JP4838962B2 - Recombinant Sendai virus vector for exogenous gene transfer into airway epithelial cells - Google Patents
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Description
【０００１】
技術分野
本発明は、気道上皮細胞への外因性遺伝子導入用組換えセンダイウイルスベクター及びそのベクターを用いた外因性遺伝子導入方法に関する。
【０００２】
背景技術
分子クローニング技術の進歩に伴い、その変異が重要なヒトの疾患を引き起こしている多くの遺伝子が同定及び単離されている。ヒト患者において、欠損または変異を起こしている遺伝子をエクスビボ技術によって置き換えることが可能であり、これは、インビトロでDNAそのもの、リポソームに包含されたDNA、または適当な染色体組み込み型のベクターで細胞を形質転換して、宿主器官に導入することによって実施される（エクスビボ遺伝子治療）。
【０００３】
遺伝子治療は、所望の遺伝子を被験者に導入し、それをインビボで発現させる治療手段を提供する。遺伝子導入は、被験者の細胞または組織をエクスビボで形質転換し、形質転換体を宿主に再び導入することにより実施される。遺伝子を直接被験者に投与することも可能である。
【０００４】
Nabelら（Science (1990) 249: 1285-1288）は、β-gal発現プラスミドを含むリポソームを用いてブタの動脈内でのインビボによる形質転換を行い、動脈壁での部位特異的な遺伝子発現を観察した。エクスビボ治療には、いくつかの欠点がある。例えば、分化した複製している細胞のみが形質転換された場合、それらの細胞が成熟し、死に至れば、導入された遺伝子の機能は失われてしまう。また、エクスビボ法では、限られた数の細胞を形質転換させることはできるが、最初に体内から取り出された細胞しか形質転換させることはできない。
【０００５】
このように遺伝子治療においては、導入すべき遺伝子、導入遺伝子を発現させる標的細胞、標的組織に適した遺伝子導入方法、投与経路を適切に選択することが極めて重要である。
【０００６】
嚢胞性繊維症（cystic fibrosis; ＣＦ）は、先天的代謝異常を起こす常染色体劣性遺伝病である。ＣＦ患者は欧米で高頻度で見られ、2,000〜2,500児に１人の頻度で本疾患に罹患している。主な症状として、肺、気道、膵臓、肝臓、および小腸などの臓器において、外分泌異常による粘液性分泌物が貯留する。ＣＦの現行治療は、肺移植および肺感染症の抗生物質治療を中心に行われているが、特に肺の感染症は致命的である。
【０００７】
ＣＦの原因遺伝子である嚢胞性線維症膜貫通伝導性制御因子（cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator；CFTR）遺伝子が明らかにされており（Riordan, J.R.ら, Science 245: 1066-1073, 1989）、正常なCFTR遺伝子を有するベクターを気道上皮細胞に導入する、ＣＦの遺伝子治療の開発が期待されている。肺及び上気道にエクスビボ治療を適用することができないため、ＣＦの遺伝子治療において外因性遺伝子はインビボで導入されると思われる。
【０００８】
肺へのベクター投与に関しては、以下のような試みがなされている。Hazinskiら（Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1991)
4: 206-209）は、齧歯類動物の無傷の肺へのリポソームを介したDNAの導入を開示している。カチオン性リポソームと、３つの遺伝子から構成される融合遺伝子、すなわち(1)ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーターに連結しているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子、(2)マウス乳ガンウイルス（MMTV）プロモーターに連結しているCAT遺伝子、及び(3)サイトメガロウイルス−β−ガラクトシダーゼ（CMV-β-gal）融合遺伝子、とを複合体化させた。このリポソーム／DNA複合体をラットの頸部気管に投与し、検出可能な程度の遺伝子発現を観察した。
【０００９】
Brighamら（Am. J. Med. Sci. (1989) 298: 278-281）はリポソーム媒体を介したCAT遺伝子のマウス肺へのインビボ形質転換を開示している。静脈内、気管内、または腹腔内注射により形質転換が行われた。静脈内及び気管内投与では肺でのCAT遺伝子発現が見られたが、腹腔内投与では見られなかった。
【００１０】
Canonicoら（Clin. Res. (1991) 39:219A）はウシ肺上皮培養細胞でのCMVプロモーターの支配下にあるヒトα-1アンチトリプシン遺伝子の発現を記載している。遺伝子はリポソームを介して培養細胞に導入された。リポソームと複合体化した遺伝子構築物を静脈内投与したニュージーランド白兎の肺組織切片において、α-1アンチトリプシンの存在が検出された。
【００１１】
さらに、米国特許第5,958,893号は、アデノウイルスベクターやカチオン性リポソームのような現在利用可能なベクターを使用して、低分子量化したCFTRをコードする遺伝子の導入方法を開示している。
【００１２】
しかしながら、アデノウイルスを介して遺伝子を気道上皮細胞へ導入した場合、遺伝子導入効率が低いことが報告されている。気道上皮細胞の先端表面にアデノウイルスのレセプターであるαβγ3インテグリン及びＣＡＲ受容体の両方が存在しないため、先端原形質膜へのアデノウイルス粒子の取り込み速度が低いことがその原因と考えられている（Goldman,
