JP4829099B2 - ペット動物の皮膚バリア機能の改善方法 - Google Patents

Description

本発明は、パントテン酸、ニコチンアミド、ヒスチジン、イノシトールおよびコリンを有してなる組成物、皮膚疾患の治療へのその使用および皮膚疾患を抑制する方法を提供する。本発明はさらに、本発明の組成物を製造する方法を提供する。

ほとんどの家庭用ペットにおいて、健康な皮膚と毛は、その動物が全般的に良好な健康状態にあることを示す。ペットの皮膚と毛の状態は、そのような重要な視覚的影響（特に、ペットの飼い主および／または一般の大衆に対して）を与えるので、特に動物が皮膚疾患を患っている場合、動物の皮膚と毛の状態を改善することが当該技術分野において引き続いている目標である。

犬の皮膚病は、ペットを獣医の診療所に連れて行く最も一般的な理由の１つである。そのような病気を患った動物の比率は、診療所の仕事量の約１５％を占めることが示されている。この統計値に寄与する主な病気は、ノミアレルギー性皮膚炎、アトピー性（アレルギー性）皮膚炎、膿皮症（細菌感染）、脂漏症および疥癬（毛包虫症およびヒゼンダニ症）である。これらの皮膚病の大半では、皮膚のバリア性が相当低下している。

ほ乳類の表皮の主な役割は、乾燥した雰囲気、物理的外傷およびアレルゲンや刺激物や毒物との頻繁な接触を含む、潜在的に損傷を与える環境の影響から体を保護するバリアを提供することにある。表皮の最も外側の「角化した」角質層（ＳＣ）が、バリア防御の主要な役割を果たす。このＳＣは、ケラチノサイトとして知られる主な皮膚細胞タイプの末端分化により形成される。末端分化プロセスは、４つの基本工程：角質化、ケアトヒアリン堆積、不溶性末端外被タンパク質の形成および開口分泌された脂質の豊富な層状体からの細胞間領域の生成を含む。

バリア形成のプロセスは、細胞分化の制御と表裏一体である。これは転じて、皮膚の水和状態による。それゆえ、経皮水分蒸発量（ＴＥＷＬ）の増加を招く表皮への任意の障害が、水和レベルを乱し、転じて、細胞の挙動の多くの面を混乱させる。この結果、皮膚構造が弱くなり、細菌感染、アレルゲンや毒性物質の浸透並びに増加した水分損失に至り、さらに状態が悪化し得る。
A. Rainbirdによる"A Balanced Diet"という章、Waltham Book of Dog and Cat Nutrition, Ed. ATB Edney, 57から74頁, Pergamon Press Oxford

本発明の課題は、皮膚の自然なバリア防御を改善するために使用できる組成物を提供することにある。この組成物は、病気に対する皮膚の自然抵抗性を向上させ、病気からの回復を補助するものである。

本発明の第１の態様は、パントテン酸、ニコチンアミド、ヒスチジン、イノシトールおよびコリンを有してなる組成物であって、パントテン酸が４００ｋｃａｌ当たり１０ｍｇから５００ｍｇのレベルで提供される組成物を提供する。

第１の態様の好ましい特徴において、この組成物は、パントテン酸、ニコチンアミド、ヒスチジン、イノシトールおよびコリンを有してなる食料品、好ましくはペットフード製品であって、パントテン酸が４００ｋｃａｌ当たり１０ｍｇから５００ｍｇのレベルで提供される食料品として提供される。本発明の組成物に関して論じた全ての好ましい特徴は、本発明の食料品にも当てはまり、その逆もしかりである。

第１の態様の食料品は、約１０ｍｇから約５００ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇから約１００ｍｇ、より好ましくは約１０ｍｇから約４０ｍｇ、さらにより好ましくは約１２ｍｇから約３５ｍｇのレベル（全て４００ｋｃａｌ当たり）でパントテン酸を含む。パントテン酸が約１５ｍｇから約２０ｍｇのレベルで提供されることが最も好ましい。パントテン酸は、補酵素Ａの形態で体内に存在する。補酵素Ａは、エネルギーを生成するどの化学反応にも必要とされる。パントテン酸は、表皮脂質合成に関与する。さらに、軟膏として局部にまたは経口のいずれかでパントテン酸を投与すると、皮膚の傷が閉じるのが加速され、瘢痕組織の強度が増加することが示唆されている。

パントテン酸は、肝臓、腎臓、酵母、卵黄およびブロッコリから提供できる。パントテン酸の他の供給源としては、魚類、貝類、鶏、ミルク、ヨーグルト、豆類、マッシュルーム、アボガドおよびサツマイモが挙げられる。

本発明に関して、パントテン酸は、好ましくは固体または半固体の栄養補助食品として、より好ましくは粉末として、単離形態で提供される。パントテン酸はパントテン酸二カルシウムとして提供されることが好ましい。

第１の態様の食料品はニコチンアミドを含む。本発明の目的に関して、ニコチンアミドという用語は、ナイアシンとニコチン酸を含む。ニコチンアミドは、補酵素のニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・ホスフェート（ＮＡＤＰ）を形成するために体内で用いられる。ニコチンアミドは、肝臓内でトリプトファンから合成できる。ニコチンアミドは、表皮セラミドの合成を増加させることが示されている。

ニコチンアミドは、酵母、肉類、家禽類、魚類、穀類、豆類および種類により提供できる。あるいは、ニコチンアミドは、固体または半固体として、好ましくは粉末として、単離形態で提供できる。

第１の態様の食料品は、約２５ｍｇから約８００ｍｇ、好ましくは約３５ｍｇから約５００ｍｇ、より好ましくは約３５ｍｇから約２００ｍｇ、さらにより好ましくは約５０ｍｇから約１５０ｍｇ、最も好ましくは約１００ｍｇ以上のレベル（全て４００ｋｃａｌ当たり）でニコチンアミドを提供する。

