JP4831864B2 - エリスロウィルス及びその応用 - Google Patents
エリスロウィルス及びその応用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4831864B2 JP4831864B2 JP2000523317A JP2000523317A JP4831864B2 JP 4831864 B2 JP4831864 B2 JP 4831864B2 JP 2000523317 A JP2000523317 A JP 2000523317A JP 2000523317 A JP2000523317 A JP 2000523317A JP 4831864 B2 JP4831864 B2 JP 4831864B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- erythrovirus
- sequence
- sequences
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000121268 Erythroparvovirus Species 0.000 title claims abstract description 96
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 33
- 241000702617 Human parvovirus B19 Species 0.000 claims description 29
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 28
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 27
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 20
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 19
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 13
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims 6
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 claims 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 17
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 16
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 15
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 13
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 12
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 11
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 11
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 11
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 101150024766 VP1 gene Proteins 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 101150093578 VP2 gene Proteins 0.000 description 6
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 3
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 2
- 101710115643 Cathelicidin-1 Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 2
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 2
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 208000012124 AIDS-related disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 208000007985 Erythema Infectiosum Diseases 0.000 description 1
- 206010049466 Erythroblastosis Diseases 0.000 description 1
- 206010015287 Erythropenia Diseases 0.000 description 1
- 101001055979 Eumenes pomiformis Venom peptide 2a Proteins 0.000 description 1
- 101001055968 Eumenes pomiformis Venom peptide 2b Proteins 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 208000001951 Fetal Death Diseases 0.000 description 1
- 206010055690 Foetal death Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000636168 Grapevine leafroll-associated virus 3 (isolate United States/NY1) Movement protein p5 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 101500006448 Mycobacterium bovis (strain ATCC BAA-935 / AF2122/97) Endonuclease PI-MboI Proteins 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100366988 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) stu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710188688 Non-structural protein 7a Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010033733 Papule Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700014121 Pyruvate Kinase Deficiency of Red Cells Proteins 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 231100000479 fetal death Toxicity 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005976 liver dysfunction Effects 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001343 mnemonic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14211—Erythrovirus, e.g. B19 virus
- C12N2750/14222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
本発明は、ヒトのエリスロウィルス（erythrovirus）由来の核酸配列、そのフラグメントならびにそれらの診断試薬および免疫原性試薬としての応用に関する。
【０００２】
エリスロウィルスＢ１９と最近名づけられたパルボウィルスＢ１９による感染は世界中で一般に広く分布していることが、血清疫学研究により分かっている。
ヨーロッパにおいて、エリスロウィルスＢ１９の血清有病率は、５才未満の被験者の約１０％、２０才を越える被験者については約５０％であり、高齢者では９０％を越える。
この高い血清有病率は、エリスロウィルスＢ１９の感染性が高いことを示唆している。近距離で接触した被験者への伝染率は１０〜６０％で、感染経路は主に空気によるものである（呼吸器系分泌物）。
エリスロウィルスＢ１９は、ヒトに特異的なウィルスである。急性感染は、普通、子供に良性の斑点状皮膚丘疹を引き起こす（表皮性巨大紅斑または第５疾患（5th disease））。関節痛が湿疹に伴うこともあり、まれに慢性化する。
慢性溶血性貧血（鎌状赤血球貧血、サラセミア、ピルベートキナーゼ欠損症等）にすでに罹っている患者では、通常、一過性の急性赤芽球症が起こり、一過性の急性無再生貧血を引き起こす。
【０００３】
エリスロウィルスＢ１９の急性一次感染は妊婦には特に危険で、胎児への感染の危険性は３０％と推定される。貧血、肝機能不全、心機能不全及び胎盤不全による胎児死の危険性は、５〜９％と推定される。
エリスロウィルスＢ１９による慢性感染は、免疫が抑制されている被験者（慢性骨髄性白血病、体液性および細胞性免疫不全、組織あるいは骨髄の移植、エイズによる疾病）に主にみられる。
ＨＩＶ−１血清反応陽性の患者において、エリスロウィルスＢ１９による慢性感染は慢性貧血の原因となるが、他の系列にも作用する（好中球減少症、特に血小板減少症）。これらの患者に十分な体液性免疫反応が欠如していることから、慢性的にエリスロウィルスを血液中に保有する状態になる。この体液性免疫反応の欠如は、慢性赤芽球減少症の発症ならびに湿疹や関節痛等の他の症状がないことを説明する。
【０００４】
エリスロウィルスＢ１９は、約５.４ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを有するウィルスである。それは、現在のところ分類された唯一のエリスロウィルスである。配列が決定された株および配列ライブラリー（GenBankまたはEMBL）で公表の対象となった株の全ての遺伝子的変異性は低い（全ゲノムにわたって９８％の核酸配列類似性、ＶＰ１領域にわたって９６％の類似性）（R.O. SHADE, J. Virol., 1986, 58, 3, 921-936, B19-AU）。
エリスロウィルスＢ１９感染のウィルス学的診断は、培養が常套方法で実行できない限りにおいて、主にウィルスのゲノムの検出に基づく。
エリスロウィルスＢ１９の急性感染（一次感染）については、この検出は遺伝子増幅（PCR）によって実行できるが、一次感染時は通常きわめて高い（血清１mlにつき1014まで）ウィルスの力価を考慮するとハイブリダイゼーション（ドット-ブロット）でも可能である。しかしながら、慢性感染時はウィルスの力価がずっと低く、遺伝子増幅検出法しか考えられない。
【０００５】
これらの検出手法は,試験対象ウィルスの遺伝子的変異性しだいであって、公知のエリスロウィルスＢ１９配列から調製した試薬では、遺伝子増幅によっても或いはＢ１９血清診断によっても変異体エリスロウィルス感染の検出はできない。
実際、現行の血清診断試験はエリスロウィルスＢ１９に特異的である（国際出願PCT WO 91/12269; 国際出願PCT WO 96/09391 (IDEIAR パルボウィルスB19 IgG 及びIgM、DAKO; パルボウィルスB19 IgG 及びIgM 酵素イムノアッセイ、BIOTRIN)）。
その結果、上記の検出手法は、核酸レベルにおいても抗体反応に関しても陰性の結果を出す危険がある。
【０００６】
新しい変異体を同定することおよび考慮に入れることは下記の開発に重要である：
−十分に感受性でかつ特異的な、即ち偽陽性または偽陰性の結果を導かないヒトのエリスロウィルス感染の検出および診断（血清診断、PCR、ハイブリダイゼーション）用試薬、
−すべてのエリスロウィルス感染を防ぐことができる組成物（ワクチン）、および
−変異体エリスロウィルス感染を治療することができる組成物（血清療法、モノクローナル抗体）。
従って、発明者は変異体、即ちエリスロウィルスB１９から遺伝子的に距離のあるエリスロウィルス（エリスロウィルスタイプＶ９と呼ばれる）の検出ができるエリスロウィルス由来配列を提供することを目標とした。
【０００７】
本発明の主題は、下記からなる群から選択されることを特徴とする核酸配列である：
−エリスロウィルスＢ１９に関して全ゲノムにわたって１０％以上の遺伝子的差異あるいは距離（９０％未満の類似性）を示すので分子的にはエリスロウィルスB１９配列とは認められないエリスロウィルス由来の配列であって、配列SEQ ID NO:1に関して６％に等しいか、それより低い遺伝子的差異（９４％を越える類似性）を示すもの、
−配列SEQ ID NO:1、および
−前記配列ID NO:1とストリンジェントな条件のもとでハイブリッドできるヌクレオチド配列。
【０００８】
この変異体エリスロウィルスはタイプＶ９変異体と呼ばれる。
ストリンジェントな条件とは、本発明の目的では下記の条件を意味すると理解される：
・４２℃、５０％のホルムアミドを含む１xＳＳＣ緩衝液中で３〜２４時間ハイブリダイゼーション、および
・６０℃、２xＳＳＣ緩衝液の中で１５分３回洗浄。
配列SEQ ID NO:1は、エリスロウィルスタイプＶ９のゲノムの約９５％に相当し全てのコード配列を含み、特にBamHI部位（部位なし）、 HINDIII部位（１部位のみ）及び PvuII（５部位）に関してＢ１９エリスロウィルスとは異なる制限酵素地図を有する。
【０００９】
より具体的には、配列SEQ ID NO:1は、特に下記の制限部位によってエリスロウィルスＢ１９とは異なる制限プロフィールを有する： AccI、AflIII、AlwI、 AlwNI、ApaI、AvaI、AvaII、AvrII、BamHI、BanI、BanII、BbeI、BbsI、BceFI、BcgI、BcnI、BglII、BsgI、BsiEI、BsmI、BsmAI、Bsp120I、BspHI、BspMI、BsrFI、Bst1107I、BstEII、BstUI、Bsu36I、DpnI、DraIII、DsaI、EaeI、EagI、EarI、Ec1136I、EcoNI、Eco109I、EcoRI、EheI、FokI、HaeI、HaeIII、HgaI、HgiAI、HhaI、HincII、HindIII、HinPI、HpaI、KasI、MaeII、MboI、McrI、MscI、MunI、NarI、NciI、NcoI、NsiI、NspI、Nsp7524I、NspBII、 NspCI、PflMI、PmeI、Ppu10I、PpuMI、PstI、PvuII、SacI、Sau3AI、ScaI、SfaNI、SfcI、SmaI、SpeI、SphI、SspI、StuI、StyI、SwaI、Tth111I、XbaI、XmaI およびそのアイソシゾマー。
【００１０】
本発明の主題はまた、エリスロウィルスＶ９の検出を可能にできる配列ID NO:1のフラグメントであって、下記からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする：
a) SEQ ID NO:1の位置328-2340に相当しNS1タンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:81）,
b) SEQ ID NO:１の位置1796-2017に相当し7.5 kDa タンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:83）、
c) SEQ ID NO:1の位置2336-4678に相当しVP1タンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:85）、
d) SEQ ID NO:1の位置2336-3016に相当しVP1uをエンコードする配列（SEQ ID NO:87）、
e) SEQ ID NO:1の位置2523-2828に相当しXタンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:89）、
f) SEQ ID NO:1の位置3017-4678に相当しVP2をエンコードする配列（SEQ ID NO:91）、
g) SEQ ID NO:1の位置4488-4883に相当し11 kDaタンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:93）、
h) 配列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91 または SEQ ID NO:93のうちの1つとハイブリッドできるヌクレオチド配列、
i) 配列SEQ ID NO:2〜80、
j) 配列SEQ ID NO:105 (E1905f)、106 (E1987r)、107 (E2076f)、108 (E2151r)、109 (E2406r)、110 (E2149rs)、111 (E2717f)、112 (E2901r)、113 (e1855f)、114 (e2960r)、115 (e1863f)、116 (e2953)、117 (e2435fStul/BglII)、118 (e4813rEcoRI)、119 (e3115fBamHI)、120 (e4813rBamHI) および 121 (e1954fp) 、および
k) 上記の配列に相補的な配列、上記の配列由来であって少なくとも１７個のヌクレオチドからなる配列またはそれらの相補的配列。
【００１１】
本発明の文脈では、核酸配列またはヌクレオチド配列（DNAまたはRNA配列）は、上に定義したような配列およびそれらの相補的配列（アンチセンス配列）ならびに前記配列またはそれらのフラグメントの１つかそれ以上を含む配列の１つを意味すると理解される。
発明はまた、上記フラグメントに相補的なヌクレオチドフラグメント、ならびに上記フラグメントに対しその長さの約１５％の割合でのヌクレオチドの除去または付加によって修飾および／またはヌクレオチドの性質のレベルで修飾されたフラグメントを含む。ただし、修飾ヌクレオチドフラグメントが、対応する未変更フラグメントが示すものと類似の、エリスロウィルスＶ９DNAまたはRNA配列とのハイブリダイゼーション能力を保持するものとする。