M.ら, Gene Ther. 3: 811-818, 1996, Boucher, R.C., J. Clin. Invest 103: 441-445,
1999）。また、カチオン性リポソームを用いた場合は、気道粘液がその取り込みを妨げており、粘膜を取り除くことによって遺伝子導入効率を上げることができることが報告されている（Kitson,
C.ら, Gene Ther. 6: 534-546, 1999, Zabner, J.ら, J. Biol. Chem. 270: 18997-19007,
1995, Fasbender, A.ら, Gene Ther. 4: 1173-1180, 1997）。
【００１３】
現在まで、気道上皮細胞に効率よく外因性遺伝子を導入できるベクター系または遺伝子導入方法は知られていない。したがって、気道上皮細胞へ効率よく遺伝子導入を行うためのベクターの開発が切望されている。
【００１４】
パラミクソウイルス科に属するセンダイウイルスは、遺伝子導入用ベクターとして非常に有用であり、その開発が進められている。（Kato, A.ら, EMBO J.
16: 578-598, 1997, 国際公開公報第97/16538号、国際公開公報第97/16539号）。センダイウイルスベクターは毒性が低く、導入された遺伝子は極めて高レベルで発現される。また、ウイルスベクター内の遺伝子挿入物が宿主染色体へ導入されることがないため、安全性にも優れている。センダイウイルスベクターの形質転換能がアデノウイルスのものとは異なることが示されている（Goldman,
M.ら, Gene Ther. 3: 811-818, 1996, Boucher, R.C., J. Clin. Invest 103: 441-445,
1999）。例えば、アデノウイルスは損傷していない部位に比べ、損傷部位に感染しやすい（Kiston, C.ら, Gene Ther. 6: 534-546,
1999, Zabner, J.ら, J. Biol. Chem. 270: 18997-19007, 1995, Fasbender, A.,ら, Gene
Ther. 4: 1173-1180, 1997）。これらの報告により、センダイウイルスベクターがアデノウイルスの欠点を相補することが示唆される。
【００１５】
発明の開示
本発明は、気道上皮細胞への外因性遺伝子導入用ベクターおよびそのベクターを用いた外因性遺伝子導入方法を提供することを課題とする。
【００１６】
本発明者らは、外因性遺伝子を保持する組換えセンダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びカチオン性脂質複合体のインビトロ及びインビボにおける種々の動物由来の気道上皮細胞への遺伝子導入効率を調べた。その結果、アデノウイルスベクター及びカチオン性脂質複合体に比べ、組換えセンダイウイルスベクターの気道上皮細胞への外因性遺伝子導入効率が顕著に優れていることを見出した。
【００１７】
また、本発明者らは、組換えセンダイウイルスベクターにより、許容性のマウス気道だけでなく、大型の動物である非許容性のケナガイタチ、ヒツジ、及びヒトの気道上皮細胞へ外因性遺伝子を効率よく形質転換できることを見出した。さらに、上皮細胞の先端表面だけでなく、無傷の粘膜下組織腺にも感染することを見出した。これらの所見を基にして本発明を完成した。
【００１８】
具体的には、本発明は、外因性遺伝子を保持する組換えセンダイウイルスベクターを含む、気道上皮細胞への外因性遺伝子導入用組成物に関する。
【００１９】
また、本発明は、外因性遺伝子を保持する組換えセンダイウイルスベクターを含む組成物を粘液に被覆された気道上皮細胞に接触させることを含む、気道上皮細胞への外因性遺伝子導入方法を提供する。
【００２０】
以下に本発明をより詳細に説明する。
【００２１】
本明細書において、「組換えセンダイウイルスベクター」とは組換えセンダイウイルスcDNAよりウイルス及びウイルス様粒子を再構成したものを意味し、組換えセンダイウイルスRNAと感染力を有するセンダイウイルスの構造部分を含む。ここで、「感染力」という用語は、ウイルスと細胞との接着能を介して細胞の内部に核酸等を導入する能力、およびウイルスの膜と宿主細胞膜との融合を含む様々なメカニズムを介して細胞の内部に導入する能力を意味する。組換えセンダイウイルスベクターはリボ核タンパク質（RNP）であってもよい。
【００２２】
「遺伝子」とはRNA及びcDNAを含む。
【００２３】
「気道上皮細胞」とは、多列繊毛上皮細胞の他に、杯細胞及びクラーラ細胞を意味し、これらは、鼻腔、喉頭、気管もしくは任意の誘導気道における気道の内面に存在するか、または肺におけるI型及びII型肺胞細胞を含むガス交換肺胞表面上に存在する。
【００２４】
本発明に用いられる組換えセンダイウイルスベクターは、組換えセンダイウイルス遺伝子を保持する。天然型センダイウイルスのゲノムは、3'の短いリーダー領域に続き、ヌクレオキャプシド（N）遺伝子、ホスホ（P）遺伝子、マトリックス（M）遺伝子、フュージョン（F）遺伝子、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（HN）遺伝子、およびラージ（L）遺伝子、および短い5'トレイラー領域をこの順序で含んでいる。
【００２５】
組換えセンダイウイルスベクターを作成するための出発材料となるセンダイウイルス遺伝子は、再構成された組換えセンダイウイルスベクターが気道上皮細胞に感染して、ベクターが保持する外因性遺伝子を感染した細胞において発現できるかぎり、欠失または改変されていてもよい。例えば、DI粒子（J.
