JP4790891B2 - Thioredoxin composition stable in solution and process for its preparation - Google Patents

Description

【０００６】
という反応が、そして、
２）ペルオキシダーゼとの組合せ反応による過酸化物消去反応として、
【０００７】
【化２】

【０００８】
というリサイクル反応が知られている。例えば、本明細書中に援用する井上善晴著、１９９９、日本農芸化学会誌７３巻１０号 第１０１３頁−第１０２１頁を参照されたい。
【０００９】
ＴＲＸは、大腸菌、酵母から高等植物、高等動物まで広く存在し、生体内の種々の酸化還元反応に関わっている。これまでに、大腸菌から高等生物に至る種々のＴＲＸの単離が試みられ、その構造の解明が進められている（特公平５−５５５１９号等）。また、チオレドキシン遺伝子のクローニングも進められている（特許第２６３３２９５号等）。
【００１０】
これらのうち、特にヒト型ＴＲＸ（場合により、「ＡＤＦ」ともいう）タンパク質は、そのアミノ酸配列の３２位、３５位、６２位、６９位および７３位の５カ所にシステイン残基を有する。このうち３２位と３５位の２つのシステインを有する部位−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−が酸化還元活性部位であることが知られている（Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｔ．Ｃ．ら（１９６４）上述；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，上述；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，上述；Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．ら，（１９９４）上述）。よって、ヒト型ＴＲＸは酸化還元部位以外、即ち、６２位、６９位および７３位にＣｙｓ残基を有するため、溶液安定性が悪く、特に酸化的な条件下ではダイマー化し活性低下をきたすことが分かっている（Ｇａｓｄａｓｋａ ＪＲ ｅｔ ａｌ． １９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｖｏｌ．５２：１７４１−１７４７）。
【００１１】
ヒト型ＴＲＸの生理的な機能の一つとして活性酸素や紫外線照射による細胞障害を防ぐ働きがある（Ｓａｃｈｉ Ｙ．ｅｔ．ａｌ．１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌ．４４：１８９−１９３）。活性酸素障害や紫外線障害から細胞を守る手段には、細胞内でのＴＲＸ合成を亢進する方法と外部からＴＲＸを添加する方法とが考えられる。ＴＲＸ合成を亢進する方法としては、ＴＲＸを含む一連の酸化防御に関与する成分の合成を促進するＡＰ−１転写因子を活性化する方法があげられる。また、外部よりＴＲＸを添加する場合は上述のＴＲＸ反応系の中で作用可能な安定なＴＲＸが必要となる。すなわち、ヒト型チオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）やヒト型チオレドキシンペルオキシダーゼ（ＴＰｘ）と有意に反応することができる安定なＴＲＸが必要となる。
【００１２】
安定なＴＲＸにとしては、Ｒｅｆ−１とＳ−Ｓ結合で結合しＡＰ−１転写因子を活性化するＣｙｓ残基置換ＴＲＸがすでに報告されている（特開平１０−１９１９７７）。当該Ｃｙｓ残基置換ＴＲＸは、チオレドキシンの有する活性中心のＣｙｓ残基は修飾せず、それ以外のＣｙｓ残基を少なくとも１つないし全て他のアミノ酸残基に置換することにより、非還元条件下でも安定としたものである。
【００１３】
しかしながら、前記Ｃｙｓ残基置換ＴＲＸは天然ＴＲＸの改変体であり、一般に遺伝子工学技術によって突然変異誘発を行って得る必要がある。さらに、多方面での産業的利用を考えた際、とりわけ食品分野や化粧品などの医薬部外品分野では、安全性確認が容易な天然供給源からの素材が好ましい。よって、改変体のＴＲＸではなく、天然源由来のＴＲＸであって、特にヒト等の哺乳動物に安全に使用可能な、安定したＴＲＸを含む組成物が希求されている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、非還元条件下でも溶液安定性のチオレドキシンを含むチオレドキシン組成物を提供することを目的とする。本発明のチオレドキシンは、酵母チオレドキシンであることを特徴とする。
【００１５】
本発明の一態様において、好ましくは、酵母チオレドキシンは、配列番号１のアミノ酸配列有するタンパク質であるか、あるいは当該配列に１またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、置換もしくは付加による変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的に活性で安定なタンパク質である。
【００１６】
本発明はまた、溶液安定性の酵母チオレドキシンのチオレドキシン組成物への使用を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明は、さらに、前記酵母チオレドキシン、及び所望により生理的に受容可能な希釈剤および／または担体を含む組成物の製造方法を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
前述したように、ＴＲＸは微生物から動植物まで広く存在する恒常的なタンパク質となっている。本願発明者は、上記問題の解決を目的として鋭意研究に努めた結果、酵母チオレドキシンが、１）１ｍＭ 過酸化水素処理後でもダイマー化を認めない；２）非還元条件下で１ヶ月間８０％以上の溶液安定性を示す；そして３）ヒトのチオレドキシンレダクターゼに対して５０％以上の交差反応性を有する、ことを発見し、本願発明を想到した。本発明は、上記酵母チオレドキシンの上記性質を利用して、溶液中でも安定で長期保存可能な組成物を提供することを目的とするものである。
【００１９】
酵母ＴＲＸ
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
【００２０】
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は典型的には、本明細書の配列表の配列番号１に記載の１０４アミノ酸配列を有する。配列番号１は酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＸ２タンパク質のアミノ酸配列である（Ｇｅｎｂａｎｋ、登録番号ＡＡＡ８５５８４（Ｕ４０８４３），ｔｈｉｏｒｅｄｏｘ．．．［ｇｉ：１１６５２１４］，Ｊａｅ Ｍａｈｎ Ｓｏｎｇら，２４−Ｊａｎ−１９９６）。しかし、天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。例えば、配列番号１は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＸ２タンパク質のアミノ酸配列であるが、サッカロマイセス属の他の種に属する酵母、あるいは他の属、例えば、ピキア属等に属する種の酵母由来のＴＲＸも本発明において使用しうる。なお、本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などを意味する。本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は１に記載のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。相同性は少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。
【００２１】
本明細書において、相同性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【００２２】
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００２３】
ただし、本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、上述したような有利な物理化学的性質の少なくとも１つを保持していることが好ましい。本明細書中において「生物学的に活性で安定な」とは、ＴＲＸタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する場合であっても、上述したＴＲＸの酸化還元機能を有し、かつ上記物理化学的な性質を保持していることを意味する。限定されるわけではないが、ＴＲＸタンパク質のダイマー化を防ぎ、溶液安定性を保持するために、ＴＲＸタンパク質は、酸化還元活性部位以外にＣｙｓ残基を有しないことが好ましい。
【００２４】
酵母ＴＲＸ遺伝子
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、天然源から精製してもよく、あるいは、例えば後述した実施例に記載したように、酵母チオレドキシンをコードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に発現させてもよい。より詳細には、例えば、
ｉ）酵母チオレドキシンタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；
ｉｉ）当該宿主細胞を酵母チオレドキシンタンパク質の発現を促進する条件下で培養し；そして
ｉｉｉ）当該宿主細胞から、組換え酵母チオレドキシンタンパク質を回収する
ことによって、組換えタンパク質を得ることができる。
【００２５】
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成ＤＮＡの何れでもよく、またゲノムＤＮＡクローン、ｃＤＮＡクローンの何れでもよい。当業者は本明細書の記載および慣用された遺伝子工学技術を用いて、本発明の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子を容易に得ることが可能である。
【００２６】
酵母ＴＲＸ遺伝子は典型的には、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する（Ｇｅｎｂａｎｋ，登録番号Ｕ４０８４３（ＡＡＡ８５５８４），ｔｈｉｏｒｅｄｏｘ．．．［ｇｉ：１１６５２１４］，Ｊａｅ Ｍａｈｎ Ｓｏｎｇら，２４−Ｊａｎ−１９９６）。配列番号２は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＸ２タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。しかしながら、これに限定されず、天然の遺伝子の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、本発明の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子のみに限定されるわけではなく、上述した酵母ＴＲＸタンパク質をコードする全ての遺伝子を包含する。
【００２７】
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子であって配列番号２に記載された酵母ＴＲＸ２遺伝子の塩基配列を有するもの、さらに配列番号２以外の塩基配列を有するものも、本明細書中の配列番号１および２に記載された酵母ＴＲＸ２タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列、またはそれらの一部に基づいて、例えば、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いて得ることが可能である。これらの遺伝子工学的手法を用いて酵母、あるいは他の生物種からさらに同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離することも可能である。
【００２８】
遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーション条件は特に限定されないが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、２５℃ないし６８℃などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温度としては、より好ましくは４５℃ないし６８℃（ホルムアミド無し）または２５℃ないし５０℃（５０％ホルムアミド）を挙げることができる。ホルムアミド濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイゼーション条件を適宜設定することによりある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできることは当業者に周知であり、このようにしてクローニングされた相同遺伝子も本発明の酵母ＴＲＸタンパク質を製造するために用いられ得る。
【００２９】
核酸増幅反応は、例えば、複製連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，ｐ．１３５０−１３５４）、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（ウーら、１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，ｐ．５６０−５６９；バリンガーら、１９９０，Ｇｅｎｅ ８９，ｐ．１１７−１２２；バラニーら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，ｐ．１８９−１９３）および転写に基づく増幅（コーら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，ｐ．１１７３−１１７７）等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（ウォーカーら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，ｐ．３９２−３９６；ウォーカーら、１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０，ｐ．１６９１−１６９６）、自己保持配列複製（３ＳＲ）（グアテリら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，ｐ．１８７４−１８７８）およびＱβレプリカーゼシステム（リザイルディら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，ｐ．１１９７−１２０２）等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
【００３０】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有する。
【００３１】
酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて、酵母ＴＲＸ遺伝子を得るための核酸増幅反応に用いる増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを作製できる。より詳細には、オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−３０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；および
３）各領域間の距離が約１００−約１０００塩基であること
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造することが可能である。当該オリゴヌクレオチド用いて、例えば本発明の酵母ＴＲＸ遺伝子を検出もしくは単離するためのハイブリダイゼーション、あるいは適当な２種をプライマー対として用いたＰＣＲ等の増幅反応に用いることが可能である(配列番号３および４）。
【００３２】
発明の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号１に記載された酵母ＴＲＸ２遺伝子の塩基配列以外の塩基配列を有するものは、また、本明細書中の配列番号１および２に記載された酵母ＴＲＸ２タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列、またはそれらの一部を利用して、例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７−６５００，１９８２）を施すことによって得ることもできる。
【００３３】
部位特異的変異誘発方は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき、例えばファージ等の一本鎖ＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いて上記一本鎖ＤＮＡに相補的な鎖を合成させ、得られた二本鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された宿主細胞の培養物を観点にプレートし、上記ＤＮＡを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。すると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するＤＮＡを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、不一致のもの、即ち元の配列を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをラジオアイソトープ等で標識された合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプローブを拾い、培養しＤＮＡを回収する。
