JP4830066B2 - 生キノコエキス製造方法、エキス及びエキス配合物 - Google Patents

Description

本発明は、免疫抑制機能又は抗アレルギー効果を有するエキスを製造する生キノコエキス製造方法、及びそのようにして得られるエキス、さらにそのエキスを配合したエキス配合物に関する。

椎茸は、その形状によって、傘がつぼみのように丸く肉厚な「冬姑（どんこ）」、傘が開いたように平らで肉薄な「香信（こうしん）」に大別される。生よりも干した椎茸の方が、味、風味、栄養価ともに上回るとされている。椎茸は、含有するグアニル酸や遊離アミノ酸の呈味性や独特の風味により、消費者に最も馴染まれてきたキノコである。干し椎茸が良い香りを発するのは、日光に当てて乾燥させることにより、イオウを含むレンチオニンという芳香成分が生成されるためと考えられている。椎茸には、エルゴステロールというビタミンD前駆体が豊富に含まれており、紫外線が当たると、100IUのビタミンD2に変化する。これは1日に必要なビタミンD2を干し椎茸なら1枚で補うことができる。以上のように、干椎茸は生椎茸とでは食感・香り・ビタミン等が大幅に異なることが知られている。

また、古来より椎茸が不老不死の妙薬である等の民間伝承も多い。近年、科学的にも椎茸に含まれているレンチナン（β-１-３グルカン）の免疫増強効果が喧伝された経緯もあって、一般の消費者においても「健康食品」としても認識が高い食品である。レンチナンは注射で効果が発現するものであるとともに、特殊な製造方法によって製造されかつ高度に精製された医薬品成分として利用されているので、干し椎茸あるいは生椎茸そのものが加工食品あるいは自家発酵食品として免疫機能修飾作用を期待できるかどうかに関してはこれまで十分に明らかになっているとは言えない。

一方本発明者らは、椎茸については、コンピュータ管理した栽培により、均一な品質を持つ生椎茸生産の他、生椎茸を原料とした加工食品の開発を行い、椎茸生産技術に関して提案している（特許文献１参照）。さらに、椎茸の多糖類の機能性に着目すると同時に、自家発酵による食品素材及び新規調味料の開発等、各種食品素材化技術を追求し生椎茸の高付加価値化に取り組んできた（特許文献２参照）。自家発酵とは、特別に他の微生物等を加えずに自身が持つ酵素反応等により内容成分を（人間にとって）有用な物質に変化させることである。
特開２００１−３４６５３８号公報 特開２００４−２４８５３１号公報

これまで椎茸が健康に対する機能性を示すことに関して、椎茸の機能性、とりわけ免疫修飾効果に関しては十分な検討が加えられているとは言えず、椎茸の機能性に着目して新規で安全な免疫機能修飾エキスを提供することはできなかった。本発明者らはさらに膨大な実験を長年にわたって繰り返した結果、椎茸には免疫増強と抑制の両免疫制御作用があることを世界で初めて示す事に成功した。そこで、椎茸が異なる成分を有する食品であることに着目し、これらの免疫制御の機能を解明・分離して素材化を達成し、これを適切に用いる（食する）ことで諸疾患に対して予防・治療効果が期待でき、健康を維持する食品が開発可能であると着想した。実際に、椎茸にはもともと免疫増強成分と免疫抑制成分が含有されていることを見出し、しかもそれぞれの成分を含むエキスを分離製造することが可能であることを見出した。

また、免疫抑制作用から期待させる諸疾患に対する予防・治療効果の一つとしてアトピー性皮膚炎の実験動物モデルであるIgE依存型アレルギー反応に対する抑制効果を調べた。その結果、エキスの経口適用により、抑制効果すなわち抗アレルギー効果が認められた。アトピー性皮膚炎は近年患者数が増加し、社会的問題になってきている。にもかかわらずステロイド抵抗性など難治性アトピー性皮膚炎の療法は未だ確立されているとは言えず、効果的な予防又は治療法の確立が望まれている。