Virol. 68: 8413-8417, 1994）などの不完全ウイルスを用いることも可能である。
【００２６】
また、遺伝子治療のためには、組換えセンダイウイルスベクターが感染力を有しているが、伝播力を欠如していることが好ましい。伝播力を欠如させるためには、F遺伝子、HN遺伝子、およびM遺伝子の少なくともひとつを欠失させておくことが好ましい。そのようなベクターには、例えば、F遺伝子が欠失したセンダイウイルスＺ株の遺伝子が含まれる。さらなる例として、pSeV18+b(+)(Yu,
D.ら, Genes to Cells 2: 457-466, 1997)またはpSeV(+)（Kato, A.ら, EMBO J. 16: 578-587,
1997）が挙げられる。
【００２７】
組換えセンダイウイルス遺伝子は、上記のセンダイウイルス遺伝子に外因性遺伝子を挿入することによって得られる。標的とする気道上皮細胞において発現させたいタンパク質をコードする限り、任意の外因性遺伝子を使用することができる。例えば、ＣＦの遺伝子治療のためには、ＣＦの原因遺伝子であるCFTR遺伝子（Riordan,
J.R.ら, Science 245: 1066-1073, 1989）が用いられる。外因性遺伝子は天然型タンパク質をコードする遺伝子であってもよく、また欠失、置換または挿入により改変された上記遺伝子であって、且つ天然型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、改変されたCFTR遺伝子は米国特許第5,958,893号に開示されている。その他の外因性遺伝子の例としては、α-1アンチトリプシン（Longら,
Biochem. 23:4828-2837, 1984）、DNase、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、カタラーゼ等をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２８】
外因性遺伝子を有する組換えセンダイウイルスベクターは、例えば、Kato, A.ら（1997, EMBO J. 16: 578-587）及びYu, D.ら（1997,
Genes Cells 2: 457-466）の記載に基づいて、次のようにして構築することができる。
【００２９】
まず、所望の遺伝子のcDNA塩基配列を含むDNA試料を用意する。DNA試料は、25ng/μl以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。但し、目的とするcDNA配列の中にNotI認識部位が含まれる場合は、予め除去しておく。この試料から所望の遺伝子断片を増幅回収するために、NotI制限酵素切断部位配列；後述する転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）、及び転写開始配列（Ｓ）配列；並びに目的遺伝子の一部の配列、を含むプライマー対として、フォワード側合成DNA配列及びリバース側合成DNA配列(アンチセンス鎖)を作成する。
【００３０】
フォワード側合成DNA配列は5'側から任意の２個以上のオリゴDNA、好ましくはGCG、GCCのNotI認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはACTTを選択し、その3'側にNotI認識部位gcggccgcを付加し、さらにその3'側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加する。さらにその3'側に所望のcDNAの開始コドンATGからATGを含めてORFの２５塩基相当の配列を付加する。但しフォワード側合成オリゴDNAの3'末端がGまたはCのいずれかとなるように、所望のcDNAから２５塩基近傍を選択する。
【００３１】
リバース側合成DNA配列は5'側から任意の２個以上のオリゴDNA、好ましくはGCG及びGCCのNotI認識部位由来の配列が含まれない、４塩基、更に好ましくはATCCを選択し、その3'側にNotI認識部位gcggccgcを付加し、さらにその3'側に長さを調節するための挿入断片のオリゴDNAを付加する。このオリゴDNAの長さは、NotI認識部位gcggccgcを含め、cDNAの相補鎖塩基数と後述するセンダイウイルスに由来するセンダイウイルスゲノムのＥＩＳ塩基数の合計が６の倍数になるように設計する（いわゆる「6のルール（rule
of six）」；Kolakofski, D.ら, J. Virol. 72:891-899, 1998, Calain, P. and Roux, L.,
