JP4830115B2 - ニワトリ型一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）から組換えニワトリ型二価抗体を製造する方法によって得られた抗体 - Google Patents

Description

本発明は、ファージディスプレイ法により得られた一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を２量化してニワトリ型二価抗体を製造する方法、および当該方法によって得られた抗体、並びに当該抗体の代表的な利用例に関するものである。

本発明者等は、これまで哺乳類動物型以外の抗体としてニワトリ型の抗体に着目し、研究を行なってきた。ニワトリは系統発生学的には哺乳類動物よりも下等であるが、哺乳類動物と同様に精緻な免疫システムを備えている動物である。特に哺乳類動物と系統発生学的に離れているため、多くの哺乳類動物で保存されているタンパク質に対して特異的抗体を作製するのに有用である。すなわちマウスやラットを用いて作製が困難なタンパク質（抗原）に対する特異的抗体が、ニワトリでは作製可能であるということである。例えば、ヒトの癌マーカーとなる抗原であるＮ−グリコリルノイラミン酸（以下「ＮｅｕＧｃ」という）は、ヒトを除くほとんどの哺乳類動物に存在しているため、マウス・ラット等では抗体を作製することはできないが、ニワトリをはじめとする鳥類ではＮｅｕＧｃが存在しないために抗体を作製することが可能である。また、クロイツフェルト・ヤコブ病や狂牛病の病原体となるプリオンタンパク質（以下「ＰｒＰ」という）は、哺乳類動物間で９０％以上の相同性が有るため哺乳類動物では抗体を作製することは困難であるが、哺乳類動物とニワトリ間の相同性は３０％台であるため、ニワトリにおいてその抗体の作製は可能である。事実、本発明者等は、細胞融合法によって上記ＮｅｕＧｃ、ＰｒＰに対するニワトリ型モノクローナル抗体の作製に成功している。この他のニワトリ型抗体のメリットとしては、哺乳類動物型の抗体との交叉反応性が無いため、ニワトリ型モノクローナル抗体と哺乳類動物型モノクローナル抗体を用いることによって、非特異的反応のない高感度抗原検出系を確立することが可能なことである。

現在ニワトリ型モノクローナル抗体の作製方法としては、細胞融合法（非特許文献１および非特許文献２参照）、およびファージディスプレイ法（非特許文献３、非特許文献４、および特許文献１参照）が既に確立されている。本発明者らは、ニワトリ型抗体の大量生産、構造改変、機能改変等を目的として遺伝子組換え技術を導入し、組換えニワトリ型抗体を作製に成功している。（特許文献２参照（特願２００４−３２５６５８号（２００４年１１月９日出願）明細書および図面参照））
しかし、上記細胞融合法によるニワトリ型モノクローナル抗体の作製は、ハイブリドーマの作製に、ある程度の時間と一定の技術を必要とするため、必ずしも簡便な方法とはいえない。また上記ファージディスプレイ法はニワトリ型モノクローナル抗体の簡便な作製方法であるが、作製された抗体が軽鎖可変領域と重鎖可変領域とをリンカーでつないだ一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）であり、抗原結合部位の構造の不安定さにより抗原との親和性が低いこと、検出のための２次抗体の結合領域が少なく検出感度が低くなること等の問題点があった。上記問題点を改善すべく、重鎖定常領域（ＣＨ３領域）の一部を用いて一本鎖可変領域断片を２量化することが行なわれている。その他、ヒトのｓｃＦｖの抗体からヒトのモノクローナル抗体への変換が行なわれている。その方法は、可変領域をＰＣＲで増幅し、制限酵素でリーダー領域や定常領域とつなぐというものである。（非特許文献５参照）。さらに、上記組換えニワトリ型抗体はハイブリドーマが分泌するニワトリ型モノクローナル抗体の遺伝子を用いており、上述のごとくハイブリドーマの作製が困難であり、必ずしも簡便な方法とはいえない。

本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は組換えニワトリ型二価抗体の簡便な製造方法として、ファージディスプレイ法により得られた一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を２量化してニワトリ型抗体を製造する方法、および当該方法によって得られた抗体、並びに当該抗体の代表的な利用例を提供することにある。
Ａｓａｏｋａ，Ｈ．Ｎｉｓｈｉｎａｋａ，Ｓ．，Ｗａｋａｍｉｙａ，Ｎ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｈ．，Ｍｕｒａｔａ，Ｍ．，１９９２．Ｔｗｏ ｃｈｉｃｋｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌ Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３２，９１−９６． Ｍａｔｓｕｄａ，Ｈ．，Ｍｉｔｓｕｄａ，ｈ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｎ．，Ｆｕｒｕｓａｗａ，Ｓ．，Ｍｏｈｒｉ，Ｓ．，Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｔ．，１９９９．Ａ ｃｈｉｃｋｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．ＦＥＭＳ Ｉｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３，１８９−１９４ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｈ．Ｉ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｔ．，Ｌｋｅｄａ−ｔａｎａｋａ，Ｏ．，１９９６．Ｃｈｉｃｋｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７，１１５６−１１６２． Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｎ．，Ｓｈｉｍｏｋａｗａ，Ｍ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｈｏｊｙｏ，Ｓ．，Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｆｕｒｕｓａｗａ，Ｓ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｈ．，２００３．Ｔｗｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８０，１５７−１６４． Ｂｏｅｌ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｆ ａｌｌ ｉｓｏｔｙｐｅｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆａｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３９（２０００），１５３−１６６． 特開２００３−９８６９号公報（公開日：平成１５（２００３）年１月１４日） 特開２００５−２７８６３３号公報（公開日：平成１７（２００５）年１０月１３日）

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を行ない、本発明を完成するに至った。すなわち本発明にかかる方法は、上記課題を解決すべく、組換えニワトリ型二価抗体を製造する方法であって、ニワトリ型一本鎖可変領域断片をコードするポリヌクレオチドを鋳型として軽鎖可変領域遺伝子、および重鎖可変領域遺伝子を増幅する増幅工程；宿主細胞において機能する軽鎖リーダー配列、前記軽鎖可変領域遺伝子、およびニワトリ型抗体の軽鎖定常領域遺伝子を連結する軽鎖発現用遺伝子断片調製工程；並びに宿主細胞において機能する重鎖リーダー配列、前記重鎖可変領域遺伝子、およびニワトリ型抗体の重鎖定常領域遺伝子を連結して重鎖発現用遺伝子断片調製工程；を含むことを特徴としている。

また本発明にかかる方法は、上記課題を解決すべく、上記増幅工程は、配列番号１に示される塩基配列を有する第１プライマー、および配列番号２に示される塩基配列を有する第２プライマーを用いて軽鎖可変領域遺伝子を増幅するとともに、配列番号７に示される塩基配列を有する第７プライマー、および配列番号８に示される塩基配列を有する第８プライマーを用いて重鎖可変領域遺伝子を増幅する工程であってもよい。

また本発明にかかるニワトリ型抗体の製造方法は、上記課題を解決すべく、上記軽鎖リーダー配列は、配列番号３に示される塩基配列を有する第３プライマー、および配列番号４に示される塩基配列を有する第４プライマーを用いて増幅されたポリヌクレオチドであってもよい。

また本発明にかかるニワトリ型抗体の製造方法は、上記課題を解決すべく、上記軽鎖定常領域遺伝子は、配列番号５に示される塩基配列を有する第５プライマー、および配列番号６に示される塩基配列を有する第６プライマーを用いて増幅されたポリヌクレオチドであってもよい。

また本発明にかかるニワトリ型抗体の製造方法は、上記課題を解決すべく、上記軽鎖リーダー配列は、配列番号３に示される塩基配列を有する第３プライマー、および配列番号４に示される塩基配列を有する第４プライマーを用いて増幅されたポリヌクレオチドであり、かつ上記軽鎖定常領域遺伝子は、配列番号５に示される塩基配列を有する第５プライマー、および配列番号６に示される塩基配列を有する第６プライマーを用いて増幅されたポリヌクレオチドであってもよい。

また本発明にかかる方法は、上記課題を解決すべく、上記重鎖リーダー配列は、配列番号９に示される塩基配列を有する第９プライマー、および配列番号１０に示される塩基配列を有する第１０プライマーを用いて増幅されたポリヌクレオチドであってもよい。

また本発明にかかる方法は、上記課題を解決すべく、上記重鎖定常領域遺伝子は、配列番号１１に示される塩基配列を有する第１１プライマー、および配列番号１２に示される塩基配列を有する第１２プライマーを用いて増幅されたポリヌクレオチドであってもよい。

また本発明にかかる方法は、上記課題を解決すべく、上記重鎖リーダー配列は、配列番号９に示される塩基配列を有する第９プライマー、および配列番号１０に示される塩基配列を有する第１０プライマーを用いて増幅されたポリヌクレオチドであり、かつ上記重鎖定常領域遺伝子は、配列番号１１に示される塩基配列を有する第１１プライマー、および配列番号１２に示される塩基配列を有する第１２プライマーを用いて増幅されたポリヌクレオチドであってもよい。

また本発明にかかる方法は、上記課題を解決すべく、上記軽鎖発現用遺伝子断片調製工程は、上記軽鎖リーダー配列；上記軽鎖可変領域遺伝子；および上記軽鎖定常領域遺伝子を鋳型として、上記第３プライマーおよび第６プライマーを用いて増幅反応を行なう工程であってもよい。

また本発明にかかる方法は、上記課題を解決すべく、上記重鎖発現用遺伝子断片調製工程は、上記重鎖リーダー配列；上記重鎖可変領域遺伝子；および上記重鎖定常領域遺伝子を鋳型として、上記第９プライマーおよび第１２プライマーを用いて増幅反応を行なう工程であってもよい。

一方、本発明にかかる抗体は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかる方法によって製造された抗体である。