【００３４】
酵母ＴＲＸタンパク質の製造
本発明の組換え酵母ＴＲＸタンパク質を発現するために、酵母ＴＲＸ遺伝子を含む組換えベクターを作製する。プラスミドなどのベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．５３（１９８９）」に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造社製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、Ｅ−ｃｏｉｌ ＪＭ１０９，ＴＢ１， ＬＥ３９２ またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
【００３５】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）」に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００３６】
べクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるべクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２などが例示されるがこれらに限定されない。
【００３７】
所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現べククーが有用である。発現べクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現べクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。好ましくは大腸菌用発現ベクターｐＴＲＰ（（ＣｌｉｎＣｈｉｍ Ａｃｔａ． １９９５ Ｊｕｎ １５；２３７ （１−２）：４３−５８）である。
【００３８】
形質転換体は、所望の発現べクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。用いられる宿主細胞としては、本発明の発現べクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞、または人工的に樹立された組換え細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。
【００３９】
宿主細胞は、大腸菌、酵母または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌（Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（ＢｍＮ４、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスタ−由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。特に好ましい宿主細胞は大腸菌、より好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（例えば、宝酒造社より入手可能）である。
【００４０】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
【００４１】
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
【００４２】
本発明のべクタ−において、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
【００４３】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｉｌではブラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬもしくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２もしくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
【００４４】
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【００４５】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００４６】
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
【００４７】
本発明の発現べクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。
【００４８】
例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｉｌ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］やコンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８）］やリチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレ−ション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒｓらの方法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
【００４９】
本発明の実施例においては、特に、酵母ＴＲＸ遺伝子を前述した大腸菌用発現ベクターｐＴＲＰに挿入後、大腸菌株ＪＭ１０９（宝酒造社製）を宿主細胞として形質転換した。得られた形質転換体ｐＴＲＰ−ｙＴＲＸ２／ＪＭ１０９は、平成１２年１月２５日に、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００４で、工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−００４６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されている。
【００５０】
上述にように遺伝子工学的に発現された組換え酵母ＴＲＸ、あるいは天然源由来のＴＲＸは、慣用されている精製技術、例えば、硫安沈殿法およびイオン交換カラムクロマトグラフィー等を用いて精製することができる。より詳細には、酵母ＴＲＸタンパク質の精製および単離は、硫安沈殿法、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｂｕｔｈｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｃ６５０ゲル（東ソー製）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｇ７５（ファルマシア製）など）、イオン交換クロマトグラフィー、などのタンパク質の精製および単離のために慣用される方法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００５１】
酵母ＴＲＸを含む組成物
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、下記の物理化学的性質：
１）１ｍＭ 過酸化水素処理後でもダイマー化を認めない；
２）非還元条件下で１ヶ月間８０％以上の溶液安定性を示す；そして
３）ヒトチオレドキシンレダクターゼに対して５０％以上の交差反応性を有する
の少なくとも１つを有する。
【００５２】
後述する実施例４（表４、図２−図３）で明らかにされたように、ヒトＴＲＸは１ｍＭの濃度の過酸化水素においてダイマー化がはっきりと認められたの対し、酵母ＴＲＸは、１ｍＭ濃度下はもちろん、１０ｍＭ濃度下においてもダイマー化は生じなかった。ＴＲＸがダイマー化を生じるか否かは、限定されるわけではないが、例えば、後述の実施例４に記載したようにして調べることが可能である。例えば、所定濃度の過酸化水素で例えば室温で約１５分ないし約１時間処理した後、非還元条件下でのポリアクリルアミド電気泳動を行う。銀染色バンドの電気移動度よりダイマー形成率を調べることが可能である。
【００５３】
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、非還元条件下、例えばジチオスレイトールなどの還元剤を含まない条件下でＰＢＳ等の溶媒に溶解した状態で、例えば冷蔵保存（１０℃以下、好ましくは約２℃−約８℃）で１ヶ月間８０％以上の溶液安定性を示す。よって、本発明の酵母ＴＲＸタンパク質含有組成物は溶液で長期間安定保存が可能なため、使用の都度凍結乾燥粉末を溶解する必要性がなく、簡便に使用可能である。
【００５４】
また、ＴＲＸは大腸菌、酵母から高等植物、高等動物まで広く存在し、これまでに、大腸菌から高等生物に至る種々のＴＲＸの単離が試みられれている。しかしながら、溶液安定性のＴＲＸとしてヒト等の哺乳動物へ適用される組成物を考慮した場合、ヒトのＴＲＸと同様に例えばヒト チオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）等のタンパク質と反応性を示すことが望ましい。微生物由来の、例えば大腸菌由来のＴＲＸはヒトのＴＲとは全く反応性を示さないことがわかった。これに対し、酵母ＴＲＸは、ヒトＴＲに対して５０％以上の交差反応性を有することが明らかとなり、哺乳動物等に適用しうることが明らかとなった。
【００５５】
よって、本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、例えば、医薬用、食品素材タンパク質の加工等に用いるための組成物としてそれが活性のある形で含まれるように処方されて利用することができる。この場合、酵母ＴＲＸタンパク質をコードするＤＮＡ配列を用いれば、先述のように例えば大腸菌や酵母などで機能する発現ベクターにそのＤＮＡを組み込んで大量に製造することもできる。
【００５６】
本発明のＴＲＸ組成物は、ＴＲＸの機能に基づき、１個以上のジスルフィド結合を分子間及び／又は分子内に有するタンパク質のジスルフィド結合を開裂する、及び／又はペルオキシダーゼとの組み合わせにより過酸化物を消去し活性酸素に対する防御反応を促進させるために使用することが可能である。
【００５７】
あるいは、ＴＲＸは酸化され不活性となっているタンパク質の分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を開裂するため、本発明のＴＲＸ組成物はそのような不活性化されたタンパク質を活性化し、機能改善するために使用可能である。また、ＴＲＸは酸化状態で活性である蛋白質の分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を開裂するため、本発明のＴＲＸ組成物は好ましくない（例えば、毒性を有する）タンパク質のジスルフィド結合を開裂し、そのようなタンパク質を不活性化するために使用可能である。例えば、オボムコイド等のプロテアーゼインヒビターが胃若しくは腸中に存在する場合、あるいはアミラーゼインヒビターが唾液中に存在する場合、消化に必要なプロテアーゼやアミラーゼの機能を阻害する。これらのインヒビタータンパク質は酸化状態（ジスルフィド結合した状態）で活性なため、本発明のＴＲＸ組成物によってこれらのジスルフィド結合を切断し、インヒビター活性を阻害することが可能である。
【００５８】
以下に、本発明のＴＲＸ組成物によるインヒビター活性の阻害の例として、穀物種子トリプシンインヒビターの不可逆的失活を記載する。
【００５９】
穀物種子中に見出されるトリプシンインヒビターは分子量が１０，０００前後と小さいため、熱処理やプロテアーゼ処理にても失活せず穀物タンパク質の消化吸収を抑制することがＩｋｅｄａらにより報告されている（Ｋ．Ｉｋｅｄａ ａｎｄ Ｔ．Ｋｕｓａｎｏ （１９８３）Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４７（７）：１４８１−１４８６）。そのため、過剰に穀物種子タンパク質、例えば穀物粉を摂取した場合しばしば消化不良をきたす要因となる。また、ソバ種子タンパク質においてはトリプシンインヒビターがソバ アレルゲンの代表的例ともなっている（Ｐａｒｋ ＳＳ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４００（１）：１０３−１０７）。そこで、穀物タンパク質の消化吸収を促進させる目的で、貯蔵タンパク質中に見出されるトリプシンインヒビター活性を効果的にかつ穀物がもともと含有する栄養性を損なうことなく失活させることが重要であると考える。すなわち、熱処理や酸アルカリ処理といった栄養素の分解やタンパク質変性を伴わない温和な条件で穀物種子トリプシンインヒビターを不可逆的に失活させることが重要と考える。穀物種子トリプシンインヒビターは、酸化状態（ジスルフィド結合状態）で活性なことが知られており、本発明のＴＲＸ組成物によって、穀物種子トリプシンインヒビターのジスルフィド結合を切断し、インヒビター活性を不可逆的に失活させることが可能である。
【００６０】
さらに、上述したような還元型ＴＲＸの反応をより促進するには、レダクターゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈとの組合せによる上述した化学式１及び２記載のリサイクル反応が望ましい。そのためには、溶液で安定なＴＲＸ組成物としてＴＲＸに加えて、レダクターゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを構成成分に含むことが望ましい。用いるレダクターゼとしては、溶液で安定な酵母ＴＲＸと反応しうるレダクターゼであれば微生物由来、酵母由来、動植物由来などの何れもものでもよい。好ましくは酵母由来のチオレドキシンレダクターゼ（ＥＣ．１．６．４．５）を用いる。
【００６１】
酵母チオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）は、例えば、酵母培養菌体より天然型酵素を精製し取得することができる。天然酵素の精製法についてはＳｐｅｒａｎｚａ ＭＬら （１９７３） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １９７３ Ｄｅｃ １９；３２７（２）：２７４−８１．「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．」などに記載がある。あるいは、酵母ＴＲタンパク質は、酵母ＴＲ遺伝子を微生物や酵母菌体に遺伝子導入して得られる組換えタンパク質でもよい。
【００６２】
なお、本発明では本明細書の実施例７において後述するように、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｘ２１８０−１Ａ株より、配列番号５の塩基配列を有し、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵母ＴＲタンパク質をコードする、酵母ＴＲ遺伝子を単離した。配列番号５の塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されている（登録番号Ｕ１０２７４，ＣＤＳ ｆｏｒｍ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ＮＡＤＰＨ） ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．，Ｃｈａｅ，Ｈ．Ｚ．ら，０５−ＡＰＲ−１９９５）公知のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＣｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲ遺伝子の配列と、５カ所で塩基配列が相違していた。本発明で得られた配列番号５の酵母ＴＲ遺伝子を用いて、組換え酵母ＴＲタンパク質を得た。当該組換えＴＲタンパク質を本発明の酵母ＴＲＸとともと共に用いると、ソバ粉のトリプシンインヒビター活性を著しく阻害することが判明した（実施例８、図５）。よって、限定されるわけではないが、本発明の酵母ＴＲＸとともに使用するチオレドキシンレダクターゼとしては、塩基配列６のアミノ酸配列を有する酵母ＴＲが好ましい。
【００６３】
また、上述したように本発明の酵母チオレドキシンはヒトＴＲと５０％以上の交差反応性を有するため、ヒトへの適用においてヒトＴＲともに使用することも可能である。
【００６４】
本発明のＴＲＸタンパク質含有組成物は、例えば、ＴＲＸの酸化還元反応が関与する細胞内酸化還元状態に関する障害、疾患等を予防および／または治療するために用いることが可能である。例えば、ＴＲＸの生体内機能の一つとして、活性酸素や紫外線照射による細胞障害を防ぐという機能がある。本発明の組成物はＴＲＸの当該機能を補完または補助するために使用することが可能である。
【００６５】
本発明の組成物は全身または局所的に、好ましくは静脈内、皮下、皮内、筋肉内に非経口的に、あるいは経口的に投与しうる。非径行的に投与可能な酵母ＴＲＸタンパク質含有組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安全性等を考慮し、当業者の技術範囲内において行い得る。
【００６６】
本発明の組成物の用量用法は、組成物の作用、例えば、患者の症状の性質および／または重度、体重、性別、食餌、投与の時間、並びに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮し、診察する医師により決定される。当業者は、これらの要素に基づき、本発明の組成物の用量を決定することができる。
【００６７】
本発明の組成物は、所望により生理学的に受容可能な希釈剤および／または担体と種々の方法で処方しても良い。例えば、これらは液体希釈剤および／または担体を含む組成物、例えばしばしば非経口投与の為に注射可能な形態をとり、そしてその為に滅菌され発熱物質を含まない、水性又は油性の溶液、懸濁液若しくは乳液として適用しても良い。非経口投与が本発明の好ましい化合物には好ましい。経口投与目的の組成物は、液体希釈剤若しくは担体を含んでいても良いが、固体、例えば澱粉、ラクトース、デキストリン若しくはステアリン酸マグネシウムのような慣用された固体担体物質、を使用するのが更に一般的である。このような固体組成物は、例えば錠剤、カプセル（スパンスルを含む）等のように、適宜に成型されたものであっても良い。本発明の組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散別または安定化剤（例えばアルギニン、アスパラギン酸など）などの補助剤を含んでいてもよい。
【００６８】
このようにして得られる抗菌剤の剤形としては、使用する用途に応じて決めればよく、上記のような添加物と混合し、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、液剤、乳剤等の形態により添付することができる。
【００６９】
本発明の組成物は、保存剤を含まなくても長期間保存が可能である。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７０】
【実施例】
実施例１ 酵母ＴＲＸ発現組換え体の作製
酵母ＴＲＸ２遺伝子のクローニング
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体ゲノムを鋳型とし、ＰＣＲによりＴＲＸ２遺伝子を増幅し、クローニングした。
【００７１】
ＴＲＸ２は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ，登録番号ＡＡＡ８５５８４およびＵ４０８４３，ｔｈｉｏｒｅｄｏｘ．．．［ｇｉ：１１６５２１４］，Ｊａｅ Ｍａｈｎ Ｓｏｎｇら，２４−Ｊａｎ−１９９６等に登録されており、そのアミノ酸配列および塩基配列を各々本明細書の配列表の配列番号１および２に記載してある。配列番号２の塩基配列に基づき、ＴＲＸ遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーを、以下のように作製した。
【００７２】
【化３】
５’プライマー（センスプライマー）
５'−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡＣＴＣＡＡＴＴＡＡＡＡＴＣＣＧＣＴＴＣＴ−３'（配列番号３）
３’プライマー（アンチセンスプライマー）
５'−ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＡＣＧＴＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＴＧ−３'（配列番号４）
５’プライマーは、配列番号２の塩基配列の塩基番号１−２７にさらに制限酵素部位ＥｃｏＲ１部位（ＧＡＡＴＴＣ）を加えて作製した。一方、３’プライマーは、配列番号２の塩基配列の塩基番号２８８−３１２にさらに制限酵素部位ＢａｍＨ１部位（ＧＧＡＴＣＣ）加えて作製した。
【００７３】
一方、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｘ２１８０−１ Ａ株（遺伝子型：ＭＡＴα，ＳＵＣ２，ｍａｌ，ｍｅｌ，ｇａｌ２，ＣＵＰ１）（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号：ＡＴＣＣ２０４５０４）をＹＰＤ液体培地にて３０℃一晩振盪培養した。培養物より遠心分離した菌体より、ザイモリアーゼ及びＲＮＡアーゼを用いて染色体ゲノムを調製した。染色体ゲノム抽出は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９０），ｐｐ．１２８−１２９に記載の方法に従った。抽出した酵母染色体ＤＮＡを鋳型に前述のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、９５℃を０．５分、５５℃を０．５分、７２℃を１．５分のサイクルを３０回繰り返した。得られたＰＣＲ増幅産物をＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１で制限酵素処理した。制限酵素処理ＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｉｔＩＩに挿入しＤＮＡシーケンス後データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）との照合により、酵母ＴＲＸ２遺伝子（配列番号２）が遺伝子増幅できたことを確認した。
【００７４】
次いで、酵母ＴＲＸ２遺伝子を含むＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理した。得られた断片を、内田らの方法（Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ． １９９５ Ｊｕｎ １５；２３７ （１−２）：４３−５８）に従い調製した大腸菌発現用ｐＴＲＰベクター（Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ． １９９５，同上）中の強力なトリプトファンプロモーター下流のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ挿入部位に連結し、ＴＲＸ２遺伝子の高発現を促すようｐＴＲＰ−ｙＴＲＸ２プラスミドを作製した。ｐＴＲＰ−ｙＴＲＸ２プラスミドを用いて市販の大腸菌株ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造社製）を常法に従い形質転換し、形質転換体ｐＴＲＰ−ｙＴＲＸ２／ＪＭ１０９を獲得した。形質転換操作については、例えばラボマニュアル遺伝子工学（村松正実編、１９８８年、丸善株式会社）第１０９頁に詳述されている。
【００７５】
形質転換体ｐＴＲＰ−ｙＴＲＸ２／ＪＭ１０９は、平成１２年１月２５日に、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００４で、工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−００４６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。
【００７６】
実施例２ 組換え酵母ＴＲＸタンパク質の精製
実施例１で作製したＴＲＸ高発現株（ｐＴＲＰ−ｙＴＲＸ２／ＪＭ１０９）を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地（０．５％酵母エキス、１％ポリペプトン、１％ ＮａＣｌ）で３７℃、一晩フラスコしんとう培養した。得られた培養菌体を集菌分離し、１ｍＭ ジチオスレイトールを含む５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に菌体を懸濁した。そして、超音波破砕後の遠心分離上清をＴＲＸ抽出液とした。次いで、抽出液を６０℃、３０分間熱処理をおこない上澄み分画を７０％飽和硫安塩析にて沈殿物として回収した。塩析沈殿物を１．５Ｍ硫安濃度（ｐＨ７．５）にて溶解し、Ｂｕｔｈｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｃ６５０ゲル（東ソー製）を用いて疎水カラムクロマトグラフィーを実施した。ＴＲＸは１．０Ｍ硫安付近を溶出ピークとして回収された。疎水クロマトグラフィ溶出液を限外ろ過膜（ＹＭ１０、アミコン製）を用いて濃縮しＳｕｐｅｒｄｅｘＰｇ７５（ファルマシア製）ゲルろ過クロマトグラフィに供した。ＴＲＸは分子量１０，０００付近に主ピークとして溶出された。
【００７７】
ゲルろ過溶出分画の純度検定をポリアクリルアミド電気泳動にて調べた結果、分子量１２，０００の単一バンドを示した。本標品を最終精製品としＤＴＴを含まないＰＢＳ（ｐＨ７．２）にバッファー交換後、凍結乾燥粉末を調製した。
【００７８】
実施例３ ＴＲＸ活性測定
Ｈｏｌｍｇｒｅｎらの方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９３）に従い、ＴＲＸ活性測定を行った。
【００７９】
詳細には、先ず、０．４ｍＭ ＤＴＴ及び０．４ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）で３７℃、１５分間、サンプルを前処理した。次いで、以下の表１の成分を含む基質反応液中でＴＲＸによるインスリン還元反応を行った。酵母ＴＲＸサンプルは、最終反応液あたり０．２、０．５、１、２および５μＭ（各々およそ２．４、６１２、２４および６０μｇ／ｍＬ）になるように添加した。インスリンの還元反応に基づくＯＤ６５０ｎｍの吸光度上昇を室温で２０分間測定した。
【００８０】
【表１】
ＴＲＸ活性測定のための基質反応液組成
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）中
１ｍｇ／ｍＬ 牛膵インスリン（シグマ製）
１Ｍ ＤＴＴ
１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ
結果を、図１に示す。
【００８１】
また、酵母ＴＲＸのヒトへの適用の可能性を調べるため、酵母ＴＲＸとヒトのチオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）との反応性を調べた。具体的には、上記基質反応液組成の１ｍＭ ＤＴＴのかわりに１Ｕ／ｍＬヒト胎盤由来ＴＲと０．２７ｍＭ ＮＡＤＰＨを添加し、同様にインスリン還元反応にもどつくＯＤ６５０ｎｍの吸光度上昇を測定した。対照として、酵母ＴＲＸの代わりにヒトＴＲＸ（特開平７−７９７８０；組換えＡＤＦ製法特許）と市販大腸菌ＴＲＸ（プロメガ社製、米国）を用いた。各種ＴＲＸサンプルは、最終反応液あたり１μＭ（およそ１２μｇ／ｍＬ）になるように添加した。
【００８２】
ヒトのＴＲとの反応度合いを下記の表２にまとめた。表２に示したように、ヒトＴＲとの反応度合いついて、酵母ＴＲＸはヒトＴＲＸと比較して５０％の相対反応速度を示した。
【００８３】
【表２】
（ヒトＴＲに対する反応度合い）
ＴＲＸ給源 相対反応速度
ヒト １００％
酵母 ５０％
大腸菌 ０％
次いで、同様に、酵母ＴＲに対する各種ＴＲＸの反応度合いも調べた。結果を以下の表３に示した。表３に示したように、酵母ＴＲとの反応度合いついて、ヒトＴＲＸは酵母ＴＲＸと比較して８０％の相対反応速度を示した。
【００８４】
【表３】
（酵母ＴＲに対する反応度合い）
ＴＲＸ給源 相対反応速度
ヒト ８０％
酵母 １００％
大腸菌 ０％
実施例４ 過酸化水素に対する感受性
酵母ＴＲＸおよびヒトＴＲＸをそれぞれ種々の過酸化水素濃度を含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解し室温で１５分間処理をした。その後、非還元条件下でのポリアクリルアミド電気泳動を行った。銀染色バンドの移動度からダイマー形成率を調べた。
【００８５】
具体的には、ポリアクリルアミド電気泳動の銀染色における１２ｋｄバンド（モノマー）と２４ｋｄバンド（ダイマー）との染色像の濃淡比率をデンシトメトリーにて数値化し、ダイマー形成率又はモノマー残存率を算出することができる。また、過酸化水素に対する感受性を各種過酸化水素処理濃度に対してダイマー形成率又はモノマー残存率をプロットすることにより酸化条件に対するＴＲＸ感受性を比較することができる。
【００８６】
非還元条件下（各過酸化水素濃度で、１５分処理）で電気泳動を行った銀染色像を図２に示す。また、各過酸化水素濃度での処理に対するダイマー形成およびモノマー残存率を表４および図３に示す。
【００８７】
【表４】

表４および図３に示したように、ヒトＴＲＸは１ｍＭの濃度の過酸化水素において、ダイマー化がはっきりと認められたの対し、酵母ＴＲＸは、１０ｍＭ濃度下においてもダイマー化は生じなかった。
【００８８】
実施例５ 酵母ＴＲＸの非還元条件下での溶液安定性
酵母ＴＲＸ凍結乾燥粉末を還元剤を含まないＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解し、溶解後の冷蔵（２℃−８℃）安定性を調べた。各経経過日数におけるＴＲＸ残存活性を実施例３に記載の活性測定方法に基づき行った。溶解直後のＴＲＸ活性値に対する各経過日数での残存活性率（％）を算出し、冷蔵保存日数に対してプロットした。
【００８９】
結果を図４に示す。図４より、酵母ＴＲＸは還元剤を含まない非還元条件下で２５日以上経過してもＴＲＸ残存活性率がほぼ１００％で、活性がほとんど変化せず溶液安定性が極めて良いことが見出された。これに対し、ヒトＴＲＸは、溶解直後から徐々に活性が下がり、１ヶ月経過後は溶解直後の４０％まで活性が低下した。また、ＴＲＸ溶解液を凍結し凍結融解がＴＲＸ活性に及ぼす影響も調べたところ、酵母ＴＲＸは凍結融解前後でも全く失活を認めなかった。
【００９０】
実施例６ 酵母チオレドキシンレダクターゼ遺伝子のクローニング
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｘ２１８０−１Ａ株（遺伝型：ＭＡＴα，ＳＵＣ２，ｍａｌ，ｍｅｌ，ｇａｌ２，ＣＵＰ１）、アメリカンタイプカルチャーコレクション番号：ＡＴＣＣ２０４５０４をＹＰＤ液体培地にて３０℃一晩振盪培養した。遠心分離菌体より、ザイモリアーゼ及びＲＮＡアーゼを用いて染色体ゲノムを調製した。染色体ゲノム抽出は、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９９０） ｐｐ１２８−１２９記載の方法に従った。
【００９１】
次いで、抽出した酵母染色体ＤＮＡを鋳型にセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（配列番号７及び８）を用いてＰＣＲ反応をおこなった。ＰＣＲは、９５℃で０．５分、５５℃で０．５分、７２℃で１．５分のサイクルを３０回繰り返した。酵母チオレドキシンレダクターゼ遺伝子のＰＣＲ増幅産物を得るために用いたセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの配列を以下に示した。センスプライマー及びアンチセンスプライマーにはそれぞれ制限酵素部位ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１サイトが導入して設計した。
【００９２】
【化４】
センスプライマー（配列番号７）
５’−ＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＴＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＴＴＡＣＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴ−３’
アンチセンスプライマー（配列番号８）
５’−ＡＣＡＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＣＴＡＧＧＧＡＡＧＴＴＡＡＧＴＡＴＴＴＣＴＣＡ−３’
得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１処理した。次いで、制限酵素処理ＤＮＡ断片をＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１処理したクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｉｔＩＩに挿入した。ＤＮＡ配列決定後、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子が増幅されたことを確認した。配列決定により明らかにされた酵母ＴＲの塩基配列および推定アミノ酸配列を後述の配列表の配列番号５および６に示した。
【００９３】
本発明により解明された酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの塩基配列およびアミノ酸配列（配列番号５および６）をＧｅｎｂａｎｋの登録配列（登録番号Ｕ１０２７４，ＣＤＳ ｆｏｒｍ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ＮＡＤＰＨ） ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．，Ｃｈａｅ，Ｈ．Ｚ．ら，０５−ＡＰＲ−１９９５）とを比較した。すると、本発明で得られた酵母ＴＲは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録配列と比較して、５ヵ所で塩基置換が生じており、その内４ヵ所がアミノ酸残基の置換をもたらすことが明らかとなった。また、１ヵ所での塩基挿入ならびに１ヵ所での欠失がおこりアミノ酸１８０番目のシステインから１９６番目のアラニンまでの１７アミノ酸配列にフレームシフトがおこっていることを見出した。
【００９４】
さらに、本発明で得られた酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＣｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲのアミノ酸配列（配列番号６）、そのＧｅｎｂａｎｋ登録アミノ酸配列（Ｕ１０２７４）、並びに酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅのＴＲのＧｅｎｂａｎｋ登録アミノ酸配列（登録番号Ｕ６３７１３，ＣＤＳ ｆｏｒｍ：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．，Ｃａｓｓｏ．Ｄ．ら，１９−ＤＥＣ−１９９５）の相同性を比較した。すると、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＣｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲのＧｅｎｂａｎｋ登録アミノ酸配列（Ｕ１０２７４）は、酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅのＴＲのＧｅｎｂａｎｋ登録アミノ酸配列（Ｕ６３７１３）と相同性が６９．９％であったのに対し、配列番号６の本発明の酵母ＴＲのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録アミノ酸配列（Ｕ６３７１３）と７３．０％とより高い相同性を有していた。
【００９５】
実施例７ 組換え酵母チオレドキシンレダクターゼタンパク質の調製およびＴＲ活性測定
次いで、実施例６で得られた酵母チオレドキシンレダクターゼ遺伝子を含む、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ処理したＰＣＲ増幅断片を、内田ら記載の方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ．１９９５ Ｊｕｎ １５；２３７（１０２）：４３−５８）に従い、調製した大腸菌発現用ｐＴＲＰベクターの強力なトリプトファンプロモーター下流のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ挿入部位に連結し、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子の高発現を促すようｐＴＲＰ−ｙＮＴＲプラスミドを作製した。ｐＴＲＰ―ｙＮＴＲを用いて市販大腸菌株ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）を常法に従い形質転換し、大腸菌形質転換体ｐＴＲＰ―ｙＮＴＲ／ＪＭ１０９を得た。形質転換操作については、例えばラボマニュアル遺伝子工学（村松正実編１９８８丸善株式会社）第１０９ページに詳述されている。
【００９６】
形質転換体ｐＴＲＰ−ｙＮＴＲ／ＪＭ１０９は、平成１２年３月２日に、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７０６７で、工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−００４６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。
【００９７】
チオレドキシンレダクターゼ高発現株（ｐＴＲＰ−ｙＮＴＲ／ＪＭ１０９）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地（０．５％酵母エキス、１％ポリペプトン、１％ＮａＣｌ）で３７℃、一晩フラスコしんとう培養した。得られた培養菌体を集菌分離し、０．１ｍＭ ＦＡＤ及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．０）に菌体を懸濁した。そして、超音波破砕後の遠心分離上清をＴＲ抽出液とした。
【００９８】
Ｏｂｌｏｎｇ ＪＥらの方法（Ｏｂｌｏｎｇ ＪＥ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：７２７１）に従い、組換えＴＲ活性を測定した。具体的には、以下の表５の基質反応液と酵母ＴＲ抽出液（１−１０Ｕ／ｍｌの酵母ＴＲ抽出液を０．０１−０．１ｍｌ使用）を混合して、ＴＲによるＤＴＮＢの還元作用を観察した。反応は、２５℃で１分間行った。ＴＲの１活性単位（１Ｕ）は、２５℃での１分間当たりの４１２ｎｍ吸光度変化量が１．０／分とした。
【００９９】
【表５】
基質反応液組成
バッファー： ０．１Ｍ Ｎａ−ＰＯ₄ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）
−１ｍＭ ＥＤＴＡ− ０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
補酵素濃度： ０．２４ｍＭ ＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母製）
基質濃度： ４ｍＭ ＤＴＮＢ （ジチオニトロ安息香酸、和光純薬製）
次いで、抽出液をＤＥＡＥ−セファロースＣＬ６Ｂカラムにチャージし０−０．２Ｍ ＮａＣｌ濃度勾配にてイオン交換クロマトグラフィーを行った。組換えチオレドキンレダクターゼ活性は０．１２Ｍ ＮａＣｌをピークとして溶出された。主分画を回収後限外ろ過膜（ＹＭ１０、アミコン製）を用いて濃縮しセファクリルＳ−２００ＨＲカラムによるゲルろ過クロマトグラフィーを行った。分子量７０ｋｄ付近に単一ピークとして溶出されたゲルろ過溶出分画の純度検定をポリアクリルアミド電気泳動にて調べた結果、分子量３５，０００の単一バンドを示した。
【０１００】
本標品を最終精製品としＥＤＴＡを含まないＰＢＳ（ｐＨ７．２）にバッファー交換後、黄色の凍結乾燥粉末を調製した。最終精製酵素は比活性１３Ｕ／ｍｇを示した。本発明の組換えチオレドキシンレダクターゼの諸性質を以下の表６に列記する。
【０１０１】
【表６】
作用ｐＨ ：７−８、至適ｐＨは７．５
ｐＨ安定性：５−９（３７℃一晩保存）
熱安定性：４５℃まで（ｐＨ７．５、２０分間処理）
実施例８ 酵母ＴＲＸによるそば粉トリプシンインヒビター阻害活性
市販のそば粉１００ｇにアセトンを１００ｍｌ混合し脱脂を行った。４℃、２時間靜置後遠心でアセトン溶液を取り除き、乾燥し脱脂そば粉を調製した。脱脂そば粉１００ｇに５００ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−０．５Ｍ ＮａＣｌを添加した。次いで、スターラーを用いて４℃一晩撹拌し、遠心分離により上清を得た。上清を硫安沈殿（９０％飽和）し、得られた沈殿について最小容量の純水で懸濁した。懸濁液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ８．６）−１ｍＭ ＥＤＴＡで透析しソバ粉トリプシンインヒビター抽出液を調製した。
【０１０２】
上述のＩｋｅｄａ Ｋらの方法（Ｋ．Ｉｋｅｄａ ａｎｄ Ｔ．Ｋｕｓａｎｏ（１９８３）Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４７（７）：１４８１−１４８６）に従い、そば粉抽出液中のトリプシンインヒビター活性を測定した。得られたソバ粉抽出液タンパク質は、１ｍｇあたり１１０ ＢＡＥＥ単位のＴＰＣＫ−トリプシン（シグマ社製、米国）を阻害するインヒビター活性を有していた。
【０１０３】
次いで、酵母チオレドキシン処理によるソバ粉トリプシンインヒビター活性の変化を調べた。具体手には、調製したソバ粉抽出液を用い、以下の表７の条件にてチオレドキシン処理を行った。
【０１０４】
【表７】
反応液量 １００Ｌ
反応バッファー ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）
？１ｍＭ ＥＤＴＡソバ抽出タンパク質 １４ｇ
ＴＰＣＫ−トリプシン ３．３ ＢＡＥＥ単位
酵母ＴＲＸ ソバ抽出タンパク質に対して０−５０重量％添加
また、酵母ＴＲＸ単独のものに対し、さらに、実施例７で得られたレダクターゼ及びＮＡＤＰＨの添加したものについても、ソバ粉トリプシンインヒビター活性への影響を調べた。レダクターゼは１４ｇ（０．１５Ｕ）、ＮＡＤＰＨは０．８３ｍｏｌそれぞれ添加した
結果を、図５に示す。図５に示されたように、チオレドキシン単独で処理を行った場合（ｙＴＲＸ単独）、トリプシンインヒビター活性の２０％が失活した。さらに、ＴＲＸおよびＮＡＤＰＨを共存させた場合（ＮＴＲ＋ＮＡＤＰＨ共存）、トリプシンインヒビター活性の６０％が失活させた。特に後者では、還元型ＴＲＸリサイクル反応の促進効果が現われ、ソバ抽出タンパク質に対するＴＲＸの添加比率を０．５％にまで低減させてもトリプシンインヒビター活性の６０％が失活した。
【０１０５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、各濃度の酵母ＴＲＸタンパク質のインスリン還元活性の時間変化を示す。
【図２】図２は、酵母およびヒトのＴＲＸを非還元条件下で電気泳動を行った銀染色像である。
【図３】図３は、各濃度の過酸化水素処理により酵母およびヒトのＴＲＸのモノマー残存率を示す。
【図４】図４は、酵母およびヒトのＴＲＸの冷蔵保存下における残存活性率の経時変化を示す。
【図５】図５は、酵母ＴＲＸ処理によるソバ粉のトリプシンインヒビターの残存活性を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
An object of the present invention is to provide a thioredoxin composition that is stable in a solution, particularly stable even under non-reducing conditions, and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
In recent years, there has been a series of evidences suggesting that intracellular phenomena, including proliferation and cell death, are regulated by the intracellular redox state (Pahl, HL & Baeuler, PA). 1994) BioAssays 16, 497-502). In particular, transcription factors controlled by a thiol redox regulatory mechanism have been listed one after another by in-vitro gel shift test (Matthews, JR, Wakasugi, N., Virerizier, JL, Yodoi, J. et al.). & Hay, RT (1992) Nucleic Acids Res. 20, 3821-30, Abate, C., Patel, L., Rauscher, F. Jd. & Curran, T. (1990) Science 249 1157- 1161). This includes AP-1, NF-κB, other members of the Dorsal / Rel family, and known transcription factors such as Myb and Ets. However, regarding the activity control of these transcription factors, it has been known that chemical reagents such as 2-ME and DTT activate the DNA binding ability of the transcription factor. The question of whether to work as yet has not been clarified.
[0003]
Thioredoxin (hereinafter referred to as “TRX”) has attracted attention as a promising candidate for an intracellular redox regulator. TRX is an electron transfer protein having a molecular weight of approximately 10,000 to 13,000 kDa that is universally present in the living body, and has a site having two cysteines-Cys-Gly-Pro-Cys- as an active center (Laurent, TC, Moore, EC, & Reichard, P. (1964) J. Biol. Chem. 239, 3436-3444; Holmgren, A. (1989) Ann. Rev. Biochem. 54, 237-271; Holmgren, A. (1989) J. Biol.Chem.264, 13963-1366; Buchanan, BB, Schurmann, P., Decotignies, P. & Lozano, RM (1994) Arch.Biochem.Biophys. 314, 257-60 A cellular factors pleiotropic involved in redox reactions through reversible oxidation of dithiol in the active center. TRX exists in both reduced and oxidized forms, and is thought to play an important role in controlling intracellular phenomena including gene expression. It is also known as mature T cell leukemia derived factor (ADF) involved in HTLV-I leukemia development. TRX is intracellular (Matthews, JR et al., 1992, supra; Okamoto, T., Ogiwara, H., Hayashi, T., Mitsui, A., Kawabe, T. & Yodoi, J. (1992) Int. Immunol 4,811-9) and extracellular. One of the functions in the cell is known to promote protein-nucleotide interactions.
[0004]
The biochemical mechanism of TRX's active oxygen defense is as follows:
1) As a reaction for cleaving intermolecular and / or intramolecular S—S bonds of proteins,
[0005]
[Chemical 1]

[0006]
And the reaction
2) As a peroxide elimination reaction by a combination reaction with peroxidase,
[0007]
[Chemical 2]

[0008]
The recycling reaction is known. See, for example, Yoshiharu Inoue, 1999, Journal of Japanese Society of Agricultural Chemistry, Vol. 73, No. 10, pages 1013-1021, incorporated herein by reference.
[0009]
TRX exists widely from E. coli and yeast to higher plants and higher animals, and is involved in various redox reactions in vivo. So far, various TRXs from Escherichia coli to higher organisms have been isolated, and the structure has been elucidated (Japanese Patent Publication No. 5-55519 etc.). In addition, cloning of the thioredoxin gene has been promoted (Japanese Patent No. 2633295).
[0010]
Among these, particularly human TRX (sometimes referred to as “ADF”) protein has cysteine residues at 5 positions of positions 32, 35, 62, 69 and 73 in the amino acid sequence. Of these, the site having two cysteines at positions 32 and 35 -Cys-Gly-Pro-Cys- is known to be a redox active site (Laurent, TC, et al. (1964), supra; Holmgren; (1989) Ann. Rev. Biochem., Supra; Holmgren, A. (1989) J. Biol. Chem., Supra; Buchanan, BB et al., (1994) supra). Therefore, human-type TRX has Cys residues other than the redox sites, that is, at positions 62, 69 and 73, so that the solution stability is poor, and dimerization may occur and activity may be reduced particularly under oxidative conditions. (Gasdaska JR et al. 1996 Biochem. Pharmacol. Vol. 52: 1741-1747).
[0011]
One of the physiological functions of human-type TRX is to prevent cell damage caused by active oxygen or ultraviolet irradiation (Sachi Y. et al. 1995, Immunology Letters Vol. 44: 189-193). As a means for protecting cells from active oxygen damage and ultraviolet light damage, a method of enhancing TRX synthesis in cells and a method of adding TRX from the outside can be considered. Examples of a method for enhancing TRX synthesis include a method for activating AP-1 transcription factor that promotes synthesis of components involved in a series of oxidation defenses including TRX. In addition, when TRX is added from the outside, stable TRX that can act in the above-described TRX reaction system is required. That is, a stable TRX capable of reacting significantly with human thioredoxin reductase (TR) or human thioredoxin peroxidase (TPx) is required.
[0012]
As a stable TRX, a Cys residue-substituted TRX that binds to Ref-1 through an SS bond and activates an AP-1 transcription factor has already been reported (JP-A-10-191977). The Cys residue substitution TRX does not modify the Cys residue at the active center of thioredoxin, and substitutes at least one or all other Cys residues with other amino acid residues. It is stable.
[0013]
However, the Cys residue-substituted TRX is a modified form of natural TRX and generally needs to be obtained by mutagenesis by genetic engineering techniques. Furthermore, when considering industrial use in various fields, materials from natural sources that are easy to check for safety are preferable, particularly in the field of quasi-drugs such as food and cosmetics. Therefore, there is a need for a composition containing stable TRX that is not a modified TRX, but a TRX derived from a natural source and that can be used safely in mammals such as humans.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a thioredoxin composition containing a thioredoxin that is solution-stable even under non-reducing conditions. The thioredoxin of the present invention is yeast thioredoxin.
[0015]
In one embodiment of the present invention, preferably, the yeast thioredoxin is a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or an amino acid containing a mutation due to deletion, substitution or addition of one or more amino acid residues in the sequence A protein that has a sequence and is biologically active and stable.
[0016]
The present invention also aims to provide the use of a solution stable yeast thioredoxin in a thioredoxin composition.
[0017]
Another object of the present invention is to provide a method for producing a composition comprising the yeast thioredoxin, and optionally a physiologically acceptable diluent and / or carrier.
[0018]
[Means for Solving the Problems]
As described above, TRX is a constant protein that exists widely from microorganisms to animals and plants. As a result of diligent research aimed at solving the above problems, the present inventor has found that yeast thioredoxin does not show dimerization even after 1) treatment with 1 mM hydrogen peroxide; 2) 80% for one month under non-reducing conditions It has been found that it exhibits the above-mentioned solution stability; and 3) it has a cross-reactivity of 50% or more with respect to human thioredoxin reductase. An object of the present invention is to provide a composition that is stable in a solution and can be stored for a long period of time by utilizing the above properties of the yeast thioredoxin.
[0019]
Yeast TRX
As long as the yeast TRX protein of this invention has the characteristics described in this specification, the origin, a manufacturing method, etc. are not limited. That is, the yeast TRX protein of the present invention may be a naturally occurring protein, a protein expressed from recombinant DNA by genetic engineering techniques, or a chemically synthesized protein.
[0020]
The yeast TRX protein of the present invention typically has the 104 amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing herein. SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the TRX2 protein of the yeast Saccharomyces cerevisiae (Genbank, accession number AAA85584 (U40843), thioredox ... [gi: 1165214], Jae Mahn Song et al, 24-Jan-1996). However, one or more amino acid mutations may occur in natural proteins due to differences in the varieties of species that produce them, genetic variations due to differences in ecosystems, or the presence of similar isozymes. It is well known that there are mutated proteins. For example, SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the TRX2 protein of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Can be used in the invention. As used herein, the term “amino acid mutation” means substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acids. The yeast TRX protein of the present invention has the amino acid sequence described in 1. However, the present invention is not limited only to the protein having the sequence, and may include all homologous proteins as long as they have the characteristics described herein. Intended. The homology is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more.
[0021]
As used herein, the percent homology is determined by comparison with sequence information using, for example, the BLAST program described in Altschul et al. (Nucl. Acids. Res. 25., p. 3389-3402, 1997). Is possible. The program can be used on the Internet from the website of National Center for Biotechnology Information (NCBI) or DNA Data Bank of Japan (DDBJ). Various conditions (parameters) for homology search by the BLAST program are described in detail on the same site, and some settings can be appropriately changed, but the search is usually performed using default values.
[0022]
In general, substitution between amino acids having similar properties (for example, substitution from one hydrophobic amino acid to another hydrophobic amino acid, substitution from one hydrophilic amino acid to another hydrophilic amino acid, substitution from one acidic amino acid to another When a substitution to an acidic amino acid or a substitution from one basic amino acid to another basic amino acid is introduced, the resulting mutant protein often has the same properties as the original protein. Techniques for producing recombinant proteins having such desired mutations using gene recombination techniques are well known to those skilled in the art, and such mutant proteins are also included within the scope of the present invention.
[0023]
However, the yeast TRX protein of the present invention preferably retains at least one of the advantageous physicochemical properties as described above. In this specification, “biologically active and stable” means that the TRX protein has the above-described TRX redox function even when the TRX protein has an amino acid sequence different from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. And the above-mentioned physicochemical properties are retained. Although not limited, in order to prevent dimerization of TRX protein and maintain solution stability, TRX protein preferably has no Cys residue other than the redox active site.
[0024]
Yeast TRX gene
The yeast TRX protein of the present invention may be purified from a natural source, or may be expressed by genetic engineering using a gene encoding yeast thioredoxin, for example, as described in the Examples below. More specifically, for example,
i) transforming a host cell with an expression vector comprising a gene encoding a yeast thioredoxin protein;
ii) culturing the host cell under conditions that promote expression of the yeast thioredoxin protein; and
iii) recovering recombinant yeast thioredoxin protein from the host cell
Thus, a recombinant protein can be obtained.
[0025]
The gene encoding the yeast TRX protein of the present invention is not particularly limited, and may be any of naturally derived DNA, recombinant DNA, and chemically synthesized DNA, and any of genomic DNA clones and cDNA clones. A person skilled in the art can easily obtain the gene encoding the yeast TRX protein of the present invention using the genetic engineering techniques described herein and commonly used.
[0026]
The yeast TRX gene typically has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (Genbank, Accession No. U40843 (AAA85584), thioledox ... [gi: 1165214], Jae Mahn Song et al., 24-Jan. -1996). SEQ ID NO: 2 is the base sequence of the gene encoding the TRX2 protein of the yeast Saccharomyces cerevisiae. However, the present invention is not limited to this. Among natural genes, there are a small number of mutations due to differences in the varieties of the species that produce them, a small number of mutations due to differences in ecosystems, and the presence of similar isozymes. It is well known to those skilled in the art. Therefore, the gene encoding the yeast TRX protein of the present invention is not limited to the gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and includes all genes encoding the yeast TRX protein described above. To do.
[0027]
A gene encoding the yeast TRX protein of the present invention having the base sequence of the yeast TRX2 gene described in SEQ ID NO: 2 and further having a base sequence other than SEQ ID NO: 2 are also included in SEQ ID NO: Based on the amino acid sequence of the yeast TRX2 protein described in 1 and 2 and the DNA sequence encoding the same, or a part thereof, for example, obtained using basic techniques of genetic engineering such as hybridization and nucleic acid amplification reaction It is possible. Using these genetic engineering techniques, it is also possible to isolate a gene encoding a protein having a similar physiological activity from yeast or other biological species.
[0028]
Hybridization conditions used for gene screening are not particularly limited, but generally stringent conditions are preferable, for example, 6 × SSC, 5 × Denhardt's, 0.1% SDS, 25 ° C. to 68 ° C. It is conceivable to use hybridization conditions such as ° C. In this case, the hybridization temperature is more preferably 45 ° C. to 68 ° C. (no formamide) or 25 ° C. to 50 ° C. (50% formamide). It is well known to those skilled in the art that DNA containing a base sequence having a homology more than a certain homology can be cloned by appropriately setting hybridization conditions such as formamide concentration, salt concentration and temperature. The homologous gene thus produced can also be used to produce the yeast TRX protein of the present invention.
[0029]
Nucleic acid amplification reactions include, for example, replication chain reaction (PCR) (Saiki et al., 1985, Science 230, p. 1350-1354), ligase chain reaction (LCR) (Woo et al., 1989, Genomics 4, p. 560-569; Ballinger et al., 1990, Gene 89, p. 117-122; Barany et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, p. 189-193) and transcription-based amplification (Cou et al., 1989, Proc. Natl. Acad.Sci.USA 86, p.1173-1177), as well as strand displacement reactions (SDA) (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, p. 392-396; Walker et al., 1992, Nuc. ds.Res.20, p.1691-1696), self-retaining sequence replication (3SR) (Guateri et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, p.1874-1878) and the Qβ replicase system (Rizildi et al. 1988, BioTechnology 6, pp. 1197-1202). In addition, amplification based on a nucleic acid sequence by competitive amplification of a target nucleic acid and a mutant sequence described in European Patent No. 0525882 (Nucleic Acid Sequence Based Amplification: NASABA) reaction or the like can also be used. The PCR method is preferred.
[0030]
The homologous gene cloned using the above hybridization, nucleic acid amplification reaction or the like is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably relative to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. 90% or more homology.
[0031]
Based on the nucleotide sequence of the gene encoding yeast TRX protein, an oligonucleotide primer for amplification used for nucleic acid amplification reaction for obtaining yeast TRX gene can be prepared. More specifically, for example, the oligonucleotide selects two regions from the base sequence of the gene encoding the yeast TRX protein of SEQ ID NO: 2 so as to satisfy the following conditions:
1) The length of each region is 15-30 bases;
2) the percentage of G + C in each region is 40-60%; and
3) The distance between each region is about 100 to about 1000 bases.
A single-stranded DNA having the same base sequence as the above region or a base sequence complementary to the above region is produced, or the genetic code is degenerate so as not to change the amino acid residue encoded by the single-stranded DNA. Produces a mixture of single-stranded DNAs considered, and if necessary, produces the single-stranded DNA modified so as not to lose the binding specificity to the base sequence of the gene encoding the protein.
It is possible to manufacture by the method including this. The oligonucleotide can be used for, for example, hybridization for detecting or isolating the yeast TRX gene of the present invention, or amplification reaction such as PCR using two appropriate primer pairs (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 3 and 4).
[0032]
A gene encoding the yeast TRX protein of the invention having a base sequence other than the base sequence of the yeast TRX2 gene described in SEQ ID NO: 1 is also described in SEQ ID NOS: 1 and 2 in the present specification. For example, site-directed mutagenesis that is a well-known technique (for example, Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20) using the amino acid sequence of the yeast TRX2 protein and the DNA sequence encoding the same, or a part thereof. , P. 6487-6500, 1982).
[0033]
The site-directed mutagenesis method is, for example, as follows using a synthetic oligonucleotide primer complementary to a single-stranded DNA to be mutated, for example, other than a specific mismatch which is a desired mutation. It can be carried out. That is, a strand complementary to the single-stranded DNA is synthesized using the synthetic oligonucleotide as a primer, and a host cell is transformed with the obtained double-stranded DNA. Plate the cultures of transformed host cells to form plaques from single cells containing the DNA. Then, theoretically, 50% of new colonies contain DNA having a mutation as a single strand, and the remaining 50% has the original sequence. The obtained plaque is labeled with a radioisotope or the like at a temperature at which it hybridizes with a DNA that completely matches the DNA having the desired mutation, but does not hybridize with a DNA that does not match, that is, that having the original sequence. Hybridize with the synthesized probe. Next, a probe that hybridizes with the probe is picked up and cultured to recover DNA.
[0034]
Production of yeast TRX protein
In order to express the recombinant yeast TRX protein of the present invention, a recombinant vector containing the yeast TRX gene is prepared. As a method for incorporating the DNA fragment of the gene of the present invention into a vector such as a plasmid, for example, “Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53 (1989)”. And the like. For convenience, a commercially available ligation kit (for example, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) can be used. The recombinant vector thus obtained (for example, a recombinant plasmid) is introduced into a host cell (for example, E-coil JM109, TB1, LE392 or XL-1 Blue).
[0035]
As a method for introducing a plasmid into a host cell, the calcium chloride method or chloride described in “Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (second edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74 (1989)”. Examples thereof include a calcium / rubidium chloride method, an electroporation method, an electroinjection method, a method using chemical treatment such as PEG, and a method using a gene gun.
[0036]
A vector can be conveniently prepared by linking a desired gene to a recombination vector (for example, plasmid DNA) available in the art by a conventional method. Specific examples of the vector used include, but are not limited to, plasmids derived from E. coli such as pBluescript, pUC18, pUC19, and pBR322.
[0037]
For the purpose of producing a desired protein, an expression vector is particularly useful. The type of expression vector is not particularly limited as long as it has a function of expressing a desired gene and producing a desired protein in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells. PQE-30, pQE-60, pMAL-C2, pMAL-p2, pSE420 and the like are preferable as expression vectors for yeast, and pYES2 (Saccharomyces genus), pPIC3.5K, pPIC9K, pAO815 (and above Pichia genus) as expression vectors for yeast. Insect expression vectors such as pBacPAK8 / 9, pBK283, pVL1392, and pBlueBac4.5 are preferred. The expression vector pTRP for E. coli ((ClinChim Acta. 1995 Jun 15; 237 (1-2): 43-58) is preferred.
[0038]
A transformant can be prepared by introducing a desired expression vector into a host cell. The host cell to be used is not particularly limited as long as it is compatible with the expression vector of the present invention and can be transformed, and is a natural cell usually used in the technical field of the present invention or artificially established. Various cells such as recombinant cells can be used. Examples include bacteria (Escherichia, Bacillus), yeasts (Saccharomyces, Pichia, etc.), animal cells, insect cells, plant cells, and the like.
[0039]
The host cell is preferably Escherichia coli, yeast or insect cell. Specifically, Escherichia coli (M15, JM109, BL21, etc.), yeast (INVSc1 (genus Saccharomyces), GS115, KM71 (genus Pichia), etc.), insect cell ( BmN4, silkworm larvae, etc.) are exemplified. Examples of animal cells include mouse-derived, Xenopus-derived, rat-derived, hamster-derived, monkey-derived or human-derived cells, or cultured cell lines established from these cells. Particularly preferred host cells are E. coli, more preferably E. coli JM109 (eg available from Takara Shuzo).
[0040]
When bacteria, particularly E. coli are used as host cells, the expression vector generally comprises at least a promoter / operator region, a start codon, a gene encoding the desired yeast TRX protein, a stop codon, a terminator, and a replicable unit.
[0041]
When yeast, plant cells, animal cells or insect cells are used as host cells, the expression vector generally comprises at least a promoter, an initiation codon, a gene encoding the desired yeast TRX protein, a stop codon, and a terminator. It is preferable. Further, it may appropriately contain a DNA encoding a signal peptide, an enhancer sequence, untranslated regions on the 5 'side and 3' side of the desired gene, a selectable marker region or a replicable unit.
[0042]
In the vector of the present invention, a suitable start codon is exemplified by methionine codon (ATG). Moreover, as a stop codon, a common stop codon (for example, TAG, TGA, TAA etc.) is illustrated.
[0043]
A replicable unit means a DNA having the ability to replicate its entire DNA sequence in a host cell, a natural plasmid, an artificially modified plasmid (a plasmid prepared from a natural plasmid) and Synthetic plasmids and the like are included. Suitable plasmids include E. coli. In plasmid, plasmid pQE30, pET or pCAL or an artificially modified product thereof (DNA fragment obtained by treating pQE30, pET or pCAL with an appropriate restriction enzyme), plasmid pYES2 or pPIC9K in yeast, and plasmid in insect cells pBacPAK8 / 9 and the like.
[0044]
As the enhancer sequence and terminator sequence, those commonly used by those skilled in the art, such as those derived from SV40, respectively, can be used.
[0045]
As the selection marker, a commonly used marker can be used by a conventional method. Examples include tetracycline, ampicillin, or antibiotic resistance genes such as kanamycin or neomycin, hygromycin or spectinomycin.
[0046]
The expression vector should be prepared by linking at least the above-mentioned promoter, start codon, gene encoding the desired yeast TRX protein, stop codon, and terminator region continuously and circularly to appropriate replicable units. Can do. At this time, an appropriate DNA fragment (for example, a linker, other restriction enzyme sites, etc.) can be used by a conventional method such as digestion with a restriction enzyme or ligation using T4 DNA ligase, if desired.
[0047]
Introduction of the expression vector of the present invention into a host cell [transformation (transfection)] can be performed using a conventionally known method.
[0048]
For example, in the case of bacteria (E. coil, Bacillus subtilis, etc.), the method of Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method [Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)] and the competent method [J. Mol. Biol. , 56, 209 (1971)], in the case of Saccharomyces cerevisiae, for example, the method of Hinnen et al [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1927 (1978)] and lithium method [J. Bacteriol. , 153, 163 (1983)], in the case of plant cells, for example, leaf cells [Science, 227, 129 (1985)], electroporation [Nature, 319, 791 (1986)]. For example, Graham's method [Virology, 52, 456 (1973)], and for insect cells, for example, the method of Summers et al. [Mol. Cell. Biol. 3, 2156-2165 (1983)].
[0049]
In the examples of the present invention, in particular, the yeast TRX gene was inserted into the aforementioned expression vector pTRP for Escherichia coli, and then transformed with Escherichia coli strain JM109 (Takara Shuzo) as a host cell. The obtained transformant pTRP-yTRX2 / JM109 was deposited on January 25, 2000 under the deposit number FERM BP-7004, National Institute of Biotechnology, Tsukuba, Ibaraki 305-0046 No. 1 No. 3).
[0050]
As described above, recombinant yeast TRX expressed by genetic engineering or TRX derived from a natural source can be purified using a conventional purification technique such as ammonium sulfate precipitation and ion exchange column chromatography. it can. More specifically, the purification and isolation of yeast TRX protein includes ammonium sulfate precipitation, gel filtration column chromatography (Butyl-Toyopearl C650 gel (manufactured by Tosoh), Superdex Pg75 (manufactured by Pharmacia), etc.), ion exchange chromatography, etc. The methods commonly used for the purification and isolation of these proteins can be combined appropriately.
[0051]
Composition comprising yeast TRX
The yeast TRX protein of the present invention has the following physicochemical properties:
1) Dimerization is not observed even after treatment with 1 mM hydrogen peroxide;
2) exhibit a solution stability of 80% or more for 1 month under non-reducing conditions; and
3) 50% or more cross-reactivity with human thioredoxin reductase
At least one of the following.
[0052]
As demonstrated in Example 4 (Table 4, FIG. 2 to FIG. 3) described later, human TRX clearly showed dimerization at 1 mM hydrogen peroxide, whereas yeast TRX had 1 mM. Dimerization did not occur under the concentration as well as the 10 mM concentration. Whether or not TRX causes dimerization is not limited, but can be examined as described in Example 4 to be described later, for example. For example, after treatment with a predetermined concentration of hydrogen peroxide, for example, at room temperature for about 15 minutes to about 1 hour, polyacrylamide electrophoresis is performed under non-reducing conditions. It is possible to examine the dimer formation rate from the electromobility of the silver stained band.
[0053]
The yeast TRX protein of the present invention is, for example, refrigerated (10 ° C. or less, preferably about 2 ° C.) in a state dissolved in a solvent such as PBS under non-reducing conditions, for example, without a reducing agent such as dithiothreitol. (About 8 ° C.) solution stability of 80% or more for one month. Therefore, since the yeast TRX protein-containing composition of the present invention can be stably stored in a solution for a long period of time, it is not necessary to dissolve the lyophilized powder every time it is used, and can be used easily.
[0054]
TRX exists widely from Escherichia coli and yeast to higher plants and higher animals, and various attempts have been made to isolate various TRX from Escherichia coli to higher organisms. However, when considering a composition to be applied to mammals such as humans as solution-stable TRX, it is desirable to exhibit reactivity with proteins such as human thioredoxin reductase (TR), as in human TRX. It was found that TRX derived from microorganisms, for example, E. coli was not reactive with human TR at all. On the other hand, it was revealed that yeast TRX has 50% or more cross-reactivity with human TR, and it was revealed that it can be applied to mammals and the like.
[0055]
Therefore, the yeast TRX protein of the present invention can be formulated and used so that it is contained in an active form, for example, as a composition for use in pharmaceuticals, processing of food material proteins, and the like. In this case, if a DNA sequence encoding the yeast TRX protein is used, it can be produced in large quantities by incorporating the DNA into an expression vector that functions in, for example, Escherichia coli or yeast as described above.
[0056]
Based on the function of TRX, the TRX composition of the present invention cleaves a disulfide bond of a protein having one or more disulfide bonds between molecules and / or molecules and / or combines a peroxide with a peroxidase. It can be used to eliminate and promote a protective response to active oxygen.
[0057]
Alternatively, since TRX cleaves intermolecular and / or intramolecular disulfide bonds of oxidized and inactive proteins, the TRX composition of the present invention activates such inactivated proteins and improves function. Can be used to Also, since TRX cleaves intermolecular and / or intramolecular disulfide bonds of proteins that are active in the oxidized state, the TRX composition of the present invention cleaves unfavorable (eg, toxic) protein disulfide bonds, It can be used to inactivate such proteins. For example, when a protease inhibitor such as ovomucoid is present in the stomach or intestine, or when an amylase inhibitor is present in saliva, the function of protease or amylase necessary for digestion is inhibited. Since these inhibitor proteins are active in the oxidized state (disulfide bond state), it is possible to cleave these disulfide bonds and inhibit the inhibitor activity by the TRX composition of the present invention.
[0058]
The following describes irreversible inactivation of cereal seed trypsin inhibitor as an example of inhibition of inhibitor activity by the TRX composition of the present invention.
[0059]
It has been reported by Ikeda et al. That trypsin inhibitor found in cereal seeds has a molecular weight as small as around 10,000, and is not inactivated even by heat treatment or protease treatment and suppresses digestion and absorption of cereal proteins (K. et al. Ikeda and T. Kusano (1983) Agr. Biol. Chem. 47 (7): 1481-1486). For this reason, excessive intake of cereal seed proteins, such as cereal flour, often causes indigestion. In buckwheat seed protein, trypsin inhibitor is also a typical example of buckwheat allergen (Park SS et al. (1997) FEBS Lett. 400 (1): 103-107). Therefore, for the purpose of promoting digestion and absorption of cereal proteins, it is important to effectively inactivate the trypsin inhibitor activity found in stored proteins without impairing the nutritional properties originally contained in cereals. That is, it is important to irreversibly inactivate the cereal seed trypsin inhibitor under mild conditions such as heat treatment and acid-alkali treatment that do not involve nutrient decomposition and protein denaturation. Cereal seed trypsin inhibitor is known to be active in an oxidized state (disulfide bond state), and the TRX composition of the present invention cleaves the disulfide bond of cereal seed trypsin inhibitor to irreversibly deactivate the inhibitor activity. It is possible to make it.
[0060]
Furthermore, in order to further promote the reaction of reduced TRX as described above, the recycle reaction described in Chemical Formulas 1 and 2 described above in combination with reductase and NAD (P) H is desirable. For this purpose, it is desirable to include reductase and NAD (P) H as components in addition to TRX as a TRX composition that is stable in solution. The reductase to be used may be any of microorganism-derived, yeast-derived and animal-derived origin as long as it is a reductase capable of reacting with a stable yeast TRX in solution. Preferably, yeast-derived thioredoxin reductase (EC.1.6.4.5) is used.
[0061]
Yeast thioredoxin reductase (TR) can be obtained by, for example, purifying a natural enzyme from cultured yeast cells. For the purification method of the natural enzyme, see Speranza ML et al. (1973) Biochim. Biophys. Acta. 1973 Dec 19; 327 (2): 274-81. There is a description in “Purification and characterization of yeastoxin reductase”. Alternatively, the yeast TR protein may be a recombinant protein obtained by gene transfer of the yeast TR gene into a microorganism or yeast.
[0062]
In the present invention, as described later in Example 7 of the present specification, from the Saccharomyces cerevisiae X2180-1A strain, it encodes a yeast TR protein having the base sequence of SEQ ID NO: 5 and having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. The yeast TR gene was isolated. The base sequence of SEQ ID NO: 5 is registered in Genbank (registration number U10274, CDS form: Saccharomyces cerevisiae thioredoxin reductase (NADPH) gene, complete cds., Chae, H.Z. The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae TR gene was different in 5 places. A recombinant yeast TR protein was obtained using the yeast TR gene of SEQ ID NO: 5 obtained in the present invention. It was found that when the recombinant TR protein was used together with the yeast TRX of the present invention, the trypsin inhibitor activity of buckwheat flour was remarkably inhibited (Example 8, FIG. 5). Therefore, although not necessarily limited, as the thioredoxin reductase used with the yeast TRX of the present invention, yeast TR having an amino acid sequence of base sequence 6 is preferable.
[0063]
Further, as described above, since the yeast thioredoxin of the present invention has 50% or more cross-reactivity with human TR, it can be used together with human TR for human application.
[0064]
The TRX protein-containing composition of the present invention can be used, for example, to prevent and / or treat disorders, diseases and the like related to the intracellular redox state involving the redox reaction of TRX. For example, one of the in vivo functions of TRX is to prevent cell damage caused by active oxygen or ultraviolet irradiation. The composition of the present invention can be used to supplement or supplement the function of TRX.
[0065]
The composition of the present invention may be administered systemically or locally, preferably intravenously, subcutaneously, intradermally, intramuscularly or parenterally, or orally. Preparation of a yeast TRX protein-containing composition that can be administered in a non-circular manner can be performed within the technical scope of those skilled in the art in consideration of pH, isotonicity, safety, and the like.
[0066]
The dosage regimen of the composition of the present invention depends on various factors that affect the effect of the composition, such as the nature and / or severity of the patient's symptoms, weight, sex, diet, time of administration, and other clinical effects. It is decided by the doctor who considers and examines. One skilled in the art can determine the dose of the composition of the invention based on these factors.
[0067]
The compositions of the present invention may be formulated in various ways, optionally with physiologically acceptable diluents and / or carriers. For example, they are compositions containing liquid diluents and / or carriers, such as injectable forms, often for parenteral administration, and are sterilized and pyrogen-free, aqueous or oily solutions, suspensions. It may be applied as a suspension or emulsion. Parenteral administration is preferred for the preferred compounds of the present invention. Compositions intended for oral administration may contain liquid diluents or carriers, but it is more common to use solids such as conventional solid carrier materials such as starch, lactose, dextrin or magnesium stearate. Is. Such a solid composition may be appropriately molded, such as a tablet or a capsule (including spansul). The composition of the present invention may further contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents or stabilizing agents (for example, arginine, aspartic acid, etc.).
[0068]
The dosage form of the antibacterial agent thus obtained may be determined according to the application to be used, mixed with the above additives, and in the form of tablets, pills, powders, granules, liquids, emulsions, etc. Can be attached.
[0069]
The composition of the present invention can be stored for a long period of time without containing a preservative.
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these are not intended to limit the technical scope of the present invention. Those skilled in the art can easily modify and change the present invention based on the description of the present specification, and these are also included in the technical scope of the present invention.
[0070]
【Example】
Example 1 Production of yeast TRX expression recombinant
Cloning of yeast TRX2 gene
Using the yeast Saccharomyces cerevisiae chromosome genome as a template, the TRX2 gene was amplified by PCR and cloned.
[0071]
TRX2 is described in, for example, Genbank, registration numbers AAA85584 and U40843, thioredox. . . [Gi: 1165214], Jae Mahn Song et al., 24-Jan-1996, etc., and their amino acid sequences and base sequences are described in SEQ ID NOS: 1 and 2 of the sequence listing of the present specification, respectively. Based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, a PCR primer for amplifying the TRX gene was prepared as follows.
[0072]
[Chemical Formula 3]
5 'primer (sense primer)
5′-CCGAATTCATGGTCACTCAATTTAAAATCCGCTTCT-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
3 'primer (antisense primer)
5′-CCGGATCCCTATACGTTGGAAGCAATAGCTTGCTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
The 5 'primer was prepared by adding a restriction enzyme site EcoR1 site (GAATTC) to base numbers 1-27 of the base sequence of SEQ ID NO: 2. On the other hand, a 3 'primer was prepared by further adding a restriction enzyme site BamH1 site (GGATCC) to base numbers 288-312 of the base sequence of SEQ ID NO: 2.
[0073]
Meanwhile, the yeast Saccharomyces cerevisiae X2180-1 A strain (genotype: MATα, SUC2, mal, mel, gal2, CUP1) (American Type Culture Collection deposit number: ATCC 204504) was shaken overnight at 30 ° C. in a YPD liquid medium. Cultured. Chromosomal genomes were prepared from bacterial cells centrifuged from the culture using zymolyase and RNAase. Chromosomal genome extraction is described in Methods in Yeast Genetics (1990), pp. The method described in 128-129 was followed. A PCR reaction was performed using the extracted yeast chromosomal DNA as a template and the above-described sense primer and antisense primer. In PCR, a cycle of 95 ° C. for 0.5 minutes, 55 ° C. for 0.5 minutes, and 72 ° C. for 1.5 minutes was repeated 30 times. The obtained PCR amplification product was subjected to restriction enzyme treatment with EcoR1 / BamH1. The restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted into the cloning vector pBluescript II and verified against the database after DNA sequencing (Genbank) to confirm that the yeast TRX2 gene (SEQ ID NO: 2) could be amplified.
[0074]
Next, the PCR amplification product containing the yeast TRX2 gene was treated with restriction enzymes EcoRI / BamHI. The obtained fragment was purified in the pTRP vector for expression of E. coli (Clin Chim Acta. 1995, ibid.) Prepared according to the method of Uchida et al. (Clin Chim Acta. 1995 Jun 15; 237 (1-2): 43-58). The pTRP-yTRX2 plasmid was constructed so as to promote the high expression of the TRX2 gene by ligating to the EcoRI / BamHI insertion site downstream of the tryptophan promoter. A commercially available E. coli strain JM109 competent cell (Takara Shuzo Co., Ltd.) was transformed with the pTRP-yTRX2 plasmid according to a conventional method to obtain a transformant pTRP-yTRX2 / JM109. The transformation operation is described in detail in, for example, page 109 of Laboratory Manual Genetic Engineering (Masamatsu Muramatsu, 1988, Maruzen Co., Ltd.).
[0075]
The transformant pTRP-yTRX2 / JM109 was deposited on January 25, 2000 under the deposit number FERM BP-7004, National Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (1-3 Higashi 1-chome Tsukuba, Ibaraki 305-0046, Japan) No.).
[0076]
Example 2 Purification of recombinant yeast TRX protein
The TRX high expression strain (pTRP-yTRX2 / JM109) prepared in Example 1 was used at 37 ° C. overnight in LB medium (0.5% yeast extract, 1% polypeptone, 1% NaCl) containing 50 μg / mL ampicillin sodium. The flask was cultivated. The obtained cultured cells were collected and separated, and the cells were suspended in 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 mM dithiothreitol. The centrifugal supernatant after ultrasonic disruption was used as the TRX extract. Next, the extract was heat-treated at 60 ° C. for 30 minutes, and the supernatant fraction was collected as a precipitate by 70% saturated ammonium sulfate salting out. The salted out precipitate was dissolved at 1.5 M ammonium sulfate concentration (pH 7.5), and hydrophobic column chromatography was performed using Butyl-Toyopearl C650 gel (manufactured by Tosoh Corporation). TRX was recovered with an elution peak around 1.0 M ammonium sulfate. The hydrophobic chromatography eluate was concentrated using an ultrafiltration membrane (YM10, manufactured by Amicon) and subjected to Superdex Pg75 (Pharmacia) gel filtration chromatography. TRX was eluted as a main peak around 10,000 molecular weight.
[0077]
As a result of examining the purity of the gel filtration elution fraction by polyacrylamide electrophoresis, it showed a single band with a molecular weight of 12,000. This sample was used as a final purified product, and the buffer was exchanged with PBS (pH 7.2) containing no DTT, and then a lyophilized powder was prepared.
[0078]
Example 3 TRX activity measurement
TRX activity was measured according to the method of Holmgren et al. (Method in Enzymology 1993).
[0079]
Specifically, first, the sample was pretreated with 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.4 mM DTT and 0.4 mg / mL bovine serum albumin (BSA) at 37 ° C. for 15 minutes. Next, an insulin reduction reaction by TRX was performed in a substrate reaction solution containing the components shown in Table 1 below. Yeast TRX samples were added at 0.2, 0.5, 1, 2 and 5 μM (approximately 2.4, 612, 24 and 60 μg / mL, respectively) per final reaction. The increase in absorbance at OD 650 nm based on the reduction reaction of insulin was measured at room temperature for 20 minutes.
[0080]
[Table 1]
Composition of substrate reaction solution for measuring TRX activity
In 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)
1 mg / mL bovine pancreatic insulin (Sigma)
1M DTT
1mg / mL BSA
The results are shown in FIG.
[0081]
In order to examine the possibility of applying yeast TRX to humans, the reactivity of yeast TRX with human thioredoxin reductase (TR) was examined. Specifically, 1 U / mL human placenta-derived TR and 0.27 mM NADPH were added instead of 1 mM DTT having the above-mentioned substrate reaction solution composition, and the increase in absorbance at OD 650 nm that returned to the insulin reduction reaction was also measured. As controls, human TRX (Japanese Patent Laid-Open No. 7-79780; method for producing recombinant ADF) and commercially available E. coli TRX (Promega, USA) were used instead of yeast TRX. Various TRX samples were added at 1 μM (approximately 12 μg / mL) per final reaction solution.
[0082]
The degree of reaction with human TR is summarized in Table 2 below. As shown in Table 2, regarding the degree of reaction with human TR, yeast TRX showed a relative reaction rate of 50% as compared with human TRX.
[0083]
[Table 2]
(Degree of response to human TR)
TRX source Relative reaction speed
100% human
Yeast 50%
E. coli 0%
Next, similarly, the reaction degree of various TRXs to yeast TR was also examined. The results are shown in Table 3 below. As shown in Table 3, regarding the degree of reaction with yeast TR, human TRX showed a relative reaction rate of 80% compared with yeast TRX.
[0084]
[Table 3]
(Degree of reaction to yeast TR)
TRX source Relative reaction speed
80% human
Yeast 100%
E. coli 0%
Example 4 Sensitivity to hydrogen peroxide
Yeast TRX and human TRX were each dissolved in PBS (pH 7.2) containing various hydrogen peroxide concentrations and treated at room temperature for 15 minutes. Thereafter, polyacrylamide electrophoresis was performed under non-reducing conditions. The dimer formation rate was examined from the mobility of the silver stained band.
[0085]
Specifically, the density ratio of the stained image of the 12 kd band (monomer) and the 24 kd band (dimer) in silver staining of polyacrylamide electrophoresis is digitized by densitometry to calculate the dimer formation rate or the monomer residual rate. be able to. Further, the sensitivity to hydrogen peroxide can be compared with the TRX sensitivity to oxidation conditions by plotting the dimer formation rate or monomer residual rate against various hydrogen peroxide treatment concentrations.
[0086]
FIG. 2 shows a silver-stained image obtained by electrophoresis under non-reducing conditions (each hydrogen peroxide concentration is treated for 15 minutes). In addition, Table 4 and FIG. 3 show the dimer formation and the residual monomer ratio for the treatment at each hydrogen peroxide concentration.
[0087]
[Table 4]

As shown in Table 4 and FIG. 3, human TRX clearly showed dimerization at a hydrogen peroxide concentration of 1 mM, whereas yeast TRX did not dimerize even at a concentration of 10 mM.
[0088]
Example 5 Solution stability of yeast TRX under non-reducing conditions
Yeast TRX lyophilized powder was dissolved in PBS (pH 7.2) containing no reducing agent, and the refrigerated (2 ° C-8 ° C) stability after dissolution was examined. TRX residual activity in each elapsed day was performed based on the activity measurement method described in Example 3. The residual activity rate (%) at each elapsed day with respect to the TRX activity value immediately after dissolution was calculated and plotted against the refrigerated storage days.
[0089]
The results are shown in FIG. From FIG. 4, it was found that yeast TRX had a TRX residual activity rate of almost 100% even after 25 days or more under non-reducing conditions containing no reducing agent, and the activity was hardly changed and the solution stability was very good. It was done. In contrast, human TRX gradually decreased its activity immediately after dissolution, and decreased to 40% immediately after dissolution after one month. In addition, when the effect of freeze-thawing on TRX activity was examined by freezing TRX lysate, yeast TRX was not inactivated at all before and after freeze-thawing.
[0090]
Example 6 Cloning of the yeast thioredoxin reductase gene
Saccharomyces cerevisiae X2180-1A strain (genotype: MATα, SUC2, mal, mel, gal2, CUP1) and American type culture collection number: ATCC204504 were cultured overnight at 30 ° C. in a YPD liquid medium. Chromosomal genomes were prepared from the centrifuged cells using zymolyase and RNAase. Chromosome genome extraction followed the method described in Method in Yeast Genetics (1990) pp128-129.
[0091]
Subsequently, a PCR reaction was performed using the extracted yeast chromosomal DNA as a template and a sense primer and an antisense primer (SEQ ID NOs: 7 and 8). For PCR, a cycle of 95 ° C. for 0.5 minutes, 55 ° C. for 0.5 minutes, and 72 ° C. for 1.5 minutes was repeated 30 times. The sequences of the sense primer and the antisense primer used to obtain the PCR amplification product of the yeast thioredoxin reductase gene are shown below. Restriction enzyme sites EcoR1 and BamH1 sites were introduced into the sense primer and the antisense primer, respectively.
[0092]
[Formula 4]
Sense primer (SEQ ID NO: 7)
5'-CCAGAAATTCATGGTTCACAACAAAGTTACTATCATTGGT-3 '
Antisense primer (SEQ ID NO: 8)
5'-ACAGATCCCTATTCTAGGGGAAGTTAAGATTTTCTCA-3 '
The obtained PCR product was treated with EcoR1 / BamH1. Subsequently, the restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted into a cloning vector pBluescript II treated with EcoR1 / BamH1. After DNA sequencing, it was confirmed that the thioredoxin reductase gene was amplified. The nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of yeast TR revealed by sequencing are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 in the sequence listing described later.
[0093]
The base sequence and amino acid sequence (SEQ ID NO: 5 and 6) of the yeast Saccharomyces cerevisiae elucidated by the present invention are registered in Genbank (registration number U10274, CDS form: Saccharomyces cerevisiae thioredoxin redc. HZ et al., 05-APR-1995). Then, it was clarified that the yeast TR obtained in the present invention had base substitutions at five positions compared to the Genbank registration sequence, and four of them resulted in substitution of amino acid residues. Further, it was found that a base shift at one position and a deletion at one position occurred, and a frame shift occurred in a 17 amino acid sequence from cysteine at amino acid position 180 to alanine at position 196.
[0094]
Further, the TR amino acid sequence of the yeast Saccharomyces cerevisiae obtained in the present invention (SEQ ID NO: 6), the Genbank registered amino acid sequence (U10274), and the Genbank registered amino acid sequence of the TR of the yeast Schizosaccharomyces pombe (registration number U63713, CDS form: CDS form: The homology of Schizosaccharomyces pombe thioredoxin reductase gene, complete cds., Casso. D. et al., 19-DEC-1995) was compared. Then, the Genbank registered amino acid sequence (U10274) of TR of yeast Saccharomyces cerevisiae was 69.9% homologous to the Genbank registered amino acid sequence (U63713) of TR of yeast Schizosaccharomyces pombe, whereas the book of SEQ ID NO: 6 The amino acid sequence of the yeast TR of the invention had a higher homology of 73.0% with the Genbank registered amino acid sequence (U63313).
[0095]
Example 7 Preparation of recombinant yeast thioredoxin reductase protein and measurement of TR activity
Subsequently, the EcoRI / BamHI-treated PCR amplified fragment containing the yeast thioredoxin reductase gene obtained in Example 6 was subjected to the method described by Uchida et al. (Clin. Chem. Acta. 1995 Jun 15; 237 (102): 43-58. The pTRP-yNTR plasmid was prepared so as to promote the high expression of the thioredoxin reductase gene by ligating to the EcoRI / BamHI insertion site downstream of the strong tryptophan promoter of the prepared E. coli expression pTRP vector. A commercially available E. coli strain JM109 competent cell (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was transformed with pTRP-yNTR according to a conventional method to obtain an E. coli transformant pTRP-yNTR / JM109. The transformation operation is described in detail, for example, on page 109 of Lab Manual Genetic Engineering (Masamatsu Muramatsu 1988 Maruzen Co., Ltd.).
[0096]
The transformant pTRP-yNTR / JM109 was deposited on March 2, 2000 under the deposit number FERM BP-7067. No.).
[0097]
A thioredoxin reductase high expression strain (pTRP-yNTR / JM109) was cultured in an LB medium (0.5% yeast extract, 1% polypeptone, 1% NaCl) containing 50 μg / ml ampicillin sodium at 37 ° C. overnight. The obtained cultured cells were collected and separated, and the cells were suspended in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 0.1 mM FAD and 1 mM EDTA. The centrifugal supernatant after ultrasonic disruption was used as the TR extract.
[0098]
Recombinant TR activity was measured according to the method of Oblong JE et al. (Oblong JE et al. (1993) Biochemistry 32: 7271). Specifically, the substrate reaction solution shown in Table 5 below and a yeast TR extract (using 0.01-0.1 ml of 1-10 U / ml yeast TR extract) were mixed to reduce DTNB by TR. Was observed. The reaction was carried out at 25 ° C. for 1 minute. One active unit (1 U) of TR had a change in absorbance at 412 nm per minute at 25 ° C. of 1.0 / min.
[0099]
[Table 5]
Substrate reaction solution composition
Buffer: 0.1M Na-PO_Four  buffer (pH 7.0)
-1 mM EDTA- 0.2 mg / ml BSA
Coenzyme concentration: 0.24 mM NADPH (manufactured by Oriental Yeast)
Substrate concentration: 4 mM DTNB (dithionitrobenzoic acid, manufactured by Wako Pure Chemical Industries)
Next, the extract was charged onto a DEAE-Sepharose CL6B column and ion exchange chromatography was performed with a 0-0.2M NaCl concentration gradient. Recombinant thioredkin reductase activity was eluted with a peak at 0.12M NaCl. The main fraction was collected and then concentrated using an ultrafiltration membrane (YM10, manufactured by Amicon) and subjected to gel filtration chromatography using a Sephacryl S-200HR column. As a result of examining the purity test of the gel filtration elution fraction eluted as a single peak around a molecular weight of 70 kd by polyacrylamide electrophoresis, a single band with a molecular weight of 35,000 was shown.
[0100]
Using this sample as a final purified product, the buffer was exchanged with PBS (pH 7.2) containing no EDTA, and then a yellow lyophilized powder was prepared. The final purified enzyme showed a specific activity of 13 U / mg. Properties of the recombinant thioredoxin reductase of the present invention are listed in Table 6 below.
[0101]
[Table 6]
Working pH: 7-8, optimum pH is 7.5
pH stability: 5-9 (stored overnight at 37 ° C.)
Thermal stability: up to 45 ° C (pH 7.5, treated for 20 minutes)
Example 8 Buckwheat trypsin inhibitor inhibitory activity by yeast TRX
Degreasing was performed by mixing 100 ml of acetone with 100 g of commercially available buckwheat flour. After standing at 4 ° C. for 2 hours, the acetone solution was removed by centrifugation and dried to prepare defatted buckwheat flour. To 100 g of defatted buckwheat flour, 500 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) -1 mM EDTA-0.5 M NaCl was added. Subsequently, it stirred at 4 degreeC overnight using the stirrer, and the supernatant was obtained by centrifugation. The supernatant was precipitated with ammonium sulfate (90% saturation), and the resulting precipitate was suspended in a minimum volume of pure water. The suspension was dialyzed against 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6) -1 mM EDTA to prepare a buckwheat trypsin inhibitor extract.
[0102]
The trypsin inhibitor activity in buckwheat extract was measured according to the method of Ikeda K et al. (K. Ikeda and T. Kusano (1983) Agr. Biol. Chem. 47 (7): 1481-1486). The obtained buckwheat flour extract protein had an inhibitory activity of inhibiting 110 BAEE units of TPCK-trypsin (Sigma, USA) per 1 mg.
[0103]
Subsequently, the change of buckwheat flour trypsin inhibitor activity by yeast thioredoxin treatment was examined. Specifically, thioredoxin treatment was performed using the prepared buckwheat flour extract under the conditions shown in Table 7 below.
[0104]
[Table 7]
Reaction liquid volume 100L
Reaction buffer 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0)
? 1mM EDTA buckwheat extract protein 14g
TPCK-trypsin 3.3 BAEE units
0-50% by weight added to yeast TRX buckwheat extract protein
Further, the effect of buckwheat trypsin inhibitor activity on the yeast TRX alone was also examined for those added with reductase and NADPH obtained in Example 7. 14 g (0.15 U) of reductase and 0.83 mol of NADPH were added.
The results are shown in FIG. As shown in FIG. 5, when treated with thioredoxin alone (yTRX alone), 20% of the trypsin inhibitor activity was inactivated. Furthermore, when TRX and NADPH coexist (NTR + NADPH coexistence), 60% of the trypsin inhibitor activity was inactivated. In particular, the latter showed an effect of promoting the reduced TRX recycling reaction, and even when the addition ratio of TRX to buckwheat extract protein was reduced to 0.5%, 60% of the trypsin inhibitor activity was inactivated.
[0105]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 shows the time change of insulin reducing activity of each concentration of yeast TRX protein.
FIG. 2 is a silver-stained image obtained by electrophoresis of yeast and human TRX under non-reducing conditions.
FIG. 3 shows monomer residual ratios of yeast and human TRX by treatment with hydrogen peroxide at various concentrations.
FIG. 4 shows time-dependent changes in residual activity ratios of yeast and human TRX under refrigerated storage.
FIG. 5 shows the residual activity of buckwheat flour trypsin inhibitor by yeast TRX treatment.

Claims (7)

Solution stability, including yeast thioredoxin, and physiologically acceptable liquid diluents and / or carriers, exhibiting 80% or more solution stability for 1 month under non-reducing conditions, and no preservatives A thioredoxin liquid composition comprising:
The thioredoxin liquid composition for use in processing a pharmaceutical or food material protein applied to humans. Yeast thioredoxin has the following properties:
1) Dimerization is not observed even after treatment with 1 mM hydrogen peroxide; and 2) at least one property of having a cross-reactivity of 50% or more with human thioredoxin reductase. Composition.   Yeast thioredoxin is a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or has an amino acid sequence containing a mutation due to deletion, substitution or addition of one or more amino acid residues in the sequence, and biological The composition according to claim 1 or 2, which is a highly active and stable protein.   The composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the yeast thioredoxin is a protein encoded by a nucleic acid having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.   Used to cleave the disulfide bonds of proteins that have one or more disulfide bonds between and / or within the molecule, and / or in combination with peroxidase to eliminate peroxides and promote protective reactions against active oxygen The composition according to any one of claims 1 to 4.   Cleaves intermolecular and / or intramolecular disulfide bonds of oxidized and inactive proteins to activate the protein, or cleaves intermolecular and / or intramolecular disulfide bonds of proteins that are active in the oxidized state The composition according to any one of claims 1 to 5, which is used to inactivate the protein. A method for producing the composition of claim 1, comprising:
i) transforming a host cell with an expression vector comprising a gene encoding a yeast thioredoxin protein;
ii) culturing the host cell under conditions that promote expression of the yeast thioredoxin protein;
iii) recovering the recombinant yeast thioredoxin protein from the host cell; and iv) formulating with a physiologically acceptable diluent and / or carrier.

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