J. Virol. 67:4822-4830, 1993）。挿入断片の3'側に、センダイウイルスのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは5'-CTTTCACCCT-3'、Ｉ配列、好ましくは5'-AAG-3'、及びＥ配列の相補鎖配列、好ましくは5'-TTTTTCTTACTACGG-3'、所望のcDNA配列の終始コドンから逆に数えて２５塩基相当の最後がＧまたはＣのいずれかになるような相補配列を付加することによって、リバース側合成オリゴDNAの3'末端を調製する。
【００３２】
PCRは、ExTaqポリメラーゼ（宝酒造）を用いる通常の方法を用いることができる。好ましくはVentポリメラーゼ（NEB）を用いて行い、増幅した目的断片はNotIで消化した後、プラスミドベクターpBluescriptのNotI部位に挿入する。得られたPCR産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。これをNotIで切断しセンダイウイルスのゲノムcDNAプラスミド、例えば、pSeV18+b(+)(Yu,
D.ら, Genes to Cells 2: 457-466, 1997)またはpSeV(+)（Kato, A.ら, EMBO J. 16: 578-587,
1997）、のNotI部位に挿入し、外因性cDNAが組込まれた組換えセンダイウイルスcDNAを得る。またプラスミドベクターpBluescriptを介さずにNotI部位に直接挿入し、組換えセンダイウイルスcDNAを得ることも可能である。
【００３３】
上記のようにして作製した組換えセンダイウイルスcDNAをインビトロまたは細胞内で転写させ、ウイルスを再構成させることによって、組換えウイルスベクターを得ることができる。cDNAからのウイルスの再構成は公知の方法を用いて行うことができる（国際公開公報第97/16538号、国際公開公報第97/16539号）。
【００３４】
cDNAからの再構成は次のようにして行うことができる。
【００３５】
６穴のプラスチックプレート上で、10％ウシ胎児血清(FCS)および抗生物質（100 units/ml ペニシリンGおよび100μg/ml ストレプトマイシン）を含む最少必須培地（MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株LLCMK2を70〜80％コンフルエント（1×106細胞）になるまで培養した。この細胞に、T7ポリメラーゼを発現するUV照射により不活化した組換えワクシニアウイルスvTF7-3（Fuerst,
T.R.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986、Kato, A.ら, Genes Cells 1:
569-579, 1996）を2 PFU/細胞で感染させる。感染1時間後、60〜2μg、より好ましくは3〜5μgの上記の組換えセンダイウイルスcDNAを、全長センダイウイルスゲノムの生成に必須なトランスに作用するウイルスタンパク質を発現するプラスミド（24〜0.5μgのpGEM-N、12〜0.25μgのpGEM-P、および24〜0.5μgのpGEM-L、より好ましくは1μgのpGEM-N、0.5μgのpGEM-P、および1μgのpGEM-L)（Kato,A.ら, Genes Cells 1: 569-579, 1996）と共にSuperfect（QIAGEN社）を用いたリポフェクション法等のトランスフェクション法によってトランスフェクションする。トランスフェクションを行った細胞は、100μg/mlのリファンピシン（Sigma）及びシトシンアラビノシド（AraC）、より好ましくは40μg/mlのシトシンアラビノシド（AraC）（Sigma）を含む血清不含のMEMで培養し、ワクシニアウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Kato,
A.ら, Genes Cells 1: 569-579, 1996）。トランスフェクションから48時間後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、10日齢の発育鶏卵の漿尿膜内へ接種する。３日後、漿尿液を回収し、ウイルス力価は赤血球凝集活性(HA)を測定することにより決定する。HAは「エンドポイント（endo-point）希釈法」（Kato,
A.ら, Genes Cells 1: 569-579, 1996）により決定することができる。HAが確認されなかった試料は、さらに発育鶏卵に試料を接種する。回収されるセンダイウイルスの力価は108〜109
PFU/mlであり、共に含まれていたワクシニアウイルスvTF7-3は103〜104 PFU/ml以下である。試料を106倍に希釈し鶏卵で再増幅させ、ワクシニアウイルスを除去する。この２回目または３回目の発育鶏卵における継代で得られた組換えウイルスを保存し、所望のcDNAが組込まれた組換えセンダイウイルスベクターを得る。保存ウイルスのプラーク形成能は、一般的に109
