、最も一般的な型であるHIV-1を含む。HIV-1は、AIDSの発症に関連する。

また、本発明は、本発明のオリゴマーペプチド、核酸および／または抗体を含む診断薬に関する。この診断薬は、単離した血漿、血清、組織、尿、精液および／または髄液のHIV感染を試験するためのアッセイシステムに用いてもよい。

また、本発明は、HIVのエンベロープタンパク質gp41、特にgp41のN-末端融合ペプチドに結合する物質を同定するツールとして、本発明のオリゴマーペプチドの少なくとも１つを含む、アッセイシステムに関する。このようなアッセイは、単離形態、ウイルス形態またはあらゆる他の形態、または、gp41のN-最末端からアミノ酸残基が35個以下の長さの合成形態の、全体のgp41タンパク質中に結合される融合ペプチドへの、あらゆる物質の結合を測定するのに好適な、あらゆるシステムであり得る。このようなアッセイは、あらゆる分光学的、細胞性、または放射性リガンドアッセイであり得るが、そのようなアッセイにおいて、本発明のオリゴマーペプチドの少なくとも１つと競合する物質の結合が測定される。本発明のオリゴマーペプチドをツールとして使用する、そのような競合アッセイの結果、HIVgp41への親和性および結合部位特異性が増した物質の同定が達成される。そのような物質は、HIV粒子による細胞性感染を遮断する効力が向上している。それらはAIDS治療のための改良された治療薬として使用することができる。

本発明のいくつかのオリゴマーペプチドを化学合成した後、得られた産物の収量および分子量を調べた。全てのペプチドについて、高収量が達成され、理論分子量を確認したが（表１参照）、これは合成方法の成功を反映している。本発明のペプチドを種々の試験に供した。

１組目の試験では、本発明のペプチドのHIV感染を阻害する効力を確認した（表２参照）。ペプチドは、HIV-1のNL4-3型に対して試験し、IC₅₀値を計算した。相当の活性を有するペプチドは、IC₅₀値が2000nM以下(VIR-673、配列番号4)、およびIC₅₀値が6500nM(VIR-574、配列番号2；VIR-577、配列番号3)であった。試験したオリゴマーペプチドは、野生型VIRIP (配列番号1)と比較して活性が増加したが；野生型VIRIP (配列番号1)は、それぞれHIVのNL4-3型で試験した場合、IC₅₀値は15,000であった。表２を要約すると、本発明のペプチドは、野生型VIRIPと比較して抗HIV活性が５倍から２２倍に上昇していた。

２組目の試験では、本発明のペプチドの哺乳類血漿中での安定性を確認した。種々の動物およびヒトから単離した血漿を、規定の濃度の本発明の種々のペプチドでスパイクした。ペプチドはヒト血漿中で、半減期および代謝がかなり向上した。またこれらのペプチドは生体動物の血漿中で向上した安定性を示す。

本質的に、本発明のペプチドは抗HIV活性が特徴であり、IC₅₀として表すと6500nM以下であり、最も活性の高いペプチドはIC₅₀が2000nM以下である。本発明の個別のぺプチドは、IC₅₀が800nM未満であった（表１参照）。また、本発明のペプチドは、血漿中の半減期が改善されることも特徴である。

実施例１：本発明のペプチドの化学合成
Ａ．モノマーペプチド鎖の合成：
本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖を、固相ペプチド合成の原理およびFmocまたはBoc保護基法を利用して化学的に合成したが(アサートン(Atherton)およびシェパード(Sheppard)、1989年、固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis)、IRLプレス(IRL Press)；メリフィールド(Merrifield)、1986年、固相合成(Solid phase synthesis)、サイエンス(Science) 232巻、341-347頁)、溶液相合成、または本発明のペプチドの保護または非保護断片の結合によっても、合成することができる。