【００１２】
これらのフラグメントの中には、特異的であってプローブまたはプライマーとして用いられるものがある。それらは、エリスロウィルスＶ９または関連エリスロウィルスに特異的にハイブリッドする。エリスロウィルスV９に関係するウィルスとは、６％に等しいか、それより低い遺伝子的差異を示すエリスロウィルスを意味すると理解される。これらのフラグメントは、配列SEQ ID NO:45〜80、NO:108および110またはそれらの相補的配列、これらの配列由来であって少なくとも１７個のヌクレオチドからなる配列、前記配列を含む配列からなる群から選択され、エリスロウィルスV９或いは関連エリスロウィルスの特異的同定にその用途が見出される。
これらのフラグメントの中には、配列SEQ ID NO:1のような、エリスロウィルスタイプＶ９或いは関連ウィルス由来の配列の増幅のためのプライマーとして用いられるものもある。これらのプライマーは、配列SEQ ID NO:2〜44および配列SEQ ID NO:105〜109 と111〜121またはそれらの相補的配列、これらの配列由来であって少なくとも１７個のヌクレオチドからなる配列からなる群から選択される。
【００１３】
前記フラグメントはまた、プライマーの場合、アンチセンス配列も含む。
そのような配列は、上記に定義したようなプローブおよび／または適切な制限酵素と組み合せてエリスロウィルス（エリスロウィルスＢ１９とエリスロウィルスＶ９）の識別同定に用途を見出す。
前記プライマーは、１７〜３０個のヌクレオチドからなるのが好ましい。好ましいプライマーは下記のものである：配列SEQ ID NO:105（配列SEQ ID NO:1の位置1797-1815）−配列SEQ ID NO:10に相当、配列SEQ ID NO:106 (配列SEQ ID NO:1の位置1899-1879)−配列SEQ ID NO:11のアンチセンス配列のフラグメントに相当、配列SEQ ID NO:107（配列SEQ ID NO:1の位置1968-1987）−配列SEQ ID NO:13のフラグメントに相当、配列SEQ ID NO:108（配列SEQ ID NO:1の位置2061-2043）−配列SEQ ID NO:58のアンチセンス配列のフラグメントに相当、配列SEQ ID NO:109（配列SEQ ID NO:1の位置2317-2298）−配列SEQ ID NO:16のアンチセンス配列のフラグメントに相当、配列SEQ ID NO:111（配列SEQ ID NO:1の位置2609-2627）−配列SEQ ID NO:19のフラグメントに相当、および配列SEQ ID NO:112（配列SEQ ID NO:1の位置2812-2793）−配列SEQ ID NO:23のアンチセンス配列のフラグメントに相当。
【００１４】
好ましいプライマー対は以下のものである：
−ペアＡ：プライマーSEQ ID NO:111とSEQ ID NO:112；
−ペアＢ：プライマーSEQ ID NO:105とSEQ ID NO:106；
−ペアＣ：配列SEQ ID NO:2〜44、105、106、107、109、111または112の中から１つと配列SEQ ID NO:45〜80、108または110の中から１つ；
−ペアＤ：プライマーSEQ ID NO:107とプライマーSEQ ID NO:109；
−ペアＥ：配列SEQ ID NO:2〜44、105、106、107、109、111または112から選択される２つのプライマー；
−ペアＦ：配列SEQ ID NO:45〜80、108または110から選択される２つのプライマー。
これらの様々なプライマーは、増幅されるフラグメントに応じてセンスプライマーまたはアンチセンスプライマーとして用いることができる。
【００１５】
本発明の主題はまた変異体エリスロウィルスであって、そのゲノムは分子的にエリスロウィルスＢ１９とは認めることができず、上記に定義したような配列SEQ ID NO:1に対し６％に等しいか、それより低い変異を示し、そのゲノムは上記に定義したようなストリンジェントな条件の下で上記に定義したような配列SEQ ID NO:45〜80、108および110の１つと特異的にハイブリッドすることを特徴とする。
本発明の主題はまたプラスミドであって、それは、エリスロウィルスＢ１９とは分子的に認めることができず、エリスロウィルスＢ１９に対して全ゲノムにわたり１０％を越える遺伝子差異を示し配列SEQ ID NO:1とは６％に等しいか、それより低い差異を示す、エリスロウィルスＶ９またはそのフラグメントと呼ばれる変異体エリスロウィルス株のウィルスゲノムを含むことを特徴とする。
【００１６】
前記エリスロウィルスＶ９のウィルスゲノムは、エリスロウィルスＢ１９から遺伝子的に距離があると考えられる。
前記プラスミドの有利な実施態様によれば、それは配列SEQ ID NO:1を含む(PCD.V9.C22)。
本発明の主題はまた、タイプＶ９エリスロウィルスの識別検出のための診断試薬であって、配列SEQ ID NO:45〜80、108および110から選択され任意に適切なマーカーで標識付けされていることを特徴とする。
適切なマーカーには、放射性同位体、酵素、蛍光色素、化学マーカー（ビオチン等）、ハプテン類（ジゴキシゲニン等）および抗体または適切な塩基類似体があげられる。
【００１７】
本発明の主題は、原材料として生物学的試料を用いてハイブリダイゼーションおよび／または遺伝子増幅によってエリスロウィルスを迅速に識別検出するための方法であって、この方法は下記からなることを特徴とする：
（１）分析対象生物学的試料を配列SEQ ID NO:45〜80、108または110の少なくとも１つのプローブと接触させる工程、および
（２）エリスロウィルスヌクレオチド配列プローブ相互作用によって生じた産物を適切な手段で検出する工程。
好ましくは、ハイブリダイゼーションは、５〜６０％のホルムアミド、１〜５x SSC、２％のブロッキング試薬（ブロッキング緩衝液、Boehringer Mannheim, Meylan, France）、０.１％ のN−ラウリルサルコシン、０.０１〜５％のSDSを含む緩衝液中で、４０〜７０°Cで９０分間行われる予備ハイブリダイゼーションを含み、その後、同じ組成の緩衝液３mlに１０(lの標識プローブを加え４０〜７０°Cで１〜３０時間ハイブリダイゼーションを行う。
【００１８】
前記の方法によれば、工程（１）に先立って下記の工程を含んでもよい：
・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程、および
・少なくとも１つの遺伝子増幅サイクル。
遺伝子増幅工程は、特に下記の遺伝子増幅手法の１つを利用して行われる：Q(−レプリカーゼでの増幅（I. Haruna ら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1965, 54, 579-587）、PCR (ポリメラーゼ連鎖反応) (R.K. Saiki ら、1986, Nature, 324:163-6)、LCR (リガーゼ連鎖反応) (F. Barany, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 189-193)、ERA (エンドラン (end-run) 増幅) (C. Adams ら、1994, Novel amplification technologies for DNA/RNA-based diagnostics meeting, San Francisco, CA, United States)、CPR (サイクリングプローブ反応) (P. Duck ら、Biotechniques, 1990, 9, 142-147) 或いはSDA (鎖置換増幅) (GT. Walker, 1994, SDA: novel amplification technologies for DNA/RNA-based diagnostics meeting, San Francisco, CA, United States)。
【００１９】
前記方法の有利な実施態様によれば、増幅サイクルは、配列SEQ ID NO:2〜44、105〜109および111〜112ならびにこれらの配列のフラグメント、好ましくは上記に定義したようなプライマーペアから選択される1対のプライマーを利用して実行される。
ペアAが用いられる場合、増幅産物は制限酵素ApaI (GGGCCC)の作用によってスクリーニングすることに利点がある。Ｂ１９ゲノムの増幅産物はApaIによって開裂する（149塩基対(bp)と55 塩基対(bp)の2つのフラグメントを生じる）が、一方、Ｖ９ゲノムの増幅産物はApaIによって開裂しない（204 bpの１つのフラグメント）。アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動法により、これらの制限フラグメントを識別することができる。
【００２０】
ペアBが用いられる場合、増幅産物は下記の制限酵素の１つの作用によってスクリーニングすることに利点がある：BglII (AGATCT)または MunI (CAATTG)；従って、エリスロウィルスＶ９またはＢ１９が関与しているかどうかによって、異なるフラグメントが得られる。BglII制限部位を含むフラグメントは上記のとおり変異体エリスロウィルスＶ９に特異的であるが、一方、Ｂ１９エリスロウィルスはこの領域にMunI部位を有する。Ｂ１９ゲノムの増幅産物はMunIによって開裂し (36 bpと67 bpの２つのフラグメントを生じる) 、BglIIによっては開裂しない (103 bpの１つのフラグメント)。一方、Ｖ９ゲノムの増幅産物はBglIIによって開裂し (19 bpと 84 bp の２つのフラグメント)、MunIによっては開裂しない (103 bpの１つのフラグメント)。 アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動法により、これらの異なる制限フラグメントを識別することができる。
ペアC（全てのエリスロウィルスとハイブリッドできるプライマーとエリスロウィルスＶ９と特異的にハイブリッドできるプライマー）が用いられた場合、またはペアF（エリスロウィルスＶ９と特異的にハイブリッドできる2つのプライマー）が用いられた場合、Ｖ９ゲノムは増幅されるが、Ｂ１９ゲノムについては特異的な増幅はない。
【００２１】
ペアDが用いられた場合、増幅産物は、配列SEQ ID NO:58〜60および110から選択される、エリスロウィルスＶ９に特異的な標識プローブとのハイブリダイゼーション、好ましくは配列SEQ ID NO:110のプローブとのハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることに利点がある。Ｖ９ゲノムの増幅産物は、これらのプローブ、特に配列SEQ ID NO:110のプローブと特異的にハイブリッドするが、一方、Ｂ１９ゲノムの増幅産物は上記のプローブとハイブリッドしない。
ペアEが用いられた場合、増幅産物は、配列SEQ ID NO:45〜80、108および110から選択される、エリスロウィルスＶ９に特異的なプローブとのハイブリダイゼーション法のいずれかによってスクリーニングされる。この場合、Ｖ９ゲノムの増幅産物はこのプローブとハイブリッドするが、Ｂ１９ゲノムの増幅産物はしない。
【００２２】
発明の主題はまた、上記の配列、これらの配列由来のフラグメントまたはそれらの相補的配列を、エリスロウィルス核酸配列のハイブリダイゼーション法または遺伝子増幅法を実行するために使用することであり、これらの方法は、個人のエリスロウィルスタイプＶ９による潜在的感染の生体外診断に用いることができる。
本発明の主題はまた、エリスロウィルスＶ９または関連ウィルスのスクリーニングおよび分類方法であって、配列SEQ ID NO:45〜80、108および110からなる群から選択され、任意に標識付けされたプローブを分類対象ウィルスの核酸と接触させ、得られた核酸−プローブハイブリッドを検出することを含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明の主題はまた、上記に定義したヌクレオチド配列によってエンコードされていることを特徴とする翻訳産物である。
本発明の主題はまた、特に上記に定義したような配列SEQ ID NO:81、83、85、87、89、91および93ならびにそれらに由来する7〜50個のアミノ酸からなるペプチドからなる群から選択されるヌクレオチド配列を利用して発現され得ることを特徴とする、タンパク質である。
ペプチドは今後、上記に定義したようなタンパク質とペプチドの両方を意味すると理解される。
そのようなペプチドは、特に、エリスロウィルスＶ９に誘導された抗体によって認識し、かつ／または抗エリスロウィルスＶ９抗体の産生を誘導することができる。
【００２４】
前記ペプチドは、特に、配列SEQ ID NO:82 (NS1タンパク質)、SEQ ID NO:86 (VP1タンパク質)、SEQ ID NO:88 (単VP1 タンパク質)、SEQ ID NO:92 (VP2 タンパク質) およびSEQ ID NO:95-104、即ち、VP1タンパク質のフラグメント[VP1aペプチド (SEQ ID NO:95)；VP1bペプチド (SEQ ID NO:96)；VP1cペプチド (SEQ ID NO:97)；ペプチドVP1d (SEQ ID NO:98)；ペプチドVP1e (SEQ ID NO:99) およびペプチドVP1f (SEQ ID NO:100)]、またはVP2タンパク質のフラグメント[ペプチドVP2a (SEQ ID NO:101)；ペプチドVP2b (SEQ ID NO:102)；ペプチドVP2c (SEQ ID NO:103)；ペプチド VP2d (SEQ ID NO:104)]ならびにそれらに由来する７〜５０個のアミノ酸からなるペプチドから選択される。
【００２５】
発明の主題はまた、特に合成手段によって得られた、発明によるヌクレオチド配列の１つまたはそれ以上の翻訳産物および／または上記に定義したようなペプチドの１つを含む免疫原性組成物である。
発明の主題はまた、上記のペプチドの１つまたはそれ以上に対する抗体と、それら抗体を特に個人のエリスロウィルスによる感染の生体外識別診断法を実行するために使用することである。
発明の主題はまた、エリスロウィルスＶ９感染の免疫学的検出法であって、
−抗エリスロウィルスＶ９抗体の検出のために、生物学的試料を発明によるペプチドと接触させること（血清診断法）と、
−エリスロウィルスV９ウィルスタンパク質の検出のために、生物学的試料を発明による抗体に接触させることを含み、
結果の読取が適切な手段、特にEIA、ELISA、RIA、蛍光によって明らかにされることを特徴とする。
【００２６】
実例として、発明によるそのような生体外診断法は、患者から採取した生物学的試料を発明による抗体または発明によるペプチドと接触させ、適切ないずれかの方法を利用して、特に標識抗免疫グロブリンを利用して、生物学的試料中に存在するかもしれないエリスロウィルスの抗原または抗体と前記抗体または前記ペプチドとの間でそれぞれ形成される免疫学的複合体を検出することを含む。
発明による試薬は、妊婦、貧血および／または慢性血小板減少症に罹っているHIV陽性患者、組織または骨髄被移植者及び中枢急性貧血（central acute anaemia）の患者でエリスロウィルスＢ１９検出試験が陰性である患者におけるＶ９エリスロウィルスおよび関連ウィルスの検出に特に有用である。
発明の主題は、これらに加えて、発明による少なくとも１つの試薬（プローブ、プライマーペア、ペプチドまたは抗体）を含むことを特徴とするエリスロウィルス診断キットである。
【００２７】
上記の特徴に加えて発明はさらに他の特徴を有するが、それらの特徴は、本発明の主題である方法の例示として下記に記載の実施態様ならびに添付図面から明らかになるであろう。
しかしながら、これらの例は発明の主題の例示としてのみ記載されたものであって何ら限定を加えるものではないことを理解すべきである。
【００２８】
実施例 1: 本発明による配列の形成
事実上V9変異体の全ゲノム(95%)を表す5028 bpのAatII/AatII制限フラグメントを、以下の方法によってシーケンシングベクターpcDNA2.1 (Invitrogen, オランダ)にクローンした。
1本鎖ウィルスDNAを、QIAamp血液キットカラム（Qiagen S.A.,フランス）を用いて急性赤芽球減少症発作患者の血清から抽出した。56℃の50mM NaCl緩衝液中で16時間のハイブリダイゼーションにより、ウィルスDNAを2本鎖DNAに変換する。次に、1.3μgの2本鎖ウィルスDNAにAatII制限酵素（18U）を37℃で2時間作用させ、次いで制限酵素を65℃で15分間不活性化する。Millipore(登録商標)VSWPO13000酢酸セルロースおよび硝酸エステル膜で、生成物を水に対して2時間透析する。このようにして調製した2本鎖ウィルスDNA AatII/AatII制限フラグメントを、連結反応工程を待つ状態で−20℃で凍結する。
【００２９】
AatIIフラグメントを受容するように、部位特異的挿入変異によってベクターpcDNA2.1を修飾する: 多数のクローニング部位のEagI制限部位を除去し、AatII部位で置換した。このようにしてつくったベクターpcDNA2.1aを細菌培養物中で増やし、QIAfilterプラスミド マキシ キット(Maxi Kit)(Qiagen S.A., フランス)を用いて精製した。次に、3μgのベクターpcDNA2.1aを酵素AatIIを用いて37℃で1時間制限作用に付し、エビのアルカリホスファターゼ(Boehringer Mannheim, Meylan, フランス)で脱リンする。酵素は、65℃で15分間不活性化する。
【００３０】
連結反応は、ベクター/ウィルスDNA挿入モル比1/1で行う。つまり上記のように調製した50 ngのベクターと100 ngのウィルスDNAインサートで、1 UのT4リガーゼ(Life Technologies, フランス)を用いて24℃で16時間行う。1/2に希釈した後、T4リガーゼを不活性化させるために連結生成物を65℃で熱し、次いで氷上で冷却する。エレクトロコンピテント細菌Sure(登録商標)(Stratagene, ハイデルベルク, ドイツ)を、2または4μlのこの連結溶液を用いてエレクトロポレートさせ(1500 V、50 μF、200 Ω)、次いで1 mlのSOC培地 (Life Technologies, フランス)で1時間インキュベートした後、100 μg/mlのアモキシリン、15 μg/mlのテトラサイクリン、100 μg/mlのIPTGおよび50 μg/mlのX-galを含有するルリアブロス寒天培地(Life Technologies, フランス)に塗布する。