PFU/mlまたは10,240 HA unit/mlの力価を有し、ウイルスを-80℃で保存すると力価が維持されると考えられる。
【００３６】
組換えセンダイウイルスcDNAが細胞内で再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。宿主として使用される細胞株には、LLCMK2細胞およびヒト由来の細胞の他に、サル腎臓由来のCV-1細胞や、ハムスター腎臓由来のBHK細胞などの培養細胞を使うことができる。
【００３７】
再構成した組換えセンダイウイルスは、そのエンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるように、接着因子、リガンド、受容体等が結合していてもよい。
【００３８】
本発明の組換えセンダイウイルスベクター含有組成物としては、上記のウイルスベクターを含んだ漿尿液を使用することができる。
【００３９】
本発明の組成物には、脱イオン水、5%デキストロース水溶液等の生理学的に許容しうる媒体を含んでいてもよい。安定剤、殺生物剤等のその他の助剤が含有されていてもよい。さらに、組換えセンダイウイルスベクター含有組成物は凍結乾燥物として製剤化されていてもよい。その場合、上述の助剤に加えて、アルブミン、プリオネクス（Prionex（登録商標）、ペンタファームジャパン）等の安定化剤を含有していてもよい。
【００４０】
組換えセンダイウイルスベクター含有組成物を粘膜に被覆された気道上皮細胞に接触させることで、組換えセンダイウイルスに含有されている外因性遺伝子を気道上皮細胞へ導入することができる。カチオン性脂質を気道上皮細胞への遺伝子導入に使用する場合は、気道粘液がカチオン性脂質の遺伝子導入の深刻な障害となるため、外因性遺伝子を導入するためには粘液を取り除かなければならない。これに対して、本発明のセンダイウイルス含有組成物は粘液に覆われたままの気道上皮細胞に接触させるだけで、外因性遺伝子を容易に導入することができる。
【００４１】
本発明の外因性遺伝子導入方法は、気道上皮細胞の疾患を治療することが期待される外因性遺伝子または細胞内に不足しているタンパク質の内因性遺伝子を発現させるための遺伝子治療に有用である。例えば、CFTR遺伝子を含む本発明のウイルスベクター含有組成物はＣＦの治療に有効である。遺伝子治療は、患部の気道上皮細胞に本発明のウイルスベクター含有組成物をインビボまたはエクスビボによって投与し、外因性遺伝子を細胞内で発現させることにより、実施することができる。インビボによる遺伝子導入は例えば、鼻腔、肺等への滴下、ネブライザーを用いた吸入等の局所投与により行うことができる。ネブライザーの例としては、喘息の治療に通常用いられている市販のものが含まれる。
【００４２】
本発明のウイルス含有組成物は、ヒト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウシ、サルなど任意の哺乳動物に適用することができる。
【００４３】
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例 1
組換えセンダイウイルスベクターの構築および再構成
組換えセンダイウイルスは公知の方法に準じて構築した（Kato, A.ら, EMBO J. 16: 578-598, 1997, Hasan, M.K.ら,
J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997）。まず、NotI制限部位を有する18bpのスペーサー配列（5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3'）を、クローニングされたセンダイウイルスゲノムcDNA（pSeV(+)）のリーダー配列とN-タンパク質をコードする配列の5'末端との間の隣接遺伝子座に挿入し、肝炎デルタウイルスのアンチゲノム鎖（antigenomic
strand）由来の自己開裂リボザイム部位を含むプラスミドpSeV18+b(+)を得た。核移行シグナルを含む大腸菌LacZ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、および大腸菌LacZのcDNA全体を、NotI部位および外因性遺伝子のためのセンダイウイルスＥおよびＳシグナル配列タグの新たなセットを含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローニングされたゲノムのNotI部位に挿入した。外因性遺伝子を含む鋳型センダイウイルスゲノムの全長を複数の6ヌクレオチドに再編成した。外因性遺伝子を含む鋳型センダイウイルスゲノム、N-タンパク質、P-タンパク質、およびL-タンパク質をコードするプラスミド（pGEM-N、pGEM-P、pGEM-L）を、市販のカチオン性脂質GL-67-DOPE-PEG（Genzyme