そこで本発明は、免疫抑制機能又は抗アレルギー効果を有するエキスを製造する生キノコエキス製造方法、及びそのようにして得られるエキス、さらにそのエキスを配合したエキス配合物を提供することを目的とする。

本発明の生キノコエキス製造方法は、可食性生キノコ子実体をペースト化し自家発酵させたものを凍結しその後融解することを特徴とする。これまでの実験で、生の子実体（一般にキノコと認識されている傘と柄の部分）をペースト化し、一定期間、一定温度で保存させることにより、遊離アミノ酸等の増加（自身のタンパク質がタンパク分解酵素により分解され、遊離アミノ酸となった）が見られた。これは、通常「自己消化」とも言われるが、本製造工程（特にペースト化）においては、単純に分解のみでなく酸化酵素等の働きによる酸化が考えられ、その結果アレルギー抑制に関与する成分に変化すると考えられる。

また、前記可食性生キノコは、椎茸、松茸、マイタケ、シメジ、エノキタケ、エリンギ、マッシュルーム、レイシ、又はアガリクスであることで、多くの種類のキノコを素材とすることができる。

また、本発明のエキスは、上記生キノコエキス製造方法によって製造されたことを特徴とする。

また、上記エキスは、免疫抑制機能をもつことで、免疫活性化機能の用途とは異なる免疫抑制機能をもつエキスの用途に用いることができる。

また、上記エキスは、抗アレルギー効果を示すことで、アレルギー性疾患等の諸疾患に対して治療・予防効果を持つエキスの用途に用いることができる。

また、本発明のエキス配合物は、上記エキスが配合されていることを特徴とする。

また、上記エキス配合物は、医薬品、医薬部外品、動物用医薬品、化粧料、食品、又は機能性食品であることで、多くの用途に応用することができる。

本発明は、極めて簡単な方法で、椎茸に含まれる免疫抑制効果を分離してエキス化する製造法である。本発明によれば、免疫機能の抑制効果を示すエキスが製造可能である。かつ、このエキスは多糖類の含量が低く、粉末化することも容易で、極めて扱いやすい素材である。この発明により天然食材として広く流通している椎茸より、ヒトの免疫機能を抑制する作用を担う機能性素材が提供され、この素材を配合することにより現代のヒトに必要な諸種感染症やアレルギー性疾患等の諸疾患に対して治療・予防効果を持つ機能性食品が開発される。

本明細書は本願の優先権の基礎である特願２００４−１３７８８１の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

図１は、各椎茸エキスに含有されるアミノ酸の量を測定した結果を示す図である。 図２は、各椎茸エキスに含有されるγ-アミノ酪酸の量を測定した結果を示す図である。 図３は、各椎茸エキスの免疫抑制効果を示す図である。 図４は、本発明エキスのアレルギー反応抑制効果を示す図である。

以下本発明の実施例を図面に基づいて説明する。ただし、以下に示す実施例は、本発明の技術思想を具体化するための免疫抑制エキスの製造方法、及びエキス、及びエキスを配合した医薬品、医薬部外品、食品、化粧料を例示するものであって、いかなる意味でも発明はこれらに限定されるものではない。

（１）原材料として用いたキノコ
原材料として、徳島県において菌床栽培方式で栽培された生椎茸を、収穫後直ちに、即ちできる限り鮮度の高いものを用いた。

（２）生椎茸のペースト化
生椎茸をペースト化する際には、磨砕機にて、1,600rpmの回転数で40ミクロン〜70ミクロンまで磨砕してペーストとした。そのとき、摩擦熱等による温度上昇は、椎茸磨砕物の品温が60℃を超えず、ある程度の品温、20℃〜50℃、好ましくは30℃〜40℃となるように調節した。このペースト化が、自家発酵の促進につながる。