例として、オリゴマーペプチド VIR-577[アミノ酸配列: LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF](配列番号55)のモノマーペプチド鎖の合成を、自動ペプチドシンセサイザ433A（アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)）で、フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)-保護したアミノ酸を用いて、ここに記載する。モノマーペプチドの合成は、負荷容量が樹脂1g当り1mmolの、予め負荷したFmoc-Phe-Wang樹脂を用い、N-メチルピロリジノン(NMP)中の無水酢酸を用いたキャッピング・サイクルが0.1mmolスケールの、標準HBTU[(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム-ヘキサフルオロフォスフェート)/HOBt(1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)活性化によって実施した。使用したアミノ酸ビルディングブロックの側鎖は以下の通り保護した：Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Cys(Trt)。ペプチド鎖集合体のアシル化工程を15〜60分間実施し、それぞれのアシル化後、Fmoc基をNMP中のピペリジンで脱保護した。１位のロイシン残基を脱保護した後、得られた保護ペプチジル樹脂をNMP、2-プロパノールおよびジクロロメタンで洗浄し、その後乾燥した。乾燥樹脂は、トリフルオロ酢酸／エタンジチオール／水(94:3:3、容量/容量/容量、40ml/g樹脂)の新鮮混合物で、室温で2〜4.5時間処理した。混合物を、氷冷したt-ブチルメチルエーテル(TBME)中に濾過し、ペプチドの沈殿を促進した。得られた沈殿は遠心分離で分離し、TBMEで洗浄し、真空下で乾燥した。粗ペプチドは、C18 HPLC分析およびエレクトロスプレイ質量分析(API 100、パーキン・エルマー(Perkin Elmer))を用いて分析した（図１＋２）。

Ｂ．モノマーペプチド鎖の二量体VIR-577へのオリゴマー化
粗モノマーペプチド鎖VIR-577を、ペプチド濃度4mg/mlでCH₃CN/H₂O(1:4)中に溶解した。溶液に8% DMSOを添加し、希アンモニアでpHを〜８に調製した。溶液を室温で一晩、激しく撹拌した。18時間後、粗混合物を酢酸で酸性化し、分取Vydac C18カラムに負荷した(47x300mm、15-20μm、流速40ml/min；溶媒A、0.07容量% TFA；溶媒B、アセトニトリル/H₂O＝80:20(容量%)中の0.07容量% TFA；UV検出、215nm；45-70容量%のBで、50分間の勾配溶出)。所望の純粋なオリゴマーペプチドを含有するフラクションは、質量分析(API 100、パーキン・エルマー(Perkin Elmer))およびC18 HPLC分析、あるいはキャピラリーゾーン電気泳動によって検出し、プールして、凍結乾燥により乾燥した。凍結乾燥したオリゴマーペプチドは、C18 HPLC分析(図3)、キャピラリーゾーン電気泳動、および質量分析 (図4)による、純度および分子量の分析に使用した。ペプチド(LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF)₂ (配列番号3)の収量は7mgであった。

Ｃ．リシンコアデンドリマーの合成：
リシンコアデンドリマーの合成には、Fmoc-Gly-Wang樹脂またはFmoc-Wang-Ala樹脂を用いる。第一のアミノ酸に、Fmoc-Lys(Fmoc)誘導体またはFmoc-Orn(Fmoc)誘導体を結合させる。NMP中の20%ピペリジンを用いてFmoc脱保護した後、樹脂は２つのアミン官能基を有し、そこで線状VIRIP-ペプチドの合成が標準Fmocサイクルによって実施される。リシンコアは、別のFmoc-Lys(Fmoc)またはFmoc-Orn(Fmoc)誘導体をコアに結合させて容易に延長することができ、線状ペプチド合成のための４つの遊離型アミン基を産生する。例として、VIR-574[アミノ酸配列:(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2-K-G](配列番号2)の合成を、自動ペプチドシンセサイザー433A(アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems))でフルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護アミノ酸を用いて述べる。合成は、負荷容量が樹脂1g当り0.68mmolの、予め負荷したFmoc-Gly-Wang樹脂を用い、N-メチルピロリジノン(NMP)中の無水酢酸を用いたキャッピング・サイクルが0.1mmolスケールの、標準HBTU[(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム-ヘキサフルオロフォスフェート)/HOBt(1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)活性化によって実施した。使用したアミノ酸ビルディングブロックの側鎖は以下の通り保護した：Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Lys(Fmoc)、Ser(tBu)。ペプチド鎖集合体のアシル化工程を15〜60分間実施し、それぞれのアシル化後、Fmoc基をNMP中のピペリジンで脱保護した。１位のロイシン残基を脱保護した後、得られた保護ペプチジル樹脂をNMP、2-プロパノールおよびジクロロメタンで洗浄し、その後乾燥した。乾燥樹脂は、トリフルオロ酢酸／エタンジチオール／水(94:3:3、容量/容量/容量、40ml/g樹脂)の新鮮混合物で、室温で2〜4.5時間処理した。混合物を、氷冷したt-ブチルメチルエーテル(TBME)中に濾過し、ペプチドの沈殿を促進した。得られた沈殿は遠心分離で分離し、TBMEで洗浄し、真空下で乾燥した。粗オリゴマーペプチドは、希酢酸に溶解し、分取Vydac C18 カラムに負荷した(47x300mm、15-20μm、流速40ml/min；溶媒A、0.07容量% TFA；溶媒B、アセトニトリル/H₂O＝80:20(容量%)中の0.07容量% TFA；UV検出、215nm；45-70容量%のBで、50分間の勾配溶出)。所望の純粋なオリゴマーペプチドを含有するフラクションは、質量分析(API 100、パーキン・エルマー(Perkin Elmer))およびC18 HPLC分析、あるいはキャピラリーゾーン電気泳動によって検出し、プールして、凍結乾燥により乾燥した。凍結乾燥したオリゴマーペプチドは、C18 HPLC分析(図5)、キャピラリーゾーン電気泳動、および質量分析 (図6)による、純度および分子量の分析に使用した。