第１の態様の食料品はヒスチジンを含む。ヒスチジンは、表皮セラミドの合成を増加させることが示されている。ヒスチジンはケラチノサイトの分化経路に関与することが前提とされている。さらに、ヒスチジンは新生児にとって必須であり、それが不足すると、成長が遅れたり、皮膚に湿疹が生じたりする。ヒスチジンは、ヘモグロビンの形成と、白血球の形成の促進に役割を持ち、組織の成長と修復に関与する。

ヒスチジンは、単離されたかある程度単離されたアミノ酸として、もしくはその塩または誘導体として提供することができる。ヒスチジンは、固体または半固体として、好ましくは粉末として提供できる。ヒスチジンの供給源としては、肉類、家禽類、魚類、米、小麦およびライ麦が挙げられる。

第１の態様の食料品は、約１０ｍｇから約１００００ｍｇ、好ましくは約４００ｍｇから約１６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇから約１１００ｍｇ、さらにより好ましくは約６００ｍｇから約１１００ｍｇ、最も好ましくは約９００ｍｇから約１１００ｍｇのレベル（全て４００ｋｃａｌ当たり）でヒスチジンを提供する。

第１の態様の食料品はイノシトールを含む。イノシトールは、細胞膜の必須成分であり、神経、脳および筋肉の適切な機能に必要である。イノシトールは、セラミドの合成を増加させるのにも関与する。

イノシトールは、固体または半固体として単離形態で提供できる。イノシトールを粉末として提供することが好ましい。あるいは、イノシトールはイノシトール一リン酸として提供しても差し支えない。本発明のためのイノシトールの供給源としては、豆類、肝臓、キャンタロープメロン、柑橘類の果実（レモンを除く）、ヒヨコマメ、レシチン顆粒、平豆、ナッツ、オート麦、豚肉、米、子牛の肉、小麦胚芽および全粒粉製品が挙げられる。

第１の態様の食料品は、約１０ｍｇから約５００ｍｇ、好ましくは約５０ｍｇから約３００ｍｇ、より好ましくは約１００ｍｇから約２３０ｍｇ、最も好ましくは約１８５ｍｇから約２００ｍｇのレベル（全て４００ｋｃａｌ当たり）でイノシトールを提供する。

第１の態様の食料品はコリンを含む。コリンは、表皮セラミドの合成を増加させるのに関与する。コリンはコリンシリカとして提供できる。

第１の態様の食料品は、約１０ｍｇから約７００ｍｇ、好ましくは約１００ｍｇから約４００ｍｇ、より好ましくは約２５０ｍｇから約３６０ｍｇ、最も好ましくは約３００ｍｇから約３３０ｍｇのレベル（全て４００ｋｃａｌ当たり）でコリンを提供する。

第１の態様の特に好ましい特徴において、パントテン酸、ニコチンアミド、ヒスチジン、イノシトールおよびコリンを有してなる食料品であって、パントテン酸が４００ｋｃａｌ当たり１０から５００ｍｇのレベルで提供され、一種類以上の残りの成分がそれぞれ以下の表に示したそれぞれのレベルで提供される食料品が提供される。

二種類以上の成分をこの表に示したそれぞれのレベルで提供することが好ましく、三種類以上の成分をこの表に示したそれぞれのレベルで提供することがより好ましく、四種類の成分をこの表に示したそれぞれのレベルで提供することが最も好ましい。

前記食料品は、必要に応じて、ピリドキシン、プロリン、一種類以上の脂肪酸またはリノール酸を一種類以上含んでよい。

第１の態様の食料品は必要に応じてピリドキシンを含んでよい。ピリドキシンは、糖新生、脳内でのセロトニンの合成およびヘムの合成を含む、体内の多くの化学反応において補酵素として関与する。ピリドキシンは、表皮セラミドの合成を増加させることも知られている。

本発明の目的に関して、ピリドキシンという用語は、ピリドキサル、ピリドキサミン、並びにピリドキサル、ピリドキサミンおよびピリドキシンのリン酸塩誘導体にも関する。ピリドキシンの供給源としては、鶏、七面鳥、サーモン、バナナ、ジャガイモ、ほうれん草、ヘーゼルナッツおよび他の野菜類が挙げられる。ピリドキシンは、遊離ピリドキシン、もしくはその塩または誘導体として提供されることが好ましく、固体または半固体として提供される。ピリドキシンは粉末として提供することが好ましい。ピリドキシンは塩酸ピリドキシンとして提供されることが好ましい。

第１の態様の食料品は、必要に応じて、約１ｍｇから約５００ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇから約１００ｍｇ、より好ましくは約８ｍｇから約２０ｍｇ、最も好ましくは約８ｍｇ以上のレベル（全て４００ｋｃａｌ当たり）でピリドキシンを提供する。

第１の態様の食料品は必要に応じてプロリンを含んでよい。プロリンは、セラミドの合成を増加させることが示されている。プロリンは、ケラチノサイトの分化経路に関与することが前提とされている。さらに、プロリンは、肌のきめを改善し、コラーゲンの形成を補助し、老化中のコラーゲンの損失を抑制するのを助けることが示されている。プロリンは、筋肉、関節および腱の維持に重要であることも示されている。

プロリンは、遊離アミノ酸もしくはその塩または誘導体として提供できる。プロリンの供給源としては、肉類、乳製品、卵、家禽類または小麦が挙げられる。プロリンはゼラチンとして提供することが好ましい。

第１の態様の食料品は、必要に応じて、約０．１ｇから約２０ｇ、好ましくは約０．５ｇから約５ｇ、より好ましくは約２ｇから約３ｇのレベル（全て４００ｋｃａｌ当たり）でプロリンを提供する。

第１の態様の食料品は、一種類以上のポリ不飽和脂肪酸を含んでよい。ポリ不飽和脂肪酸は、一種類以上のオメガ−３脂肪酸（エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）またはアルファ−リノレン酸（ＡＬＡ）を含む）または一種類以上のオメガ−６脂肪酸（ガンマ−リノレン酸（ＧＬＡ）を含む）を含んでよい。各脂肪酸は、純粋な形態で、または一種類以上の魚油、大豆油、クロフサスグリ油、ヒマワリ油または挽いたナッツの油により提供してもよい。さらに、脂肪酸はアマニ油から得ても差し支えない。