また本発明にかかる抗体は、上記課題を解決すべく、（ａ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなる軽鎖、および（ｃ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列；または（ｄ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなる重鎖を備え、プリオンタンパク質と結合する活性を有することを特徴としている。

また本発明にかかる抗体は、上記課題を解決すべく、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、および配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を備えることを特徴とする抗体であってもよい。

また本発明にかかる抗体は、上記課題を解決すべく、検出用マーカーとして利用し得る酵素または放射性同位元素で標識されている抗体であってもよい。上記検出用マーカーとして利用し得る酵素としては、基質と反応して発色する酵素であることが好ましい。例えばペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ等が検出用マーカーとして利用し得る酵素として利用される。また上記検出用マーカーとして利用し得る放射性同位元素としては、例えば^１４Ｃ、^３Ｈ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^９０Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉが利用可能である。上記検出用マーカーとして利用し得る酵素または放射性同位元素で標識された抗体によれば、直接法により抗原（プリオンタンパク質）を検出することができ、非特異的反応を低減し、より高感度に抗原を検出することが可能となる。なお、標識の方法は従来公知の方法で行なえばよい。

また本発明にかかるプリオンタンパク質の検出キットは、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかる抗体を含むことを特徴としている。

また本発明にかかるプリオンタンパク質の検出キットは、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかる抗体を用いてプリオンタンパク質を検出する工程を含むことを特徴としている。

また本発明にかかるプリオン病の診断キットは、上記本発明にかかる抗体を含むことを特徴としている。

また本発明にかかるプリオン病の診断方法は、上記本発明にかかる抗体を用いて、生体から調製された試料中の異常プリオンタンパク質を検出する工程を含むことを特徴としている。

本発明にかかる方法によれば、ファージディスプレイ法によって得られた一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）から、抗原結合部位を２つ有する組換えニワトリ型二価抗体を製造することができる。それゆえ、これまで作製に時間と技術を要していたハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマからニワトリ型抗体の遺伝子を取得する必要が無いため、組換えニワトリ型二価抗体を容易に作製することができるという効果を奏する。また上記方法によって得られた抗体は、抗原結合部位を２つ有する二価抗体であるため抗原との親和性が高く、またＦｃ領域を有しており検出用の２次抗体が結合する領域が多いために抗原を高感度で検出することができるという効果を奏する。

また本発明にかかる抗体は、組み換えニワトリ型二価抗体である。それゆえ、非特異的反応のない高感度抗原検出系の確立することが可能となる。さらには、当該高感度抗原検出系を用いた各種疾患の診断薬、診断方法を提供することができるという効果を奏する。

例えば、本発明にかかる方法により、プリオンタンパク質と結合するｓｃＦｖから組換えニワトリ型二価抗体を製造すれば、プリオンタンパク質の高感度検出系および高感度検出方法を確立することができる。さらに前記高感度検出系および高感度検出方法を用いて異常プリオンタンパク質を検出することによって、プリオン病（クロイツフェルト・ヤコブ病またはウシ海綿状脳症等）の診断を高感度に行なうことができる。

ｐｃＣＫＬ−３−１５の構築方法の概略を説明する図である。 ｐｃＣＫＨ−２の構築方法の概略を説明する図である。 ｐｃＣＫＨ−２の構築に用いたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す図である。 ｐｃＤＨＦ３−１５の構築方法の概略を説明する図である。 実施例２において、各抗体を用いて異常プリオンタンパク質（ＢＳＥ−ＵＫ１０ＰＫ）の検出を行なった結果を示す図であり、（ａ）は４４Ｂ１で検出を行なった結果を示し、（ｂ）はＴ２で検出を行なった結果を示し、（ｃ）は３−１５二価抗体を用いて検出した結果を示し、（ｄ）は３−１５一価抗体を用いて検出した結果を示す。 実施例３において、ＨＲＰ標識二次抗体を用いてＢＳＥの検出を行った結果を示す図であり、（ａ）はＨＲＰ標識Ａｂ３−１５を用いた直接法によるＢＳＥの検出結果を示し、（ｂ）はＨＲＰ標識Ｔ２を用いた直接法によるＢＳＥの検出結果を示す。

本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。

本発明の方法は、組換えニワトリ型二価抗体を製造する方法であって、ニワトリ型一本鎖可変領域断片をコードするポリヌクレオチドを鋳型として軽鎖可変領域遺伝子、および重鎖可変領域遺伝子を増幅する増幅工程；宿主細胞において機能する軽鎖リーダー配列、前記軽鎖可変領域遺伝子、およびニワトリ型抗体の軽鎖定常領域遺伝子を連結する軽鎖発現用遺伝子断片調製工程；宿主細胞において機能する重鎖リーダー配列、前記重鎖可変領域遺伝子、およびニワトリ型抗体の重鎖定常領域遺伝子を連結して重鎖発現用遺伝子断片調製工程；前記軽鎖発現用遺伝子断片および重鎖発現用遺伝子断片を宿主細胞に導入する工程；並びに前記宿主細胞を培養する工程；を含むことを特徴としている。

ここで「ニワトリ型二価抗体」とは、ニワトリ型抗体であって１分子あたり抗原結合部位を２つ有する抗体を意味する。換言すれば、抗原との結合価が２価の抗体を意味する。すなわち、それぞれ相同な２本の軽鎖（軽鎖可変領域および軽鎖定常領域）および２本の重鎖（重鎖可変領域および重鎖定常領域）とがジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）により結合した構造を有する抗体である。ただし完全長の抗体分子である必要は無く、２本の重鎖がＳ−Ｓ結合により結合することができる構造、すなわち少なくともＦ（ａｂ’）_２フラグメントを有する構造であればよい。他方、ファージディスプレイ法で得られる抗体（いわゆる「ファージディスプレイ抗体」）は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域がリンカーによってつながれ、２種類の可変領域が接近することよって、１つの抗原結合部位を形成している。したがって、ファージディスプレイ抗体は、１分子あたり１つの抗原結合部位を有する抗体である。ここで上記軽鎖と重鎖がリンカーによりつながったファージディスプレイ抗体は、一本鎖可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ＦＶ（ｓｃＦｖ））または、一本鎖抗体と呼ばれる場合がある。

なお本明細書において「ニワトリ型抗体」とは、ニワトリが有する免疫機能によって、抗原に対してニワトリが生産する抗体（ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＹ）のことである。そのうち特に抗原の特定部分だけを認識する単一の抗体のことを「ニワトリ型モノクローナル抗体」という。ただし、本発明においては「ニワトリ型抗体」とは、ニワトリ自身が生産する天然抗体と同様の構造を有する抗体であればよく、例えばニワトリ以外の宿主細胞にニワトリ型抗体をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換細胞によって生産される抗体、公知のファージディスプレイ法により生産される抗体をも含む意味である。また抗体の一部のアミノ酸が欠失・置換されたものであってよく、またアミノ酸が付加されたもの（構造改変ニワトリ型抗体）であってもよい。

以下に本発明の方法における各工程を説明する。

＜増幅工程＞
当該増幅工程は、ニワトリ型一本鎖可変領域断片をコードするポリヌクレオチドを鋳型として軽鎖可変領域遺伝子、および重鎖可変領域遺伝子を増幅する工程である。

「ニワトリ型一本鎖可変領域断片」とは、ニワトリ型抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域をリンカーでつないだ一本鎖可変領域断片のことを意味する。なお本明細書において、便宜上、一本鎖可変領域断片を「ｓｃＦｖ」と記載する。

上記鋳型となるｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド（以下「ｓｃＦｖポリヌクレオチド」という）は、例えば所望のｓｃＦｖを提示するファージからＤＮＡを回収することにより得られる。当該ｓｃＦｖポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド断片であっても、プラスミドであってもよく、またその配列情報から化学合成により取得したものであってもよい。

上記ｓｃＦｖポリヌクレオチドは、所望の抗原と結合する軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする領域を含んでいる。したがって軽鎖可変領域遺伝子（換言すれば「軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド」）および重鎖可変領域遺伝子（換言すれば「重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド」）は、当該ｓｃＦｖポリヌクレオチドを鋳型として、ＰＣＲ法およびその改変法等の公知のＤＮＡ増幅方法を実施すれば増幅することができる。

なお、上記増幅反応においては、軽鎖可変領域遺伝子および重鎖可変領域遺伝子を増幅するためのプライマーを適宜設計して用いる必要がある。当該プライマーはファージディスプレイ法を行なう際に、種々の軽鎖可変領域遺伝子および重鎖可変領域遺伝子を増幅するために用いた各プライマーの塩基配列情報をもとに設計することができる。

なお、ニワトリ型抗体においては、上記のように設計した各プライマー、すなわち軽鎖可変領域を増幅するために用いられるプライマー、および重鎖可変領域を増幅するために用いられるプライマーをそれぞれ１セットずつ作製しておけば、同一のファージライブラリーから選択したファージ由来のｓｃＦｖポリヌクレオチドの略すべてに対して使用することが可能である。すなわち、種々の抗原に対する抗体の軽鎖可変領域遺伝子または重鎖可変領域遺伝子を、各１セットのプライマーで略全て増幅することができる。

これは、ニワトリをはじめとする鳥類が持つ独特の抗体遺伝子の多様性獲得メカニズムによって成り立つ。すなわち、哺乳類動物の抗体遺伝子の多様性は、Ｖ領域に存在するＶ遺伝子群とＪ遺伝子群の中からそれぞれ１つのＶ遺伝子およびＪ遺伝子が再編成されることによって獲得している。したがって、ファージディスプレイ法を行なう際には、種々の軽鎖可変領域遺伝子および重鎖可変領域遺伝子を各１セットのプライマーだけでは増幅することができない。つまり種々の軽鎖可変領域遺伝子および重鎖可変領域遺伝子を増幅するためには、複数のプライマーセットを設計して増幅に用いなければならないということである。