この合成法は、小規模で多数のペプチド合成にも適応することができた。２つの分子間ジスルフィド結合を有する本発明のオリゴマーペプチドを、ジメチルスルホキシドを用いて、または用いず、pH7.5〜8.5で空気で処理し、続いてヨウ素で処理して、システイン架橋形成を促進し、１つのアセトアミドメチル保護したシステインおよび１つの非保護システインを有する前駆体から出発して、二量体を形成した。

Ｄ．システインでAcm保護したモノマーペプチド鎖の合成：
本発明のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖を、固相ペプチド合成の原理およびFmocまたはBoc保護基法を利用して化学的に合成したが(アサートン(Atherton)およびシェパード(Sheppard)、1989年、固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis)、IRLプレス(IRL Press)；メリフィールド(Merrifield)、1986年、固相合成(Solid phase synthesis)、サイエンス(Science) 232巻、341-347頁)、溶液相合成、または本発明のペプチドの保護または非保護断片の結合によっても、合成することができる。

例として、オリゴマーペプチドVIR-705[アミノ酸配列: LEKIPC(Acm)SIPpEVAFNKPFVF](配列番号36)のモノマーAcm保護ペプチド鎖の合成を、自動ペプチドシンセサイザ433A（アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)）で、フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)-保護したアミノ酸を用いて、ここに記載する。モノマーペプチドの合成は、負荷容量が樹脂1g当り1mmolの、予め負荷したFmoc-Phe-Wang樹脂を用い、N-メチルピロリジノン(NMP)中の無水酢酸を用いたキャッピング・サイクルが0.1mmolスケールの、標準HBTU[(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム-ヘキサフルオロフォスフェート)/HOBt(1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)活性化によって実施した。使用したアミノ酸ビルディングブロックの側鎖は以下の通り保護した：Glu(OtBu)、Asn(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Cys(Acm)。ペプチド鎖集合体のアシル化工程を15〜60分間実施し、それぞれのアシル化後、Fmoc基をNMP中のピペリジンで脱保護した。１位のロイシン残基を脱保護した後、得られた保護ペプチジル樹脂をNMP、2-プロパノールおよびジクロロメタンで洗浄し、その後乾燥した。乾燥樹脂は、トリフルオロ酢酸／エタンジチオール／水(94:3:3、容量/容量/容量、40ml/g樹脂)の新鮮混合物で、室温で2〜4.5時間処理した。混合物を、氷冷したt-ブチルメチルエーテル(TBME)中に濾過し、ペプチドの沈殿を促進した。得られた沈殿は遠心分離で分離し、TBMEで洗浄し、真空下で乾燥した。粗ペプチドは、C18 HPLC分析およびエレクトロスプレイ質量分析(API 100、パーキン・エルマー(Perkin Elmer))を用いて分析した（図8＋9）。