ポリ不飽和脂肪酸は、抗炎症かつ抗酸化化合物である。これらは、アトピー、ノミアレルギー性皮膚炎および痒みの治療に有用である。

第１の態様の食料品は、必要に応じてリノール酸を含んでよい。リノール酸は、表皮セラミドの合成に有益である。

第１の態様の食料品は、必要に応じて、約１０ｍｇから約１０００ｍｇ／４００ｋｃａｌ、好ましくは約５０ｍｇから約５００ｍｇ／４００ｋｃａｌ、より好ましくは約４００ｍｇ／４００ｋｃａｌ以上のレベルで一種類以上の脂肪酸を提供する。エイコサペンタエン酸を約３００ｍｇ／４００ｋｃａｌ以上のレベルで提供すること、および／またはドコサヘキサエン酸を約２００ｍｇ／４００ｋｃａｌ以上のレベルで提供することが最も好ましい。

本発明は、全ての態様について、どのような動物にも関連する。本発明は、特に、ヒト、ウマ、ネコ（例えば、Felis domesticus、イエネコ）および最も好ましくはイヌ（例えば、Canis domesticus、イエイヌ）に関する。

本発明の好ましい態様による食料品は、動物が食餌において食べるどのような製品をも包含する。特に、その製品は、ペットフード、より詳しくは、キャットフードまたはドッグフードである。それゆえ、本発明は、標準的な食品並びにペットフード・スナック（例えば、スナックバー、ビスケット、飲料および甘いお菓子）を含む。本発明の食料品が調理済み製品であることが好ましい。本発明の食料品は、肉類または動物由来の材料（ビーフ、チキン、ターキー、ラム、魚類、血漿、骨髄等またはそれら一種類以上の組合せなどの）を含んでもよい。あるいは、本発明の製品は、タンパク源を提供するために、肉類を含まないもの（大豆、トウモロコシグルテンまたは大豆製品などの肉代替品を含むことが好ましい）であってもよい。本発明の製品は、大豆タンパク濃縮物、乳タンパク質、グルテンなどの追加のタンパク源を含んでもよい。タンパク源は、一種類以上のチキン、米、ナマズ、カラフトシシャモ、タピオカまたはメンハーデンなどの選択されたタンパク質であることが好ましい。本発明の目的に関して、選択されたタンパク質は、成分が過敏症反応に一般に関連しない、最小数の成分から由来するタンパク質である。

本発明の製品は、一種類以上の穀物（例えば、トウモロコシ、米、オート麦、大麦等）などのデンプン源を含んでもよい。この製品は、ゲル化デンプン基質を含んでもよい。

本発明の食料品は、ドライタイプの製品（約５から１２％の水分を有する）、セミモイストタイプの製品（約１２から７０％の水分を有する）、またはウェットタイプの製品（約７０から９０％の水分を有する）であってもよい。

本発明の食料品は包装されていることが好ましい。このようにして、消費者は、パッケージから、食料品に含まれている成分が分かり、問題の特定のペットに適していることを確認できる。パッケージは、金属（通常は、缶詰またはホイルの形態にある）、プラスチック（通常は、パウチまたはボトルの形態にある）、紙またはボール紙であってよい。どのような製品中の水分量も、使用できるまたは要求されるパッケージのタイプに影響を与える。

本発明の食料品は、完全なバランスの取れた食品であることが好ましく、または完全なバランスの取れた食品（例えば、National Reasearch Council, 1985, Nutritional Requirements for Dogs, National Academy Press, Washington D.C. or Association of American Feed Control Officials, Official Publication 1996に記載されているような）と組み合わせて用いられることが好ましい。完全なバランスの取れた食事は、高品質の市販の食品を含む。高品質の市販の食品は、主要な栄養素の消化性が８０％以上である、National Reaserach Council, 1985（前出）の栄養素の勧告に合わせて製造された食事として定義できる。

食料品に加えるべき成分の濃度は、動物が食べるであろう食料品と任意の追加の栄養素のエネルギー含有量に基づいて計算される。完全なバランスの取れた食品（高品質の市販の食品を含む）が、本発明による食料品を有してなることが好ましい。

第１の態様の食料品は補助食品として提供できる。補助食品は、追加の食料品の有無にかかわらずに与えられる粉末、ビスケット、キブル、ソース、トッピング、小包または錠剤であって差し支えない。補助食品を追加の食料品と共に与える場合、補助食品は、連続して、同時にまたは別々に与えても差し支えない。補助食品は、食料品と混ぜ合わせても、食料品の上に振りかけたり注いだり、もしくは別々に出してもよい。あるいは、補助食品は、水またはミルクなどの、飲用に与えられる液体に加えることもできる。

第１の態様の食料品は、小売店および／または獣医から得られる、市販の製品として提供してもよい。

第１の態様の別の特徴において、本発明の組成物は、経口（吸引によるものを含む）、非経口、粘膜（口内、舌下、鼻などの）、直腸、経皮または局所を含むどのような都合の良い方法によって、投与のために提供しても差し支えない。第１の態様のこの特徴において、組成物は食料品ではないことが好ましい。

本発明の第１の態様の組成物は、表皮に外部から塗布される配合物として提供できる。この組成物は、クリームまたはローション（水中油または油中水のクリームおよびローションを含む）、スプレー、粉末、ゲル、シャンプー、コンディショナー、ムース、血清、オイル、スティック、パッチ、湿潤剤または閉塞剤(occlusive)の形態であって差し支えない。