24個の(組換え)白色コロニーを選択し、それらのプラスミドをDNAのミニプレップによって抽出し、概略の制限酵素地図(AatII、AatII + BamHI、BamHI、BamHI + BglII、HindII)によって、V9ウィルスインサートに大きさと制限酵素地図が適合しているインサートを含む2つの組換えクローンを選択することができた。
【００３１】
これら2つのクローン(2および22)は、自動シークエンサーABI 377 (Perkin Elmer、フランス)を用いて配列決定した。これらは実際に5028 bpのインサートを有しており 、2つの配列は位置1165以外で同一である(クローン2及び22について、それぞれクロ ーンAおよびG)。V9ウィルスDNAの直接配列により、位置1165のGが正しいことが決定 できた。したがって、配列がSEQ ID NO:1に相当するクローン22(PCD.V9.C22)が選択さ れた。
図1から6は、エリスロウィルスV9とエリスロウィルスB19との遺伝的距離を示す。これらの図において、種々のエリスロウィルス配列はGenBankの記憶用コード(mnemonic)(1997年10月発売の103.0)によって示している。
【００３２】
実施例 2: 特定のプローブを用いたDNAハイブリダイゼーション(ドットブロット、スロットブロットまたはマイクロプレート)によるV9タイプエリスロウィルスの診断
ウィルスDNAを、例えばQIAamp血液キットカラム(Qiagen S.A. フランス)、または核酸を抽出する他のいずれかの方法によって生物学的試料(血液、血清、血漿、羊水、骨髄、組織)から抽出する。溶液中のDNAを95℃で2分間変性させ、次いで氷上で冷却し、吸引濾過によってナイロン膜または硝酸セルロース膜上に移し、その後固定(膜を80℃で1時間加熱)する。次に、ストリンジェントな条件下で、例えば配列SEQ ID NO:1またはその相補的配列、またはそのフラグメント、特に配列SEQ ID NO:45〜SEQ ID NO:80および110とそれらの相補的配列、または適切に標識したこれらの配列のフラグメントなどのV9に特異なDNAプローブまたはRNAプローブを用いて膜をハイブリダイズする。この標識は、放射性元素(32P, 33P, 35S, 3H, 14Cまたは別の放射性同位元素)、低温標識(ビオチン)、蛍光マーカー、ジゴキシゲニン、またはDNAあるいはRNAフラグメントに結合するかまたは組み込まれてもよく、かつ特定の抗体またはルテニウムキレートで検出可能なその他の分子を用いた標識付けでもよい。放射活性元素を標識する場合には、オートラジオグラフィまたは放射性同位元素の放出を検出できるその他の方法(例えばPhosphorimager, Molecular Dynamics, Bondoufle, フランス)によって視覚化することができる。ビオチン標識の場合には、酵素/ストレプトアビジン複合体および適当な視覚化基質を用いて視覚化することができる。蛍光標識では、fluoro-Imager (Molecular Dynamics, Bondoufle, フランス)または蛍光放射を検出できる他のいずれかの装置を用いて視覚化することができる。ジゴキシゲニン(または他の抗原)を用いた標識では、視覚化は酵素(アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼまたはいずれかの他の酵素)に直接結合した抗ジゴキシゲニン抗体(または標識に使用した抗原に特異的な抗体)を用いるか、または間接的に、抗ジゴキシゲニン抗体(または標識に使用した抗原に特異的な抗体)と酵素に結合した抗体とを用いて行われる。視覚化には、複合体の酵素に適した基質が用いられる。ルテニウムキレート(TBRなど)を用いた標識の場合には、エレクトロ-ケミルミネッセンス反応(G.F. Blackburnら., Clin. Chem., 1991, 37:1534-1539)によって視覚化される。
【００３３】
この方法の変形は、ウィルスDNAをマイクロプレートまたは他の固形支持体に固定し、上記の標識プローブとハイブリダイズすることからなる。
この方法の別の変形は、未標識プローブをマイクロプレートまたは他の固形支持体に固定し、予め標識した試料のウィルスDNAとハイブリダイズすることからなる。
【００３４】
実施例 3: 遺伝子増幅(PCRつまりポリメラーゼ連鎖反応)およびハイブリダイゼーションによるV9タイプエリスロウィルスの診断
ウィルスDNAを、QIAamp血液キットカラム(Qiagen S.A., フランス)またはいずれかの他の核酸抽出法によって生物学的試料(血液、血清、血漿、羊水、骨髄、組織)から抽出する。
PCRはSaikiらに記載の方法(Nature, 1986, 324: 163-66)に基づき、最終容量100μlの反応混合物(50 mMのKCl; 10 mMのTris-HCl pH 8.3; 2.5 mMのMgCl2; 200μMのdNTP; 25 pmolのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド)中の10 μlのDNA溶液と1.5 IUのAmpliTaq GoldTM (Perkin Elmer, フランス)を用いて行う。増幅プライマーは、V9変異体DNAのみを増幅ように選択した20〜25 マーのオリゴヌクレオチドである。2つのプライマー(センスおよびアンチセンス)がV9に特異的な配列(SEQ ID NO:45〜80、 108および110)またはそれらの相補的配列のフラグメントであるか、またはプライマーの一方がV9に特異的な配列(SEQ ID NO:45〜80、108および110)またはそれらの相補的配列から選択され、もう一方のプライマーがB19エリスロウィルスおよびV9エリスロウィルスのいずれをもハイブリダイズすることができる配列(SEQ ID NO:2〜44, 105〜107, 109および111〜112)またはそれらの相補的配列から選択される。温度サイクルは、以下のプログラムに従ってサーモサイクラー(T9600、Perkin Elmer,フランス)により反応混合物に適用される。
【００３５】
1サイクル： 95℃で6分
5サイクル： 95℃で60秒、
60℃で30秒、
72℃で30秒
45サイクル： 95℃で30秒、
60℃で30秒、
72℃で30秒
1サイクル： 72℃で5分間
【００３６】
従来技術(Sambrook J.ら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor)にしたがって、増幅生成物を1.3%アガロースゲル上に置いて電気泳動分離に付し、装填したナイロン膜に毛管作用によって転移する。
プローブは20〜30マーのオリゴヌクレオチドであり、V9に特異的な配列(SEQ ID NO:45〜80、108および110)またはそれらの相補的配列のフラグメントである。これは、DIGオリゴヌクレオチド追跡キット(Boehringer Mannheim, Meylan, フランス)を用いてDIG-dUTPで3'に標識する。
転移膜は、50% ホルムアミド; 5x SSC; 2%の阻止試薬(Boehringer Mannheim, Meylan, フランス); 0.1%のN-ラウリルサルコシン; 0.02%のSDSからなる緩衝液中、42℃で90分間予めハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは、同組成の3mlの緩衝液中、10μlの標識プローブを用いて42℃で16時間行う。0.1% SDS含有2x SSC緩衝液中、60℃で10分間膜を2回洗浄し、次いで0.1% SDS含有1x SSC 緩衝液中、60℃で10分間2回洗浄する。その後、膜をDIG蛍光検出キット (Boehringer Mannheim, Meylan, フランス)およびオートラジオグラフィで視覚化する。
【００３７】
実施例 4: 遺伝子増幅およびハイブリダイゼーションによるB19タイプおよびV9タイプエリスロウィルスの集団診断および識別診断
ウィルスDNAを生物学的試料 (血液、血清、血漿、羊水、骨髄、組織)からQIAamp血液キットカラム(Qiagen S.A., フランス)またはその他のいずれかの核酸抽出法によって抽出する。
PCRは、Saikiらに記載の方法(上記に引用のNature, 1986)に基づき、最終容量100μlの反応混合物(50 mMのKCl; 10 mMのTris-HCl pH 8.3; 2.5 mMのMgCl2; 200μMのdNTP; 25 pmolのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド)中、10μlのDNA溶液と1.5 IUのAmpliTaq GoldTM (Perkin Elmer, フランス)を用いて行う。増幅プライマーは、B19DNAおよびV9変異体DNAを増幅するように選択した20〜25マーのオリゴヌクレオチドである。2つのプライマー(センスおよびアンチセンス)は、B19エリスロウィルスおよびV9エリスロウィルスのいずれをもハイブリダイズできる配列(SEQ ID NO:2〜44、105〜107、109および111〜112)またはそれらの相補的配列のフラグメントである。温度サイクルは、以下のプログラムに従ってサーモサイクラー(T9600, Perkin Elmer, フランス)で反応混合物に適用される。
【００３８】
1サイクル： 95℃で6分
5サイクル： 95℃で60秒
60℃で30秒
72℃で30秒
45サイクル： 95℃で30秒
60℃で30秒
72℃で30秒
1サイクル： 72℃で5分
【００３９】
従来技術(上記に引用のSambrook J.ら, 1989)にしたがって、増幅生成物を1.3%アガロースゲル上に置いて電気泳動分離に付し、装填したナイロン膜に毛管作用によって転移する。
プローブは20〜30マーのオリゴヌクレオチドで、V9に特異的な配列(SEQ ID NO:45〜80、108および110)もしくはそれらの相補的配列のフラグメントであるか、またはB19に特異的な配列のフラグメントであるか、最終的にはまたは、集団診断の実施を目的とする場合にはB19とV9のいずれをもハイブリダイズする配列(SEQ ID NO:2〜44または105〜107、109、111〜112)のフラグメントである。これは、DIGオリゴヌクレオチド追跡キット(Boehringer Mannheim, Meylan, フランス)を用いてDIG-dUTPで3'に標識する。
転移膜は実施例3に記載した条件下で予めハイブリダイズし、その後ハイブリダイズする。
【００４０】
実施例 5: 遺伝子増幅および制限酵素によるB19タイプおよびV9タイプエリスロウィルスの集団診断および識別診断
QIAamp血液キットカラム(Qiagen S.A., フランス)またはその他のいずれかの核酸抽出法による生物学的試料(血液、血清、血漿、羊水、骨髄、組織)からのウィルスDNAの抽出。
NS1a PCRは、Saikiらによる記載の方法にしたがって、最終容量50 μlの反応混合物(50 mMのKCl; 10 mMのTris-HCl pH 8.3; 2.5のmM MgCl2; 200μMのdNTP; 12.5 pmolのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド)中の5μlのDNA溶液、1.5 IUのAmpliTaq GoldTM (Perkin Elmer, フランス)および一対のプライマーB(センスプライマーe1905f、SEQ ID NO:105; およびアンチセンスプライマーe1987r、SEQ ID NO:106)を用いて以下の温度サイクルで行う (サーモサイクラーT9700, Perkin Elmer, フランス):
【００４１】
1 サイクル： 94℃で6分
5 サイクル： 94℃で30秒
55℃で1分
72℃で1分
45 サイクル： 94℃で30秒
60℃で30秒
72℃で30秒
1 サイクル： 72℃で7分
【００４２】
従来技術(上記に引用のSambrook J.ら, 1989)にしたがって、増幅生成物のアリコート(10μl)を2%アガロースゲル上に置いて電気泳動分離に付し、装填したナイロン膜に毛管作用によって転移する。36 マー、e1954fp (SEQ ID NO:121)のオリゴヌクレオチドプローブ: 配列SEQ ID NO:11のフラグメントACCAGTATCAGCAGCAGTGGTGGTGAAAGCTCTGAAと膜をハイブリダイズした。このプローブによって、B19タイプおよびV9タイプのエリスロウィルスを検出することができる。
増幅生成物のアリコート(10μl)を制限酵素MunIの作用に2時間付し、次いで2%アガロースゲル上で電気泳動分離に付した。上記のように、開裂があればエリスロウィルスのタイプはB19であり、開裂がなければV9である。
【００４３】
NS1a PCRの結果:
旧B19 PCR(Lefrereら, Transfusion, 1995, 35:389-391)で中程度または微弱な陽性を示すことがわかった79個の試料を、新NS1a PCR(コンセンサスエリスロウィルス、本発明による配列)を用いてスクリーニングした。スクリーニングした79個の試料のうち、31個が陽性であり、制限酵素MunIによって分類された。このうち、18個(58%)がB19タイプ、13個(42%)がV9タイプであった。
NS1a PCRで陽性だった試料は、30サイクルの第1増幅工程(PCRS1)でプライマー対e1855f (SEQ ID NO:113)とe2960r (SEQ ID NO:114)を使用し、50 サイクルの第2増幅工程(PCRS2)でプライマー対e1863f (SEQ ID NO:115)とe2953r (SEQ ID NO:116)を使用することにより、反復(nested)PCR(S1S2 PCR)で1100 bpに増幅することができた。15個の試料が S1S2 PCRで陽性を示すことが分かり、1110 bpで配列決定された(NS1A PCRによる13個のB19タイプ、2個の変異体タイプ)。配列分析から、以下のことが示された:
【００４４】
- Bプライマー(センスプライマーe1905f、SEQ ID NO:105；およびアンチセンスプライマーe1987r、SEQ ID NO:106)は、15個の配列(B19タイプおよび変異体タイプ)のすべて、ならびに公知のB19配列のすべてにおいて完全に保存されている。このことは、B19およびV9のコンセンサス診断検査法におけるこれらの使用の重要性を立証している。
- 配列SEQ ID NO:11のフラグメントであるプローブe1954fp (SEQ ID NO:121)は、15個の配列および公知のB19配列すべてにおいて同様に完全に保存されている。
- B19配列は、それら(GenBank の7個のB19配列およびこの研究での13個のB19配列)のあいだに差異が1.2%以下の完全に均質な基を形成する。
- 最終的に、MunI消化でのNS1a PCRによって変異体エリスロウィルスに分類された2個の配列において、V9で4.5%以下の差異が認められる。
【００４５】
実施例 6: V9のキャプシド遺伝子VP1およびVP2のバキュロウィルス発現ベクターへのクローニング
第1の工程:
‐VP1遺伝子の細菌プラスミドへのクローニング
最終容量100 μlの反応混合物(20 mM Tris-HCl pH 8.8; 10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4; 2 mM MgSO4; 0.1% トリトンX-100; 0.1 mg/ml BSA; 0.2 mM dNTP; 25 pmolのセンスプライマー (e2435fStuI/BglII:
AAAGGCCTAGATCTTGTAGATTATGAGTAAAAC、SEQ ID NO:117)およびアンチセンスプライマー(e4813rEcoRI:GGGAATTCGGTGGGTGACGGTTCCTG、SEQ ID NO:118))中の10 μlのV9ウィルスDNA 10-2希釈液および2.5 UのPfu TurboTM (Stratagene, フランス)を用いて、Saikiらに記載の方法(Nature, 1986, 324:163-166)にしたがってV9のVP1遺伝子をPCRで増幅する。増幅プライマーは V9配列のVP1遺伝子のいずれかの側から選択し、その5'末端はクローニングを容易にするように制限部位(名称中に示す)を加えて修飾した。反応混合物に対して適用された温度サイクルは、以下の通りである。
【００４６】
1サイクル： 94℃で1分
20サイクル： 94℃で1分
55℃で1分
72℃で2.5分
1 サイクル： 72℃で10分
【００４７】
VP1遺伝子の増幅生成物をシリカカラム(QIAquick PCR精製キット, Qiagen, フランス)を用いて精製し、次いで制限酵素StuIおよびEcoRIの作用に付した。制限酵素の熱不活性化後(65℃で20分間)、0.025μmのフィルター(VSWP01300, Millipore)上で水に対して透析することにより、VP1遺伝子フラグメントを精製した。プラスミドpBacPAK8 (Clontech, フランス)を制限酵素StuIおよびEcoR1の作用に付し、次いでベクターをエビのアルカリホスフォターゼ(Boehringer, フランス)で脱リンする。制限酵素の熱不活性化後(65℃で20分間)、プラスミドをQIAquick PCR精製キット(Qiagen)で精製した。
【００４８】
連結は、50 ngのプラスミドpBacPAK8と100 ngのVP1フラグメント(上記のように調製)とT4リガーゼ(Life Technologies, フランス)を用いて行う。T4リガーゼの熱不活性化後(65℃で10分間)、水で1/2に希釈した2μlの連結生成物を25μlのエレクトロ-コンピテント細菌(Epicurian Coli Sure エレクトロポレーション-コンピテント細胞、Strategene)を用いてエレクトロポレートさせる。エレクトロポレートした細菌を直ちに1 mlのSOC培地(2%トリプトン, 0.5%の酵母エキス、10 mMのNaCl, 2.5 mMのKCl, 10 mMのMgCl2, 10 mMのMgSO4 および20 mMのグルコース)中に採取し、攪拌しながら37℃で1時間インキュベートする。次に、10μl、100μlおよび890μlの形質転換細菌を、50μg/mlのアンピシリンを含有するレノックス寒天の皿(10 g/lのペプトン、5 g/lの酵母エキス、5 g/lのNaClおよび13 g/lの寒天)にプレートする。37℃で24時間インキュベートした後、コンストラクト当たり24個のコロニーを5 mlの50 μg/mlアンピシリン含有レノックス培地で副培養し、攪拌しながら37℃で24時間インキュベートする。