（３）ペースト化した椎茸の自家発酵
ペースト化した生椎茸でさらに自家発酵を促進させるため、椎茸ペーストを適当量袋に詰め、真空ポンプ等により減圧操作を行い、密封した。これを2時間〜18時間、好ましくは3時間〜6時間、前記の温度で保温した。

（４）椎茸を素材にしたエキス製造法
ペースト化に続いて自家発酵させた生椎茸を、-20℃以下に緩慢凍結させた。完全に凍結後、今度は緩慢解凍を行い、そのとき得られる解凍液部を収集し、液中の酵素失活及び殺菌を兼ねて加熱処理を行った（120℃、40分程度）。加熱処理により派生した沈殿は、フィルタープレス等でろ過後、再度、加熱殺菌処理を行い、目的のエキスを得た。得られるエキスは、水分93％前後でほとんど多糖類を含まず、グルコース、トレハロース等の糖質を1〜2％、遊離アミノ酸を0.8〜0.9％、γ-アミノ酪酸を50〜70mg/100ml、エリタデニンを15〜20mg/100ml含み、pH5.5〜6.5である。この方法で調整した椎茸エキスをFPエキスとした。当該FPエキスの粉末化はスプレードライもしくは凍結真空乾燥により可能である。対照エキスとして以下の3種類を用意した。FTエキスは、生椎茸をペースト化し、自家発酵をさせずに2倍量の蒸留水を加え、120℃、50分熱水抽出後、遠心分離（約10,000ｘｇ、20分）した上清である。SFPエキスは、生椎茸をそのまま加熱処理（120℃、50分のオートクレーブ処理）したものをペースト化し、以後の緩慢凍結からFPエキスと同様の操作にて凍結解凍抽出したエキスである。NDエキスは、乾燥椎茸を粉末にし、FTエキスの水分量と同量の蒸留水を加え、120℃、50分熱水抽出後、遠心分離（約10,000ｘｇ、20分）した上清である。

（５）各種椎茸エキス中成分の測定
表１に、上記製造法によって得られた各椎茸エキスに含有されるLPS（リポポリサッカライド）、糖、タンパク質、及び核酸の量を測定した結果を示す。

図１は、上記製造法によって得られた各椎茸エキスに含有されるアミノ酸の量を測定した結果を示す図である。

図２は、上記製造法によって得られた各椎茸エキスに含有されるγ-アミノ酪酸（GABA）の量を測定した結果を示す図である。
1)LPSは、トキシカラーシステム（生化学工業）を用い、標準エンドトキシンを標準物質として、測定した。測定値は、LPSとβ-グルカンの総和である。
2)糖は、フェノール硫酸法により、グルコースを標準物質として測定した。
3)タンパク質はブラッドフォード法により、牛血清アルブミンを標準物質として測定した。
4)核酸はOD260の吸光度×50μg/mlから算出した。
5)遊離アミノ酸量及びγ-アミノ酪酸（GABA）はニンヒドリン法を利用しアミノ酸分析計（6300E型、ベックマン社製）にて測定した。

自家発酵させたFPエキスは、自家発酵してないFTエキスやSFPエキスと比較し、遊離アミノ酸の増大が一部を除き認められ、特にアスパラギン酸、プロリン、グリシン、バリン、チロシンが多く検出された。ただし、アスパラギン酸とグルタミン酸は磨砕しなくても増加することが分かる。

高血圧を正常化する機能性成分として認知されつつあるγ−アミノ酪酸（GABA）はFTエキスと比較して、4倍以上の増大が認められた。なおかつ、一度熱をかけたFTエキスやSFPエキスでは多く存在した多糖類がFPエキスではほとんど抽出されておらず、多糖類によるゲル化を避けることができ、抽出効率が飛躍的に向上した。