一方、ニワトリを始めとする鳥類の抗体遺伝子の多様性は、Ｖ領域に存在する１つのＶ遺伝子および１つのＪ遺伝子が再編成され、さらにＶ遺伝子の一部が、多数存在する偽遺伝子と遺伝子変換することによって獲得している。したがって、鳥類のＶ領域をコードする遺伝子は、たった１つのＶ遺伝子およびＪ遺伝子組み合わせからなっている。よってそのＶ領域をコードする塩基配列の中に塩基配列が不変な領域にプライマーを設計すれば、略全ての軽鎖可変領域遺伝子および重鎖可変領域遺伝子を各１セットのプライマーによって増幅することができるということである。これは、本発明の大きな利点の一つである。

本発明の方法に適用可能な軽鎖可変領域遺伝子を増幅するためのプライマーとしては、例えば、ＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣ（配列番号１）の塩基配列を有する第１プライマー、およびＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴ（配列番号２）の塩基配列を有する第２プライマーが挙げられる。また本発明の方法に適用可能な重鎖可変領域遺伝子を増幅するためのプライマーとしては、例えば、ＣＴＧＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号７）の塩基配列を有する第７プライマー、およびＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴ（配列番号８）の塩基配列を有する第８プライマーが挙げられる。なお本発明に適用可能なプライマーは上記プライマーに限定されるものではなく、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するものであってもよく、さらにはこれらの相補的配列からなるプライマーであってもよい。

上記第１プライマー、第２プライマー、第７プライマーおよび第８プライマーは、以下の観点から設計した。ただしプライマーの設計方法はこれに限られるものではない。

ニワトリ型ファージディスプレイ抗体発現用プラスミドは、所望の抗原を免疫したニワトリの脾臓より抽出したｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、以下に示すプライマー（軽鎖可変領域増幅用プライマー（ＣＬＳＢ、ＣＬＦ）、重鎖可変領域増幅用プライマー（ＣＨＢ、ＣＨＳＦ））を用いて軽鎖可変領域遺伝子、および重鎖可変領域遺伝子を増幅し、プラスミドｐＰＤＳに挿入して作製される（詳細については「Ｙａｍａｎａｋａ．Ｈ．Ｉ．ｅｔ ａｌ Ｃｈｉｃｋｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１５７：１１５６−１１６２」参照のこと）。なお上記ＣＬＢＳＢの塩基配列はＴＣＴＧＡＣＧＧＴＣＧＣＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣ（配列番号１５）、ＣＬＦの塩基配列はＡＴＴＡＧＣＧＣＧＣＴＴＡＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴ（配列番号１６）、ＣＨＢの塩基配列はＣＴＧＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号１７）、ＣＨＳＦの塩基配列はＴＣＣＡＣＣＴＧＴＣＧＡＣＡＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴ（配列番号１８）である。

上記方法によって得られたニワトリ型ファージディスプレイ抗体は、当該抗体を構成する軽鎖可変領域遺伝子および重鎖可変領域遺伝子を上記プライマー（ＣＬＳＢ、ＣＬＦ、ＣＨＢ，ＣＨＳＦ）を用いて増幅しているため、常に上記プライマー（ＣＬＳＢ、ＣＬＦ、ＣＨＢ，ＣＨＳＦ）の塩基配列を有することとなる。したがって、上記プライマー（ＣＬＳＢ、ＣＬＦ）の塩基配列をもとに本発明において適用するプライマーを設計すれば、あらゆる抗原に対するニワトリ型抗体の軽鎖可変領域遺伝子を増幅することができ、上記プライマー（ＣＨＢ，ＣＨＳＦ）の塩基配列をもとに本発明において適用するプライマーを設計すれば、あらゆる抗原に対するニワトリ型抗体の軽鎖可変領域遺伝子を増幅することができる。

なお、上記第１プライマーはＣＬＳＢの一部の塩基配列をもとに設計しており、第２プライマーはＣＬＦの一部の塩基配列をもとに設計しており、第７プライマーはＣＨＢの塩基配列をそのまま用いており、第８プライマーはＣＨＳＦの一部の塩基配列をもとに設計している。第１プライマー、第２プライマー、第８プライマーについては、ベースとなるプライマーの一部の塩基配列に、ベースとなるプライマーには存在しない塩基配列を付加しているが、この塩基配列は、後に行なう軽鎖発現用遺伝子断片調製工程および重鎖発現用遺伝子断片調製工程において、軽鎖可変領域遺伝子とリーダー配列、または軽鎖可変領域遺伝子と軽鎖定常領域遺伝子とを連結する際に使用する塩基配列であり、連結する２つのヌクレオチド鎖内に相補的配列として存在する塩基配列である。

なお当該工程において実施するＰＣＲ法等の条件については、適宜検討の上、採用すればよい。

＜軽鎖発現用遺伝子断片調製工程＞
当該工程は、宿主細胞において機能する軽鎖リーダー配列、前記軽鎖可変領域遺伝子、およびニワトリ型抗体の軽鎖定常領域遺伝子を連結して軽鎖発現するために用いられる遺伝子断片を調製する工程である。

「リーダー配列」とは、分泌タンパク質のアミノ酸末端ドメインをコードするヌクレオチド鎖であり、細胞内で合成されたタンパク質が細胞外へ分泌する際の分泌シグナルをコードするヌクレオチド鎖である。なお上記「軽鎖リーダー配列」とは、宿主細胞内で合成された抗体の軽鎖の分泌シグナルをコードするヌクレオチド鎖のことを意味する。

本発明において使用するリーダー配列は、そのコードするポリペプチドが宿主において分泌シグナルとして機能するものであれば特に限定されるものではなく、従来公知のものを適宜選択の上、利用すればよい。軽鎖リーダー配列としては、例えば本発明者等が細胞融合法を用いて作製した抗ＰｒＰニワトリモノクローナル抗体（ＨＵＣ２−１３、詳細については特許文献２参照のこと）のリーダー配列、ｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＭｕｒｉｎｅ Ｉｇ ｋａｐｐａ−ｃｈａｉｎ Ｖ−Ｊ２−Ｃのリーダー配列等が利用可能である。軽鎖リーダー配列の取得方法は、特に限定されるものではなく、上記従来公知の塩基配列情報から、当該リーダー配列を化学合成により入手してもよいし、上記いずれかのモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法等により取得してもよい。

軽鎖リーダー配列をＰＣＲ法等により取得する際に使用するプライマーとしては、例えばＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴ（配列番号３）の塩基配列を有する第３プライマー、およびＧＧＣＴＧＡＧＴＣＡＧＣＧＣＴＧＣＣＴＧＣ（配列番号４）の塩基配列を有する第４プライマーが挙げられる。なお上記第３プライマーにはクローニングに用いる制限酵素サイト（ＨｉｎｄＩＩＩ）を付加するために塩基配列（ＡＡＧＣＴＴ）が含まれていてもよい。すなわちＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴ（配列番号１９）であってもよい。また上記第３プライマーには、リーダー配列とは無関係な塩基配列が、５’末端にさらに付加されているものであってもよい。例えば、配列番号１９に示される塩基配列からなる第３プライマーの５’末端に塩基配列（ＡＴＡＴＡＴ）が付加されたプライマー、すなわちＡＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴ（配列番号２０）の塩基配列からなるプライマーであってもよい。当該塩基配列（ＡＴＡＴＡＴ）は、ベクターへの導入の際に制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）によって軽鎖リーダー配列から切断される配列であり、その塩基の種類および塩基の組み合わせは特に限定されるものではない。

なお、第３プライマーにおいては、上記のごとくＨｉｎｄＩＩＩが付加されているが、本発明の方法においては、これに限定されるものではなく、導入するベクターのクローニングサイトの種類、軽鎖リーダー配列に含まれる制限酵素サイトの情報をもとに適宜選択の上、採用すればよい。

一方、「ニワトリ型抗体の軽鎖定常領域遺伝子」とは、ニワトリ型抗体の軽鎖定常領域をコードするポリヌクレオチドを意味する。ニワトリ型抗体の軽鎖定常領域は略全てのニワトリ型抗体に共通するものであり、従来公知のニワトリ型モノクローナル抗体の塩基配列情報から軽鎖定常領域の塩基配列情報を入手し、軽鎖定常領域遺伝子を化学合成等により取得すればよい。軽鎖定常領域の塩基配列情報としては、例えば本発明者等が細胞融合法を用いて作製したニワトリの抗体遺伝子軽鎖のｇｅｒｍｌｉｎｅの塩基配列情報（ｇｅｎｅ ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ２４４０３）が利用可能である。軽鎖定常領域遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、上記従来公知の塩基配列情報から当該を化学合成により入手してもよいし、上記いずれかのモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法等により取得してもよい。なお増幅する軽鎖定常領域は、重鎖とＳ−Ｓ結合をすることができる領域を有していれば足り、特に全長である必要は無い。

軽鎖定常領域遺伝子をＰＣＲ法等により取得する際に使用するプライマーとしては、例えばＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＣＧＧＣＣＡ（配列番号５）の塩基配列を有する第５プライマー、およびＴＴＡＧＣＡＣＴＣＧＧＡＣＣＴＣＴＴＣＡＧ（配列番号６）の塩基配列を有する第６プライマーが挙げられる。なお上記第６プライマーにはクローニングに用いる制限酵素サイト（ＸｂａＩ）を付加するために塩基配列（ＴＣＴＡＧＡ）が含まれていてもよい。すなわちＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＡＣＴＣＧＧＡＣＣＴＣＴＴＣＡＧ（配列番号２１）であってもよい。また上記配列番号２１に示される塩基配列からなる第６プライマーには、軽鎖定常領域遺伝子とは無関係な塩基配列が、５’末端に付加されているものであってもよい。例えば、第６プライマーの５’末端に塩基配列（ＴＣ）が付加されたプライマー、すなわちＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＡＣＴＣＧＧＡＣＣＴＣＴＴＣＡＧ（配列番号２２）の塩基配列からなるプライマーであってもよい。当該塩基配列（ＴＣ）は、ベクターへの導入の際に制限酵素（ＸｂａＩ）によって軽鎖定常領域遺伝子から切断される配列であり、その塩基の種類および塩基の組み合わせは特に限定されるものではない。