本発明の第２の態様は、皮膚のバリア機能を改善するのに使用するための本発明の第１の態様において定義される組成物を提供する。好ましい特徴において、第２の態様は、特に皮膚が、疾病および／または外傷に冒されるまたは冒され易い、もしくは曝露される場合、皮膚のバリア機能を維持および／または改善するための、本発明の第１の態様において定義される食料品に関する。そのような改善は、経皮水分蒸発の程度を減少させ、皮膚が外傷や感染を受けにくくすることを含む。したがって、第２の態様の食料品は、皮膚が疾病および／または外傷に抵抗する能力を向上させ、および／または経皮水分蒸発の程度を減少させる。この食料品は、皮膚のバリア機能が損なわれたか減少した動物に、皮膚のバリア機能が損なわれ易いまたは減少し易い動物に、もしくは皮膚のバリアに障害を受けるか受けることが予測される動物に与えることができる。

第１の態様の食料品は、分化している皮膚細胞の間に存在するバリア強化脂質の形成の増加を促進させる。さらに、この食料品は、シャンプーなどの後の、熱いまたは冷たい状況などのストレスのかかる期間中にバリア強化脂質を維持する。皮膚バリアがこのように改善されると、有害な環境要因が皮膚に浸透したり、危険なほど深く皮膚浸透したりするのが防がれ、よって、皮膚が疾病に冒されにくくなる。第１の態様の食料品は、皮膚内でバリア強化脂質を維持するおよび／または増加させる。この食料品が、皮膚においてバリア強化脂質の形成を維持するおよび／または増加させることがより好ましい。皮膚のバリア機能が改善されるまたは維持されると、第１の態様の食料品によって、皮膚の疾病および／または外傷からの回復を促進するおよび／または補助することができる。

第１の態様の食料品は、皮膚の損傷、皮膚の擦り傷、痒みに関連する皮膚の外傷、掻くことによる損傷および／または炎症の回復を促進させるおよび／または補助する。

本発明の第２の態様はさらに、皮膚の疾患の予防および／または治療のための第１の態様の食料品に関する。そのような皮膚の疾患としては、脂漏症、魚鱗癬、湿疹／アトピー性皮膚炎、必須脂肪酸疾患および冬季乾燥症などの不十分なバリア機能に関連する皮膚状態が挙げられる。第２の態様は、ヒト、イヌ、ネコおよびウマに使用するための食料品に関することが好ましい。第２の態様の好ましい特徴において、食料品は、イヌにおける皮膚の疾患を予防または治療するために使用できるペットフードであることが好ましい。

本発明の目的に関して、「治療」という用語は、動物が患う症候群、特に、皮膚疾患の症候群を減少させるまたは緩和するおよび／または皮膚疾患の治療技術に援助することを意味する。「治療」という用語はさらに、皮膚の回復を促進または補助する、例えば、皮膚の外観および状態を改善することを意味する。「予防」という用語は、動物が患っている症候群の進行を停止するまたはそのような症候群の重症度を減少させることを意味する。さらに、「予防」という用語は、症候群の進行を遅らせることを意味する。食料品は、付加的な治療として与えられることが好ましく、従来の治療と組み合わせて与えられることが好ましい。食料品は、従来の治療と別々に、同時にまたは連続して使用することができる。そのような従来の治療の例としては、皮膚軟化薬および／または水和クリームの塗布や、影響を受けた区域の閉塞が挙げられる。従来の治療はさらに、経口（吸飲によるものを含む）、非経口、粘膜（口内、舌下、鼻など）、直腸、経皮または局所を含む任意の都合の良い方法による薬剤の投与を含む。第２の態様の食料品は、皮膚の回復を促進または補助するため、例えば、従来の治療の最中または後に皮膚の外観および状態を改善するために使用しても差し支えない。

本発明の食料品は、薬物療法などの従来の治療への依存性を減少させることができるであろう。あるいは、前述した動物は、それほど症候群を示さないか、または症候群の重症度が減少されるであろう。その動物は、健康レベルが改善されるであろう。

バリア機能の低下は、炎症性疾患などの主要な状態または病状の二次的影響であることが多い。したがって、第１の態様の食料品は、皮膚のバリア機能に影響を与える状態の副作用を治療するのに使用することができる。主要な状態を治療するのに薬剤を使用する場合、第１の態様の食料品は、皮膚のバリア機能の二次的低下を治療するための薬剤と組み合わせて用いても差し支えない。第１の態様の食料品は、薬剤とは別々に、同時にまたは連続して使用しても差し支えない。

第１の態様の全ての好ましい特徴は、第２の態様にも当てはまる。

本発明の第３の態様は、皮膚疾患の予防または治療のための組成物の製造にパントテン酸、ニコチンアミド、ヒスチジン、イノシトールおよびコリンを使用する方法であって、パントテン酸が、１０ｍｇから約５００ｍｇ／４００ｋｃａｌのレベルで提供される方法に関する。第３の態様の好ましい特徴において、組成物はペットフードである。

第１と第２の態様の全ての好ましい特徴は、第３の態様にも当てはまる。

本発明の第４の態様は、皮膚疾患を予防または治療する方法であって、第１の態様の組成物を動物に投与する工程を有してなる方法に関する。第４の態様の好ましい特徴において、組成物はペットフードである。動物はそれを必要としているものであろう。動物は、炎症性皮膚疾患、脂漏症、魚鱗癬、湿疹／アトピー性皮膚炎、必須脂肪酸疾患および冬季乾燥症などの不十分なバリア機能に関連する皮膚状態を患っているまたはその傾向を有することが好ましい。

第４の態様の目的に関して、食料品は、一日一回または一日二回投与される。食料品は、動物の従来の食品と組み合わせてまたはその代わりに与えても差し支えない。食料品は、補助療法として与えても差し支えなく、従来の治療と組み合わせて与えられることが好ましい。本発明の目的に関して、食料品は、皮膚疾患を調節するために、または皮膚疾患がその二次的状態である場合の主要な状態を治療するために、従来の治療と共に与えることができる。さらに、例えば、皮膚の損傷、皮膚の擦り傷、痒みに関連する皮膚の外傷、掻くことによる損傷および／または炎症の回復を促進または補助するために、従来の治療過程が終わった後に、この食料品を与えても差し支えない。