（６）椎茸エキスによるマクロファージ細胞に対する免疫抑制化
免疫活性はマクロファージをLPSで刺激した場合に産生される一酸化窒素量で比較することが可能である。そこで、マウスマクロファージ細胞株RAW264のけんだく液（8×10⁵cell/100μl）に、LPS（1μg/ml）と、11.3%になるように希釈した各種椎茸エキスをあわせて100μl添加し、24時間後の培養上清を回収し、グリエス試薬にて産生された一酸化窒素量に対応する亜硝酸濃度を測定した。RAW264細胞をLPSで刺激すると一酸化窒素が誘導される。ここにFPエキスを加えると、この一酸化窒素産生が抑制されることより、FPエキス中には、マクロファージ活性化を抑制する因子が含まれると考えられる（図３）。前述したように、椎茸には免疫活性化成分と免疫抑制化成分の両方が含まれていると考えられる。FPエキスの免疫抑制効果は、FTエキス、NDエキスに比べて強いことより、FPエキス抽出方法にて、生椎茸の持つ免疫抑制成分が効果的に分離されたことが示されている。FPエキスでは、上述のようにアミノ酸の成分変化及び高血圧に効果があるとされるGABAの含量が増えており、このことが免疫機能の抑制効果に相乗的に作用することが考えられる。

（７）FPエキスの経口投与によるマウスのIgE依存性アレルギー反応に対する抑制効果
FPエキスについて、マウスを用いたIgE依存性アレルギー反応の実験系により抑制効果が認められるかどうかについて検討した。

本実験系は抗ジニトロフェニル（DNP）-IgE抗体をマウスに静脈内投与し、3時間後にジニトロフルオロベンゼン（DNFB）を含む液を、アレルゲンとしてマウスの右側の耳介に塗布することで誘導される耳介の浮腫に対して抑制効果を示すか調べるもので、感作されたマスト細胞が抗原と結合し、ヒスタミンなどのケミカルメディエータを遊離することで、誘導される早期反応（1時間目の浮腫）と、続いてサイトカインの産生による細胞浸潤により誘導される遅発反応（24時間目の浮腫）を特徴とする。

本実施例では、抗DNP-IgEモノクローナル抗体溶液（1μｇ/BALB/cマウス）又はコントロールとして、抗体を溶解させていない溶媒（りん酸バッファー）を静脈内投与し、3時間後に0.25%のDNFB（ジニトロフルオロベンゼン）を含むアセトン・オリーブ油（4:1)溶液20μlを、アレルゲンとしてマウスの右側の耳介に塗布した。アレルゲン塗布の直前にシックネスゲージを用いて耳介（右）の厚さを測定した。塗布前及び塗布後（1時間目、2時間目及び24時間目）に耳介の厚さをシックネスゲージを用いて測定し、塗布前からの厚さの増加分を浮腫（μｍ)として算出した。溶媒を静脈投与した群を陰性対照群とし、抗DNP-IgEモノクローナル抗体溶液を静脈投与した群を陽性対照群とした。対照群（陰性及び陽性）は、水を自由摂取させ、さらに、アレルゲン塗布2時間前に蒸留水を500μl/マウスでゾンデを用いて経口投与した。

対照薬として、ステロイドであるプレドニンを用いた。サンプルの投与方法は、水溶性のプレドニンは10mg/kgの用量でアレルゲン塗布の2時間前に腹腔内投与した。FPエキスは、アレルゲン塗布の7日前より24時間後の間、自由摂取させ、さらに、アレルゲン塗布2時間前に2.5倍濃度の水溶液を500μl/マウスでゾンデを用いて経口投与した。

薬剤の投与の効果はアレルゲン塗布1時間後に認められる早期反応と、24時間後に誘起される遅発反応の抑制率で評価した。抑制率は、各時間の陽性対照群の浮腫の平均値からFPエキス投与群又はプレドニン投与群の浮腫の平均値を減じた値を、各時間の陽性対照群の浮腫の平均値から陰性対照群の浮腫の平均値を減じた値で割った値に、100を乗じて算出した。その結果、対照薬として用いたプレドニン投与群では70％以上の抑制率が早期及び遅発反応で認められた。これに対して椎茸を原材料とし著しく安価に製造可能なFPエキス1%添加群においても、20〜40%程度の抑制率が早期及び遅発反応で認められた。