なお、第６プライマーにおいては、上記のごとくＸｂａＩが付加されているが、本発明の方法においては、これに限定されるものではなく、導入するベクターのクローニングサイトの種類、軽鎖定常領域遺伝子に含まれる制限酵素サイトの情報をもとに適宜選択の上、採用すればよい。

次に軽鎖リーダー配列、軽鎖可変領域遺伝子、および軽鎖定常領域遺伝子を連結して軽鎖発現用遺伝子断片を調製する方法について、上記第３および第４プライマーを用いて増幅した軽鎖リーダー配列、第５および第６プライマーを用いて増幅した軽鎖定常領域遺伝子、並びに第１および第２プライマーを用いて増幅した軽鎖可変領域遺伝子を例に挙げて説示する。なお本工程はこれに限定されるものではない。

本工程は例えば、上記第３および第４プライマーを用いて増幅した軽鎖リーダー配列、第５および第６プライマーを用いて増幅した軽鎖定常領域遺伝子、並びに第１および第２プライマーを用いて増幅した軽鎖可変領域遺伝子を鋳型として、第３プライマーおよび第６プライマーを用いてＰＣＲ法等の増幅反応を行なうことによって実施することができる。第１プライマーと第４プライマーとは相補の関係にあり、両プライマーを用いて増幅した増幅断片同士はその相補配列を介してアニーリングが起こりうる状態にあるといえる。すなわち軽鎖リーダー配列の３’末端と軽鎖可変領域の５’末端とをアニーリングにより連結することが可能であるといえる。また同様に第２プライマーと第５プライマーとは一部が相補の関係にあり、両プライマーを用いて増幅した増幅断片同士はその相補配列を介してアニーリングが起こりうる状態にあるといえる。すなわち軽鎖可変領域の３’末端と軽鎖定常領域の５’末端とをアニーリングにより連結することが可能であるといえる。

よって、第３および第４プライマーを用いて増幅した軽鎖リーダー配列、第５および第６プライマーを用いて増幅した軽鎖定常領域遺伝子、並びに第１および第２プライマーを用いて増幅した軽鎖可変領域遺伝子を混合してアニーリング反応を行なえば、上記それぞれが連結したポリヌクレオチド、すなわち軽鎖発現用遺伝子断片を調製することができる。さらに第３プライマーの塩基配列は当該軽鎖発現用遺伝子断片の５’末端に存在し、第６プライマーの塩基配列（相補配列）は当該軽鎖発現用遺伝子断片の３’末端に存在するため、両プライマーを用いて増幅反応を行なえば、当該軽鎖発現用遺伝子断片を大量に増幅することができる。

なお上記の要領で軽鎖発現用遺伝子断片が増幅しない場合は、第３および第４プライマーを用いて増幅した軽鎖リーダー配列、並びに第１および第２プライマーを用いて増幅した軽鎖可変領域遺伝子を鋳型として、第３プライマーおよび第２プライマーを用いてＰＣＲ法等の増幅反応を行なって軽鎖リーダー配列と軽鎖可変領域遺伝子を連結した後、当該軽鎖リーダー配列と軽鎖可変領域遺伝子を連結したポリヌクレオチドと、第５および第６プライマーを用いて増幅した軽鎖定常領域遺伝子とを鋳型として、さらに第３プライマーおよび第６プライマーを用いて増幅反応を行なえばよい。

また逆に第１および第２プライマーを用いて増幅した軽鎖可変領域遺伝子、並びに第５および第６プライマーを用いて増幅した軽鎖定常領域遺伝子を鋳型として、第１プライマーおよび第６プライマーを用いてＰＣＲ法等の増幅反応を行なって軽鎖可変領域遺伝子と軽鎖定常領域遺伝子を連結した後、さらに当該軽鎖可変領域遺伝子と軽鎖定常領域遺伝子を連結したポリヌクレオチドと、第３および第４プライマーを用いて増幅した軽鎖リーダー配列とを鋳型として、第３プライマーおよび第６プライマーを用いて増幅反応を行なってもよい。

なお当該工程において実施するＰＣＲ法等の条件については、適宜検討の上、採用すればよい。また軽鎖リーダー配列、軽鎖可変領域遺伝子、および軽鎖定常領域遺伝子の連結は、上記方法に限定されるものではなく、通常の遺伝子工学的手法を適宜選択して行なってもよい。また本工程に適用可能なプライマーは、目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）を増幅し得るものであれば、上記プライマーに限定されるものではなく、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するものであってもよく、さらにはこれらの相補的配列からなるプライマーであってもよい。

＜重鎖発現用遺伝子断片調製工程＞
当該工程は、宿主細胞において機能する重鎖リーダー配列、前記重鎖可変領域遺伝子、およびニワトリ型抗体の重鎖定常領域遺伝子を連結して重鎖発現するために用いられる遺伝子断片を調製する工程である。

「リーダー配列」とは、分泌タンパク質のアミノ酸末端ドメインをコードするヌクレオチド鎖であり、細胞内で合成されたタンパク質が細胞外へ分泌する際の分泌シグナルをコードするヌクレオチド鎖である。なお上記「重鎖リーダー配列」とは、宿主細胞内で合成された抗体の重鎖の分泌シグナルをコードするヌクレオチド鎖のことを意味する。

本発明において使用するリーダー配列は、そのコードするポリペプチドが宿主において分泌シグナルとして機能するものであれば特に限定されるものではなく、従来公知のものを適宜選択の上、利用すればよい。重鎖リーダー配列としては、例えば本発明者等が細胞融合法を用いて作製した抗ＰｒＰニワトリモノクローナル抗体（ＨＵＣ２−１３、詳細については特許文献２参照のこと）のリーダー配列が利用可能である。重鎖リーダー配列の取得方法は、特に限定されるものではなく、上記従来公知の塩基配列情報から、当該リーダー配列を化学合成により入手してもよいし、上記いずれかのモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法等により取得してもよい。

重鎖リーダー配列をＰＣＲ法等により取得する際に使用するプライマーとしては、例えばＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧＴＣＴＣＣ（配列番号９）の塩基配列を有する第９プライマー、およびＡＡＣＧＴＣＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＡＧ（配列番号１０）の塩基配列を有する第１０プライマーが挙げられる。なお上記第９プライマーにはクローニングに用いる制限酵素サイト（ＫｐｎＩ）を付加するために塩基配列（ＧＧＴＡＣＣ）が含まれていてもよい。すなわちＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧＴＣＴＣＣ（配列番号２３）であってもよい。また上記第９プライマーには、リーダー配列とは無関係な塩基配列含まれていてもよい。例えば、配列番号２３に示される塩基配列からなる第９プライマーの５’末端に塩基配列（ＴＴ）が付加されたプライマー、すなわちＴＴＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧＴＣＴＣＣ（配列番号２４）の塩基配列からなるプライマーであってもよい。当該塩基配列（ＴＴ）は、ベクターへの導入の際に制限酵素（ＫｐｎＩ）によって重鎖リーダー配列から切断される配列であり、その塩基の種類および塩基の組み合わせは特に限定されるものではない。

なお、第９プライマーにおいては、上記のごとくＫｐｎＩが付加されているが、本発明の方法においては、これに限定されるものではなく、導入するベクターのクローニングサイトの種類、重鎖リーダー配列に含まれる制限酵素サイトの情報をもとに適宜選択の上、採用すればよい。

一方、「ニワトリ型抗体の重鎖定常領域遺伝子」とは、ニワトリ型抗体の重鎖定常領域をコードするポリヌクレオチドを意味する。ニワトリ型抗体の重鎖定常領域は略全てのニワトリ型抗体に共通するものであり、従来公知のニワトリ型モノクローナル抗体の塩基配列情報から重鎖定常領域の塩基配列情報を入手し、重鎖定常領域遺伝子を化学合成等により取得すればよい。重鎖定常領域の塩基配列情報としては、例えば本発明者等が細胞融合法を用いて作製したニワトリの抗体遺伝子重鎖のｇｅｒｍｌｉｎｅの塩基配列情報（ｇｅｎｅ ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ３０３１９およびＸ０７１７４）が利用可能である。重鎖定常領域遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、上記従来公知の塩基配列情報から当該を化学合成により入手してもよいし、上記いずれかのモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法等により取得してもよい。なお増幅する重鎖定常領域遺伝子は、塩基サイズが大きいために全長を増幅することが困難である。したがって、特に全長を増幅する必要は無い。

重鎖定常領域遺伝子（一部）をＰＣＲ法等により取得する際に使用するプライマーとしては、例えばＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣ（配列番号１１）の塩基配列を有する第１１プライマー、およびＣＡＡＡＣＡＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣ（配列番号１２）の塩基配列を有する第１２プライマーが挙げられる。なお上記第１１および第１２プライマーを用いて増幅される重鎖定常領域遺伝子（一部）には、ベクターへの導入に利用可能なＨｉｎｄＩＩＩサイトが含まれている。当該第１１および第１２プライマーは、これらのプライマーによって得られる重鎖定常領域遺伝子（一部）にＨｉｎｄＩＩＩサイトが含まれるように設計されているものである。したがって、増幅によって得られる重鎖定常領域遺伝子が当該ＨｉｎｄＩＩＩを含むようにプライマーが設計されていれば、上記配列番号１１および１２の塩基配列を有するプライマーに限定されない。ただし、上記ＨｉｎｄＩＩＩサイトの末端から少なくとも６ｂｐ以上塩基が付加されるようにプライマーを設計することが好ましい。なお、増幅によって得られる重鎖定常領域遺伝子に含まれる制限酵素サイトは、当該ＨｉｎｄＩＩＩに限定されるものではなく、導入するベクターのクローニングサイトの種類、重鎖定常領域遺伝子に含まれるその他の制限酵素サイトの情報をもとに適宜選択すればよい。