【００４９】
プラスミドDNAをQIAprep 8 Turbo ミニプレップキット(Qiagen)を用いてアルカリ性ミニライシス(minilysis)で抽出し、Stu1/EcoRIおよびKpnI/HindIII制限部位によって分析し、インサートの存在とその方向性を確定する。クローンpB8-VP1.C5を選択し、組換えプラスミドをシーケンシングによって調べた。
- VP2遺伝子の細菌プラスミドへのクローニング
V9のVP2遺伝子を、Saikiらに記載の方法(Nature, 1986, 324:163-166)にしたがって、最終容量100 μlの反応混合物(20 mMのTris-HCl pH 8.8; 10 mMのKCl, 10 mMの(NH4)2SO4; 2 mMのMgSO4; 0.1%のトリトン X-100; 0.1 mg/mlのBSA; 0.2 mMのdNTP; 25 pmolのセンスプライマー(e3115fBamHI:
CACGGATCCATACCCCAGCATGACTTCAG, SEQ ID NO:119)およびアンチセンスプライマー(e4813rBamHI: CACGGATCCGGTGGGTGACGGTTCCTG, SEQ ID NO:120))中の10 μlのV9ウィルスDNA 10-2 希釈液と2.5 UのPfu TurboTM (Stratagene, フランス)とを用いてPCRで増幅させる。増幅プライマーはV9配列のVP2 遺伝子のいずれかの側で選択し、その5'末端はクローニングを容易にするために制限部位(名称中に示す)を加えて修飾した。反応混合物に適用された温度サイクルは、以下の通りである:
【００５０】
1サイクル： 94℃で1分
20サイクル： 94℃で1分
60℃で1分
72℃で2.5分
1サイクル： 72℃で10分
【００５１】
VP2遺伝子の増幅生成物をシリカカラム(QIAquick PCR精製キット、Qiagen, フランス)を用いて精製し、次いで制限酵素BamHIの作用に付した。VP2遺伝子フラグメントは、QIAquick PCR精製キット(Qiagen)で精製した。
プラスミドpBacPAK8 (Clontech, フランス)を制限酵素BamHIの作用に付し、次いでベクターをエビのアルカリホスファターゼ(Boehringer, フランス)を用いて脱リンする。エビのアルカリホスファターゼを熱不活性化した後(65℃で20分間)、プラスミドをフェノール/クロロホルム抽出で精製し、エタノールで沈澱させる。
連結は、50 ngのプラスミドpBacPAK8と100 ngのVP2フラグメント(上記のように調製)と、T4リガーゼ(Life Technologies, フランス)を用いて行う。T4リガーゼの熱不活性化後(65℃で10分間)、水で2/1に希釈した2μlの連結生成物を、25μlのエレクトロ-コンピテント細菌(Epicurian Coli Sure エレクトロポレーション-コンピテント細胞、Stratagene)を用いてエレクトロポレートする。エレクトロポレートした細菌を直ちに1 mlのSOC培地中に採取し、攪拌しながら37℃で1時間インキュベートする。次に、10μl、100μlおよび890μlの形質転換細菌を、50μg/mlアンピシリン含有レノックス寒天の皿で培養する。37℃で24時間インキュベートした後、コンストラクト当たり24個のコロニーを5 mlの50μg/mlアンピシリン含有レノックス培地で副培養し、攪拌しながら37℃で24時間インキュベートする。
【００５２】
QIAprep 8 Turbo ミニプレップキット(Qiagen)を用いてアルカリミニライシスでプラスミドDNAを抽出し、BamHIとSacIの制限部位によって分析し、インサートの存在とその方向性を決定する。クローンpB8-VP2.C20を選択し、組換えプラスミドをシーケンシングで調べた。VP2のイニシエーターATGのすぐ上流で除かれた塩基Aが確認できるが、この変異は無視できるものである。これは、VP2の発現を生じさせない。
【００５３】
第2の工程:
-VP1を発現する組換えバキュロウィルスの構築
プラスミドpB8-VP1.C5を、Bsu361(BacPAKTM バキュロウィルス発現系、Clontech)で線状化したバキュロウィルスBacPAk6とともに、リポフェクチンを用いてSF9昆虫細胞に形質移入する。溶菌プラーク法で2回の分離を行い、分離したプラークをニトロセルロース膜に転移し、次いでこの膜をV9のVP1遺伝子に特異的なDNAプローブでハイブリダイズする。
組換えバキュロウィルスBacPAK6-pB8-VP1.C4.2は、このようにして選択した。VP1タンパク質の発現は、この組換えバキュロウィルスに感染させたSF9細胞の細胞ペレットでウエスタンブロッティングすることによって確認された。バンドは予想された大きさのVP1 (約80 kDa)で確認されたが、これは抗-VP1-B19モノクローナル抗体(Argene, フランス)では認められない。このモノクローナル抗体は、V9のVP1タンパク質と交差反応しない可能性がある。
【００５４】
バキュロウィルスへのクローニングは、プライマーBac1とBac2(Clontech)を用いたPCRの後にシーケンシングして確認された。
-VP2を発現する組換えバキュロウィルスの構築
プラスミドpB8-VP2.C20を、Bsu361(BacPAKTM バキュロウィルス発現系、Clontech)で線状化したバキュロウィルスBacPAk6とともに、リポフェクチンを用いてSF9昆虫細胞に形質移入する。溶菌プラーク法で2回の分離を行い、分離したプラークをニトロセルロース膜に転移し、次いでこの膜をV9のVP2遺伝子に特異的なDNAプローブを用いてハイブリダイズする。
【００５５】
組換えバキュロウィルスBacPAK6-pB8-VP2.C1.3が、選択される。VP2タンパク質の発現は、この組換えバキュロウィルスに感染させたSF9細胞の細胞ペレットでウエスタンブロッティングすることによって確認した。抗-VP2-B19モノクローナル抗体(Argene, フランス)は、アクリルアミドゲル上でも明確に見ることができる見かけの分子量が約58 kDaのタンパク質を実際に検出する。電子顕微鏡では、V9のVP2タンパク質を発現する組換えバキュロウィルス感染後のSF9細胞の培養上清に、直径が約20〜30 nmのウィルス様粒子が確認される。得られたウィルス様粒子の大きさと外観は、あらゆる点でB19について記述のものと一致している。この観察から、V9のVP2タンパク質がバキュロウィルスから天然形態で産生されたことが確認される。というのは、これは自己集合によって中空キャプシドを形成することができるためである。
バキュロウィルスへのクローニングは、プライマーBac1とBac2(Clontech)を用いたPCRの後にシーケンシングすることによって確認された。
【００５６】
第3の工程:
バキュロウィルスで発現されたV9のタンパク質VP1とVP2は、精製すると、V9エリスロウィルス感染を診断するための新しい血清学的試験の標的抗原として使用されるであろう。
上記より明らかなように、本発明は単に明示的に記載した実施例、具体例および用途に限定されるものではない。本発明はそれどころか、本発明の範疇又は範囲から逸脱しないで当業者がなし得る全ての変形を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 エリスロウィルスＶ９の系統樹で、完全エリスロウィルス配列の系統樹を示す。
【図２】 エリスロウィルスＶ９の系統樹で、エリスロウィルスNS1遺伝子の系統樹を示す。
【図３】 エリスロウィルスＶ９の系統樹で、エリスロウィルスVP1遺伝子の系統樹を示す。
【図４】 完全エリスロウィルス配列についての遺伝子の距離を示す。
【図５】 エリスロウィルスNS1遺伝子についての遺伝子の距離を示す。
【図６】 エリスロウィルスVP1遺伝子についての遺伝子の距離を示す。
【図７】 配列ID NO:1の制限酵素地図を表す。
【配列表】
本発明は、ヒトのエリスロウィルス（erythrovirus）由来の核酸配列、そのフラグメントならびにそれらの診断試薬および免疫原性試薬としての応用に関する。
【０００２】
エリスロウィルスＢ１９と最近名づけられたパルボウィルスＢ１９による感染は世界中で一般に広く分布していることが、血清疫学研究により分かっている。
ヨーロッパにおいて、エリスロウィルスＢ１９の血清有病率は、５才未満の被験者の約１０％、２０才を越える被験者については約５０％であり、高齢者では９０％を越える。
この高い血清有病率は、エリスロウィルスＢ１９の感染性が高いことを示唆している。近距離で接触した被験者への伝染率は１０〜６０％で、感染経路は主に空気によるものである（呼吸器系分泌物）。
エリスロウィルスＢ１９は、ヒトに特異的なウィルスである。急性感染は、普通、子供に良性の斑点状皮膚丘疹を引き起こす（表皮性巨大紅斑または第５疾患（5th disease））。関節痛が湿疹に伴うこともあり、まれに慢性化する。
慢性溶血性貧血（鎌状赤血球貧血、サラセミア、ピルベートキナーゼ欠損症等）にすでに罹っている患者では、通常、一過性の急性赤芽球症が起こり、一過性の急性無再生貧血を引き起こす。
【０００３】
エリスロウィルスＢ１９の急性一次感染は妊婦には特に危険で、胎児への感染の危険性は３０％と推定される。貧血、肝機能不全、心機能不全及び胎盤不全による胎児死の危険性は、５〜９％と推定される。
エリスロウィルスＢ１９による慢性感染は、免疫が抑制されている被験者（慢性骨髄性白血病、体液性および細胞性免疫不全、組織あるいは骨髄の移植、エイズによる疾病）に主にみられる。
ＨＩＶ−１血清反応陽性の患者において、エリスロウィルスＢ１９による慢性感染は慢性貧血の原因となるが、他の系列にも作用する（好中球減少症、特に血小板減少症）。これらの患者に十分な体液性免疫反応が欠如していることから、慢性的にエリスロウィルスを血液中に保有する状態になる。この体液性免疫反応の欠如は、慢性赤芽球減少症の発症ならびに湿疹や関節痛等の他の症状がないことを説明する。
【０００４】
エリスロウィルスＢ１９は、約５.４ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを有するウィルスである。それは、現在のところ分類された唯一のエリスロウィルスである。配列が決定された株および配列ライブラリー（GenBankまたはEMBL）で公表の対象となった株の全ての遺伝子的変異性は低い（全ゲノムにわたって９８％の核酸配列類似性、ＶＰ１領域にわたって９６％の類似性）（R.O. SHADE, J. Virol., 1986, 58, 3, 921-936, B19-AU）。
エリスロウィルスＢ１９感染のウィルス学的診断は、培養が常套方法で実行できない限りにおいて、主にウィルスのゲノムの検出に基づく。
エリスロウィルスＢ１９の急性感染（一次感染）については、この検出は遺伝子増幅（PCR）によって実行できるが、一次感染時は通常きわめて高い（血清１mlにつき1014まで）ウィルスの力価を考慮するとハイブリダイゼーション（ドット-ブロット）でも可能である。しかしながら、慢性感染時はウィルスの力価がずっと低く、遺伝子増幅検出法しか考えられない。
【０００５】
これらの検出手法は,試験対象ウィルスの遺伝子的変異性しだいであって、公知のエリスロウィルスＢ１９配列から調製した試薬では、遺伝子増幅によっても或いはＢ１９血清診断によっても変異体エリスロウィルス感染の検出はできない。
実際、現行の血清診断試験はエリスロウィルスＢ１９に特異的である（国際出願PCT WO 91/12269; 国際出願PCT WO 96/09391 (IDEIAR パルボウィルスB19 IgG 及びIgM、DAKO; パルボウィルスB19 IgG 及びIgM 酵素イムノアッセイ、BIOTRIN)）。
その結果、上記の検出手法は、核酸レベルにおいても抗体反応に関しても陰性の結果を出す危険がある。
【０００６】
新しい変異体を同定することおよび考慮に入れることは下記の開発に重要である：
−十分に感受性でかつ特異的な、即ち偽陽性または偽陰性の結果を導かないヒトのエリスロウィルス感染の検出および診断（血清診断、PCR、ハイブリダイゼーション）用試薬、
−すべてのエリスロウィルス感染を防ぐことができる組成物（ワクチン）、および
−変異体エリスロウィルス感染を治療することができる組成物（血清療法、モノクローナル抗体）。
従って、発明者は変異体、即ちエリスロウィルスB１９から遺伝子的に距離のあるエリスロウィルス（エリスロウィルスタイプＶ９と呼ばれる）の検出ができるエリスロウィルス由来配列を提供することを目標とした。
【０００７】
本発明の主題は、下記からなる群から選択されることを特徴とする核酸配列である：
−エリスロウィルスＢ１９に関して全ゲノムにわたって１０％以上の遺伝子的差異あるいは距離（９０％未満の類似性）を示すので分子的にはエリスロウィルスB１９配列とは認められないエリスロウィルス由来の配列であって、配列SEQ ID NO:1に関して６％に等しいか、それより低い遺伝子的差異（９４％を越える類似性）を示すもの、
−配列SEQ ID NO:1、および
−前記配列ID NO:1とストリンジェントな条件のもとでハイブリッドできるヌクレオチド配列。
【０００８】
この変異体エリスロウィルスはタイプＶ９変異体と呼ばれる。
ストリンジェントな条件とは、本発明の目的では下記の条件を意味すると理解される：
・４２℃、５０％のホルムアミドを含む１xＳＳＣ緩衝液中で３〜２４時間ハイブリダイゼーション、および
・６０℃、２xＳＳＣ緩衝液の中で１５分３回洗浄。
配列SEQ ID NO:1は、エリスロウィルスタイプＶ９のゲノムの約９５％に相当し全てのコード配列を含み、特にBamHI部位（部位なし）、 HINDIII部位（１部位のみ）及び PvuII（５部位）に関してＢ１９エリスロウィルスとは異なる制限酵素地図を有する。
【０００９】
より具体的には、配列SEQ ID NO:1は、特に下記の制限部位によってエリスロウィルスＢ１９とは異なる制限プロフィールを有する： AccI、AflIII、AlwI、 AlwNI、ApaI、AvaI、AvaII、AvrII、BamHI、BanI、BanII、BbeI、BbsI、BceFI、BcgI、BcnI、BglII、BsgI、BsiEI、BsmI、BsmAI、Bsp120I、BspHI、BspMI、BsrFI、Bst1107I、BstEII、BstUI、Bsu36I、DpnI、DraIII、DsaI、EaeI、EagI、EarI、Ec1136I、EcoNI、Eco109I、EcoRI、EheI、FokI、HaeI、HaeIII、HgaI、HgiAI、HhaI、HincII、HindIII、HinPI、HpaI、KasI、MaeII、MboI、McrI、MscI、MunI、NarI、NciI、NcoI、NsiI、NspI、Nsp7524I、NspBII、 NspCI、PflMI、PmeI、Ppu10I、PpuMI、PstI、PvuII、SacI、Sau3AI、ScaI、SfaNI、SfcI、SmaI、SpeI、SphI、SspI、StuI、StyI、SwaI、Tth111I、XbaI、XmaI およびそのアイソシゾマー。
【００１０】
本発明の主題はまた、エリスロウィルスＶ９の検出を可能にできる配列ID NO:1のフラグメントであって、下記からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする：
a) SEQ ID NO:1の位置328-2340に相当しNS1タンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:81）,
b) SEQ ID NO:１の位置1796-2017に相当し7.5 kDa タンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:83）、
c) SEQ ID NO:1の位置2336-4678に相当しVP1タンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:85）、
d) SEQ ID NO:1の位置2336-3016に相当しVP1uをエンコードする配列（SEQ ID NO:87）、
e) SEQ ID NO:1の位置2523-2828に相当しXタンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:89）、
f) SEQ ID NO:1の位置3017-4678に相当しVP2をエンコードする配列（SEQ ID NO:91）、
g) SEQ ID NO:1の位置4488-4883に相当し11 kDaタンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:93）、
h) 配列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91 または SEQ ID NO:93のうちの1つとハイブリッドできるヌクレオチド配列、
i) 配列SEQ ID NO:2〜80、
j) 配列SEQ ID NO:105 (E1905f)、106 (E1987r)、107 (E2076f)、108 (E2151r)、109 (E2406r)、110 (E2149rs)、111 (E2717f)、112 (E2901r)、113 (e1855f)、114 (e2960r)、115 (e1863f)、116 (e2953)、117 (e2435fStul/BglII)、118 (e4813rEcoRI)、119 (e3115fBamHI)、120 (e4813rBamHI) および 121 (e1954fp) 、および
k) 上記の配列に相補的な配列、上記の配列由来であって少なくとも１７個のヌクレオチドからなる配列またはそれらの相補的配列。
【００１１】
本発明の文脈では、核酸配列またはヌクレオチド配列（DNAまたはRNA配列）は、上に定義したような配列およびそれらの相補的配列（アンチセンス配列）ならびに前記配列またはそれらのフラグメントの１つかそれ以上を含む配列の１つを意味すると理解される。
発明はまた、上記フラグメントに相補的なヌクレオチドフラグメント、ならびに上記フラグメントに対しその長さの約１５％の割合でのヌクレオチドの除去または付加によって修飾および／またはヌクレオチドの性質のレベルで修飾されたフラグメントを含む。ただし、修飾ヌクレオチドフラグメントが、対応する未変更フラグメントが示すものと類似の、エリスロウィルスＶ９DNAまたはRNA配列とのハイブリダイゼーション能力を保持するものとする。
【００１２】