本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様に定義された食料品を製造する方法に関する。

この食料品は、非特許文献１などの当該技術分野において知られている任意の方法により製造することができる。

各成分は、加工中の任意のときに、一緒に加えられる。それらは、全て同時に、または任意の特定の順序で個別に加えてもよい。食料品の他の成分は、加工中に任意のときに加えてもよい。食料品の二成分以上を一緒に混ぜ合わせ、次いで、一緒にすりつぶす。すりつぶされた粒子の水分と温度は、さらなる加工工程の前に調節することができる。前記成分は、加熱工程または調理工程の前または後に加えてもよい。加工は、製品の成形および／または包装を含んでもよい。第５の態様の好ましい特徴において、製品は、ペレットまたはキブルを形成するために押出成形される。押出しは、２０〜１０００ｐｓｉｇ（ゲージ圧で１４０ｋＰａ〜７ＭＰａ）の圧力および９０〜１６５℃の温度で行われることが好ましい。

パントテン酸、ピリドキシン、ニコチンアミド、プロリン、ヒスチジン、イノシトールおよびコリンは、食料品の他の成分と混ぜ合わせてもよく、完成した食料品に加えても差し支えない。パントテン酸、ニコチンアミド、ヒスチジン、イノシトールおよびコリンの内の一種類以上を、食料品の表面に被覆または噴霧しても差し支えない。あるいは、パントテン酸、ニコチンアミド、ヒスチジン、イノシトールおよびコリンの内の一種類以上を、食料品の他の成分の一種類以上と混ぜ合わせる。食料品の最終的な含水量は、冷却装置を用いて調節できる。

本発明の各態様の全ての好ましい特徴は、必要な変更を加えて、全ての他の態様に当てはまる。

以下、図面を参照して、本発明を以下の非限定的実施例を参照して詳しく説明する。

皮膚細胞（ケラチノサイト）についての組成物の効果の測定
イヌ・ケラチノサイトを得る
イヌ・ケラチノサイトは、健康な成犬から採取した皮膚の試料（４ｍｍ生検）の移植片培養により得た。試料を洗浄し、抗生物質を含有する冷たいＰＢＳ中で解剖した。表皮を真皮から切り離し、１ｍｍ²の小片に切断した。次いで、表皮の小片を、２４ウェルを有するコラーゲンで被覆したプラスチックプレートの個々のウェル内に配置し、手短に乾燥させた（６０秒間）。次いで、１０％のウシ胎仔血清を加えたグリーン培地を加え、ケラチノサイトが皮膚の縁から増殖し始めるまで、移植片を７〜１０日間に亘り培養した。ここで、トリプシンを用いて、主要な皮膚細胞をプラスチックと移植片組織から取り外し、ｉ３Ｔ３（照射を受けた繊維芽細胞）フィーダ層上に移した。細胞は、単独でプラスチック上に移せるときのほぼ密集となるまで、フィーダ層上で展開させた。主要なケラチノサイトは、この時点でアッセイに使用できるか、または必要な数だけさらに展開させることができる。

イン・ビトロ脂質合成アッセイ
ケラチノサイトを、ウェル当たり５×１０⁴個の細胞の密度でコラーゲン被覆した２４ウェルプレート内に供給した。これらの細胞を一晩落ち着かせ、次いで、培地を交換した。次いで、細胞を、増殖を促進する培養条件下（ウシ脳下垂体抽出物の存在下）に４日間置いた。４日後、培地を、分化を促進するものに交換し、この段階で、試験すべき補助物を加えた（個々の実験を参照）。これらの条件下で６日間置いた後、セラミドアッセイについては［¹⁴Ｃ」−セリンを加え、全脂質アッセイについては［¹⁴Ｃ］−アセテートを加えた。両方の場合、ウェル当たり０．５マイクロＣｉであった。細胞を放射性マーカおよび補助物の存在下で２日間に亘り培養した。培養期間の終わりに、トリプシンを用いて細胞を収穫し、ＰＢＳを用いて洗浄した。その後、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ溶液を用いて脂質を抽出し、次いで、４ｍｌのシンチレーション流体に加えた。液体シンチレーション分光計により、放射能を計数した。セラミド合成アッセイについての結果が図２〜８に示されている。全脂質合成アッセイについての結果が図９〜１０に示されている。

イヌの表皮バリア機能を改善するための栄養補給に関する可能性を研究するために、研究所でのスクリーニングアッセイを開発した。これらのアッセイは、二つの異なる形式で設計した。一組目のアッセイは、表皮脂質を合成するおよび／または増殖させる皮膚細胞（ケラチノサイト）の能力への補助物の影響に焦点を当てている。皮膚脂質のうまくいった製造は、効果的な表皮バリアの形成に固有である。ケラチノサイトの適切な増殖は、表面での皮膚の剥がれ落ちにより常に失われる細胞を置き換える新たな細胞を提供するのに必須である。

バリア機能拡散アッセイ
外側のウェル中に２．６ｍｌのグリーン培地を、内側のウェル中に４００マイクロリットルのグリーン培地を含有するＣｏｓｔａｒ Ｓｎａｐｗｅｌｌプレート（ＡＳＬカタログ番号４０２／０３６９／０８）を用意した。後者に、１×１０⁵個のイヌ・ケラチノサイトを接種した。これらのプレートを３７℃、５％のＣＯ₂で培養した。２４時間後に内側のウェル中のグリーン培地を交換して、死んだ細胞を除去し、次いで、プレートをさらに４８時間に亘り培養した。試験濃度の補助物を含有するグリーン培地を調製した（表１参照）。三日目に、内側と外側のウェルから培地を除去し、９００マイクロリットルの試験／対照培地を外側のウェル中に入れた。加えた培地の量によって、ケラチノサイトが気液界面にあることを確実にした。培地を二日／三日毎に交換しながら、プレートをさらに７日間に亘り培養した。補助物の濃度毎に二つのＳｎａｐｗｅｌｌを用い、対照毎にも二つを用いた。