Ｅ．モノマーAcm保護ペプチド鎖の二量体VIR-705へのオリゴマー化：
粗モノマーペプチド鎖VIR-577を、ペプチド濃度6mg/mlでHOAc/H₂O(4:1)中に溶解した。溶液に、HOAc中の0.05M I₂溶液を４等量添加した。溶液を室温で60分間、激しく撹拌し、残ったI₂をアスコルビン酸溶液で還元した。粗混合物を５倍容量の水で希釈し、分取Vydac C18カラムに負荷した(47x300mm、15-20μm、流速40ml/min；溶媒A、0.07容量% TFA；溶媒B、アセトニトリル/H₂O＝80:20(容量%)中の0.07容量% TFA；UV検出、215nm；45-70容量%のBで、50分間の勾配溶出)。所望の純粋なオリゴマーペプチドを含有するフラクションは、質量分析(API 100、パーキン・エルマー(Perkin Elmer))およびC18 HPLC分析、あるいはキャピラリーゾーン電気泳動によって検出し、プールして、凍結乾燥により乾燥した。凍結乾燥したオリゴマーペプチドは、C18 HPLC分析(図10)、キャピラリーゾーン電気泳動、および質量分析 (図11)による、純度および分子量の分析に使用した。ペプチド(LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF)₂(配列番号36)の収量は97mgであった。

本発明のオリゴマーペプチドの合成方法を、本発明の精製ペプチド１ｇ〜５ｇを産する、0.5〜20mmolの範囲のより大きな規模に適用した。

これらの一般的合成アプローチを用いて、他のものの中から表１に示したオリゴマーペプチドを合成し、クロマトグラフィーで最大98%まで精製し、分析した：

VIR-577はホモ二量体であり；分子間ジスルフィド架橋が7位のアミノ酸のシステインで起こる。VIR-574はリシンコア結合ホモ二量体である。VIR-673はシステイン残基およびPEG-スペーサーを有し、システインとペプチド配列の間でジスルフィド結合したホモ二量体である。VIR-705はホモ二量体であり；分子間ジスルフィド架橋が6位のアミノ酸のシステインで起こる。VIR-706はホモ二量体であり；分子間ジスルフィド架橋が6位のアミノ酸のシステインで起こる。VIR-712はホモ二量体であり；分子間ジスルフィド架橋が6位のアミノ酸のシステインで起こる。VIR-716はホモ二量体であり；分子間ジスルフィド架橋が6位のアミノ酸のシステインで起こる。VIR-717はホモ二量体であり；分子間ジスルフィド架橋が6位のアミノ酸のシステインで起こる。

実施例２：本発明のオリゴマーペプチドによるHIV感染の阻害
一次CD4受容体および主要なHIV-1侵入補因子であるCXCR4およびCCR5の両方を発現する、P4-CCR5指標細胞(シャーニュ(Charneau)ら、1994年；分子生物学ジャーナル(Journal of Molecular Biology) 241巻、651-662頁)を用い、本発明のオリゴマーペプチドがHIV-1感染の有力な阻害剤であるか評価した。これらの細胞は、HIV-1プロモータの制御下でβ-ガラクトシダーゼ受容体遺伝子を含有する。従って、β-ガラクトシダーゼ受容体遺伝子の活性化によって、HIV-1感染の効率を測定することができ、故にHIV-1阻害剤の効力を定量化することができる(デトユクス(Detheux)M.ら、2000年；実験医学ジャーナル(Journal of Experimental Medicine) 192巻、1501-1508頁；ミュンフ(Munch)ら、2002年；抗菌剤および化学療法(Antimicrobial Agents and Chemotherapy) 46巻、982-990頁)。

代表的な感染アッセイを実施するため、P4-CCR5細胞(シャーニュ(Charneau)ら、1994年；分子生物学ジャーナル(Journal of Molecular Biology) 241巻、651-662頁；シャーニュ(Charneau)ら、ウイルス学(Virology). 1994年 205巻、247-53頁)を、10容量％のFCSを追加したRPMI 1640培地中に保持した。この細胞系は、CD4およびHIV-1コレセプタであるCCR5およびCXCR4の両方を共発現し、HIV-1プロモータの制御下でβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。ウイルスのストックは、記載された通りのカルシウム共沈法(デトユクス(Detheux)ら、J Exp Med. 192巻:1501-8頁；2000年)によって生産し、p24抗原レベルを、NIH AIDSリージェント・プログラムで得られるHIV p24 ELISAキットを用いて定量した。細胞を平底の96穴皿に播種し、一晩培養し、培地総量50ml中に1ngのp24抗原を含むウイルスで感染させる前に、様々な量のペプチドと共にインキュベートした。一晩インキュベーションした後、細胞を2回洗浄し、阻害ペプチドを含まない新鮮な培地で培養した。感染3日後、細胞を溶解し、ガラクト-ライト・プラス(Galacto-Light Plus^Tm)化学発光受容体アッセイキット(トロピックス(Tropix)、ベッドフォード、マサチューセッツ州)を用いて製造元の推奨通りに感染率を定量した。全ての感染は5部実施した。