これらのフラグメントの中には、特異的であってプローブまたはプライマーとして用いられるものがある。それらは、エリスロウィルスＶ９または関連エリスロウィルスに特異的にハイブリッドする。エリスロウィルスV９に関係するウィルスとは、６％に等しいか、それより低い遺伝子的差異を示すエリスロウィルスを意味すると理解される。これらのフラグメントは、配列SEQ ID NO:45〜80、NO:108および110またはそれらの相補的配列、これらの配列由来であって少なくとも１７個のヌクレオチドからなる配列、前記配列を含む配列からなる群から選択され、エリスロウィルスV９或いは関連エリスロウィルスの特異的同定にその用途が見出される。
これらのフラグメントの中には、配列SEQ ID NO:1のような、エリスロウィルスタイプＶ９或いは関連ウィルス由来の配列の増幅のためのプライマーとして用いられるものもある。これらのプライマーは、配列SEQ ID NO:2〜44および配列SEQ ID NO:105〜109 と111〜121またはそれらの相補的配列、これらの配列由来であって少なくとも１７個のヌクレオチドからなる配列からなる群から選択される。
【００１３】
前記フラグメントはまた、プライマーの場合、アンチセンス配列も含む。
そのような配列は、上記に定義したようなプローブおよび／または適切な制限酵素と組み合せてエリスロウィルス（エリスロウィルスＢ１９とエリスロウィルスＶ９）の識別同定に用途を見出す。
前記プライマーは、１７〜３０個のヌクレオチドからなるのが好ましい。好ましいプライマーは下記のものである：配列SEQ ID NO:105（配列SEQ ID NO:1の位置1797-1815）−配列SEQ ID NO:10に相当、配列SEQ ID NO:106 (配列SEQ ID NO:1の位置1899-1879)−配列SEQ ID NO:11のアンチセンス配列のフラグメントに相当、配列SEQ ID NO:107（配列SEQ ID NO:1の位置1968-1987）−配列SEQ ID NO:13のフラグメントに相当、配列SEQ ID NO:108（配列SEQ ID NO:1の位置2061-2043）−配列SEQ ID NO:58のアンチセンス配列のフラグメントに相当、配列SEQ ID NO:109（配列SEQ ID NO:1の位置2317-2298）−配列SEQ ID NO:16のアンチセンス配列のフラグメントに相当、配列SEQ ID NO:111（配列SEQ ID NO:1の位置2609-2627）−配列SEQ ID NO:19のフラグメントに相当、および配列SEQ ID NO:112（配列SEQ ID NO:1の位置2812-2793）−配列SEQ ID NO:23のアンチセンス配列のフラグメントに相当。
【００１４】
好ましいプライマー対は以下のものである：
−ペアＡ：プライマーSEQ ID NO:111とSEQ ID NO:112；
−ペアＢ：プライマーSEQ ID NO:105とSEQ ID NO:106；
−ペアＣ：配列SEQ ID NO:2〜44、105、106、107、109、111または112の中から１つと配列SEQ ID NO:45〜80、108または110の中から１つ；
−ペアＤ：プライマーSEQ ID NO:107とプライマーSEQ ID NO:109；
−ペアＥ：配列SEQ ID NO:2〜44、105、106、107、109、111または112から選択される２つのプライマー；
−ペアＦ：配列SEQ ID NO:45〜80、108または110から選択される２つのプライマー。
これらの様々なプライマーは、増幅されるフラグメントに応じてセンスプライマーまたはアンチセンスプライマーとして用いることができる。
【００１５】
本発明の主題はまた変異体エリスロウィルスであって、そのゲノムは分子的にエリスロウィルスＢ１９とは認めることができず、上記に定義したような配列SEQ ID NO:1に対し６％に等しいか、それより低い変異を示し、そのゲノムは上記に定義したようなストリンジェントな条件の下で上記に定義したような配列SEQ ID NO:45〜80、108および110の１つと特異的にハイブリッドすることを特徴とする。
本発明の主題はまたプラスミドであって、それは、エリスロウィルスＢ１９とは分子的に認めることができず、エリスロウィルスＢ１９に対して全ゲノムにわたり１０％を越える遺伝子差異を示し配列SEQ ID NO:1とは６％に等しいか、それより低い差異を示す、エリスロウィルスＶ９またはそのフラグメントと呼ばれる変異体エリスロウィルス株のウィルスゲノムを含むことを特徴とする。
【００１６】
前記エリスロウィルスＶ９のウィルスゲノムは、エリスロウィルスＢ１９から遺伝子的に距離があると考えられる。
前記プラスミドの有利な実施態様によれば、それは配列SEQ ID NO:1を含む(PCD.V9.C22)。
本発明の主題はまた、タイプＶ９エリスロウィルスの識別検出のための診断試薬であって、配列SEQ ID NO:45〜80、108および110から選択され任意に適切なマーカーで標識付けされていることを特徴とする。
適切なマーカーには、放射性同位体、酵素、蛍光色素、化学マーカー（ビオチン等）、ハプテン類（ジゴキシゲニン等）および抗体または適切な塩基類似体があげられる。
【００１７】
本発明の主題は、原材料として生物学的試料を用いてハイブリダイゼーションおよび／または遺伝子増幅によってエリスロウィルスを迅速に識別検出するための方法であって、この方法は下記からなることを特徴とする：
（１）分析対象生物学的試料を配列SEQ ID NO:45〜80、108または110の少なくとも１つのプローブと接触させる工程、および
（２）エリスロウィルスヌクレオチド配列プローブ相互作用によって生じた産物を適切な手段で検出する工程。
好ましくは、ハイブリダイゼーションは、５〜６０％のホルムアミド、１〜５x SSC、２％のブロッキング試薬（ブロッキング緩衝液、Boehringer Mannheim, Meylan, France）、０.１％ のN−ラウリルサルコシン、０.０１〜５％のSDSを含む緩衝液中で、４０〜７０°Cで９０分間行われる予備ハイブリダイゼーションを含み、その後、同じ組成の緩衝液３mlに１０(lの標識プローブを加え４０〜７０°Cで１〜３０時間ハイブリダイゼーションを行う。
【００１８】
前記の方法によれば、工程（１）に先立って下記の工程を含んでもよい：
・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程、および
・少なくとも１つの遺伝子増幅サイクル。
遺伝子増幅工程は、特に下記の遺伝子増幅手法の１つを利用して行われる：Q(−レプリカーゼでの増幅（I. Haruna ら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1965, 54, 579-587）、PCR (ポリメラーゼ連鎖反応) (R.K. Saiki ら、1986, Nature, 324:163-6)、LCR (リガーゼ連鎖反応) (F. Barany, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 189-193)、ERA (エンドラン (end-run) 増幅) (C. Adams ら、1994, Novel amplification technologies for DNA/RNA-based diagnostics meeting, San Francisco, CA, United States)、CPR (サイクリングプローブ反応) (P. Duck ら、Biotechniques, 1990, 9, 142-147) 或いはSDA (鎖置換増幅) (GT. Walker, 1994, SDA: novel amplification technologies for DNA/RNA-based diagnostics meeting, San Francisco, CA, United States)。
【００１９】
前記方法の有利な実施態様によれば、増幅サイクルは、配列SEQ ID NO:2〜44、105〜109および111〜112ならびにこれらの配列のフラグメント、好ましくは上記に定義したようなプライマーペアから選択される1対のプライマーを利用して実行される。
ペアAが用いられる場合、増幅産物は制限酵素ApaI (GGGCCC)の作用によってスクリーニングすることに利点がある。Ｂ１９ゲノムの増幅産物はApaIによって開裂する（149塩基対(bp)と55 塩基対(bp)の2つのフラグメントを生じる）が、一方、Ｖ９ゲノムの増幅産物はApaIによって開裂しない（204 bpの１つのフラグメント）。アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動法により、これらの制限フラグメントを識別することができる。
【００２０】
ペアBが用いられる場合、増幅産物は下記の制限酵素の１つの作用によってスクリーニングすることに利点がある：BglII (AGATCT)または MunI (CAATTG)；従って、エリスロウィルスＶ９またはＢ１９が関与しているかどうかによって、異なるフラグメントが得られる。BglII制限部位を含むフラグメントは上記のとおり変異体エリスロウィルスＶ９に特異的であるが、一方、Ｂ１９エリスロウィルスはこの領域にMunI部位を有する。Ｂ１９ゲノムの増幅産物はMunIによって開裂し (36 bpと67 bpの２つのフラグメントを生じる) 、BglIIによっては開裂しない (103 bpの１つのフラグメント)。一方、Ｖ９ゲノムの増幅産物はBglIIによって開裂し (19 bpと 84 bp の２つのフラグメント)、MunIによっては開裂しない (103 bpの１つのフラグメント)。 アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動法により、これらの異なる制限フラグメントを識別することができる。
ペアC（全てのエリスロウィルスとハイブリッドできるプライマーとエリスロウィルスＶ９と特異的にハイブリッドできるプライマー）が用いられた場合、またはペアF（エリスロウィルスＶ９と特異的にハイブリッドできる2つのプライマー）が用いられた場合、Ｖ９ゲノムは増幅されるが、Ｂ１９ゲノムについては特異的な増幅はない。
【００２１】
ペアDが用いられた場合、増幅産物は、配列SEQ ID NO:58〜60および110から選択される、エリスロウィルスＶ９に特異的な標識プローブとのハイブリダイゼーション、好ましくは配列SEQ ID NO:110のプローブとのハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることに利点がある。Ｖ９ゲノムの増幅産物は、これらのプローブ、特に配列SEQ ID NO:110のプローブと特異的にハイブリッドするが、一方、Ｂ１９ゲノムの増幅産物は上記のプローブとハイブリッドしない。
ペアEが用いられた場合、増幅産物は、配列SEQ ID NO:45〜80、108および110から選択される、エリスロウィルスＶ９に特異的なプローブとのハイブリダイゼーション法のいずれかによってスクリーニングされる。この場合、Ｖ９ゲノムの増幅産物はこのプローブとハイブリッドするが、Ｂ１９ゲノムの増幅産物はしない。
【００２２】
発明の主題はまた、上記の配列、これらの配列由来のフラグメントまたはそれらの相補的配列を、エリスロウィルス核酸配列のハイブリダイゼーション法または遺伝子増幅法を実行するために使用することであり、これらの方法は、個人のエリスロウィルスタイプＶ９による潜在的感染の生体外診断に用いることができる。
本発明の主題はまた、エリスロウィルスＶ９または関連ウィルスのスクリーニングおよび分類方法であって、配列SEQ ID NO:45〜80、108および110からなる群から選択され、任意に標識付けされたプローブを分類対象ウィルスの核酸と接触させ、得られた核酸−プローブハイブリッドを検出することを含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明の主題はまた、上記に定義したヌクレオチド配列によってエンコードされていることを特徴とする翻訳産物である。
本発明の主題はまた、特に上記に定義したような配列SEQ ID NO:81、83、85、87、89、91および93ならびにそれらに由来する7〜50個のアミノ酸からなるペプチドからなる群から選択されるヌクレオチド配列を利用して発現され得ることを特徴とする、タンパク質である。
ペプチドは今後、上記に定義したようなタンパク質とペプチドの両方を意味すると理解される。
そのようなペプチドは、特に、エリスロウィルスＶ９に誘導された抗体によって認識し、かつ／または抗エリスロウィルスＶ９抗体の産生を誘導することができる。
【００２４】
前記ペプチドは、特に、配列SEQ ID NO:82 (NS1タンパク質)、SEQ ID NO:86 (VP1タンパク質)、SEQ ID NO:88 (単VP1 タンパク質)、SEQ ID NO:92 (VP2 タンパク質) およびSEQ ID NO:95-104、即ち、VP1タンパク質のフラグメント[VP1aペプチド (SEQ ID NO:95)；VP1bペプチド (SEQ ID NO:96)；VP1cペプチド (SEQ ID NO:97)；ペプチドVP1d (SEQ ID NO:98)；ペプチドVP1e (SEQ ID NO:99) およびペプチドVP1f (SEQ ID NO:100)]、またはVP2タンパク質のフラグメント[ペプチドVP2a (SEQ ID NO:101)；ペプチドVP2b (SEQ ID NO:102)；ペプチドVP2c (SEQ ID NO:103)；ペプチド VP2d (SEQ ID NO:104)]ならびにそれらに由来する７〜５０個のアミノ酸からなるペプチドから選択される。
【００２５】
発明の主題はまた、特に合成手段によって得られた、発明によるヌクレオチド配列の１つまたはそれ以上の翻訳産物および／または上記に定義したようなペプチドの１つを含む免疫原性組成物である。
発明の主題はまた、上記のペプチドの１つまたはそれ以上に対する抗体と、それら抗体を特に個人のエリスロウィルスによる感染の生体外識別診断法を実行するために使用することである。
発明の主題はまた、エリスロウィルスＶ９感染の免疫学的検出法であって、
−抗エリスロウィルスＶ９抗体の検出のために、生物学的試料を発明によるペプチドと接触させること（血清診断法）と、
−エリスロウィルスV９ウィルスタンパク質の検出のために、生物学的試料を発明による抗体に接触させることを含み、
結果の読取が適切な手段、特にEIA、ELISA、RIA、蛍光によって明らかにされることを特徴とする。
【００２６】
実例として、発明によるそのような生体外診断法は、患者から採取した生物学的試料を発明による抗体または発明によるペプチドと接触させ、適切ないずれかの方法を利用して、特に標識抗免疫グロブリンを利用して、生物学的試料中に存在するかもしれないエリスロウィルスの抗原または抗体と前記抗体または前記ペプチドとの間でそれぞれ形成される免疫学的複合体を検出することを含む。
発明による試薬は、妊婦、貧血および／または慢性血小板減少症に罹っているHIV陽性患者、組織または骨髄被移植者及び中枢急性貧血（central acute anaemia）の患者でエリスロウィルスＢ１９検出試験が陰性である患者におけるＶ９エリスロウィルスおよび関連ウィルスの検出に特に有用である。
発明の主題は、これらに加えて、発明による少なくとも１つの試薬（プローブ、プライマーペア、ペプチドまたは抗体）を含むことを特徴とするエリスロウィルス診断キットである。
【００２７】
上記の特徴に加えて発明はさらに他の特徴を有するが、それらの特徴は、本発明の主題である方法の例示として下記に記載の実施態様ならびに添付図面から明らかになるであろう。
しかしながら、これらの例は発明の主題の例示としてのみ記載されたものであって何ら限定を加えるものではないことを理解すべきである。
【００２８】
実施例 1: 本発明による配列の形成
事実上V9変異体の全ゲノム(95%)を表す5028 bpのAatII/AatII制限フラグメントを、以下の方法によってシーケンシングベクターpcDNA2.1 (Invitrogen, オランダ)にクローンした。
1本鎖ウィルスDNAを、QIAamp血液キットカラム（Qiagen S.A.,フランス）を用いて急性赤芽球減少症発作患者の血清から抽出した。56℃の50mM NaCl緩衝液中で16時間のハイブリダイゼーションにより、ウィルスDNAを2本鎖DNAに変換する。次に、1.3μgの2本鎖ウィルスDNAにAatII制限酵素（18U）を37℃で2時間作用させ、次いで制限酵素を65℃で15分間不活性化する。Millipore(登録商標)VSWPO13000酢酸セルロースおよび硝酸エステル膜で、生成物を水に対して2時間透析する。このようにして調製した2本鎖ウィルスDNA AatII/AatII制限フラグメントを、連結反応工程を待つ状態で−20℃で凍結する。
【００２９】
AatIIフラグメントを受容するように、部位特異的挿入変異によってベクターpcDNA2.1を修飾する: 多数のクローニング部位のEagI制限部位を除去し、AatII部位で置換した。このようにしてつくったベクターpcDNA2.1aを細菌培養物中で増やし、QIAfilterプラスミド マキシ キット(Maxi Kit)(Qiagen S.A., フランス)を用いて精製した。次に、3μgのベクターpcDNA2.1aを酵素AatIIを用いて37℃で1時間制限作用に付し、エビのアルカリホスファターゼ(Boehringer Mannheim, Meylan, フランス)で脱リンする。酵素は、65℃で15分間不活性化する。
【００３０】
連結反応は、ベクター/ウィルスDNA挿入モル比1/1で行う。つまり上記のように調製した50 ngのベクターと100 ngのウィルスDNAインサートで、1 UのT4リガーゼ(Life Technologies, フランス)を用いて24℃で16時間行う。1/2に希釈した後、T4リガーゼを不活性化させるために連結生成物を65℃で熱し、次いで氷上で冷却する。エレクトロコンピテント細菌Sure(登録商標)(Stratagene, ハイデルベルク, ドイツ)を、2または4μlのこの連結溶液を用いてエレクトロポレートさせ(1500 V、50 μF、200 Ω)、次いで1 mlのSOC培地 (Life Technologies, フランス)で1時間インキュベートした後、100 μg/mlのアモキシリン、15 μg/mlのテトラサイクリン、100 μg/mlのIPTGおよび50 μg/mlのX-galを含有するルリアブロス寒天培地(Life Technologies, フランス)に塗布する。