十日目に、Ｓｎａｐｗｅｌｌは、拡散アッセイの準備ができていた。この時点で、各Ｓｎａｐｗｅｌｌの内側のウェルを取り外し、個々の拡散チャンバ内に配置した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）をチャンバの両側に加え（各側に６ｍｌ）、次いで、各チャンバを拡散装置内に入れた。これにより、チャンバを３７℃に恒温にし、ガス（空気中５％のＣＯ₂）を連続的にチャンバ中にポンプで送り込み、それゆえ、確実に培地を動かすことができた。１００マイクロリットルの放射性同位体で標識付けられた水（³Ｈ）を各チャンバの左側に加え、右側から、３分間隔で９０分間に亘り５０マイクロリットルの試料を採取した。試料を採取した後にＤＭＥＭ（５０マイクロリットル）を右側に入れた。次いで、４ｍｌのシンチレーション流体を含有するシンチレーションガラス瓶中に試料を入れ、各試料中の放射性標識の量を、液体シンチレーション分光計を用いて計数した。このアッセイの結果が図１３〜１８に示されている。細胞の存在下で補助物を試験した実験に加え、細胞の不在下で対照実験を行った（図１３）。

皮膚バリアを横切る拡散速度は、食料品の存在下で培養した細胞中で減少した。このデータは、食料品の存在下で細胞を培養すると、皮膚表面を通る経皮水分蒸発量が減少したことを示している（減少した拡散速度により示されるように）。このデータは、この食料品が、機能的な皮膚バリアの形成と最適化を促進したことも示している。

第２のアッセイ形式は、イン・ビトロのバリア機能拡散アッセイである。このシステムは、ケラチノサイトの単層の形態にあるバリアを横切る水性の放射性同位体により標識付けられたマーカの拡散速度を試験することにより動作する。マーカの拡散速度と、ケラチノサイトにより形成されたバリアの量との間には、逆の関係がある。これは、バリア機能の生理的尺度に近い。

さらに、ケラチノサイトがどのように得られたか並びにアッセイ形式の詳細が以下に述べられている。

ケラチノサイトの増殖アッセイ
どの補助物に、ケラチノサイトの細胞分裂を増加させる効果があるのかを試験するために、増殖アッセイを行った。細胞を、コラーゲン被覆したプレートにウェル当たり５×１０⁴個接種し、増殖促進条件下（ウシ脳下垂体抽出物、ＢＰＥを有する）で７２時間に亘り培養した。次いで、培地を、ＢＰＥを含まないものと交換し、代わりに、補助物を加えた。さらに２４時間後、各ウェルに５マイクロリットルの３Ｈ−チミジンを加えた（３７ＭＢｑ／ｍｌ）。細胞を、放射性同位体標識の存在下で２４時間に亘り培養し、次いで、トリプシンにより収穫した。収穫後、冷たい１０％のトリカルボン酸（ＴＣＡ）中で沈殿させ、冷たい５％のＴＣＡ中でペレットを２回洗浄した。最後に、シンチラント中にペレットを再度懸濁させ、液体シンチレーション分光計を用いて、放射性の含有物を計数した。

薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
図１は、¹⁴Ｃ−セリンと共に以前に培養された分化したイヌ・ケラチノサイトのＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ抽出液体分画がその上で分離されたＴＬＣプレートを示している。レーンＫは、ケラチノサイトからの放射性同位体で標識付けられた液体分画を示している。これらのバンドは、同じプレートで展開させた標識付けられていない標準物との比較によって、セラミドであることが示された。繊維芽細胞について行ったＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ抽出について見られたバンドのパターン（レーンＦ）は、ケラチノサイトの見られたものとは異なり、含有物のほとんどは、ホスファチジルセリンについて見られたものであった。

顕微鏡写真
図１１ａと１２は、拡散アッセイのために調製したケラチノサイトを撮った顕微鏡写真を示している。図１１ａは、部分的に末端が分化した層の下にある基底細胞の完全な層を示している。この構成は、層状のイン・ビトロ表皮を表している。図１１ｂは、末端分化またはその近くでの細胞の最も外側の層の透過型電子顕微鏡写真を示している。これは、イン・ビトロ角質層である。図１２は、表皮脂質の存在を強調するためにナイルレッドで染色された図１１ａと同様の区域を示している。図１１および１２に示された画像によって、イン・ビトロで表皮が形成されたことが確認され、またこれは、通常の皮膚のバリア特性に似たバリア特性を生じたことが確認された。

経皮水分蒸発量（ＴＥＷＬ）の評価による本発明の組成物の皮膚の健康の利益の試験
イヌの皮膚の健康への本発明の組成物の効果を評価するために、経皮水分蒸発量（ＴＥＷＬ）を用いた。このパラメータは、所定の時間で皮膚を通して体から失われた水分量を示している。この経路を通って出ていく水分量は、バリアとしての皮膚の質および有効性と比例している。それゆえ、ＴＥＷＬの減少は、バリア機能における改善に関連する。

方法
動物
１９９０年７月３日から２０００年４月２０日の間に生まれた３２匹の黒いラブラドール・レトリバー
３２匹のイヌを、対照パネル群と試験パネル群の二つのグループに分けた。各グループは１６匹のイヌからなった。できる限り、これらの動物を、性別と年齢についてグループ間で一致させた。

食餌
全てのイヌに、１００ｇのチキンとビーフが加えられて混ぜられた完全な乾燥フードを給餌した。

一日当たりに給餌した食餌の量は、個々の動物毎に計算した。使用した計算式は、１１０Ｋｃａｌ×（体重）^0.75であった。これは、指針としてのみ用いた。給餌した量は、安定な体重を維持するために、必要に応じて調節した。