Co. Ltd.）と複合体化し、ワクシニアウイルスvT7-3（Fuerst, T.R.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
8122-8126, 1986、Kato, A.ら, Genes Cells 1: 569-579, 1996）と共にLLCMK2細胞に形質転換した。40時間後、凍結および解凍を3回繰り返すことにより細胞を破壊し、10日齢の発育鶏卵の漿尿膜内に注入した。その後、ウイルスを回収し、卵における継代によりワクシニアウイルスを除去した。ニワトリ赤血球を用いた赤血球凝集活性（HA)（Kato,
A.ら, Genes Cells 1: 569-579, 1996）によりウイルス力価を決定し、ウイルスを含む漿尿液を本発明の組換えセンダイウイルスベクター含有組成物として、使用直前まで-80℃で保存した。
【００４５】
実施例２
鼻腔滴注または鼻腔灌流によるマウスの鼻腔および肺へのインビボ遺伝子導入
２−１．センダイウイルスベクターとカチオン性脂質との比較
pGL3-対照ベクター（Promega）のHindIII-BamHI断片をヒト・サイトメガロウイルス・イミディエート・アーリー（CMV-IE）プロモーターの支配下にあるpcDNA3（Invitrogen）のマルチクローニング・サイトに挿入することによりpCMV-ルシフェラーゼを構築した。pCMV-ルシフェラーゼをGL-67-DOPE-PEG（Genzyme
Co. Ltd.）と複合体化し、GL-67-pCMV-lucを得た。
【００４６】
肺へのベクターの遺伝子導入効率及び接触時間の遺伝子導入効率に与える影響を調べるため、鼻腔内への滴注及び灌流により各ベクターを投与した。まず、雄balb/cマウス（6〜8週齢）の鼻腔内に、100μlの種々の濃度の実施例１で得られたルシフェラーゼ遺伝子を含むセンダイウイルスベクター（SeV-luc）またはGL-67-pCMV-luc（80μg
DNA/匹）を公知の方法（Yonemitsu, Y.ら, Gene Ther. 4: 631-638, 1997）に従い、滴注した。
【００４７】
鼻腔灌流は、カテーテルを5mm鼻腔内に挿入し、ペリスタリック・ポンプ（P-1型、Pharmacia Biotech）を用いて各150μlの上記のベクター溶液を5から6μl/分の速度で灌流することにより実施した。遺伝子導入処理の2日後、過剰量のペントバルビタールを腹腔内に注射することにより、麻酔下でマウスを屠殺した。鼻甲介、気管、および肺を摘出し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００４８】
対照として、外因性遺伝子を実施例１に記載のpSeV18+b(+)を用いて、上記と同様に遺伝子導入処理を行った。以下の実施例においても対照としてpSeV18+b(+)を用いた。
【００４９】
ルシフェラーゼ活性は、公知の方法（Yonemitsu, Y.ら, Gene Ther. 4: 631-638, 1997）に従って、以下のようにして測定した。まず、組織をPBSで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む１×溶解用緩衝液中でハサミで切り刻み、4℃、13,000rpmで10分間遠心分離し、30μlの上清を100μlのルシフェラーゼ活性測定用緩衝液（Promega）に添加した。20℃で10秒間プレインキュベーションした後すぐに10秒の積分で光の強度をターナーTD20eルミノメーター（Turner
TD20e luminometer）（Turner Co.）により測定した。この条件で、1pgの組換えルシフェラーゼ（Promega）は、2.6×101RLUと等しかった。タンパク質濃度は、市販のタンパク質アッセイ系（Bio-Rad
Laboratories Ltd., Hertfordshire, UK）を用いて、ウシ血清アルブミンに対応する標準曲線に従い、ブラッドフォード（Bradford）の方法により測定した。データは、RLU/mgタンパク質として表し、各サンプルは2回以上測定した。
【００５０】
SeV-lucとGL-67-pCMV-lucの遺伝子導入効率と比較した結果を図１（肺）及び図２（鼻）にそれぞれ示す。図１から明らかなように、SeV-lucで形質転換された肺は、用量依存的にGL-67-pCMV-lucよりも10,000倍以上高いルシフェラーゼ活性を示した。SeVによるルシフェラーゼ遺伝子発現量は、GL-67-pCMV-lucよりも接触時間の長さに関わらず、約10,000倍高いことが示された。これらの結果から、センダイウイルスベクターは単に気道上皮細胞に接触させるだけで、マウスの肺及び鼻に同様に遺伝子を効率よく導入できることがわかる。
【００５１】
２−２．センダイウイルスベクターとアデノウイルスベクターとの比較
SeV-lucまたはルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノウイルスベクター、AdCMV-ルシフェラーゼ（Ade-luc）（Kendall, J.M.ら, Cell