次に重鎖リーダー配列、重鎖可変領域遺伝子、および重鎖定常領域遺伝子を連結して重鎖発現用遺伝子断片を調製する方法について、上記第９および第１０プライマーを用いて増幅した重鎖リーダー配列、第７および第８プライマーを用いて増幅した重鎖定常領域遺伝子、並びに第１１および第１２プライマーを用いて増幅した重鎖可変領域遺伝子を例に挙げて説示する。なお本工程はこれに限定されるものではない。

本工程は例えば、上記第９および第１０プライマーを用いて増幅した重鎖リーダー配列、第１１および第１２プライマーを用いて増幅した重鎖定常領域遺伝子、並びに第７および第８プライマーを用いて増幅した重鎖可変領域遺伝子を鋳型として、第９プライマーおよび第１２プライマーを用いてＰＣＲ法等の増幅反応を行なうことによって実施することができる。第１０プライマーと第７プライマーとは相補の関係にあり、両プライマーを用いて増幅した増幅断片同士はその相補配列を介してアニーリングが起こりうる状態にあるといえる。すなわち重鎖リーダー配列の３’末端と重鎖可変領域遺伝子の５’末端とをアニーリングにより連結することが可能であるといえる。また同様に第８プライマーと第１１プライマーとは相補の関係にあり、両プライマーを用いて増幅した増幅断片同士はその相補配列を介してアニーリングが起こりうる状態にあるといえる。すなわち重鎖可変領域の３’末端と重鎖定常領域の５’末端とをアニーリングにより連結することが可能であるといえる。

よって、第９および第１０プライマーを用いて増幅した重鎖リーダー配列、第１１および第１２プライマーを用いて増幅した重鎖定常領域遺伝子、並びに第７および第８プライマーを用いて増幅した重鎖可変領域遺伝子を混合してアニーリング反応を行なえば、上記それぞれが連結したポリヌクレオチド、すなわち重鎖発現用遺伝子断片を調製することができる。さらに第９プライマーの塩基配列は当該重鎖発現用遺伝子断片の５’末端に存在し、第１２プライマーの塩基配列（相補配列）は当該重鎖発現用遺伝子断片の３’末端に存在するため、両プライマーを用いて増幅反応を行なえば、当該重鎖発現用遺伝子断片を大量に増幅することができる。

なお上記の要領で重鎖発現用遺伝子断片が増幅しない場合は、第９および第１０プライマーを用いて増幅した重鎖リーダー配列、並びに第７および第８プライマーを用いて増幅した重鎖可変領域遺伝子を鋳型として、第９プライマーおよび第８プライマーを用いてＰＣＲ法等の増幅反応を行なって重鎖リーダー配列と重鎖可変領域遺伝子を連結した後、当該重鎖リーダー配列と重鎖可変領域遺伝子を連結したポリヌクレオチドと、第１１および第１２プライマーを用いて増幅した重鎖定常領域遺伝子とを鋳型として、さらに第９プライマーおよび第１２プライマーを用いて増幅反応を行なえばよい。

また逆に第７および第８プライマーを用いて増幅した重鎖可変領域遺伝子、並びに第１１および第１２プライマーを用いて増幅した重鎖定常領域遺伝子を鋳型として、第７プライマーおよび第１２プライマーを用いてＰＣＲ法等の増幅反応を行なって重鎖可変領域遺伝子と重鎖定常領域遺伝子を連結した後、さらに当該重鎖可変領域遺伝子と重鎖定常領域遺伝子を連結したポリヌクレオチドと、第９および第１０プライマーを用いて増幅した重鎖リーダー配列とを鋳型として、第９プライマーおよび第１２プライマーを用いて増幅反応を行なってもよい。

なお既述のとおり第１１および第１２プライマーを用いて増幅した重鎖可変領域遺伝子は、重鎖可変領域遺伝子の一部である。よって、当該重鎖定常領域遺伝子（一部）、第９および第１０プライマーを用いて増幅した重鎖リーダー配列、並びに第７および第８プライマーを連結した重鎖発現用遺伝子断片は、ニワトリ型抗体の重鎖の一部をコードするものであり、全長をコードするものではない。当該ニワトリ型抗体の重鎖の一部をコードする重鎖発現用遺伝子断片を全長をコードするものにする場合は、全長の重鎖定常領域遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ消化断片と、上記重鎖発現用遺伝子断片のＨｉｎｄＩＩＩ消化断片とをライゲーションすればよい。その結果、ニワトリ型抗体の重鎖の全長をコードする重鎖発現用遺伝子断片を取得することができる。

なお当該工程において実施するＰＣＲ法等の条件については、適宜検討の上、採用すればよい。また重鎖リーダー配列、重鎖可変領域遺伝子、および重鎖定常領域遺伝子の連結は、上記方法に限定されるものではなく、通常の遺伝子工学的手法を適宜選択して行なってもよい。また本発明に適用可能なプライマーは目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）を増幅し得るものであれば、上記プライマーに限定されるものではなく、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するものであってもよく、さらにはこれらの相補的配列からなるプライマーであってもよい。

＜形質転換工程＞
本発明にかかる方法には、上述の工程で取得した軽鎖発現用遺伝子断片および重鎖発現用遺伝子断片を宿主細胞に導入して形質転換体を取得する工程（形質転換工程）が含まれていることが好ましい。

（軽鎖発現用ベクターおよび重鎖発現用ベクターの構築）
以下に、軽鎖発現用遺伝子断片および重鎖発現用遺伝子断片を宿主細胞に導入し、該細胞内で軽鎖および重鎖を発現させるためのベクター（以下「軽鎖発現用ベクター」および「重鎖発現用ベクター」と称する）、およびそれらの構築方法について説明する。

軽鎖発現用ベクターまたは重鎖発現用ベクターは、ニワトリ型モノクローナル抗体の軽鎖または重鎖を宿主細胞内で発現させることができるものであれば特にその構成等は限定されるものではなく、環状ベクターであってもよいし、リニア形状であってもよい。したがって基本的には取得した軽鎖発現用遺伝子断片または重鎖発現用遺伝子断片をプロモーターの下流に制御可能に連結して構築すればよい。使用するプロモーターの種類も特に限定されるものではなく、宿主細胞内において機能するものであればよい。例えば、動物由来細胞用としては、ＳＶ４０やウシ・パピローマ・ウイルス（ＢＰＶ）プロモーターやヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）等が挙げられる。またその他上記軽鎖発現用ベクターまたは重鎖発現用ベクターには、プロモーター以外の種々のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。ＤＮＡセグメントとしては、例えば遺伝子導入のマーカーとなる薬剤耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子等）、ターミネーター、精製用タグ（ヒスチジンタグ等）を付加する配列を挙げることができる。また導入する宿主細胞に好適な市販ベクターを用いてもよい。後述する実施例においては、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ａ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、およびｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ａ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をベースとして用い、軽鎖発現用ベクター、および重鎖発現用ベクターを構築している。そのほかｐＥＦ１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が公知のベクターとして利用可能である。

各発現用ベクターの構築方法は、特に限定されるのではなく、必要な遺伝子配列を通常の遺伝子工学的手法を用いて連結すればよい。またＰＣＲによって取得した軽鎖発現用遺伝子断片または重鎖発現用遺伝子断片をサブクローニングすることなく上記各発現用ベクターを構築してもよいし、サブクローニング用ベクター、例えばｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩを用いて大腸菌等にサブクローニングを行なった後に上記各発現用ベクターを構築してもよい。

（軽鎖発現用ベクターおよび重鎖発現用ベクターの宿主細胞の形質転換）
上記軽鎖発現用ベクターおよび重鎖発現用ベクターを用いて、宿主細胞の形質転換を行なう。なお抗体分子は軽鎖および重鎖がＳ−Ｓ結合によって形成される複合体（軽鎖―重鎖複合体）が２分子結合した２量体である。したがって宿主細胞には、軽鎖発現用遺伝子断片および重鎖発現用遺伝子断片の両者を導入する必要がある。

なお形質転換される宿主細胞については、特に限定されるものではなく、上記で構築した各発現用ベクターに応じた宿主を選択して用いればよい。すなわち宿主細胞は、動物由来細胞であっても、植物由来細胞であってもよい。また動物由来細胞、植物由来細胞とは、細胞、組織、並びに器官も含む意味である。特にニワトリ型モノクローナル抗体の大量生産を目的としている本発明においては、免疫システムを有する動物由来の細胞であることが好ましく、液体培地等で培養可能な細胞（培養細胞）が好ましい。動物由来培養細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｈｅｌａ細胞、メラノーマ細胞、マウス３Ｔ３細胞等が挙げられ、植物由来培養細胞の例としては、タバコＢＹ２細胞等が挙げられる。後述する実施例においては、宿主細胞にＣＨＯ細胞を用いている。これは、当該細胞は浮遊培養が可能であること、世代時間が１２時間と短く、増殖能力が高いために抗体の大量生産に好適であるという理由による。

一方、形質転換方法についても特に限定されるものではなく、宿主細胞および発現用ベクターに好適な方法を選択して用いればよい。例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法、プロトプラスト／スフェロプラスト法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また特に植物由来細胞への一般的な形質転換法としては、アグロバクテリウムを用いた形質転換法（アグロバクテリウム法）を挙げることができる。ただし軽鎖発現用遺伝子断片および重鎖発現用遺伝子断片が、宿主細胞のゲノムに組み込まれることが好ましい。抗体遺伝子がゲノムに組み込まれることにより、細胞分裂後の娘細胞にもベクターの構成に含まれる遺伝子を確実に伝達することが可能となり、ニワトリ型抗体の生産効率を維持することが可能となるからである。