24個の(組換え)白色コロニーを選択し、それらのプラスミドをDNAのミニプレップによって抽出し、概略の制限酵素地図(AatII、AatII + BamHI、BamHI、BamHI + BglII、HindII)によって、V9ウィルスインサートに大きさと制限酵素地図が適合しているインサートを含む2つの組換えクローンを選択することができた。
【００３１】
これら2つのクローン(2および22)は、自動シークエンサーABI 377 (Perkin Elmer、フランス)を用いて配列決定した。これらは実際に5028 bpのインサートを有しており 、2つの配列は位置1165以外で同一である(クローン2及び22について、それぞれクロ ーンAおよびG)。V9ウィルスDNAの直接配列により、位置1165のGが正しいことが決定 できた。したがって、配列がSEQ ID NO:1に相当するクローン22(PCD.V9.C22)が選択さ れた。
図1から6は、エリスロウィルスV9とエリスロウィルスB19との遺伝的距離を示す。これらの図において、種々のエリスロウィルス配列はGenBankの記憶用コード(mnemonic)(1997年10月発売の103.0)によって示している。
【００３２】
実施例 2: 特定のプローブを用いたDNAハイブリダイゼーション(ドットブロット、スロットブロットまたはマイクロプレート)によるV9タイプエリスロウィルスの診断
ウィルスDNAを、例えばQIAamp血液キットカラム(Qiagen S.A. フランス)、または核酸を抽出する他のいずれかの方法によって生物学的試料(血液、血清、血漿、羊水、骨髄、組織)から抽出する。溶液中のDNAを95℃で2分間変性させ、次いで氷上で冷却し、吸引濾過によってナイロン膜または硝酸セルロース膜上に移し、その後固定(膜を80℃で1時間加熱)する。次に、ストリンジェントな条件下で、例えば配列SEQ ID NO:1またはその相補的配列、またはそのフラグメント、特に配列SEQ ID NO:45〜SEQ ID NO:80および110とそれらの相補的配列、または適切に標識したこれらの配列のフラグメントなどのV9に特異なDNAプローブまたはRNAプローブを用いて膜をハイブリダイズする。この標識は、放射性元素(32P, 33P, 35S, 3H, 14Cまたは別の放射性同位元素)、低温標識(ビオチン)、蛍光マーカー、ジゴキシゲニン、またはDNAあるいはRNAフラグメントに結合するかまたは組み込まれてもよく、かつ特定の抗体またはルテニウムキレートで検出可能なその他の分子を用いた標識付けでもよい。放射活性元素を標識する場合には、オートラジオグラフィまたは放射性同位元素の放出を検出できるその他の方法(例えばPhosphorimager, Molecular Dynamics, Bondoufle, フランス)によって視覚化することができる。ビオチン標識の場合には、酵素/ストレプトアビジン複合体および適当な視覚化基質を用いて視覚化することができる。蛍光標識では、fluoro-Imager (Molecular Dynamics, Bondoufle, フランス)または蛍光放射を検出できる他のいずれかの装置を用いて視覚化することができる。ジゴキシゲニン(または他の抗原)を用いた標識では、視覚化は酵素(アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼまたはいずれかの他の酵素)に直接結合した抗ジゴキシゲニン抗体(または標識に使用した抗原に特異的な抗体)を用いるか、または間接的に、抗ジゴキシゲニン抗体(または標識に使用した抗原に特異的な抗体)と酵素に結合した抗体とを用いて行われる。視覚化には、複合体の酵素に適した基質が用いられる。ルテニウムキレート(TBRなど)を用いた標識の場合には、エレクトロ-ケミルミネッセンス反応(G.F. Blackburnら., Clin. Chem., 1991, 37:1534-1539)によって視覚化される。
【００３３】
この方法の変形は、ウィルスDNAをマイクロプレートまたは他の固形支持体に固定し、上記の標識プローブとハイブリダイズすることからなる。
この方法の別の変形は、未標識プローブをマイクロプレートまたは他の固形支持体に固定し、予め標識した試料のウィルスDNAとハイブリダイズすることからなる。
【００３４】
実施例 3: 遺伝子増幅(PCRつまりポリメラーゼ連鎖反応)およびハイブリダイゼーションによるV9タイプエリスロウィルスの診断
ウィルスDNAを、QIAamp血液キットカラム(Qiagen S.A., フランス)またはいずれかの他の核酸抽出法によって生物学的試料(血液、血清、血漿、羊水、骨髄、組織)から抽出する。
PCRはSaikiらに記載の方法(Nature, 1986, 324: 163-66)に基づき、最終容量100μlの反応混合物(50 mMのKCl; 10 mMのTris-HCl pH 8.3; 2.5 mMのMgCl2; 200μMのdNTP; 25 pmolのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド)中の10 μlのDNA溶液と1.5 IUのAmpliTaq GoldTM (Perkin Elmer, フランス)を用いて行う。増幅プライマーは、V9変異体DNAのみを増幅ように選択した20〜25 マーのオリゴヌクレオチドである。2つのプライマー(センスおよびアンチセンス)がV9に特異的な配列(SEQ ID NO:45〜80、 108および110)またはそれらの相補的配列のフラグメントであるか、またはプライマーの一方がV9に特異的な配列(SEQ ID NO:45〜80、108および110)またはそれらの相補的配列から選択され、もう一方のプライマーがB19エリスロウィルスおよびV9エリスロウィルスのいずれをもハイブリダイズすることができる配列(SEQ ID NO:2〜44, 105〜107, 109および111〜112)またはそれらの相補的配列から選択される。温度サイクルは、以下のプログラムに従ってサーモサイクラー(T9600、Perkin Elmer,フランス)により反応混合物に適用される。
【００３５】
1サイクル： 95℃で6分
5サイクル： 95℃で60秒、
60℃で30秒、
72℃で30秒
45サイクル： 95℃で30秒、
60℃で30秒、
72℃で30秒
1サイクル： 72℃で5分間
【００３６】
従来技術(Sambrook J.ら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor)にしたがって、増幅生成物を1.3%アガロースゲル上に置いて電気泳動分離に付し、装填したナイロン膜に毛管作用によって転移する。
プローブは20〜30マーのオリゴヌクレオチドであり、V9に特異的な配列(SEQ ID NO:45〜80、108および110)またはそれらの相補的配列のフラグメントである。これは、DIGオリゴヌクレオチド追跡キット(Boehringer Mannheim, Meylan, フランス)を用いてDIG-dUTPで3'に標識する。
転移膜は、50% ホルムアミド; 5x SSC; 2%の阻止試薬(Boehringer Mannheim, Meylan, フランス); 0.1%のN-ラウリルサルコシン; 0.02%のSDSからなる緩衝液中、42℃で90分間予めハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは、同組成の3mlの緩衝液中、10μlの標識プローブを用いて42℃で16時間行う。0.1% SDS含有2x SSC緩衝液中、60℃で10分間膜を2回洗浄し、次いで0.1% SDS含有1x SSC 緩衝液中、60℃で10分間2回洗浄する。その後、膜をDIG蛍光検出キット (Boehringer Mannheim, Meylan, フランス)およびオートラジオグラフィで視覚化する。
【００３７】
実施例 4: 遺伝子増幅およびハイブリダイゼーションによるB19タイプおよびV9タイプエリスロウィルスの集団診断および識別診断
ウィルスDNAを生物学的試料 (血液、血清、血漿、羊水、骨髄、組織)からQIAamp血液キットカラム(Qiagen S.A., フランス)またはその他のいずれかの核酸抽出法によって抽出する。
PCRは、Saikiらに記載の方法(上記に引用のNature, 1986)に基づき、最終容量100μlの反応混合物(50 mMのKCl; 10 mMのTris-HCl pH 8.3; 2.5 mMのMgCl2; 200μMのdNTP; 25 pmolのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド)中、10μlのDNA溶液と1.5 IUのAmpliTaq GoldTM (Perkin Elmer, フランス)を用いて行う。増幅プライマーは、B19DNAおよびV9変異体DNAを増幅するように選択した20〜25マーのオリゴヌクレオチドである。2つのプライマー(センスおよびアンチセンス)は、B19エリスロウィルスおよびV9エリスロウィルスのいずれをもハイブリダイズできる配列(SEQ ID NO:2〜44、105〜107、109および111〜112)またはそれらの相補的配列のフラグメントである。温度サイクルは、以下のプログラムに従ってサーモサイクラー(T9600, Perkin Elmer, フランス)で反応混合物に適用される。
【００３８】
1サイクル： 95℃で6分
5サイクル： 95℃で60秒
60℃で30秒
72℃で30秒
45サイクル： 95℃で30秒
60℃で30秒
72℃で30秒
1サイクル： 72℃で5分
【００３９】
従来技術(上記に引用のSambrook J.ら, 1989)にしたがって、増幅生成物を1.3%アガロースゲル上に置いて電気泳動分離に付し、装填したナイロン膜に毛管作用によって転移する。
プローブは20〜30マーのオリゴヌクレオチドで、V9に特異的な配列(SEQ ID NO:45〜80、108および110)もしくはそれらの相補的配列のフラグメントであるか、またはB19に特異的な配列のフラグメントであるか、最終的にはまたは、集団診断の実施を目的とする場合にはB19とV9のいずれをもハイブリダイズする配列(SEQ ID NO:2〜44または105〜107、109、111〜112)のフラグメントである。これは、DIGオリゴヌクレオチド追跡キット(Boehringer Mannheim, Meylan, フランス)を用いてDIG-dUTPで3'に標識する。
転移膜は実施例3に記載した条件下で予めハイブリダイズし、その後ハイブリダイズする。
【００４０】
実施例 5: 遺伝子増幅および制限酵素によるB19タイプおよびV9タイプエリスロウィルスの集団診断および識別診断
QIAamp血液キットカラム(Qiagen S.A., フランス)またはその他のいずれかの核酸抽出法による生物学的試料(血液、血清、血漿、羊水、骨髄、組織)からのウィルスDNAの抽出。
NS1a PCRは、Saikiらによる記載の方法にしたがって、最終容量50 μlの反応混合物(50 mMのKCl; 10 mMのTris-HCl pH 8.3; 2.5のmM MgCl2; 200μMのdNTP; 12.5 pmolのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド)中の5μlのDNA溶液、1.5 IUのAmpliTaq GoldTM (Perkin Elmer, フランス)および一対のプライマーB(センスプライマーe1905f、SEQ ID NO:105; およびアンチセンスプライマーe1987r、SEQ ID NO:106)を用いて以下の温度サイクルで行う (サーモサイクラーT9700, Perkin Elmer, フランス):
【００４１】
1 サイクル： 94℃で6分
5 サイクル： 94℃で30秒
55℃で1分
72℃で1分
45 サイクル： 94℃で30秒
60℃で30秒
72℃で30秒
1 サイクル： 72℃で7分
【００４２】
従来技術(上記に引用のSambrook J.ら, 1989)にしたがって、増幅生成物のアリコート(10μl)を2%アガロースゲル上に置いて電気泳動分離に付し、装填したナイロン膜に毛管作用によって転移する。36 マー、e1954fp (SEQ ID NO:121)のオリゴヌクレオチドプローブ: 配列SEQ ID NO:11のフラグメントACCAGTATCAGCAGCAGTGGTGGTGAAAGCTCTGAAと膜をハイブリダイズした。このプローブによって、B19タイプおよびV9タイプのエリスロウィルスを検出することができる。
増幅生成物のアリコート(10μl)を制限酵素MunIの作用に2時間付し、次いで2%アガロースゲル上で電気泳動分離に付した。上記のように、開裂があればエリスロウィルスのタイプはB19であり、開裂がなければV9である。
【００４３】
NS1a PCRの結果:
旧B19 PCR(Lefrereら, Transfusion, 1995, 35:389-391)で中程度または微弱な陽性を示すことがわかった79個の試料を、新NS1a PCR(コンセンサスエリスロウィルス、本発明による配列)を用いてスクリーニングした。スクリーニングした79個の試料のうち、31個が陽性であり、制限酵素MunIによって分類された。このうち、18個(58%)がB19タイプ、13個(42%)がV9タイプであった。
NS1a PCRで陽性だった試料は、30サイクルの第1増幅工程(PCRS1)でプライマー対e1855f (SEQ ID NO:113)とe2960r (SEQ ID NO:114)を使用し、50 サイクルの第2増幅工程(PCRS2)でプライマー対e1863f (SEQ ID NO:115)とe2953r (SEQ ID NO:116)を使用することにより、反復(nested)PCR(S1S2 PCR)で1100 bpに増幅することができた。15個の試料が S1S2 PCRで陽性を示すことが分かり、1110 bpで配列決定された(NS1A PCRによる13個のB19タイプ、2個の変異体タイプ)。配列分析から、以下のことが示された:
【００４４】
- Bプライマー(センスプライマーe1905f、SEQ ID NO:105；およびアンチセンスプライマーe1987r、SEQ ID NO:106)は、15個の配列(B19タイプおよび変異体タイプ)のすべて、ならびに公知のB19配列のすべてにおいて完全に保存されている。このことは、B19およびV9のコンセンサス診断検査法におけるこれらの使用の重要性を立証している。
- 配列SEQ ID NO:11のフラグメントであるプローブe1954fp (SEQ ID NO:121)は、15個の配列および公知のB19配列すべてにおいて同様に完全に保存されている。
- B19配列は、それら(GenBank の7個のB19配列およびこの研究での13個のB19配列)のあいだに差異が1.2%以下の完全に均質な基を形成する。
- 最終的に、MunI消化でのNS1a PCRによって変異体エリスロウィルスに分類された2個の配列において、V9で4.5%以下の差異が認められる。
【００４５】
実施例 6: V9のキャプシド遺伝子VP1およびVP2のバキュロウィルス発現ベクターへのクローニング
第1の工程:
‐VP1遺伝子の細菌プラスミドへのクローニング
最終容量100 μlの反応混合物(20 mM Tris-HCl pH 8.8; 10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4; 2 mM MgSO4; 0.1% トリトンX-100; 0.1 mg/ml BSA; 0.2 mM dNTP; 25 pmolのセンスプライマー (e2435fStuI/BglII:
AAAGGCCTAGATCTTGTAGATTATGAGTAAAAC、SEQ ID NO:117)およびアンチセンスプライマー(e4813rEcoRI:GGGAATTCGGTGGGTGACGGTTCCTG、SEQ ID NO:118))中の10 μlのV9ウィルスDNA 10-2希釈液および2.5 UのPfu TurboTM (Stratagene, フランス)を用いて、Saikiらに記載の方法(Nature, 1986, 324:163-166)にしたがってV9のVP1遺伝子をPCRで増幅する。増幅プライマーは V9配列のVP1遺伝子のいずれかの側から選択し、その5'末端はクローニングを容易にするように制限部位(名称中に示す)を加えて修飾した。反応混合物に対して適用された温度サイクルは、以下の通りである。
【００４６】
1サイクル： 94℃で1分
20サイクル： 94℃で1分
55℃で1分
72℃で2.5分
1 サイクル： 72℃で10分
【００４７】
VP1遺伝子の増幅生成物をシリカカラム(QIAquick PCR精製キット, Qiagen, フランス)を用いて精製し、次いで制限酵素StuIおよびEcoRIの作用に付した。制限酵素の熱不活性化後(65℃で20分間)、0.025μmのフィルター(VSWP01300, Millipore)上で水に対して透析することにより、VP1遺伝子フラグメントを精製した。プラスミドpBacPAK8 (Clontech, フランス)を制限酵素StuIおよびEcoR1の作用に付し、次いでベクターをエビのアルカリホスフォターゼ(Boehringer, フランス)で脱リンする。制限酵素の熱不活性化後(65℃で20分間)、プラスミドをQIAquick PCR精製キット(Qiagen)で精製した。
【００４８】
連結は、50 ngのプラスミドpBacPAK8と100 ngのVP1フラグメント(上記のように調製)とT4リガーゼ(Life Technologies, フランス)を用いて行う。T4リガーゼの熱不活性化後(65℃で10分間)、水で1/2に希釈した2μlの連結生成物を25μlのエレクトロ-コンピテント細菌(Epicurian Coli Sure エレクトロポレーション-コンピテント細胞、Strategene)を用いてエレクトロポレートさせる。エレクトロポレートした細菌を直ちに1 mlのSOC培地(2%トリプトン, 0.5%の酵母エキス、10 mMのNaCl, 2.5 mMのKCl, 10 mMのMgCl2, 10 mMのMgSO4 および20 mMのグルコース)中に採取し、攪拌しながら37℃で1時間インキュベートする。次に、10μl、100μlおよび890μlの形質転換細菌を、50μg/mlのアンピシリンを含有するレノックス寒天の皿(10 g/lのペプトン、5 g/lの酵母エキス、5 g/lのNaClおよび13 g/lの寒天)にプレートする。37℃で24時間インキュベートした後、コンストラクト当たり24個のコロニーを5 mlの50 μg/mlアンピシリン含有レノックス培地で副培養し、攪拌しながら37℃で24時間インキュベートする。
【００４９】