Calcium 19: 133-142, 1996）を、実施例１と同様の方法でマウスの鼻腔内に滴注し、鼻甲介、気管、及び肺を切除し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００５２】
また、シミアンウイルスラージT抗原の核移行シグナルとlacZ遺伝子を保持するセンダイウイルスベクター（SeV-NLS-lacZ）及びアデノウイルスベクター（AdCMV-nls-lacZ）を調製し、上記２−１と同様の方法でマウスの鼻腔内に滴注した。気管支、気管、及び鼻甲介を切除し、それぞれの組織を0.25％グルタルアルデヒド及び2％パラホルムアルデヒドを含む氷冷0.1M
PBS溶液で10分間固定し、回転振とうしながら室温で3時間、X-gal染色（溶液：5mMシアン化カリウム第一鉄、5mM シアン化第二鉄、2mM 塩化マグネシウム、1mg/ml
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド）した。X-gal染色された組織を再固定し、パラフィン包埋し、5μmの切片を光学顕微鏡下で調べた。結果を図３，４及び５に示す。
【００５３】
図３に示すように、SeV-lucで形質転換した細胞はAde-lucで形質転換した細胞の5,000倍高い遺伝子発現を示した。
【００５４】
X-gal陽性上皮細胞は、いずれのベクターで形質転換した場合も、同様の頻度で細気管支内で分布していた（図４）。一方、AdCMV-nls-lacZで処理されたマウスの気管または鼻では青色細胞がほとんど検出されなかったが、SeV-NLS-lacZで処理されたマウスではX-gal陽性細胞が高頻度で観察された。図５に示すように、青色細胞は、繊毛を有する円柱細胞だけでなく、繊毛を有しない分泌細胞（NC）においても見られた。対照的に、基底細胞（BC）には青色シグナルは検出されなかった。
【００５５】
これらの結果は、アデノウイルスベクターでは遺伝子を導入できない気道上皮細胞に対しても、センダイウイルスベクターを用いれば遺伝子を導入することが可能であることを示している。
【００５６】
実施例３
ケナガイタチの肺への遺伝子導入
ケナガイタチ（体重500〜600g）に麻酔をかけ、実施例２と同様にして、3×108または3×109pfu/mlの精製SeV-lacZを含むBSS溶液3mlを鼻腔内に投与した（各群についてn=3）。対照（n=2）には3mlのSeV-luc（109pfu/ml）を投与した。感染の48時間後、ケナガイタチを屠殺し、インサイチューで気管にカニューレを挿入し、氷冷固定液（2％ホルマリン、0.2％グルタルアルデヒド、2mM
MgCl2、5mM EGTAを含むPBS溶液、pH7.3）で肺を膨張させた。気管および肺を一塊として切除し、実施例２と同様にして、X-gal染色を行った。各肺を、7つの部分、すなわち気管、4つの右葉［上部（R1）、中央（R2、R3）および下部（R4）］ならびに2つの左葉［上部（L1）および下部（L2）］に切り離し、気道上皮細胞および粘膜下組織腺中のβ-Gal陽性細胞を、計数線付きのレンズを用いてポイント・カウンティング（point
counting）により顕微鏡下で計数した。一つの気道当たりの青色細胞の割合を得るため、一つの気道につき10個の20倍拡大視野を調べ、肺葉の異なる領域（近位、中央、遠位）から無作為に採取された3個から8個の気道を各肺葉について調べた。変動係数（CV）として表される反復測定の誤差（ERM）は、18％であった。同一動物内でのCVは、3×108pfu/mlを受容した動物では24％と43％の間、3×109pfu/mlを受容した動物では8％と14％の間であった。
【００５７】
気道上皮細胞（図６Ａ及び図７ａ及びｂ）及び粘膜下組織腺（図６Ｂ及び図７ｃ）で用量依存的にβーガラクトシダーゼ活性が見られた。粘膜下組織腺はCFTRの主な発現部位である。対照では全く活性は見られなかった（図７ｄ）。
【００５８】
実施例４
ヒト健常ドナーの鼻腔上皮細胞への遺伝子導入
ヒト健常ドナー（男性６名、女性３名）から鼻腔上皮細胞をブラッシングにより採取した。リン酸緩衝食塩水（PBS：137mM NaCl、3mM KCl、8mM
Na2HPO4、1mM KH2PO4、pH7.2）で2回洗浄した後、細胞を10％ウシ胎児血清を含む培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地；DMEM）に再懸濁させ、2群または3群に分割し、96穴培養プレートの各ウェルに播いた。鼻腔細胞の生存は、位相差顕微鏡による繊毛運動の観察およびトリパンブルー陽性細胞数の顕微鏡による計数により確認した。ベクター溶液、（SeV-luc及びGL-67-pCMV-luc）を各穴に添加し、24時間後、細胞を集め、PBSで3回洗浄した。その後、実施例２と同様にルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図８に示す。