また軽鎖発現用遺伝子断片および重鎖発現用遺伝子断片が宿主細胞に導入されたか否かを確認する方法は、特に限定されるものではなく、公知の各種の方法を用いることができる。具体的には、各種マーカーを用いればよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと組み換え植物ウイルス遺伝子とを含むプラスミド等を発現用ベクターとして宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。例えば後述する実施例においては、ＣＨＯ細胞を形質転換しており、薬剤耐性マーカー（ネオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換しており、ネオマイシンおよびゼオシンを含有する培地中で、形質転換候補細胞株を培養することにより、生育してきた細胞株を形質転換体として選抜することが可能となる。その他のマーカーとしては、ピューロマイシン耐性マーカー、ブレオマイシン耐性マーカー、ＸＧＰＲＴ遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子等が動物細胞の選抜には有効であり、ビアラホス耐性マーカー、カナマイシン耐性マーカー等が植物細胞の選抜に有効である。その他、宿主細胞から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、導入したタンパク質（転写因子）の遺伝子全長を特異的に増幅するいわゆるジェノミックＰＣＲ法を挙げることができる。この方法によって、目的タンパク質（転写因子）をコードする遺伝子が増幅されてくることを電気泳動法等によって確認できれば、該遺伝子の導入を確認することができる。

＜形質転換体の培養工程（組換えニワトリ型二価抗体の生産）＞
本発明かかる方法は、さらに上記形質転換体を培養して組換えニワトリ型二価抗体を生産する工程が含まれていることが好ましい。

次に上記で取得した形質転換体を用いて組換えニワトリ型二価抗体の生産を行なう工程について説示する。より具体的には、上記形質転換体を培養し、その培養物から目的の組換えニワトリ型二価抗体を精製すればよい。ここで形質転換体の培養方法および培養条件等は、該形質転換体の培養に好適な方法を用いればよく、特に限定されるものではない。例えば動物細胞を培養する場合は、浮遊培養法、担体付着培養法、ホローファイバー培養法等が好適である。特に浮遊培養法は、適応できる細胞がリンパ系の細胞等に限られるが、ジャーファーメンターを利用することができ、スケールアップが容易であるために、より好ましいといえる。後述する実施例において採用した形質転換ＣＨＯ細胞は、既に述べた通り、浮遊培養が可能な細胞である。また動物細胞を培養する際の培地としては、限定されるわけではないが、アミノ酸、ビタミン類、ブドウ糖、塩類に、血清が加えられている場合がある。その他、緩衝液として重炭酸／炭酸ガス系緩衝液が用いられており、培養器として、ＣＯ_２インキュベーターが利用可能である。またｐＨのモニター用にフェノールレッドを添加する場合がある。培養条件は、一般的には３７℃で培養するが、細胞株によっては、２８℃、４０℃の場合がある。なお後述する実施例においては、形質転換ＣＨＯ細胞の培養には、１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＦ１２ｍｅｄｉａ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で３日間培養を行なっている。

一方、植物細胞を培養する際の培地としては、限定されるものではないが、無機塩類、炭素源、ビタミン類、アミノ酸が加えられている場合がある。さらに、ココナツミルクや酵母エキスを加えて成長を促進させる場合がある。その他、オーキシンとサイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン等の植物ホルモンを添加する場合がある。また培養条件であるが、光、温度、通気の有無等を培養する細胞に応じて最適なものを採用すればよい。

次に目的の組換えニワトリ型二価抗体の調製方法および精製方法について説明する。軽鎖発現用遺伝子断片および重鎖発現用遺伝子断片が導入された形質転換体は、細胞内で目的の組換えニワトリ型二価抗体の軽鎖および重鎖を生産する。生産された軽鎖および重鎖は細胞内でＳ−Ｓ結合により軽鎖−重鎖複合体を形成し、さらに軽鎖−重鎖複合体の２量体が形成されることによって抗体分子となる。このとき生産された抗体分子は、培養液に分泌されるか、または細胞内に蓄積する。なお生産された抗体分子が分泌されるか細胞内に蓄積するかは形質転換体細胞の種類や培養方法等によって決まる。前者のごとく生産された組換えニワトリ型二価抗体が培養液中に分泌される場合には、培養液上清を遠心分離やろ過等によって調製し、組換えニワトリ型二価抗体とすればよい。一方、細胞内に組換えニワトリ型二価抗体が蓄積する場合には、細胞をガラスビーズ等を用いた公知の細胞破砕方法により細胞を破砕し、該細胞破砕物より組換えニワトリ型二価抗体を取得すればよい。

なお必要に応じて上記方法によって取得した組換えニワトリ型二価抗体を、アフィニティークロマトグラフィーや精製用のレジンを用いる方法によって精製を行なってもよい。上記精製を行なうことによって、プロテアーゼや抗原抗体反応を阻害する夾雑物を除去することができ、取得した組換えニワトリ型二価抗体を高感度微量抗原検出系により好適に用いることができる。後述する実施例においては、生産される組換えニワトリ型二価抗体重鎖のＣ末端にヒスチジンタグが付加されるように設計してある。ヒスチジンはニッケルに吸着する性質を有するため、ニッケルカラムを用いることによって目的の組換えニワトリ型二価抗体を簡単に精製することができる。

＜本発明にかかる組換えニワトリ型二価抗体＞
本発明にかかる抗体（組換えニワトリ型二価抗体）は、上記本発明にかかる方法により取得された組換えニワトリ型二価抗体である。当該抗体としては、例えば抗ＰｒＰファージディスプレイ抗体３−１５（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｈｉｃｋｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐａｎｅｌ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６６ ８０７−８１４参照）をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、上記説示した本発明の方法により取得した抗体（以下「３−１５二価抗体」という）が挙げられる。なお３−１５二価抗体の取得方法の詳細については実施例において説示する。

３−１５二価抗体は、（ａ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなる軽鎖、および（ｃ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列；または（ｄ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなる重鎖を備え、プリオンタンパク質と結合する活性を有することを特徴とする抗体である。

上記「１個もしくはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。

なお配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号２７に示した。配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号２８に示した。なお上記３−１５二価抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドおよび重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２７、２８の限定されるものではなく、各塩基はコドン表に従って適宜変更可能である。

かかる３−１５二価抗体は、抗ＰｒＰファージディスプレイ抗体３−１５（以下「３−１５一価抗体」を鋳型として作製した二価抗体であり、ＰｒＰに対する結合活性を有している。後述する実施例において示すように、３−１５二価抗体は、３−１５一価抗体に比してはるかに高いＰｒＰ結合能を有していた。また現在ＢＳＥの確定検査で用いられているＰｒＰ抗体〔４４Ｂ１（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２０（２００４）ｐ４０−５１参照）およびＴ２〕と同等のＰｒＰ結合能を有していた。さらに４４Ｂ１に比して検出のバックグラウンドが低く、より高感度にＰｒＰを検出することができるということがわかった。

＜３−１５二価抗体の利用＞
上記３−１５二価抗体は試料中のＰｒＰを高感度で検出することができる。また３−１５二価抗体を用いて異常ＰｒＰを検出することによって、プリオン病の診断を行なうことができる。ここで「プリオン病」とは、ＰｒＰ（特に異常ＰｒＰ）が原因で発症する病気の総称のことであり、クロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、ヒツジやヤギで発病するスクレイピー、Ｇｒｅｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅ症候群（ＧＳＳ）、クルー病等が知られている。なおＰｒＰの検出方法は特に限定されるものではなく、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、ＲＩＡ法等の公知の方法を採用すればよい。また上記方法における条件は標準の条件で行なえばよく、また検出に用いられる抗体の量についても適宜最適な条件等を選択の上、採用すればよい。

ウエスタンブロット法によるＰｒＰの検出方法、およびプリオン病の診断を行なう方法としては以下の方法が挙げられる。ＰｒＰ（正常型ＰｒＰおよび異常型ＰｒＰ）を検出する場合は、生体から取得した試料（例えば脳破砕液、脳脊髄破砕液、脊髄液等）をプロテイナーゼＫで処理せずにポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する。プリオン病を診断する（異常型ＰｒＰを検出する）場合は、生体から取得した試料（例えば脳破砕液、脳脊髄破砕液、脊髄液等）をプロテイナーゼＫで処理した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する。その後ウエスタンブロッティング法にてプリオンタンパク質を検出すればよい。なお異常ＰｒＰはプロテイナーゼＫ耐性を有しており、上記の通りプロテイナーゼＫで処理した試料について、３−１５二価抗体を用いて検出を行なえば試料中に異常ＰｒＰが含まれているか否か、すなわちプリオン病であるか否かを診断することができる。

上記方法が適用可能な試料としては、ＰｒＰを発現する生物由来細胞であれば特に限定されるものではなく、例えばヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ由来細胞等が挙げられる。また試料は細胞抽出液の状態であることが好ましい。

一方、上記３−１５二価抗体は、ＰｒＰ検出キット、またはプリオン病診断キットに利用可能である。上記ＰｒＰ検出キットまたはプリオン病診断キットには、少なくとも３−１５二価抗体が含まれていればＰｒＰ、または異常ＰｒＰを検出することができるが、その他の構成が含まれていてもよい。その他の構成としては、例えばプロテイナーゼＫ、電気泳動用ゲル、電気泳動用試薬、ウエスタンブロッティング用試薬、正常ＰｒＰ、異常ＰｒＰ等を挙げることができる。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

（実施例１：３−１５二価抗体の製造）
本発明の一例としてヒトプリオンタンパク質（ＰｒＰ）に対する組換えニワトリ型二価抗体の生産を行なった。

〔軽鎖発現用遺伝子断片の構築〕
軽鎖可変領域遺伝子の調製は、抗ＰｒＰファージ抗体３−１５の発現用プラスミドｐｈＡｂ３−１５（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｈｉｃｋｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐａｎｅｌ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６６ ８０７−８１４参照）を鋳型として、第１プライマー（配列番号１）、第２プライマー（配列番号２）を用いてＰＣＲ法により行なった。