プラスミドDNAをQIAprep 8 Turbo ミニプレップキット(Qiagen)を用いてアルカリ性ミニライシス(minilysis)で抽出し、Stu1/EcoRIおよびKpnI/HindIII制限部位によって分析し、インサートの存在とその方向性を確定する。クローンpB8-VP1.C5を選択し、組換えプラスミドをシーケンシングによって調べた。
- VP2遺伝子の細菌プラスミドへのクローニング
V9のVP2遺伝子を、Saikiらに記載の方法(Nature, 1986, 324:163-166)にしたがって、最終容量100 μlの反応混合物(20 mMのTris-HCl pH 8.8; 10 mMのKCl, 10 mMの(NH4)2SO4; 2 mMのMgSO4; 0.1%のトリトン X-100; 0.1 mg/mlのBSA; 0.2 mMのdNTP; 25 pmolのセンスプライマー(e3115fBamHI:
CACGGATCCATACCCCAGCATGACTTCAG, SEQ ID NO:119)およびアンチセンスプライマー(e4813rBamHI: CACGGATCCGGTGGGTGACGGTTCCTG, SEQ ID NO:120))中の10 μlのV9ウィルスDNA 10-2 希釈液と2.5 UのPfu TurboTM (Stratagene, フランス)とを用いてPCRで増幅させる。増幅プライマーはV9配列のVP2 遺伝子のいずれかの側で選択し、その5'末端はクローニングを容易にするために制限部位(名称中に示す)を加えて修飾した。反応混合物に適用された温度サイクルは、以下の通りである:
【００５０】
1サイクル： 94℃で1分
20サイクル： 94℃で1分
60℃で1分
72℃で2.5分
1サイクル： 72℃で10分
【００５１】
VP2遺伝子の増幅生成物をシリカカラム(QIAquick PCR精製キット、Qiagen, フランス)を用いて精製し、次いで制限酵素BamHIの作用に付した。VP2遺伝子フラグメントは、QIAquick PCR精製キット(Qiagen)で精製した。
プラスミドpBacPAK8 (Clontech, フランス)を制限酵素BamHIの作用に付し、次いでベクターをエビのアルカリホスファターゼ(Boehringer, フランス)を用いて脱リンする。エビのアルカリホスファターゼを熱不活性化した後(65℃で20分間)、プラスミドをフェノール/クロロホルム抽出で精製し、エタノールで沈澱させる。
連結は、50 ngのプラスミドpBacPAK8と100 ngのVP2フラグメント(上記のように調製)と、T4リガーゼ(Life Technologies, フランス)を用いて行う。T4リガーゼの熱不活性化後(65℃で10分間)、水で2/1に希釈した2μlの連結生成物を、25μlのエレクトロ-コンピテント細菌(Epicurian Coli Sure エレクトロポレーション-コンピテント細胞、Stratagene)を用いてエレクトロポレートする。エレクトロポレートした細菌を直ちに1 mlのSOC培地中に採取し、攪拌しながら37℃で1時間インキュベートする。次に、10μl、100μlおよび890μlの形質転換細菌を、50μg/mlアンピシリン含有レノックス寒天の皿で培養する。37℃で24時間インキュベートした後、コンストラクト当たり24個のコロニーを5 mlの50μg/mlアンピシリン含有レノックス培地で副培養し、攪拌しながら37℃で24時間インキュベートする。
【００５２】
QIAprep 8 Turbo ミニプレップキット(Qiagen)を用いてアルカリミニライシスでプラスミドDNAを抽出し、BamHIとSacIの制限部位によって分析し、インサートの存在とその方向性を決定する。クローンpB8-VP2.C20を選択し、組換えプラスミドをシーケンシングで調べた。VP2のイニシエーターATGのすぐ上流で除かれた塩基Aが確認できるが、この変異は無視できるものである。これは、VP2の発現を生じさせない。
【００５３】
第2の工程:
-VP1を発現する組換えバキュロウィルスの構築
プラスミドpB8-VP1.C5を、Bsu361(BacPAKTM バキュロウィルス発現系、Clontech)で線状化したバキュロウィルスBacPAk6とともに、リポフェクチンを用いてSF9昆虫細胞に形質移入する。溶菌プラーク法で2回の分離を行い、分離したプラークをニトロセルロース膜に転移し、次いでこの膜をV9のVP1遺伝子に特異的なDNAプローブでハイブリダイズする。
組換えバキュロウィルスBacPAK6-pB8-VP1.C4.2は、このようにして選択した。VP1タンパク質の発現は、この組換えバキュロウィルスに感染させたSF9細胞の細胞ペレットでウエスタンブロッティングすることによって確認された。バンドは予想された大きさのVP1 (約80 kDa)で確認されたが、これは抗-VP1-B19モノクローナル抗体(Argene, フランス)では認められない。このモノクローナル抗体は、V9のVP1タンパク質と交差反応しない可能性がある。
【００５４】
バキュロウィルスへのクローニングは、プライマーBac1とBac2(Clontech)を用いたPCRの後にシーケンシングして確認された。
-VP2を発現する組換えバキュロウィルスの構築
プラスミドpB8-VP2.C20を、Bsu361(BacPAKTM バキュロウィルス発現系、Clontech)で線状化したバキュロウィルスBacPAk6とともに、リポフェクチンを用いてSF9昆虫細胞に形質移入する。溶菌プラーク法で2回の分離を行い、分離したプラークをニトロセルロース膜に転移し、次いでこの膜をV9のVP2遺伝子に特異的なDNAプローブを用いてハイブリダイズする。
【００５５】
組換えバキュロウィルスBacPAK6-pB8-VP2.C1.3が、選択される。VP2タンパク質の発現は、この組換えバキュロウィルスに感染させたSF9細胞の細胞ペレットでウエスタンブロッティングすることによって確認した。抗-VP2-B19モノクローナル抗体(Argene, フランス)は、アクリルアミドゲル上でも明確に見ることができる見かけの分子量が約58 kDaのタンパク質を実際に検出する。電子顕微鏡では、V9のVP2タンパク質を発現する組換えバキュロウィルス感染後のSF9細胞の培養上清に、直径が約20〜30 nmのウィルス様粒子が確認される。得られたウィルス様粒子の大きさと外観は、あらゆる点でB19について記述のものと一致している。この観察から、V9のVP2タンパク質がバキュロウィルスから天然形態で産生されたことが確認される。というのは、これは自己集合によって中空キャプシドを形成することができるためである。
バキュロウィルスへのクローニングは、プライマーBac1とBac2(Clontech)を用いたPCRの後にシーケンシングすることによって確認された。
【００５６】
第3の工程:
バキュロウィルスで発現されたV9のタンパク質VP1とVP2は、精製すると、V9エリスロウィルス感染を診断するための新しい血清学的試験の標的抗原として使用されるであろう。
上記より明らかなように、本発明は単に明示的に記載した実施例、具体例および用途に限定されるものではない。本発明はそれどころか、本発明の範疇又は範囲から逸脱しないで当業者がなし得る全ての変形を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 エリスロウィルスＶ９の系統樹で、完全エリスロウィルス配列の系統樹を示す。
【図２】 エリスロウィルスＶ９の系統樹で、エリスロウィルスNS1遺伝子の系統樹を示す。
【図３】 エリスロウィルスＶ９の系統樹で、エリスロウィルスVP1遺伝子の系統樹を示す。
【図４】 完全エリスロウィルス配列についての遺伝子の距離を示す。
【図５】 エリスロウィルスNS1遺伝子についての遺伝子の距離を示す。
【図６】 エリスロウィルスVP1遺伝子についての遺伝子の距離を示す。
【図７】 配列ID NO:1の制限酵素地図を表す。
【配列表】
Claims (23)
- エリスロウィルスＢ１９の配列と比較して全ゲノムにわたって１０％以上の遺伝子的変異を示すので分子的にエリスロウィルスＢ１９ゲノムとは認めることができないこと、配列SEQ ID NO:1に対し６％に等しいか、それより低い遺伝子的変異を示すこと、およびそのゲノムがストリンジェントな条件の下で配列SEQ ID NO:45〜80、108および110の１つと特異的にハイブリッドすることを特徴とする、エリスロウィルスタイプV9として知られる変異体エリスロウィルス。
- ａ)全てのコード配列を含み請求項１で定義されるエリスロウィルスタイプV9のゲノムの95％を示す配列SEQ ID NO:1のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ)−エリスロウィルスＢ１９配列に関して全ゲノムにわたって１０％以上の遺伝子的差異を示し、配列SEQ ID NO:1に関して６％に等しいか、それより低い遺伝子的差異を示す配列、および
−ストリンジェントな条件のもとで次の配列：SEQ ID NO:45〜80、SEQ ID NO:108、およびSEQ ID NO:110の１つとハイブリッドできる配列
からなる群より選択される配列を示す請求項１で定義されるエリスロウィルスタイプV9のゲノム
からなる群から選択されることを特徴とするポリヌクレオチド。 - 図7.1〜7.3の制限プロフィールを有することを特徴とする請求項２のポリヌクレオチド。
- 配列SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:93からなる群から選択される、エリスロウィルスタイプＶ９のタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする配列SEQ ID NO:1のフラグメント。
- 配列SEQ ID NO:45〜80、108およびNO:110、それらの相補的配列、少なくとも１７個のヌクレオチドからなるこれらの配列由来の配列および前記配列を含む配列からなる群から選択され、エリスロウィルスＶ９または関連エリスロウィルスの特異的同定においてプローブまたはプライマーとして用いることができることを特徴とする配列SEQ ID NO:1のフラグメント。
- 配列SEQ ID NO:2〜44、105〜107、109および111〜121、ならびにそれらの相補的配列からなる群から選択され、エリスロウィルスの識別検出のためにプライマーまたはプローブとして用いることができることを特徴とする配列SEQ ID NO:1のフラグメント。
- −対Ａ：プライマーSEQ ID NO:111とSEQ ID NO:112；
−対Ｂ：プライマーSEQ ID NO:105とSEQ ID NO:106；
−対Ｃ：配列SEQ ID NO:2〜44、105、106、107、109、111または112の中から１つと配列SEQ ID NO:45〜80、108または110の中から１つ；
−対Ｄ：プライマーSEQ ID NO:107とプライマーSEQ ID NO:109；
−対Ｅ：配列SEQ ID NO:2〜44、105、106、107、109、111または112から選択される２つのプライマー；および
−対Ｆ：配列SEQ ID NO:45〜80、108または110から選択される２つのプライマー
からなる群から選択されることを特徴とするプライマー対。 - 配列SEQ ID NO:45〜80、108、110及び121からなる群より選択されることを特徴とするプローブ。
- 請求項２または３に記載のポリヌクレオチド、または請求項４〜６のいずれか１項に記載のフラグメントを含むことを特徴とするプラスミド。
- 配列SEQ ID NO:1を含むことを特徴とする請求項９のプラスミド。
- 配列SEQ ID NO:45〜80、108および110、それらの相補的配列、少なくとも１７個のヌクレオチドからなるこれらの配列由来の配列から選択され、任意に適切なマーカーで標識付けされていることを特徴とする、タイプＶ９エリスロウィルス類の識別検出のための診断試薬。
- (１)分析対象生物学的試料を配列SEQ ID NO:45〜80、108または110の少なくとも１つのプローブと接触させる工程と、
(２)エリスロウィルスヌクレオチド配列プローブ相互作用によって生じた産物を適切な手段で検出する工程
とを含むことを特徴とする、原材料として生物学的試料を用いてハイブリダイゼーションおよび／または遺伝子増幅によってエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。 - 工程(１)に先立って、
・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・少なくとも１つの遺伝子増幅サイクル
とを含むことを特徴とする請求項１２の方法。 - 請求項７のプライマー対を利用して増幅サイクルが行われることを特徴とする請求項１３の方法。
- ・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・請求項７のプライマー対Ｂを利用する少なくとも１つの遺伝子増幅サイクルと、
・一方で配列SEQ ID NO:121とのハイブリダイゼーションによる、もう一方で制限酵素MunIの作用による、増幅した産物の検出
とを含むことを特徴とするエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。 - ・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・請求項７のプライマー対Ａを利用する少なくとも１つの遺伝子増幅サイクルと、
・制限酵素ApaIの作用による、増幅した産物の検出
とを含むことを特徴とするエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。 - ・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・請求項７のプライマー対Ｃを利用する少なくとも１つの遺伝子増幅サイクルと、
・増幅した産物の検出
とを含むことを特徴とするエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。 - ・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・請求項７のプライマー対Ｄを利用する少なくとも１つの遺伝子増幅サイクルと、
・配列SEQ ID NO:58〜60及び110からなる群より選択される配列を有するプローブとのハイブリダイゼーションによる、増幅した産物の検出
とを含むことを特徴とするエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。 - ・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・請求項７のプライマー対Ｅを利用する少なくとも１つの遺伝子増幅サイクルと、
・配列SEQ ID NO:45〜80、108及び110からなる群より選択される配列を有するプローブとのハイブリダイゼーションによる、増幅した産物の検出
とを含むことを特徴とするエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。 - ・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・請求項７のプライマー対Ｆを利用する少なくとも１つの遺伝子増幅サイクルと、
・増幅した産物の検出
とを含むことを特徴とするエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。 - 個人のエリスロウィルスによる潜在的感染の生体外診断に用いることができるエリスロウィルス核酸配列のハイブリダイゼーション法または遺伝子増幅法を実行するための請求項２または３のポリヌクレオチドあるいは請求項４〜６のいずれか１つのフラグメントの使用。
- 請求項５のフラグメントからなる群から選択され任意に標識付けされたプローブを任意に標識付けされた分類対象ウィルスの核酸と接触させ、得られた核酸−プローブハイブリッドを検出することを含むことを特徴とするエリスロウィルスＶ９または関連エリスロウィルスのスクリーニングおよび分類方法。
- 請求項１１の少なくとも１つの試薬および／または請求項７のプライマー対および／または請求項８のプローブを含むことを特徴とするエリスロウィルス診断キット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR97/15197 | 1997-12-03 | ||
| FR9715197A FR2771751B1 (fr) | 1997-12-03 | 1997-12-03 | Erythrovirus et ses applications |
| PCT/FR1998/002615 WO1999028439A2 (fr) | 1997-12-03 | 1998-12-03 | Erythrovirus et ses applications |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001525163A JP2001525163A (ja) | 2001-12-11 |
| JP4831864B2 true JP4831864B2 (ja) | 2011-12-07 |
Family
ID=9514085
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000523317A Expired - Fee Related JP4831864B2 (ja) | 1997-12-03 | 1998-12-03 | エリスロウィルス及びその応用 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7291452B1 (ja) |
| EP (1) | EP1037916B1 (ja) |
| JP (1) | JP4831864B2 (ja) |
| AT (1) | ATE469169T1 (ja) |
| AU (1) | AU757453B2 (ja) |
| CA (1) | CA2311297C (ja) |
| DE (1) | DE69841687D1 (ja) |
| DK (1) | DK1037916T3 (ja) |
| ES (1) | ES2348203T3 (ja) |
| FR (1) | FR2771751B1 (ja) |
| PT (1) | PT1037916E (ja) |