図４の「IgE(-)」は、溶媒を静脈投与した陰性対照群の浮腫の平均値±標準偏差を示す。
「IgE(+)」は、抗DNP-IgEモノクローナル抗体溶液を静脈投与した陽性対照群の浮腫の平均値±標準偏差を示す。
「プレドニン」は、早期反応（1時間目の浮腫）および遅発反応（24時間目の浮腫）を共に抑制する効果が知られているプレドニン投与群の浮腫の平均値±標準偏差を示す。
「FPエキス」は、FPエキス投与群の浮腫の平均値±標準偏差を示す。

（８）椎茸エキス配合食品の製造方法及び椎茸エキス配合食品
FPエキス入り飴製造方法
原材料としてグラニュー糖、水飴、水、椎茸エキスを5：5：5：1の割合で混合し、加熱して１２０℃〜１６０℃で煮詰めた。これを冷却用鉄板上で冷却し、棒状に引き伸ばして５g前後の粒状に成型し飴を得た。この飴は、原料キノコ（椎茸）の風味はなく、万人向けの味であった。エキス分が口内に留まる時間が長いため、のどの炎症を緩和した。

（９）椎茸エキスを使用したハンドクリームの製造方法
1)FPエキス入り脂溶性クリーム処方
下記組成の脂溶性基材にFPエキスを9対1の割合で添加し、混合して軟膏を得た。
100g中
白色ワセリン・・・・・・・・・・・・・・25ｇ
ステアリルアルコール・・・・・・・・・・20ｇ
プロピレンアルコール・・・・・・・・・・12ｇ
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60・・・・4ｇ
モノステアリン酸グリセリン・・・・・・・ 1ｇ
パラオキシ安息香酸メチル・・・・・・・ 0.1ｇ
パラオキシ安息香酸プロピル・・・・・・ 0.1ｇ
精製水・・・・・・・・・・・・・・・・ 適量 含有
原料キノコ（椎茸）独特のにおいはなく、若干褐色を呈した。両方の手に手荒れのある女性の片手のみに塗布してもらったところ、塗布した方の手荒れの炎症が完治した。

2)椎茸エキス入り水溶性クリーム処方
下記組成表において、まずA組を70度で加熱溶解し、これに1/4量の精製水で溶き70度で加熱溶解したB組と、1/4量の精製水で溶き70度で加熱溶解したC組を加え、ホモジナイザーで充分混合した後、40度まで冷却して、D組を加えPHを6.8まで調整したものに残りの精製水とFPエキスを30％加えて十分混合して乳液を得た。椎茸独特のにおいは少なく、若干褐色を呈した。椎茸エキスが持つ糖質等の保水性により、肌の乾燥を防止した。手荒れ等の炎症を緩和した。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (8)

1. 生椎茸子実体をペースト化し自家発酵させたものを凍結しその後融解して解凍液部を得ることを特徴とする生椎茸エキス製造方法。
2. 請求項１記載の生椎茸エキス製造方法によって製造されたことを特徴とするエキス。
3. 請求項２記載のエキスを含有する免疫抑制のための医薬品。
4. 請求項２記載のエキスを含有する抗アレルギー用医薬品。
5. 請求項２記載のエキスを含有する免疫抑制のための動物用医薬品。
6. 請求項２記載のエキスを含有する抗アレルギー用の動物用医薬品。
7. 請求項２記載のエキスが配合されていることを特徴とするエキス配合物。
8. 前記エキス配合物は、医薬部外品、化粧料、食品、又は機能性食品であることを特徴とする請求項７記載のエキス配合物。

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