また軽鎖定常領域遺伝子の調製は、組換え抗ＰｒＰニワトリ型抗体の軽鎖発現用プラスミド（ｐｃＣＫＬ−１、その構築方法については特許文献２（特願２００４−３２５６５８号（２００４年１１月９日出願））明細書および図面参照）を鋳型として、第５プライマー（配列番号５）、第６プライマー（配列番号２２）を用いてＰＣＲ法により行なった。

また軽鎖リーダー配列の調製は、発明者らが構築した組換え抗ＰｒＰニワトリ型抗体発現用プラスミド（ｐｃＣＫＬ−４、上記ｐｃＣＫＬ−１のＶ領域がニワトリモノクローナル抗体のＨＵＮＮ−１に変換されたもの。ＨＵＮＮ−１については『Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｈｉｃｋｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐａｎｅｌ ａｇｉｎｓｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６６ ８０７−８１４』参照のこと。）を鋳型として、第３プライマー（配列番号２０）、第４プライマー（配列番号４）を用いてＰＣＲ法により行なった。

ＰＣＲは以下の条件にて行なった。ＰＣＲ反応液の組成は、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）５μｌ；２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μｌ；２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ３．２μｌ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１．６ｍＭ）；プライマー（１０μＭ）各２．５μｌ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．０．５μＭ）；鋳型ＤＮＡ１μｌ；ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡株式会社製）１μｌであり、最終的に蒸留水で５０μｌにメスアップした。また反応は、（１）９４℃で２分間；（２）９４℃で１５秒間；（３）５５℃で３０秒間；（４）６８℃で２分間の条件で、（１）の後、（２）〜（４）を３０サイクル行なった。

上記で取得した軽鎖可変領域遺伝子、軽鎖定常領域遺伝子、および軽鎖リーダー配列を鋳型として、第３プライマー（配列番号２０）および第６プライマー（配列番号２２）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲの条件は、鋳型ＤＮＡとして上記軽鎖可変領域遺伝子、軽鎖定常領域遺伝子、および軽鎖リーダー配列を反応液５０μｌあたり０．５μｌずつ添加した以外は、上記（１）〜（４）の方法に準じた。

上記ＰＣＲによって得られた増幅断片（約７００ｂｐ）を、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩで切断し、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ａ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩサイトに挿入してｐｃＣＫＬ−３−１５を構築した。なお当該ｐｃＣＫＬ−３−１５についてはシークエンスにより変異が入っていないことを確認した。またｐｃＣＫＬ−３−１５は、ネオマイシン耐性遺伝子，ＣＭＶ（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ヒトメガロウイルス）プロモーター，ＢＧＨ（ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ：ウシ成長ホルモン）ポリＡシグナルを有する。なお上記制限酵素消化は、１０×Ｍ ｂｕｆｆｅｒ３μｌ、ＤＮＡ１０μｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１μｌ、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１μｌ、Ｈ_２Ｏ１５μｌの反応液組成で、３７℃・６時間反応を行なった。

上記方法の概略を図１に示した。

〔重鎖発現用遺伝子断片の構築〕
（１．ｐｃＣＫＨ−２の構築）
ｐｃＣＫＨ−２の構築方法の概略を図２（ａ）に示した。ｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ａ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＨｉｎｄＩＩＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑末端化を行ない、さらにセルフライゲーションにより、オリジナルに存在するＨｉｎｄＩＩＩサイトを欠失させた。発明者らが構築した組換え抗ＰｒＰニワトリ型抗体の重鎖発現用プラスミド（ｐｃＣＫＨ−１、その構築方法については特許文献２（特願２００４−３２５６５８号（２００４年１１月９日出願））明細書および図面参照）をＫｐｎＩおよびＰｉｎＡＩ消化して得られた抗ＰｒＰニワトリ型抗体遺伝子断片を、上記プラスミドのＫｐｎＩおよびＰｉｎＡサイトに挿入した。図２（ｂ）に示すオリゴヌクレオチド（配列番号２５、２６）を合成し、上記プラスミドのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入してｐｃＣＫＨ−２を構築した。

（２．重鎖リーダー配列、重鎖可変領域遺伝子、重鎖定常領域遺伝子の増幅、および重鎖発現用プラスミドｐｃＤＨＦ３−１５の構築）
ｐｃＤＨＦ３−１５の構築方法の概略を図３に示した。

重鎖可変領域遺伝子の調製は、抗ＰｒＰファージ抗体３−１５の発現用プラスミドｐｈＡｂ３−１５（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｈｉｃｋｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐａｎｅｌ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６６ ８０７−８１４参照）を鋳型として、第７プライマー（配列番号７）、第８プライマー（配列番号８）を用いてＰＣＲ法により行なった。

また重鎖定常領域遺伝子（一部）の調製は、本発明者らが構築した組換え抗ＰｒＰニワトリ型抗体の重鎖発現用プラスミド（ｐｃＣＫＨ−１、その構築方法については特許文献２（特願２００４−３２５６５８号（２００４年１１月９日出願））明細書および図面参照）を鋳型として、第１１プライマー（配列番号１１）、第１２プライマー（配列番号１２）を用いてＰＣＲ法により行なった。

また軽鎖リーダー配列の調製は、ｐｃＣＫＨ−１を鋳型として、第９プライマー（配列番号２４）、第１０プライマー（配列番号１０）を用いてＰＣＲ法により行なった。

ＰＣＲは以下の条件にて行なった。ＰＣＲ反応液の組成は、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）５μｌ；２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μｌ；２５ｍＭ ＭｇＳＯ_４ ３．２μｌ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１．６ｍＭ）；プライマー（１０μＭ）各２．５μｌ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．０．５μＭ）；鋳型ＤＮＡ１μｌ；ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡株式会社製）１μｌであり、最終的に蒸留水で５０μｌにメスアップした。また反応は、（１）９４℃で２分間；（２）９４℃で１５秒間；（３）５５℃で３０秒間；（４）６８℃で２分間の条件で、（１）の後、（２）〜（４）を３０サイクル行なった。

上記で取得した重鎖可変領域遺伝子、重鎖定常領域遺伝子、および重鎖リーダー配列を鋳型として、第９プライマー（配列番号２４）および第１２プライマー（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液の組成は、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）５μｌ；２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μｌ；２５ｍＭ ＭｇＳＯ_４ ２μｌ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１ｍＭ）；プライマー（１０μＭ）各１．５μｌ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．０．３μＭ）；鋳型ＤＮＡ各０．５μｌ；ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡株式会社製）１μｌであり、最終的に蒸留水で５０μｌにメスアップした。また反応は、（１）９４℃で２分間；（２）９４℃で１５秒間；（３）５５℃で３０秒間；（４）６８℃で２分間の条件で、（１）の後、（２）〜（４）を３０サイクル行なった。

上記ＰＣＲによって得られた増幅断片（約８００ｂｐ）を、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上記ｐｃＣＫＨ−２のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入してｐｃＤＨＦ３−１５を構築した。なお当該ｐｃＤＨＦ３−１５についてはシークエンスにより変異が入っていないことを確認した。またｐｃＤＨＦ３−１５は、ゼオシン耐性遺伝子，ＣＭＶ（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ヒトメガロウイルス）プロモーター，ＢＧＨ（ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ：ウシ成長ホルモン）ポリＡシグナルを有する。

〔ＣＨＯ細胞の形質転換〕
約２×１０^５のＣＨＯ細胞（（財）ヒューマンサイエンス振興財団）に、ｐｃＣＫＬ−３−１５およびｐｃＤＨＦ３−１５（各２．５μｇ）をＰｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの方法については、操作マニュアルにしたがって行なった。

トランスフェクション開始から４８時間後、４００μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ社）と２００μｇ／ｍｌ Ｚｅｏｃｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて上記薬剤耐性細胞をセレクトした。さらに上記薬剤耐性細胞を、１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＦ１２ｍｅｄｉａ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で３日間培養を行なった。当該培養にて得られた培養液上清について、後述するＥＬＩＳＡ法によって最終的にＰｒＰに対して特異性の高いクローンを選択した。

ＥＬＩＳＡ法は、以下のようにして行なった。各クローンを培養し、細胞数約１×１０^６／Ｐｌａｔｅにそろえ、３日間培養した。当該培養液上清について、抗原に対する反応性をＥＬＩＳＡ法によって調べた。ＥＬＩＳＡプレートに抗原リコンビナントマウスプリオンタンパク質（発明者らが調製したもの）を４℃、一晩の条件で固相化した。２５％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（雪印乳業社製）入りＰＢＳで、３７℃、１時間でブロッキングを行なった。洗浄後、各細胞培養液上清を加えて３７℃、１時間インキュベートした。さらに洗浄後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｋｉｒｅｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を加え、３７℃、１時間インキュベートした。洗浄後、ｏ−フェニレンジアミンを用いて発色し、４９０ｎｍの吸収を測定した。当該吸光度の高かったクローンを選抜した。

（実施例２：３−１５二価抗体による異常ＰｒＰの検出）
〔方法〕
（１．サンプル溶液の調製）
異常ＰｒＰサンプルとして、英国より輸入したＢＳＥウシの脳（ＢＳＥ−ＵＫ１０）から延髄部分を採取し、これをガラスビーズで破砕後、プロテイナーゼＫで処理したものを用いた。異常ＰｒＰサンプルにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを加えて、サンプル溶液を調製した。当該サンプル溶液を６分間煮沸し、１２％ゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。

より詳細には、以下のようにしてサンプル溶液を調製した。
英国より輸入したＢＳＥウシの脳（ＢＳＥ−ＵＫ１０）から蒸留水を用いて調製された５０％（ｗ／ｖ）ＢＳＥウシ脳乳剤（入手先：農業技術研究機構動物衛生研究所 プリオン病センター）に、ＴＮ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．６））を加えて２０％（ｗ／ｖ）ＢＳＥウシ脳乳剤とした。

この２０％（ｗ／ｖ）ＢＳＥウシ脳乳剤２５０μｌに、２０％（ｗ／ｖ）正常ウシ脳乳剤２５０μｌを加え、終濃度１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＥウシ脳乳剤５００μｌを調製した。なお、上記２０％（ｗ／ｖ）正常ウシ脳乳剤は、プラテリアＢＳＥ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて陰性が確認された正常ウシ（０２−Ｂ−２３０、日本国におけるＢＳＥサーベイランス（ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）試料）の脳組織２００ｍｇにＴＮ Ｂｕｆｆｅｒを８００μｌ加え、安井器械株式会社製マルチビーズショッカー（４０００ｒｐｍ、６０秒間）を用いて調製されたものである。

上記１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＥウシ脳乳剤に、４０ｍｇ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ６．２５ｍｌと、１０ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ ２ｍｌとを加えて混合し、３７℃で３０分間消化した。

その後、上記反応液へ２−Ｂｕｔａｎｏｌを２５μｌ加えて混合し、２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ １ｍｌ加えて混合し、３７℃で３０分間消化した。

さらに上記反応液へ、０．４Ｍ Ｐｅｆａｂｌｏｃ（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）２．５ｍｌを加えて混合し、プロテイナーゼＫの反応を停止させた。

上記反応液へＢｕｔａｎｏｌ−Ｍｅｔｈａｎｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２５０ｍｌ加えて混合し、１５０００ｒｐｍ、１０分間、２０℃で遠心分離を行なって、沈殿を回収した。

沈殿を常温で乾燥させた後、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー１００μｌを加え、１００℃で６分間煮沸してサンプル溶液とした。

（２．ウエスタンブロッティング）
ウエスタンプレキャストゲル（ＮｕＰＡＧＥ １２％ Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＧｅｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて、２００Ｖの定電圧で４０分間の電気泳動を行なった。

電気泳動終了後、ウエットタイプブロッターを用い、９０ｖの定電圧で４０分間、ポリビニル膜（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製））へ転写した。転写後、５％スキムミルク（Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（雪印乳業社製））および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでブロッキングを行なった。上記メンブレンを洗浄後、３−１５二価抗体を一次抗体として用い、異常ＰｒＰ（ＢＳＥ−ＵＫ１０ＰＫ）の検出を行なった。なお比較として、３−１５一価抗体、現在ＢＳＥの確定検査に用いられている４４Ｂ１（北海道大学大学院獣医学研究科 プリオン病学講座 堀内氏より入手）およびＴ２（動物衛生研究所より入手）を用いて検出した。各抗体をメンブレンあたり抗体の量として２０ｎｇとなるようにポリビニル膜上に添加し、室温にて６０分間反応させた。

また二次抗体反応は、３−１５二価抗体を検出する際にはＨＲＰ ａｎｔｉ ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を３０００倍希釈したものを使用し、４４Ｂ１およびＴ２を検出する際にはＨＲＰ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を３０００倍希釈したものを使用した。

なお３−１５二価抗体として、形質転換ＣＨＯ細胞の培養上清を用い、その抗体量をＥＬＩＳＡ法により測定した。一方、３−１５一価抗体は、可溶型として発現させ、ヒスチジンタグによるアフィニティー精製を行ない、さらにゲルろ過精製を行なったものを使用した。タンパク量を測定し、これを抗体量として用いた。発色はＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて発光させた後、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ ＩＳ−８０４４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて検出した。

〔結果〕
結果を図４に示した。図４の（ａ）は４４Ｂ１で検出を行なった結果を示し、図４の（ｂ）はＴ２で検出を行なった結果を示し、図４の（ｃ）は３−１５二価抗体を用いて検出した結果を示し、図４の（ｄ）は３−１５一価抗体を用いて検出した結果を示す。同図における各レーンは、左から異常ＰｒＰ（ＢＳＥ−ＵＫ１０ＰＫ）を５ｍｇ／ｌａｎｅ、２．５ｍｇ／ｌａｎｅ、１．３ｍｇ／ｌａｎｅの濃度で電気泳動を行なった各結果を示している。

図４の（ａ）〜（ｄ）の結果より、３−１５二価抗体は、糖鎖付加による３種類の異常ＰｒＰ（二糖鎖型、一糖鎖型、無糖鎖型）をすべて認識することができた。図４中の各バンドは、上から二糖鎖型異常ＰｒＰ、一糖鎖型異常ＰｒＰ、無糖鎖型異常ＰｒＰをそれぞれ示す。

また図４の（ａ）〜（ｄ）の結果より、３−１５二価抗体は、現在ＢＳＥ確定検査に利用されている抗体（４４Ｂ１、Ｔ２）と略同等の異常ＰｒＰ結合能を有していた。さらに４４Ｂ１に比して検出のバックグラウンドが低く、より高感度にＰｒＰを検出することができるということがわかった。

一方、３−１５一価抗体は異常ＰｒＰに対する検出感度が低いのに対して、３−１５二価抗体は明らかに検出感度が高かった。したがって、ファージディスプレイ法により得られた一価抗体（ｓｃＦｖ）を、本発明の方法を用いて二価抗体にすることによって、明らかに抗原を高感度に検出できるということがわかった。

（実施例３：ＨＲＰ標識３−１５二価抗体による異常ＰｒＰの検出）
〔方法〕
ＨＲＰ標識された３−１５二価抗体（以下「ＨＲＰ標識３−１５二価抗体」という）、およびＨＲＰ標識されたＴ２（以下「ＨＲＰ標識Ｔ２」という）を使用した。抗体のＨＲＰ標識は、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ−Ｋｉｔ（株式会社 同人化学研究所製）を用いて、添付のマニュアルに準じて行なわれた。なお上記抗体を３０００倍希釈して異常ＰｒＰ（ＢＳＥ−ＵＫ１０ＰＫ）の検出に用いた。抗体の希釈にはＰＢＳ−Ｔ（０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０−ＰＢＳ）を用いた。

上記以外は、実施例２の方法に準じて本実施例を行なった。

〔結果〕
結果を図５に示した。図５の（ａ）はＨＲＰ標識３−１５二価抗体を用いた直接法による異常ＰｒＰ（ＢＳＥ−ＵＫ１０ＰＫ）の検出結果を示しており、図５の（ｂ）はＨＲＰ標識Ｔ２を用いた直接法による異常ＰｒＰ（ＢＳＥ−ＵＫ１０ＰＫ）の検出結果を示している。図５の（ａ）および（ｂ）における各レーンは、左から異常ＰｒＰ（ＢＳＥ−ＵＫ１０ＰＫ）を２．５ｍｇ／ｌａｎｅ、１．３ｍｇ／ｌａｎｅ、０．６ｍｇ／ｌａｎｅ、０．３ｍｇ／ｌａｎｅ、０．１５ｍｇ／ｌａｎｅの濃度で電気泳動を行なった各結果を示している。

図５の結果より、ＨＲＰ標識３−１５二価抗体を用いることによって非特異的反応も少なく、かつ非常に高感度に異常ＰｒＰ（ＢＳＥ−ＵＫ１０ＰＫ）を検出することができるということが分かった。よって、ＨＲＰ標識３−１５二価抗体を用いることによって、簡便かつ高感度にＢＳＥ診断を行なうことができるということが示された。

本発明にかかる方法によれば、ファージディスプレイ法によって得られた一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）から、抗原結合部位を２つ有する組換えニワトリ型二価抗体を製造することができる。それゆえ、これまで作製に時間と技術を要していたハイブリドーマからニワトリ型抗体の遺伝子を取得する必要が無いため、組換えニワトリ型二価抗体を容易に作製することができるという効果を奏する。また上記方法によって得られた抗体は、抗原結合部位を２つ有する二価抗体であるため抗原との親和性が高く、またＦｃ領域を有しており検出用の２次抗体が結合する領域が多いために抗原を高感度で検出することができるという効果を奏する。

また本発明にかかる抗体は、組み換えニワトリ型二価抗体である。それゆえ、非特異的反応のない高感度抗原検出系の確立することが可能となる。さらには、当該高感度抗原検出系を用いた各種疾患の診断薬、診断方法を提供することができるという効果を奏する。

例えば、本発明にかかる方法により、プリオンタンパク質と結合するｓｃＦｖから組換えニワトリ型二価抗体を製造すれば、プリオンタンパク質の高感度検出系および高感度検出方法を確立することができる。さらに前記高感度検出系および高感度検出方法を用いて異常プリオンタンパク質を検出することによって、プリオン病（クロイツフェルト・ヤコブ病またはウシ海綿状脳症等）の診断を高感度に行なうことができる。

したがって、本発明は抗体を取り扱う産業、例えば医薬品産業、検査薬品産業、食品産業をはじめとする広範な分野で有効に利用できる。さらには、実験・研究用の試薬産業等にも応用することが可能となる。

Claims (6)

1. （ａ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列；または
   （ｂ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
   からなる軽鎖、および
   （ｃ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列；または
   （ｄ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
   からなる重鎖を備え、プリオンタンパク質と結合する活性を有することを特徴とする抗体。
2. 配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、および
   配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を備えることを特徴とする抗体。
3. 検出用マーカーとして利用し得る酵素または放射性同位元素で標識されている、請求項１または２に記載の抗体。
4. 請求項１ないし３のいずれか１項に記載の抗体を含むことを特徴とするプリオンタンパク質の検出キット。
5. 請求項１ないし３のいずれか１項に記載の抗体を用いてプリオンタンパク質を検出する工程を含むことを特徴とするプリオンタンパク質の検出方法。
6. 請求項１ないし３のいずれか１項に記載の抗体を含むことを特徴とするプリオン病の診断キット。

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