このアッセイの結果により、本発明のオリゴマーペプチドは、VIRIPと比較して、抗HIV-1活性が非常に増強していることが示される。本発明のオリゴマーペプチドは、最大22倍まで、X4屈性のHIV-1 NL4-3によって感染を阻害した（表２）。これらのデータから、野生型VIRIP配列のオリゴマー化および特別な修飾により、本発明のオリゴマーペプチドの抗HIV-1効力が非常に増強されることが示される。以下に、記載した感染アッセイから得られた、本発明のペプチドのIC₅₀値を示す。

図１は、VIR-577モノマー[LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF](配列番号55)のC18 HPLCの痕跡である。条件：Vydac C18 (4.6×250mm、300A、5μm、流速: 0.8ml/分、勾配: 30分間で10-70容量%のB、緩衝液A: 0.07容量% TFA、緩衝液B: 0.05容量% TFA、80容量%アセトニトリル)。図２は、VIR-577モノマー[LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF](配列番号55)のエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)である。質量分析は、Sciex API 100質量分析計を用いて記録した。[M+2H]²⁺ (m/z 1148.5)および[M+1H]¹⁺ (m/z 2296.5)の分子イオンを示す。図３は、VIR-577[(LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF)₂](配列番号3)のC18 HPLCの痕跡である。条件：Vydac C18 (4.6×250mm、300A、5μm、流速: 0.8ml/分、勾配: 30分間で10-70容量%のB、緩衝液A: 0.07容量% TFA、緩衝液B: 0.05容量% TFA、80容量%アセトニトリル)。図４は、VIR-577[(LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF)₂](配列番号3)のエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)である。質量分析は、Sciex API 100質量分析計を用いて記録した。[M+4H]⁴⁺ (m/z 1148.5)、[M+3H]³⁺ (m/z 1531.0)および[M+2H]²⁺ (m/z 2294.5)の分子イオンを示す。図５は、VIR-574[ (LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)₂-K-G](配列番号2)のC18 HPLCの痕跡である。条件：Vydac C18 (4.6(250mm、300A、5μm、流速: 0.8ml/分、勾配: 30分間で10-70容量%のB、緩衝液A: 0.07容量% TFA、緩衝液B: 0.05容量% TFA、80容量%アセトニトリル)。図６は、VIR-577[(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)₂-K-G](配列番号2)のエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)である。質量分析は、Sciex API 100質量分析計を用いて記録した。[M+4H]⁴⁺ (m/z 1183.0)、[M+3H]³⁺ (m/z 1576.5)および[M+2H]²⁺ (m/z 2364.0)の分子イオンを示す。図７は、リシンコアデンドリマーの一例の、VIR-574[(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)₂-K-G](配列番号2)の化学構造図である。図８は、VIR-705モノマー[LEKIPC(Acm)SIPpEVAFNKPFVF](配列番号36)のC18 HPLCの痕跡である。条件：Vydac C18 (4.6×250mm、300A、5μm、流速: 0.8ml/分、勾配: 60分間で10-70容量%のB、緩衝液A: 0.07容量% TFA、緩衝液B: 0.05容量% TFA、80容量%アセトニトリル)。図９は、VIR-705モノマー[LEKIPC(Acm)SIPpEVAFNKPFVF](配列番号36)のエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)である。質量分析は、Sciex API 100質量分析計を用いて記録した。[M+3H]³⁺ (m/z 696.5)、[M+2H]²⁺ (m/z 1174.5)および[M+1H]¹⁺ (m/z 2347.5)の分子イオンを示す。図１０は、VIR-705二量体[(LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF)₂](配列番号36)のC18 HPLCの痕跡である。条件：Vydac C18 (4.6×250mm、300A、5μm、流速: 0.8ml/分、勾配: 30分間で10-70容量%のB、緩衝液A: 0.07容量% TFA、緩衝液B: 0.05容量% TFA、80容量%アセトニトリル)。図１１は、VIR-705二量体[(LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF)₂](配列番号36)のエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)である。質量分析は、Sciex API 100質量分析計を用いて記録した。[M+4H]⁴⁺ (m/z 1138.5)、[M+3H]³⁺ (m/z 1517.5)および[M+2H]²⁺ (m/z 2276.0)の分子イオンを示す。本発明のペプチドのIC₅₀値を示す。