補助物
１２週間の試験段階について、試験パネル群の各イヌには、粉末形態の組成物が与えられた。この組成物は、食品の湿った成分の上に振りかけて、混ぜた。

この組成物は、表１に示した濃度で以下の５成分からなった。

各イヌに給餌した補給物の量は、ベースの食餌中に存在する濃度を斟酌して計算した。

試行設計
予備給餌を行う前の週に、グリーンフィールド・コンディショニング・シャンプーを用いて、全てのイヌを入浴させた。試験段階の一週目に、同じシャンプーを用いて、全てのイヌを再び入浴させた。一週間に一回、二分間に亘り、全てのイヌを櫛で毛繕いした。

試行は、８週間の予備給餌と、その後の１２週間の試験段階の、合計で２０週間に亘り行った。

予備給餌の開始
８週間に亘り、イヌに完全食を給餌した。予備給餌の１週目に、全てのイヌにＴＥＷＬ測定を行った。

予備給餌に終わり
予後給餌の最終週に、全てのイヌにＴＥＷＬ測定を行った。

試験段階
１２週間の試験段階で、全てのイヌに完全食を給餌した。試験パネル群には、粉末形態の組成物も与えた。ＴＥＷＬ測定は、試験段階の３、６、９および１２週目に行った。

ＴＥＷＬ測定
各ＴＥＷＬセッション時に、一貫した温度と湿度の条件下で、ツイン・プローブを用いて、各イヌから５つの読取値を得た（合計で１０の読取値が得られる）。

一組のＴＥＷＬ読取値は、腰から得た。プローブと皮膚との間に良好な接点を与えるために、毛を注意深く分けた。

試行中ずっと、通常通りイヌを運動させた。ＴＥＷＬ測定を行う日には、測定を行うまで、イヌを乾燥したままにした。

獣医診察
試行を開始する前に、全てのイヌに十分な獣医診察を行った。

データ分析
経皮水分蒸発量の測定値間の比較を、クラスカル・ワリス検定を用いた二試料比較により行った。

結果
経皮水分蒸発量（ＴＥＷＬ）
Ｄｅｒｍａｌａｂ ＴＥＷＬメータで行った以前の検証研究によって、標準誤差を安定化するために、所定の時点で所定の部位で検体について８回の読取りを行うことが最適であることが示された。ＴＥＷＬの読取りを行うための最も信頼できる体の部位は、脊椎の丁度外側の背中にあることも検証により示された。この位置は、容易に到達でき、平らであり、動物を環境の水分源から離した状態に維持するものとすると、最も濡れにくい（例えば、舐めることにより、皮膚と毛の上に外因的に水分が形成されると、誤って高い読取値が生じてしまう）。

試行の開始時または８週間の予備給餌後に、対照パネル群と試験パネル群との間のＴＥＷＬ値には、差は観察されなかった（表２）。試験の給餌段階の３週間後と６週間後に、どのグループにも差は観察されなかった。しかしながら、試験段階の９週間後に、背中での読取値について、試験グループと対照グループとの間で、ＴＥＷＬに著しい差が観察された（Ｐ＝０．０４８）。試験給餌の１２週間後（試行の終わり）に、脊椎外側の読取値について、試験の食餌と対照の食餌との間でより大きな差が観察された（０．００７）。

示された値は、平均ＴＥＷＬ（ふつうの文字）、平均ランキング（中央値に基づく、ボールドの文字）および平均の標準偏差（括弧）である。クラスカル・ワリス検定の意義は、９５％の信頼限界で０．０５以下で到達する。ＳＯＰは試行の開始を表し、ＥＯＰは予備給餌の終わりを表し、ＥＯＴは試行の終わりを表す。ＴＥＷＬの単位は、１時間の体表面積当たりの水分蒸発量のグラム（ｇ／ｍ²・時）として表される。

１６匹のイヌの二つのグループからのデータが図１９に示されており、ここで、グループの間に*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１があり、ＳＯＰ／ＥＯＰは、予備給餌の開始と終わりであり、３−１２は、補給を行った週である。ＴＥＷＬはｇ／ｍ²・時である。

まとめ
本発明の組成物を給餌すると、イヌの経皮水分蒸発量が著しく減少することが示された。減少したＴＥＷＬにより実証されるように、バリア機能の著しい改善が、組成物を給餌して９週間後に最初に観察された（Ｐ＜０．０５）。バリア機能は、試験給餌のさらに３週間後にさらに改善されたことが分かった（合計で１２週間、Ｐ＜０．０１）。皮膚病学において、ＴＥＷＬによる皮膚からの減少した水分蒸発量は、環境因子の浸透に対する表皮の増大した抵抗性に直接相関関係にあると理解されている。これは転じて、疾病に抵抗する皮膚の能力を増大させ、全体的な健康の改善が導かれる。皮膚病は、イエイヌの重要な問題であることが広く認識されている。したがって、このように食餌に介在することは、これらの動物における天然の防御と健康を促進させる上での大きな進歩を示す。

図１は、¹⁴Ｃ−セリンとのインキュベーション後の皮膚繊維芽細胞（Ｆ）または分化したケラチノサイト（Ｋ）からの脂質分画の一次元薄層クロマトグラフを示す。各レーンは、３×１０⁵個の細胞からのＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ抽出物を含有する。 図２は、対照のインキュベーションをニコチンアミドの追加したものと比較した、¹⁴Ｃ−セリンを含ませることにより測定した、イヌ・ケラチノサイトによるイン・ビトロのセラミド合成を示す。 図３は、対照のインキュベーションをヒスチジンまたはパントテン酸の追加したものと比較した、¹⁴Ｃ−セリンを含ませることにより測定した、イヌ・ケラチノサイトによるイン・ビトロのセラミド合成を示す。 図４は、対照のインキュベーションをリノール酸の追加したものと比較した、¹⁴Ｃ−セリンを含ませることにより測定した、イヌ・ケラチノサイトによるイン・ビトロのセラミド合成を示す。 図５は、対照のインキュベーションをピリドキシンの追加したものと比較した、¹⁴Ｃ−セリンを含ませることにより測定した、イヌ・ケラチノサイトによるイン・ビトロのセラミド合成を示す。 図６は、対照のインキュベーションをコリンおよびイノシトールの追加したものと比較した、¹⁴Ｃ−セリンを含ませることにより測定した、イヌ・ケラチノサイトによるイン・ビトロのセラミド合成を示す。 図７は、対照のインキュベーションをニコチンアミドまたはヒスチジンの追加したものと比較した、¹⁴Ｃ−セリンを含ませることにより測定した、イヌ・ケラチノサイトによるイン・ビトロのセラミド合成を示す。 図８は、対照のインキュベーションをプロリンの追加したものと比較した、¹⁴Ｃ−セリンを含ませることにより測定した、イヌ・ケラチノサイトによるイン・ビトロのセラミド合成を示す。 図９は、対照のインキュベーションをニコチンアミドの追加したものと比較した、¹⁴Ｃ−アセテートを含ませることにより測定した、イヌ・ケラチノサイトによるイン・ビトロの総脂質合成を示す。 図１０は、対照のインキュベーションをヒスチジンまたはパントテン酸の追加したものと比較した、¹⁴Ｃ−アセテートを含ませることにより測定した、イヌ・ケラチノサイトによるイン・ビトロの総脂質合成を示す。 図１１ａは、Ｃｏｓｔａｒ Ｓｎａｐｗｅｌｌ膜上で成長させ、その後、気液界面で分化したイヌ・ケラチノサイトの顕微鏡写真を示す。顕微鏡写真は、クレシルバイオレットにより対比染色されていた。目盛りのバーは４０マイクロメートルである。図１１ｂは、Ｃｏｓｔａｒ Ｓｎａｐｗｅｌｌ膜上で成長させ、その後、気液界面で分化したイヌ・ケラチノサイトの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）を示す。顕微鏡写真は、クエン酸鉛／酢酸ウラニルにより対比染色されていた。目盛りのバーは２マイクロメートルである。 図１２は、Ｃｏｓｔａｒ Ｓｎａｐｗｅｌｌ膜上で成長させ、気液界面で分化し、ナイルレッドを用いた染色されたイヌ・ケラチノサイトの顕微鏡写真を示す。蛍光染色は、薄層中に中性脂質の存在を示している。 図１３は、ケラチノサイトの存在下（■）または不在下（○）でのケラチノサイトの単層に亘る滴定水の拡散速度により測定した経皮拡散を示す。 図１４は、追加なしのケラチノサイトの存在下（◇）における拡散速度をピリドキシンを追加したケラチノサイトの存在下（■）での拡散速度を比較した、分化したケラチノサイトの層に亘り滴定水の拡散速度により測定した経皮拡散を示す。 図１５は、追加なしのケラチノサイトの存在下（◇）における拡散速度をニコチンアミドを追加したケラチノサイトの存在下（●）での拡散速度を比較した、分化したケラチノサイトの層に亘り滴定水の拡散速度により測定した経皮拡散を示す。 図１６は、追加なしのケラチノサイトの存在下（◇）における拡散速度をパントテン酸を追加したケラチノサイトの存在下（●）での拡散速度を比較した、分化したケラチノサイトの層に亘り滴定水の拡散速度により測定した経皮拡散を示す。 図１７は、追加なしのケラチノサイトの存在下（◇）における拡散速度をプロリンを追加したケラチノサイトの存在下（●）での拡散速度を比較した、分化したケラチノサイトの層に亘り滴定水の拡散速度により測定した経皮拡散を示す。 図１８は、追加なしのケラチノサイトの存在下（△）における拡散速度をコリンおよびイノシトールを追加したケラチノサイトの存在下（◆）での拡散速度を比較した、分化したケラチノサイトの層に亘り滴定水の拡散速度により測定した経皮拡散を示す。 図１９は、１６匹からなる二つのグループにおける経皮水分蒸発量（ＴＥＷＬ）を示しており、ここで、試験用のイヌには組成物が補給され、ＳＯＰ／ＥＯＰ（予備給餌の開始と終わり）のグループ間で*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１；３〜１２＝補給した週、ＴＥＷＬ：ｇ／ｍ²・時。

Claims (10)

1. ペット動物の皮膚バリア機能を改善する方法であって、パントテン酸と、ニコチンアミドと、ヒスチジンと、イノシトールと、コリンとを含有しかつパントテン酸を１０ｍｇから５００ｍｇ／４００ｋｃａｌのレベルで提供するペットフードを、ペット動物に与えることを含む方法。
2. 前記ペットフードが、ニコチンアミドを２５ｍｇから８００ｍｇ／４００ｋｃａｌのレベルで提供することを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 前記ペットフードが、ヒスチジンを１０ｍｇから１００００ｍｇ／４００ｋｃａｌのレベルで提供することを特徴とする請求項１または２記載の方法。
4. 前記ペットフードが、イノシトールを１０ｍｇから５００ｍｇ／４００ｋｃａｌのレベルで提供することを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の方法。
5. 前記ペットフードが、コリンを１０ｍｇから７００ｍｇ／４００ｋｃａｌのレベルで提供することを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の方法。
6. 前記ペットフードが、ピリドキシンもしくはピリドキサルもしくはピリドキサミンあるいはそれらのリン酸塩誘導体、プロリン、一種類以上の脂肪酸またはリノール酸の一種類以上をさらに含むことを特徴とする請求項１から５いずれか１項記載の方法。
7. 前記ペットフードが、ピリドキシンを１ｍｇから５００ｍｇ／４００ｋｃａｌのレベルで提供することを特徴とする請求項６記載の方法。
8. 前記ペットフードが、プロリンを０．１ｇから２０ｇ／４００ｋｃａｌのレベルで提供することを特徴とする請求項６または７記載の方法。
9. 皮膚中におけるバリア向上脂質の形成を維持または増加させることにより、皮膚バリア機能を改善することを特徴とする請求項１から８いずれか１項記載の方法。
10. 経皮水分蒸発量を減少させることにより、皮膚バリア機能を改善することを特徴とする請求項１から９いずれか１項記載の方法。

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