| WO (1) | WO1999028439A2 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2771751B1 (fr) * | 1997-12-03 | 2000-05-26 | Assist Publ Hopitaux De Paris | Erythrovirus et ses applications |
| US6642033B1 (en) * | 1999-07-20 | 2003-11-04 | V.I. Technologies, Inc. | Nucleic acids for detecting parvovirus and methods of using same |
| WO2003020742A1 (en) | 2001-08-31 | 2003-03-13 | Gen-Probe Incorporated | Assay for detection of human parvovirus b19 nucleic acid |
| EP2251441B1 (en) | 2004-02-10 | 2013-05-08 | F. Hoffmann-La Roche AG | Detection of parvovirus B19 |
| US20060057643A1 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-16 | Mccarthy Laurence R | Methods and compositions for detecting erythrovirus genotypes |
| WO2006137939A2 (en) | 2004-11-09 | 2006-12-28 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting group a streptococci |
| WO2007096199A2 (en) * | 2006-02-22 | 2007-08-30 | Ikdt Institut Kardiale Diagnostik Und Therapie Gmbh | Differential diagnostics and therapy of virally induced heart muscle disease |
| CA2673770A1 (en) | 2007-01-16 | 2008-07-24 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Human erythrovirus |
| WO2009038840A2 (en) * | 2007-06-14 | 2009-03-26 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of adventitious contaminant viruses |
| EP3257859B1 (en) | 2009-02-26 | 2020-09-23 | Gen-Probe Incorporated | Assay for detection of human parvovirus nucleic acid |
| US9598739B1 (en) | 2009-03-13 | 2017-03-21 | Grifols Therapeutics Inc. | Human erythrovirus |
| AU2011276328C1 (en) | 2010-07-06 | 2016-01-21 | Novartis Ag | Norovirus derived immunogenic compositions and methods |
| EP3009522B1 (en) | 2011-07-15 | 2019-09-04 | Gen-Probe Incorporated | Method for detecting hepatitis a virus nucleic acids in single-plex or multiplex assays |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU7966987A (en) * | 1986-09-08 | 1988-04-07 | Applied Biotechnology, Inc. | Empty viral capsid vaccines |
| JP2755817B2 (ja) * | 1988-11-14 | 1998-05-25 | アメリカ合衆国 | パルボウイルスキャプシド |
| NL8902301A (nl) | 1989-09-14 | 1991-04-02 | Rijksuniversiteit | Humaan parvovirus b19 eiwitten, hun produktie en hun gebruik in diagnostische assays en vaccins. |
| US6204044B1 (en) * | 1989-09-14 | 2001-03-20 | Caroline Sarah Brown | Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines |
| US6379885B1 (en) * | 1989-09-14 | 2002-04-30 | Rijksuniversiteit Te Leiden | Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines |
| DE4003826C2 (de) | 1990-02-08 | 1995-11-23 | Mikrogen Molekularbiol Entw | Peptide der Kapsidproteine VP1 oder VP2 des Parvovirus B19 |
| US6274307B1 (en) * | 1990-02-08 | 2001-08-14 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologically active peptides or polypeptides from the parvovirus B19 |
| JPH07147986A (ja) * | 1992-09-24 | 1995-06-13 | Denki Kagaku Kogyo Kk | ヒトパルボウイルス遺伝子、それによってコ−ドされるポリペプチド及び用途 |
| AU3698595A (en) * | 1994-09-22 | 1996-04-09 | Hans Wolf | Dna sequence and protein of the non-structural reading frame i of the human parvovirus b19 |
| FR2771751B1 (fr) | 1997-12-03 | 2000-05-26 | Assist Publ Hopitaux De Paris | Erythrovirus et ses applications |
| DE10030677A1 (de) | 2000-02-15 | 2001-08-16 | Peter Hechler | Schuhwerk mit einer Decksohle |
| US6668044B1 (en) | 2000-07-19 | 2003-12-23 | Xtend Communications Corp. | System and method for recording telephonic communications |
-
1997
- 1997-12-03 FR FR9715197A patent/FR2771751B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-03 JP JP2000523317A patent/JP4831864B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-03 WO PCT/FR1998/002615 patent/WO1999028439A2/fr not_active Ceased
- 1998-12-03 CA CA2311297A patent/CA2311297C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-03 AU AU14403/99A patent/AU757453B2/en not_active Ceased
- 1998-12-03 ES ES98958322T patent/ES2348203T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-03 DK DK98958322.4T patent/DK1037916T3/da active
- 1998-12-03 PT PT98958322T patent/PT1037916E/pt unknown
- 1998-12-03 AT AT98958322T patent/ATE469169T1/de active
- 1998-12-03 EP EP98958322A patent/EP1037916B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-03 DE DE69841687T patent/DE69841687D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-03 US US09/555,640 patent/US7291452B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-10-05 US US11/868,380 patent/US8105610B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2311297A1 (fr) | 1999-06-10 |
| WO1999028439A3 (fr) | 1999-07-22 |
| US7291452B1 (en) | 2007-11-06 |
| CA2311297C (fr) | 2012-10-02 |
| ATE469169T1 (de) | 2010-06-15 |
| US20080248528A1 (en) | 2008-10-09 |
| JP2001525163A (ja) | 2001-12-11 |
| FR2771751B1 (fr) | 2000-05-26 |
| AU1440399A (en) | 1999-06-16 |
| PT1037916E (pt) | 2010-08-30 |
| EP1037916B1 (fr) | 2010-05-26 |
| WO1999028439A2 (fr) | 1999-06-10 |
| DE69841687D1 (de) | 2010-07-08 |
| ES2348203T3 (es) | 2010-12-01 |
| EP1037916A2 (fr) | 2000-09-27 |
| AU757453B2 (en) | 2003-02-20 |
| DK1037916T3 (da) | 2010-09-27 |
| FR2771751A1 (fr) | 1999-06-04 |
| US8105610B2 (en) | 2012-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8105610B2 (en) | Method of making novel erythrovirus V9 VP2 capsid polypeptides | |
| JP4541712B2 (ja) | Ｐｔｌｖエンベロープタンパク質の表面成分をコードする配列を起源とするオリゴヌクレオチド及びそれらの使用 | |
| Sugieda et al. | Outbreaks of Norwalk-like virus-associated gastroenteritis traced to shellfish: coexistence of two genotypes in one specimen | |
| EP0217919B1 (en) | Type-specific papillomavirus dna sequences and peptides | |
| US8748092B2 (en) | Methods and compositions for detecting BK virus | |
| EP0905258A2 (en) | Method for detecting nucleic acid sequences based on the use of solid phase immobilised nucleotide probes (line probe assay) | |
| IE904540A1 (en) | "Post-transfusional non-A non-B hepatitis viral polypeptides " | |
| US5550016A (en) | Oligonucleotides of HCV, primers and probes therefrom, method of determining HCV genotypes and method of detecting HCV in samples | |
| JP3130024B2 (ja) | ウイルス検出用プライマー | |
| JP2001517072A (ja) | ヒト・サイトメガロウイルス組合せ抗原およびその使用 | |
| US6395512B1 (en) | DNA coding for a peptide of a papilloma virus main capside protein and use thereof | |
| US20030147917A1 (en) | Retrovirus from the HIV group and its use | |
| JP3141024B2 (ja) | オリゴヌクレオチド | |
| JPH09173100A (ja) | ホップ潜在ウイルスの遺伝子及び該ウイルスの検出方法 | |
| US6849431B2 (en) | Non-B, non-C, non-G hepatitis virus gene, polynucleotide, polypeptide, virus particle, method for isolating virus particle, and method for detecting virus | |
| BRPI0100837B1 (pt) | Sequência de dna que codifica a proteína externa de membrana antigênica e específica de salmonella typhi | |
| JPH05192200A (ja) | ヒトパピローマウイルスの検出方法 | |
| JPH06321991A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルス由来のポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子 | |
| JP3484727B2 (ja) | Ｂ型肝炎ウイルス由来のポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子 | |
| US20030059806A1 (en) | Probes for the detection of human papillomavirus | |
| JPH07236476A (ja) | 新規ネコ免疫不全ウイルス株及びその外被膜蛋白質遺伝子ｒｎａに対応するｄｎａ並びにネコ免疫不全ウイルスワクチン | |
| JP2004129673A (ja) | 新規ネコ免疫不全ウイルス株及びその外被膜蛋白質遺伝子ｒｎａに対応するｄｎａ並びにネコ免疫不全ウイルスワクチン | |
| JPH061799A (ja) | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチド、該ペプチドをコードする核酸断片およびその利用法 | |
| AU2012261529A1 (en) | Methods and compositions for detecting BK virus | |
| JPH08304403A (ja) | 抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051111 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080819 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20081114 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20081121 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090217 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100302 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100531 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100607 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100831 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110301 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110610 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20110801 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110823 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110920 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140930 Year of fee payment: 3 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |