JP4820921B2

JP4820921B2 - アミノ酸配列、ｄｎａ及び酵母の育成方法

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Publication number: JP4820921B2
Application number: JP2010540528A
Authority: JP
Inventors: 伸介酒井; 朋子岩井; 一栄高岡
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Current assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Co Ltd
Priority date: 2008-11-27
Filing date: 2009-11-27
Publication date: 2011-11-24
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Description

本発明は酵母に特異的なアミノ酸配列、そのＤＮＡ及び形質転換等による遺伝子改変による酵母の育成方法に関する。

細胞間の凝集は、ａ型細胞とα型細胞間の性的凝集、出芽娘細胞の母細胞からの未分離、非性的凝集などに起因することが知られているが、本発明は、これらのうちの非性的凝集の制御を目的とする。非性的凝集の機構を説明するモデルとしては、凝集性酵母の細胞表層にあるレクチン様タンパク質と糖鎖の結合で隣り合う酵母が結合しているとするレクチン仮説（例えば非特許文献１参照。）が有力であるが、レクチン様タンパク質の同定は成されていない。このことが、酵母凝集の制御が未だ困難である要因でもある。

酵母の凝集性に関与する既知の遺伝子としては、ＦＬＯ１、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０の特異的なレクチン様タンパク質をコードする遺伝子のファミリーがあり、染色体末端領域（テロメア周辺領域）に存在する。一方、凝集性、産膜、浸潤性増殖、基質付着に関連するタンパク質ＦＬＯ１１／ＭＵＣ１をコードする遺伝子は、非染色体末端領域に存在することが報告されている。
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５０，８７８（１９８２）

既知のＦＬＯタンパク質（ＦＬＯ１、５、９）は、配列番号１〜５に記載の９アミノ酸の配列のいずれか、あるいは組み合わせた配列を１〜３回有する。

この配列部位を構成する繰り返し配列は、ＦＬＯ１では配列番号４、配列番号１、配列番号５を各１回からなる３回、ＦＬＯ９では配列番号２、配列番号３を各１回からなる２回、ＹＡＬ０６５Ｃでは配列番号２、配列番号３を各１回からなる２回の繰り返しがあり、ＦＬＯ５では配列番号２のみ１回で繰り返し無しによって構成されている。

また、ＦＬＯ８、ＦＬＯ１０、ＭＵＣ１（ＦＬＯ１１）、ＹＡＲ０６１Ｗ、ＹＡＲ０６２Ｗ、ＹＨＲ２１３Ｗには上記の配列はなかった。

上記の従来の酵母を用いたアルコールの発酵生産法は、酵母と生成物とを分離することが困難であるため、非効率的であり、アルコール生産性が不十分である欠点があった。この原因は酵母の凝集性の限界にあり、我々はこの問題を解明した結果、アミノ酸配列の何れかを４回以上繰り返す配列を含むことが凝集性向上に寄与することを見出し、本発明に至った。

そこで、本発明の課題は、以下の通りである。
（１）酵母に凝集性を付与する活性を有するアミノ酸配列を提供すること；
（２）酵母に凝集性を付与する活性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子ＤＮＡを提供すること；
（３）上記の遺伝子ＤＮＡを利用して、凝集性が付与または強化された酵母の育種方法を提供すること；

本発明の他の課題は、以下の記載によって明らかとなる。

上記課題は以下の各発明によって解決される。

請求項１記載の発明は、配列番号１〜３の何れかで示される配列の繰り返しを４回以上有するアミノ酸配列からなり、酵母に凝集性を付与する活性を有するポリペプチドである。

請求項２記載の発明は、請求項１記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡである。

本発明によれば、酵母に凝集性を付与する活性を有するアミノ酸配列を提供することができ、酵母に凝集性を付与する活性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子ＤＮＡを提供することができ、上記の遺伝子ＤＮＡを利用して、凝集性が付与または強化された酵母の育種方法を提供することができる。

酵母ＡＭ１２菌株、及び非凝集性酵母Ｓ２８８Ｃ菌株におけるＦＬＯ９遺伝子の発現強度の測定結果を示した図Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法によるプラスミドｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１／ＦＬＯ９キメラの作製手順とプライマーの位置を示す図ｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１、ｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１／ＦＬＯ９キメラ、ＦＬＯ１遺伝子を持たないｐＡＵＲ１２３のプラスミドをそれぞれ導入した酵母株３種類について、１分間静置後の沈降性を示す写真。

はじめに、本発明におけるアミノ酸配列の繰り返し配列について説明する。

サッカロマイセス属セレビシエ菌の凝集性は、細胞表層のマンナン分子のマンノース残基を隣り合った細胞間で直接結合できる特殊な細胞表層のレクチン様タンパク質（または、ＦＬＯｃｃｕｌｉｎタンパク質）の関与が報告されている。この細胞間の相互作用によって、多くの細胞が集合し、最終的に酵母の沈降性が生じる。また、サッカロマイセス属セレビシエ菌の凝集性では糖に対する感受性が異なる２つの表現型が知られており、ＦＬＯ１はマンノース感受性を示し、ＮｅｗＦＬＯ（ＦＬＯＮＳ）はマンノースとグルコースに感受性を示す。

酵母の凝集性に関与する遺伝子としては、ＦＬＯ１、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０の特異的なレクチン様タンパク質をコードする遺伝子のファミリーが提案されており、染色体末端領域（テロメア周辺領域）に存在する。一方、凝集性、産膜、浸潤性増殖、基質付着に関連するタンパク質ＦＬＯ１１／ＭＵＣ１をコードする遺伝子は、非染色体末端領域に存在することが報告されている。

これら全てのＦＬＯタンパク質は、グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）という糖脂質の一種によって修飾を受け、ＧＰＩによって細胞膜に繋ぎ留められている。ＧＰＩがあたかも錨のように作用することから、このようなタンパク質はＧＰＩアンカー型タンパク質と呼ばれる。

ＦＬＯタンパク質は、共通の３つのドメイン領域から成り、Ｎ末端側のレクチンドメイン、セリン・スレオニン残基を多く含む繰り返し配列を含む中央ドメイン、Ｃ末端側のグリコシルフォスファシジルイノシトールとのアンカー配列を含むドメインである。

一部の繰り返し配列の配列については、マンノース感受性のＦＬＯ１とマンノースとグルコースに感受性のＮｅｗＦＬＯ（ＦＬＯＮＳ）の間の糖に対する感受性の違いに関与していることが報告されているが、繰り返し配列が有する機能についてはほとんど分かっていない。

これらの酵母の凝集性に関与する遺伝子の分子レベルの研究としては、ＦＬＯ１遺伝子の単離とその解析がなされている（ＹＥＡＳＴ，９，４２３（１９９３）およびＹＥＡＳＴ，１０，２１１（１９９４））。ＦＬＯ１タンパク質は、細胞表層に局在するタンパク質で、酵母細胞の凝集性に係わる因子である（Ｂｏｎｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：４９２９−４９３６（１９９７））。そのＮ末端側から、分泌シグナル領域、酵母細胞の凝集性に係わる領域、そしてＣ末端領域にＧＰＩアンカー結合領域を有している。また、このアミノ酸配列中には１３個所の糖鎖結合部位がある。

自然界に存在するＦＬＯタンパク質（ＦＬＯ１、５、９）は、配列番号１〜３の９アミノ酸配列のいずれか、あるいは組み合わせた配列を１〜３回有する。

今回本発明者らは、高い凝集性を有する酵母ＡＭ１２菌由来のＦＬＯタンパク質（ＡＭ１２ＦＬＯ９）中に、９アミノ酸配列の繰り返しを４回有する部位があることを見出した。

９アミノ酸の繰り返し配列を４回有するＦＬＯはこれまでに報告がなく、ＡＭ１２において初めて単離された。

ＡＭ１２ＦＬＯタンパク質のペプチド鎖のＣ末端側領域に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号３を４回繰り返す配列部位がある。

この配列部位を構成する繰り返し配列は、前述のようにＦＬＯ１では配列番号４、配列番号１、配列番号５を各１回からなる３回、ＦＬＯ９では配列番号２、配列番号３を各１回からなる２回、ＹＡＬ０６５Ｃでは配列番号２、配列番号３を各１回からなる２回の繰り返しがあり、ＦＬＯ５では配列番号２のみ１回で繰り返し無しによって構成されている。

これらの配列を解析した結果、配列番号１〜３を任意に選択し４回以上繰り返した配列を、ＦＬＯタンパク質のＣ末端付近に組み込むことで、酵母の凝集性向上が可能であることを見出した。

４回以上繰り返した配列の例を挙げると、配列番号１１を例示できる。

本発明の繰り返し遺伝子ＤＮＡを導入することにより、凝集性が付与あるいは強化された酵母を得ることができる。繰り返し遺伝子ＤＮＡを導入する方法としては、遺伝子工学の分野において慣用されているものを用いればよく、それを慣用基準（ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ１６３．３９１（１９８７）等）に準じて実施すればよい。具体的には、所望のＤＮＡをベクターに組み込んでこれを酵母に導入する方法、ベクターに組み込まずに直接酵母に導入する方法などを挙げることができる。産業に用いる上では、ベクター保持株よりも染色体導入株が望ましい。

上記のＤＮＡをベクターに組み込んでこれを酵母に導入する方法において、使用可能なベクターとしては、たとえば、ＹＲｐ系（酵母染色体のＡＲＳ配列を複製起点とする酵母用マルチコピーベクター）、ＹＥｐ系（酵母の２μｍＤＮＡの複製起点を持つ酵母用マルチコピーベクター）、ＹＣｐ系（酵母染色体のＡＲＳ配列を複製起点として持ち、かつ酵母染色体のセントロメアのＤＮＡ配列を持つ酵母用シングルコピーベクター）、ＹＩｐ系（酵母の複製起点を持たない酵母染色体組み込み用ベクター）等、知られているもの全てのものを用いることができる。これらのベクターは文献に記載されており（医学出版センター刊、「酵母のニューバイオテクノロジー」、ｐ．２８４）、容易に作製することができる。

ベクターに組み込まずに直接酵母にＤＮＡを導入する手法の代表的なものとしては、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を持つプラスミドと導入するＤＮＡ配列とで同時に酵母を形質転換する共形質転換法を挙げることができる（特公平５−６０９１８号公報）。上記のような方法において、導入した遺伝子ＤＮＡを酵母中で発現させるために、あるいは発現を増加させるためには、転写および翻訳を制御するユニットであるプロモーターを本発明ＤＮＡ鎖の５’−上流域に、ターミネーターを３’−下流域にそれぞれ組み込めば良い。このプロモーターおよびターミネーターとしては、繰り返し遺伝子それ自身に由来するものの他、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，３０１８（１９８２））、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１０，７７９１（１９８２））、グリセロールアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４，９８３９（１９７９））等既に知られている遺伝子由来のもの、もしくは、人工的にそれを改良したものの使用が可能である。より具体的には、ＡＤＨ（別名ＡＤＣ）、ＧＡＰＤＨ（別名ＧＰＤ）、ＰＨＯ、ＧＡＬ、ＰＧＫ、ＥＮＯ、ＴＲＰ、ＨＩＰ等のプロモーターやターミネーターを使用することができる。

さらに、適当なプロモーターを選択することにより、本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を酵母中で制御して発現させることも可能である。例えば、ガラクトキナーゼ遺伝子のプロモーターを使用すれば、培地の糖源をたとえばグルコースからガラクトースに変えることにより発現を増加させることができる。

本発明は、５回以上繰り返し遺伝子ＤＮＡをＡＭ１２菌の４回繰り返し遺伝子ＤＮＡなどと入れ替えることによる、元来凝集性を有する酵母の凝集性をさらに向上する方法をも包含する。

また、この逆の転換も本発明により提供された繰り返し遺伝子ＤＮＡにより可能である。つまり、本発明の繰り返し遺伝子ＤＮＡを破壊することによって、繰り返し遺伝子蛋白を発現させる能力を欠失または減少させたＤＮＡを導入することにより、凝集性が欠失または減少した酵母を得ることができる。繰り返し遺伝子ＤＮＡの破壊は、繰り返し遺伝子の繰り返し遺伝子蛋白発現に関与する領域、たとえば、プロモーター領域やコード領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このようにして繰り返し遺伝子を破壊することによって、繰り返し遺伝子蛋白を発現させる能力を欠失または減少させたＤＮＡは、上記したＤＮＡ導入法と同じ手法で酵母に導入することができる。その導入によって、ホスト酵母の染色体ＤＮＡ中の繰り返し遺伝子と導入したＤＮＡとの間で相同組換えが起こり、ホスト酵母の繰り返し遺伝子が分断されて繰り返し遺伝子蛋白を発現する能力が欠失または減少し、その結果、ホスト酵母の凝集性が欠失または減少すると考えられる。

本発明は、上記の繰り返し遺伝子ＤＮＡの発現を抑制することによって、酵母の凝集性を欠失または減少させる方法をも包含する。このような方法の例としては、繰り返し遺伝子ＤＮＡを破壊することによって、繰り返し遺伝子蛋白を発現させる能力を欠失または減少させたＤＮＡを導入する方法、アンチセンスＲＮＡ法等を挙げることができる。

本発明において形質転換すべき酵母、すなわちホスト酵母、は分類学上、酵母の範疇に入りうる任意のものであり得る。本発明によって高い凝集性を付与された酵母は、バイオエタノール製造の過程において有用である。また本発明の酵母を培養することを含む醸造製品は、ビール、清酒、焼酎、ワイン、ウイスキー、ブランデーを含むアルコール飲料、また醤油、味噌、みりんなどの調味料、さらには、燃料用アルコールなどを包含する。本発明における醸造製品の製造法としては、前記醸造製品に係わる醸造過程を包含する。

本発明タンパク質を細胞凝集剤として非凝集性酵母を含む溶液に単純混合することにより酵母凝集効果を得ることもできる。また、細胞間凝集に限らず、例えば細胞を基盤上に固定するような場合（バイオセンサー等）においても応用できる。

以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例によって限定されない。

実施例１（酵母ＡＭ１２菌株由来ＲＮＡからのＦＬＯ遺伝子断片の単離）
（１−１）ＴｏｔａｌＲＮＡの抽出サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株をＹＰＤ培地（１％Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、２％Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、２％Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）で３０℃、８時間培養し、菌体を回収後、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製ＨｉｇｈＰｕｒｅＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔを用いてＴｏｔａｌＲＮＡの抽出を行った。

（１−２）３’−ＲＡＣＥ法によるＰＣＲ産物の取得
抽出したＴｏｔａｌＲＮＡを鋳型に、タカラバイオ社製３’−ＦｕｌｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔを用いて、逆転写反応を、続いてＰＣＲ反応を行った。ＴｏｔａｌＲＮＡは６５℃で１０分間加熱後、氷上で急冷し、１μｇを逆転写反応（反応液量２０μｌの系）に用いた。逆転写反応液組成は、キットのプロトコールに従って行った。ＰＣＲサーマルサイクラーの反応条件は、３０℃１０分間、４２℃６０分間、９５℃５分間、５℃５分間を１サイクル行った。

次に、得られた逆転写反応液１μｌを用い、以下の反応液組成、および反応条件でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ用酵素としては、東洋紡社製の高正確性ポリメラーゼＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２を用いた。その結果、約０．６ｋｂｐのＰＣＲ断片が得られた。ＰＣＲ反応条件として９４℃２分間の後、９８℃１０秒間、６０℃３０秒間、６８℃５分間を１サイクルとして３０サイクル行い、反応終了後は４℃にした。

Ｆｏｒｗａｒｄプライマーとして、ｃ００２５８−Ｆ１を用いた（配列番号６）。
５’−ＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＣＴＡＣＴＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＴＴＧ−３’

Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーはタカラバイオ製３’−ＦｕｌｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔの３ｓｉｔｅｓＡｄａｐｔｏｒＰｒｉｍｅｒを用いた。

（１−３）ＰＣＲ産物の回収
ＰＣＲ産物を１％のＴＡＥアガロースゲルにて電気泳動を行った結果、約０．６ｋｂｐの位置にバンドが見られた。このバンドをゲルから切り出し、キアゲン社製のＱｉａｇｅｎｑｕｉｃｋＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔを用いて抽出精製を行った。

（１−４）ＴＡクローニング
東洋紡社製ＴＡｒｇｅｔＣｌｏｎｅ^ＴＭ−Ｐｌｕｓ−キットを用いて、ＰＣＲ産物をｐＴＡ２ベクター（アンピシリン耐性遺伝子をマーカーとして持つ）に組み込み、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。次に、得られたアンピシリン耐性を示す大腸菌から東洋紡社製のＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ‐Ｐｌａｓｍｉｄ−を用いてプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、１％のＴＡＥアガロース電気泳動を行った結果、ｐＴＡ２ベクターにＰＣＲ産物が組み込まれていることが確認された。

（１−５）塩基配列決定
ＰＣＲ産物を組み込まれたｐＴＡ２ベクターを鋳型に、ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクルシーケンス反応を行った。次に、ＢＥＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲ社製のＣＥＱ８０００ＤＮＡＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍを用い、塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物の両側は、ユニバーサルプライマーのＭ１３ＰｒｉｍｅｒＭ３とＭ１３ＰｒｉｍｅｒＲＶを用いて解読を行った。次に、得られた塩基配列を基に設計した以下のプライマーを用いてＰＣＲ産物の内側の配列を決定した。最終的に、二つの独立した実験から得られたＰＣＲ産物を組み込まれたｐＴＡ２ベクターについて、遺伝子断片の全長配列を解読し、二つが一致していることを確認した。

＜配列決定に用いたプライマー＞
Ｍ１３ＰｒｉｍｅｒＭ３（配列番号７）
５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’
Ｍ１３ＰｒｉｍｅｒＲＶ（配列番号８）
５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’
ｃ００２５８−Ｆ３（配列番号９）
５’−ＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＡＣＡＧＴＧＣＴＡＣＣＡＧＴＧＡＧ−３’
ｃ００２５８−Ｆ４（配列番号１０）
５’−ＡＣＡＧＴＡＧＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴ−３’

（１−６）塩基配列からアミノ酸への変換、比較解析
得られた塩基配列からアミノ酸への変換は、株式会社ゼネティックス製の遺伝子情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）Ｖｅｒ．９Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）版を用いて行った。

得られた酵母ＡＭ１２菌株由来ＲＮＡからのＦＬＯ遺伝子断片の配列を配列番号１２に示す。

実施例２
＜既知配列との比較＞
既知配列との比較は、インターネットを介した同ソフトウェアの塩基配列対塩基配列データベースのＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡＳＴＮ）、タンパク質配列対タンパク質配列データベースのＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡＳＴＰ）、および付属のホモロジー解析機能、マルチプルアライメント機能を用いて行った。

既知の遺伝子と比較した結果、ＦＬＯ１と最も相同性が高く、他にＦＬＯ９、ＹＡＬ０６５Ｃ、ＦＬＯ５とも相同性が見られた。

また、遺伝子断片は、ＦＬＯ１（１５３７アミノ酸）のＣ末側の１３７６〜１５５４に位置する。ＦＬＯ９、５でもＣ末端側に位置し、ＹＡＬ０６５Ｃでは全長に相当することが分かった。

更に比較をすることにより、分離したアミノ酸配列には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号３の４回繰り返し配列が存在することを見出した。

他の遺伝子の相当する部位では、同様のアミノ酸の配列が、ＦＬＯ１で３回、ＦＬＯ９とＹＡＬ０６５Ｃで２回、ＦＬＯ５で１回見つかった。

実施例３（酵母ＡＭ１２菌由来ゲノムＤＮＡからのＦＬＯ９遺伝子の単離、及び部分配列の決定）
（３−１）フォスミドゲノムライブラリーの作製
ＡＭ１２菌株をＹＰＤ培地で３０℃、８時間培養し、菌体を回収後、ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＢｕｆｆｅｒＳｅｔ＆Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（キアゲン製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡをＤＮＡ断片化装置によりランダムに断片化し、ＭｉｇｈｔｙＣｌｏｎｉｎｇＢｌｕｎｔＥｎｄ（タカラバイオ製）を使用してＤＮＡ断片の末端を平滑処理し、パルスフィールド電気泳動による３３〜４８ｋｂ付近のサイズのＤＮＡをゲルから分画した。切り出したゲル断片からＤＮＡを精製し、インサートＤＮＡとした。調整したインサートＤＮＡ断片とベクターｐＣＣ１ＦＯＳ（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ製）をＴ４ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて４℃で終夜ライゲーション反応を行なった。ベクターライゲーション後、ＭａｘＰｌａｘＬａｍｂｄａｐａｃｋａｇｉｎｇＥｘｔｒａｃｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ製）を用いて、ｉｎｖｉｔｒｏｐａｃｋａｇｉｎｇを行った。ライブラリーの一部を用いて宿主大腸菌ＥＰＩ３００に形質転換し、タイターを測定した。また、ランダムに選択した１６個の白コロニーよりＦｏｓｍｉｄＤＮＡを抽出し、ＮｏｔＩで制限酵素処理した後、パルスフィールド電気泳動でインサートサイズが３０Ｋｂ以上であることを確認した。

（３−２）クローンプールグリセロールストック作製
約１万クローン分のライブラリー溶液を宿主大腸菌ＥＰＩ３００に導入し、形質転換体を作製した。方法は、１０ｍＭＭｇＳＯ_４と０．２％（ｗ／ｖ）のマルトースを添加したＬＢ培地に宿主大腸菌ＥＰＩ３００のシングルコロニーを植菌し、３７℃で３〜５時間振とう培養を行った。遠心して集菌し、上清を廃棄した後、上清と等量の１０ｍＭＭｇＳＯ_４に、菌体を懸濁した。

ＳＭｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＳＯ_４、０．０１％ｇｅｌａｔｉｎ）を加えて希釈し１００μｌに合わせたライブラリー溶液を菌体懸濁液１００μｌに加えて混合し、３７℃で１時間静置培養した。終濃度が１２．５μｇ／ｍｌになるように、クロラムフェニコールを添加したＬＢ寒天培地（１００μｍｏｌ／ｍｌＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍｌＸ−Ｇａｌ）に播種し、３７℃で一晩培養した。クロラムフェニコール耐性寒天培地を入れた９６穴プレートの１ウェルに、１００クローンになるように形質転換体を添加し、終夜３７℃で、静置培養をした。実際に含まれるクローン数は、これと同時に１ウェルに添加したのと同じ量をシャーレ寒天培地にプレーティングし計測した。

培養後の９６穴プレートの各ウェルに、２０％グリセロール含有クロラムフェニコールＬＢ液体培地を添加した。コロニーを懸濁後に新しい９６穴プレートに移し変え、クローンプールグリセロールストックプレートとした。作製したグリセロールストック溶液についてはタイターの確認を行った。

（３−３）クローンプールＤＮＡ調整
作製したクローンプールグリセロールストックプレートから一部をＬＢ培地に植菌し、培養後にアルカリ‐ＳＤＳ法を用いてフォスミドＤＮＡを調整し、２０μＬ／ｗｅｌｌの滅菌蒸留水に溶解した。

（３−４）一次スクリーニング
作製した各ウェルのクローンプールＤＮＡを鋳型に、ＬＡＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ製）、ＦＬＯ９−３Ｆプライマー（配列番号１４）、ＦＬＯ９−２Ｒプライマー（配列番号１５）を用いて、一次スクリーニングＰＣＲ（アニーリング温度５５℃、３０サイクル）を行った。ＰＣＲ産物の電気泳動を行い、バンドが見られたウェルを一次陽性クローンとした。

ＦＬＯ９−３Ｆ（配列番号１４）
５‘−ＴＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＴＴＡＴＡＧＴＧＴＡ−３’
ＦＬＯ９−２Ｒ（配列番号１５）
５‘−ＡＧＴＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＴＴＣＧＣＣＡＡ−３’

（３−５）配列の決定
得られた一次陽性クローンのＰＣＲ産物から直接、プライマーウォーキング法によってシーケンスを行い、獲得したクローンの塩基配列の一部を決定した。

酵母ＡＭ１２菌由来ＦＬＯ９遺伝子配列の一部、及び推定される翻訳物の配列は配列番号１６に示す。参照配列（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ１２９８０ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅＩｌｅｆｔａｒｍｓｅｑｕｅｎｃｅ）との相同性から推定ＯＲＦを決定した。また、３’側の非翻訳領域の相同性から当該のＦＬＯ遺伝子は、ＦＬＯ９遺伝子であった。さらに、ＯＲＦの３’側の配列は、実施例１で酵母抽出ＲＮＡより逆転写によって得られた配列と一致していることが分かった。

実施例４（酵母ＡＭ１２菌株由来ＦＬＯ９遺伝子の発現解析）
酵母ＡＭ１２菌株においてＦＬＯ９遺伝子が発現しているかどうか、また、その発現強度を調べるために、ＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。ＡＭ１２菌株、及び非凝集性酵母としてＳ２８８Ｃ菌株をＹＰＤ培地で３０℃、３時間培養し、菌体を回収後、実施例１と同様に、ＨｉｇｈＰｕｒｅＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製）を用いてＴｏｔａｌＲＮＡの抽出を行った。抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡマイクロアレイ実験を行った。ＤＮＡチップは、ＹｅａｓｔＯｌｉｇｏＭｉｃｒｏａｒｒａｙ（Ｖ２）（ＡｇｉｌｅｎｔＯｒｄｅｒＮｕｍｂｅｒ２５１５０７２１０５２５）（アジレント製）を用い、一色のラベリング方法で行った。このＤＮＡチップには標準株Ｓ２８８Ｃ株の全遺伝子６０００個に対応したオリゴＤＮＡがのっており、酵母より抽出したＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより各遺伝子の発現強度を測定することができる。ＦＬＯ９に関しては、Ａ＿０６＿Ｐ１０８７のプローブを用いた。

解析結果を図１に示す。ＡＭ１２菌株ではＦＬＯ９遺伝子が強く発現していた。一方、凝集性を持たない株であるＳ２８８Ｃ菌株では、ＦＬＯ９遺伝子の発現が低い値に留まっていた。

実施例５（ＦＬＯ遺伝子導入酵母の凝集沈降性試験）
（５−１）ＦＬＯ１遺伝子の酵母発現ベクター（ｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１）の作製
サッカロマイセス属セレビシエＹ２５８菌株由来のＹＡＲ０５０Ｗ（ＦＬＯ１）のＯＲＦ領域（開始コドンから終止コドンを含む）を挿入したＢＧ１８０５−ａｍｐベクターを保持する大腸菌ＤＨ５α株をＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＹｅａｓｔＯＲＦｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手した（カタログＮｏ．ＹＳＣ３８６７−９５２０５３７）。Ｙ２５８菌株由来ＦＬＯ１遺伝子の配列、及び推定される翻訳物の配列を配列番号１８に示す。常法に従って大腸菌よりプラスミドを抽出し、それを鋳型にｃ０２５５３−Ｆ２プライマー（配列番号２０）及びｃ００２５８−Ｒ３プライマー（配列番号２１）を用いてＰＣＲを行い、ＦＬＯ１ＯＲＦ領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＸｈｏＩで処理し、電気泳動後、ゲルから目的サイズのバンドを切り出し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ＧｅｌＣｌｅａｎｕｐ−キット（東洋紡製）を用いて抽出し、ＦＬＯ１断片とした。一方、ｐＡＵＲ１２３ベクター（タカラバイオ製）を制限酵素ＸｈｏＩで処理後に、ＣＩＡＰ処理し、電気泳動後、ゲルから目的バンドを切り出し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ‐ＰＣＲ＆ＧｅｌＣｌｅａｎｕｐ−キット（東洋紡製）を用いて抽出し、ｐＡＵＲ１２３−ＸｈｏＩ断片とした。ｐＡＵＲ１２３−ＸｈｏＩ断片とＦＬＯ１断片はＴ４リガーゼを用いて連結し、連結物を大腸菌ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ（タカラバイオ製）に形質転換し、アンピシリン耐性を示すコロニーを獲得した。コロニーを培養後、常法に従ってプラスミドを抽出精製し、プラスミドｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１とした。シーケンス解析により、ＦＬＯ１断片の挿入の向きが正しいことを確認した。

ｃ０２５５３−Ｆ２プライマー（配列番号２０）
５‘−ＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＧＣＴＡ−３’
ｃ００２５８−Ｒ３プライマー（配列番号２１）
５‘−ＣＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＧＡＣＧＣ−３’

（５−２）ＦＬＯ１／ＦＬＯ９キメラ遺伝子の酵母発現ベクター（ｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１／ＦＬＯ９の作製
実施例１で取得した酵母ＡＭ１２菌株由来ＦＬＯ９Ｃ末端の断片（１７１アミノ酸）は、Ｙ２５８菌株由来ＦＬＯ１（９０７アミノ酸、配列番号１８）上の７４６番目アミノ酸から終止コドンまでの位置に該当する。そこで、Ｙ２５８菌株由来のＦＬＯ１の７４６番目から終始コドンまでの領域とＡＭ１２菌株由来ＦＬＯ９Ｃ末端の断片（１７１アミノ酸）とを置き換えたＦＬＯ１／ＦＬＯ９キメラタンパク質を発現できるプラスミドの作製を行った。

Ｙ２５８菌株ＦＬＯ１遺伝子の翻訳産物（配列番号１８）新たに作製したＦＬＯ１／ＦＬＯ９キメラ遺伝子の翻訳産物（配列番号２２）では、１番目から７４５番目までのアミノ酸は全く同じである。７４６番目のアミノ酸以降では、７７８番目以降、前者が、配列番号４、配列番号１、配列番号５の３回繰り返し配列が存在し、後者では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号３の４回繰り返し配列が存在する。

その他の部位では、３アミノ酸の違いがあるが、新たに作製したＦＬＯ１／ＦＬＯ９キメラ遺伝子の翻訳産物（配列番号２２）は、実質的に、Ｙ２５８菌株ＦＬＯ１遺伝子の翻訳産物（配列番号１８）の７７８番目以降の３回繰り返し配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号３からなる４回繰り返し配列（配列番号１１）に置き換えられているものである。

具体的な作製方法は、次の通りである。実施例１で作製したＡＭ１２菌株由来ＦＬＯ９のＣ末端の遺伝子断片（ＦＬＯ９Ｃ）を有するｐＴＡベクターを制限酵素ＸｈｏＩで処理し、電気泳動にてＦＬＯ９Ｃ断片部分とベクター部分を分離後、ゲルから目的サイズのバンドを切り出し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ＧｅｌＣｌｅａｎｕｐ−キット（東洋紡社製）を用いて抽出し、ＦＬＯ９Ｃ断片とした。上記で作製したｐＡＵＲ１２３−ＸｈｏＩ断片を用い、ＦＬＯ９Ｃ断片とＴ４リガーゼを用いて連結し、連結物を大腸菌ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン耐性を示すコロニーを獲得した。コロニーを培養後、常法に従ってプラスミドを調製し、プラスミドｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ９Ｃとした。シーケンス解析により、ＦＬＯ９Ｃ断片の挿入の向きが正しいことを確認した。

次に、図２に示すようにプラスミドｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１／ＦＬＯ９キメラを作製した。プラスミドｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ９Ｃを鋳型に、Ｆ９Ｃ−Ｆ１プライマー（配列番号２４）及びｐ１２３−Ｒ４プライマー（配列番号２５）を用いてＰＣＲを行い、ベクター部分を含むプラスミド全長領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を電気泳動後、ゲルから目的サイズのバンドを切り出し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ＧｅｌＣｌｅａｎｕｐ−キット（東洋紡製）を用いて抽出し、ｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ９Ｃ断片とした。一方、前述したＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＹｅａｓｔＯＲＦｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのＦＬＯ１ＯＲＦ領域（カタログＮｏ．ＹＳＣ３８６７−９５２０５３７）のプラスミド抽出物を鋳型に、Ｆ１Ｎ−Ｆプライマー（配列番号２６）及びＦ９Ｃ−Ｒ１プライマー（配列番号２７）を用いてＰＣＲを行い、Ｙ２５８ＦＬＯ１ＯＲＦの１番目から７４５番目のアミノ酸までの領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を電気泳動後、ゲルから目的サイズのバンドを切り出し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ＧｅｌＣｌｅａｎｕｐ−キット（東洋紡製）を用いて抽出し、ＦＬＯ１−１−７４５断片とした。ｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ９Ｃ断片とＦＬＯ１−１−７４５断片はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎキット（タカラバイオ社製）を用いて連結し、連結物を大腸菌ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン耐性を示すコロニーを獲得した。コロニーを培養後、常法に従ってプラスミドを調製し、プラスミドｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１／ＦＬＯ９キメラとした。シーケンス解析により、ＦＬＯ１／ＦＬＯ９キメラ断片の配列、及び挿入の向きが正しいことを確認し、次の実験に用いた。

Ｆ９Ｃ−Ｆ１プライマー（配列番号２４）
５‘−ＣＴＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴＴＡＣＧ−３’
ｐ１２３−Ｒ４プライマー（配列番号２５）
５‘−ＣＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣＴＴＧＧＴ−３’
Ｆ１Ｎ−Ｆプライマー（配列番号２６）
５‘−ＧＣＡＴＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＧＣＴＡ−３’
Ｆ９Ｃ−Ｒ１プライマー（配列番号２７）
５‘−ＣＡＡＣＡＴＣＡＴＴＣＡＣＡＧＴＡＧＣＣ−３’

（５−３）非凝集性酵母への各発現ベクターの導入
文部科学省ＮＢＲＰ「酵母」から提供された非凝集性のサッカロマイセス属セレビシエＢＹ１９９４株（ＤＫＤ−５Ｄ、ＳＨ１９９４）を宿主として用いた。また、上述のｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１、ｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１／ＦＬＯ９キメラ、ｐＡＵＲ１２３の３種類のプラスミドをそれぞれ酵母への導入に用いた。

具体的な実験は次の通りである。ＢＹ１９９４株をＹＰＤ液体培地で３０℃、一晩培養したものを前培養液とした。前培養液を４０ｍｌのＹＰＤ液体培地に植菌して、菌体濁度がＯＤ_６００で約１になるまで３０℃で培養した。培養後の菌体を遠心して集菌し、２０ｍｌの０．１Ｍ酢酸リチウム溶液（０．１Ｍ酢酸リチウム、０．１ＭＤＴＴ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に懸濁し、室温で１時間放置した。再度遠心して、集菌後に、滅菌水で２回洗菌し、さらに、１Ｍソルビトールで１回
洗菌した。最終的に、５０μlの１Ｍソルビトールを加えて、菌を懸濁した。１００μｌの酵母懸濁液と０．１μｇ〜１μｇのプラスミドＤＮＡを混合して、０．２ｃｍギャップのキュベットに分注して、氷中で１０分間静置した。キュベットをジーンパルサーシステム（バイオラッド社製）にセットし、１．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ω、パルス１回の条件で、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後の菌液を１Ｍソルビトールで希釈し、オーレオバシジン１μg／ｍｌを添加したＹＰＤ寒天平板培地上に塗末
した。３０℃で３〜４日間培養後に、オーレオバシジン耐性を示すコロニーを獲得した。オーレオバシジン１μg／ｍｌの終濃度で添加したＹＰＤ液体培地でコロニーを培養後、常法に従ってゲノムＤＮＡを調製し、それを鋳型に、ｐＡＵＲ１２３Ｆプライマー（タカラバイオ社製）及びｐＡＵＲ１２３Ｒプライマー（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ（アニーリング温度６０℃、３０サイクル）を行い、増幅が確認できたものをプラスミド保持株とした。

（５−４）各ベクター導入酵母の凝集沈降性の比較
前述のｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１、ｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１／ＦＬＯ９キメラ、ＦＬＯ１遺伝子を持たないｐＡＵＲ１２３のプラスミド（タカラバイオ社製）をそれぞれ導入した酵母株３種類について、オーレオバシジンの終濃度が１μｇ／ｍｌになるように添加したＹＰＤ液体培地５ｍｌに植菌し、３０℃で２日間の振とう培養を行った。培養後に試験管を静置し、目視によって各株の凝集沈降性を比較した。

図３は、１分間静置後の試験管の写真である。図３中、左がｐＡＵＲ１２３ベクターを導入した酵母、中央がｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１を導入した酵母、右がｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１／ＦＬＯ９キメラを導入した酵母である。ｐＡＵＲ１２３ベクターを導入した酵母では、その後１０分間以上静置しても菌体の沈降は見られなかった。ｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１を導入した酵母についても、目視でわずかに判別できる沈降性が見られる程度であった。一方、ｐＡＵＲ１２３−ＦＬＯ１／ＦＬＯ９キメラを導入した酵母では、１分間の静置で、試験管の底面への沈降が見られた。このことより、遺伝子に配列番号１〜３で示される繰り返し配列の何れかを４回繰り返すように遺伝子改変することで、ＦＬＯ遺伝子が機能して生じる酵母の凝集沈降性が強化されることが示された。

Claims

配列番号１〜３の何れかで示される配列の繰り返しを４回以上有するアミノ酸配列からなり、酵母に凝集性を付与する活性を有するポリペプチド。
請求項１記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。