略語:
AIDS: 後天性免疫不全症候群(aquired immuno-deficiency syndrome)
Boc: t-ブチルオキシカルボニル(tert-butyloxycarbonyl)
CXCR4: CXCケモカイン受容体４(CXC chemokine receptor 4)
CCR5: CCケモカイン受容体５(CC chemokine recptor 5)
ESI-MS: エレクトロスプレーイオン化質量分析
(electrospray ionization-mass spectrometry)
FP: 融合ペプチド(fusion peptide)
HIV: ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
(high performance liquid chromatography)
HR-1、HR-2: ７個の繰り返し１、２(heptad repeat 1、2)
MALDI-TOF: マトリックス支援レーザー脱離イオン化
(matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight)
小型PEG: -NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-NH₂
NMR: 核磁気共鳴(nuclear magnetic resonance)
Oic: オクタヒドロインドリル-2-カルボン酸
(octahydroindolyl-2-carboxylic acid)
PEG: ペギル(pegyl)、ポリオキシエチレングリコール
(polyoxyethyleneglycol)
QSAR: 定量的構造活性相関(quantitative structure-activity relationship)
TBu: t-ブチル(tert-butyl)
TFA: トリフルオロ酢酸(trifluoroacetic acid)
Tic: 1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸
(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid)
Trt: トリチル(trityl)

Claims

以下のアミノ酸配列の１つを含む、抗ＨＩＶ活性を有するオリゴマーペプチド：
VIR-574 (LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)₂-K-G 配列番号2
VIR-577 (LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF)₂ 配列番号3
VIR-673 (LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF-小型PEG-C-アミド)₂ 配列番号4
VIR-705 (LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF)₂ 配列番号36
VIR-706 (LEAIPCGIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)₂ 配列番号37
VIR-712 (N-Me-LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)₂ 配列番号43
VIR-716 (N-Me-LEKIPCSIPPEFLFGKPFVF)₂ 配列番号47
VIR-717 (N-Me-LEDIPCSIPPEFLFGKPFVF)₂ 配列番号48。
請求項１に記載のオリゴマーペプチドであって、HIV融合ペプチドであるｇｐ４１と相互作用する、オリゴマーペプチド。
請求項１又は２に記載のオリゴマーペプチドであって、IC₅₀が6500nM以下である、オリゴマーペプチド。
請求項１から３のいずれか１項に記載のオリゴマーペプチドのモノマーペプチド鎖をコードする核酸。
請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマーペプチドに特異的に結合する抗体。
請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマーペプチドの少なくとも１つ、請求項４の核酸および／または請求項５の抗体を含む、医薬。
請求項６に記載の医薬であって、経口、静脈内、筋肉内、皮内、皮下および／またはくも膜下投与のための製剤である、医薬。
請求項６または７の医薬であって、少なくとも１つのさらなる治療薬を含む、医薬。
請求項８の医薬であって、該少なくとも１つのさらなる治療薬が、ウイルス・プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、融合阻害剤、サイトカイン、サイトカイン阻害剤、グリコシル化阻害剤またはウイルス・mRNA阻害剤である、医薬。
請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマーペプチドの、HIV感染症の治療用医薬の製造のための、使用。
請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマーペプチドの少なくとも１つを含む、HIV融合ペプチドであるｇｐ４１と相互作用する能力のある分子を見つけ出すためのアッセイ。
請求項１１に記載のアッセイにおける、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマーペプチドの使用。
請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマーペプチドの少なくとも１つ、請求項４に記載の核酸および／または請求項５に記載の抗体を含む、診断薬。
請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマーペプチドの少なくとも１つ、請求項４に記載の核酸および／または請求項５に記載の抗体を用いることにより、単離した血液、血漿、組織、尿、精液および／または髄液のHIV感染を試験するための方法。