【００５９】
SeV-lucで形質転換された細胞はGL-67-pCMV-lucで形質転換された細胞より約1,000倍高いルシフェラーゼ活性を示した。
【００６０】
実施例５
ヒツジ気管上皮細胞への遺伝子導入
５−１．粘液が遺伝子導入に及ぼす影響
粘液が各ベクターの遺伝子導入効率に及ぼす影響を天然ヒツジ気管モデルを用いて調べた。天然ヒツジ気管モデルは公知の方法に従って調製した（Kitson, C.ら,
Gene Ther. 6: 534-546, 1999）。屠殺後、切除されたヒツジ気管の上皮層を筋肉と外膜に切り離し、0.5cm2の正方形切片に切断し、その後位相差顕微鏡下で繊毛運動を確認した。いくつかの組織においては、公知の方法に従い粘液を除去した（Kitson,
C.ら, Gene Ther. 6: 534-546, 1999）。これらの組織を気−液界面に置き、10μlのSeV-luc、GL-67-lucベクター溶液を先端表面に滴下し、形質転換を行った。48時間後、実施例２と同様に、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図９に示す。
【００６１】
図９に示されるように、GL-67-lucによる遺伝子導入と比較して、SeVによる遺伝子導入は粘液による重大な影響を受けなかった。
【００６２】
５−２．粘液の粘性が遺伝子導入に及ぼす影響
遺伝子導入の直前に種々の濃度のウシ唾液腺ムチンを加えた以外は上記５−１と同様の操作を行った。結果を図１０に示す。
【００６３】
図１０に示されるように、GL-67-lucによる遺伝子導入はムチンの添加により阻害された。また、試料にムチンを添加した場合のルシフェラーゼ活性は無処理の細胞のルシフェラーゼ活性と有意な差はなかったことから、粘液の粘性ではなく、ムチン自体がカチオン性脂質を介した遺伝子導入の障壁になっていることが示された。一方、漿液のムチン成分はSeVによる遺伝子導入効率に影響を与えないが、粘性はSeVを介した形質転換に若干影響を与えることが示された。
【００６４】
５−３．部位特異的遺伝子導入効率
５−１と同様の方法で、SeV-lucまたはAdCMV-lucでヒツジ気管上皮細胞を形質転換した。遺伝子導入後、組織の端部を切開、切断し、端部及び中央部のルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定した。結果を図１１に示す。また、SeV-lucまたはAdCMV-lucの代わりに、SeV-GFPおよびCMV-IEプロモーターの支配下にあるGFPを有する高力価アデノウイルス・セロタイプ5、AdCMV-GFP（Kramel
Biotech International Ltd.）を用いて、同様に遺伝子導入処理を行った。遺伝子導入の２日後、蛍光位相差顕微鏡下で緑色蛍光タンパク質（GFP）シグナルを観察した。結果を図１２に示す。
【００６５】
図１１及び１２に示すように、ヒツジ気管組織においてAdCMV-GFPは損傷を受けた端部で高レベルで発現することが示され、損傷のない中央部では比較的発現が少ないことが確認された。一方、SeV-lucで処理した組織は、端部と中央部での遺伝子発現に大きな差を示さなかった。
【００６６】
実施例６
SeV/CFTRの構築と電気生理学的特性
CFの原因遺伝子であるCFTRを発現する組換えセンダイウイルスベクターを構築した。CFTR遺伝子（Riordan, J. R.ら、Science 245:
1066-1073, 1989）を、EおよびSシグナル配列を含むプライマーセットを用いたPCRにより増幅した。プライマーセットを以下に示す。
フォワードプライマー：5'-acttgcggccgccaaagttcaatgcagaggtcgcctctggaaaaggccagc-3' (配列番号：4)
リバースプライマー：5'-atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggctaaagccttgtatcttgcacctcttcttc-3'(配列番号：5)
【００６７】
増幅断片をpSeV18+b(+)のNotI部位に挿入し、実施例１と同様にしてウイルスの再構成を行った。
【００６８】
調製したCFTR発現センダイウイルス(sample-1 SeV/CFTR)をCOS7細胞に感染させ、得られた感染細胞を用いて、ホールセルパッチクランプ（whole-cell
patch clamp）法による解析を行った。図１３にホールセルパッチクランプ法の概略を示す。バス溶液（bath solution）中の細胞にピペット溶液を保持するガラスピペットを接触させ、陰圧をかけて細胞膜を取り除いた。この際、ピペット溶液は、145
mM NMDG+、148.4 mM Cl-、6.7 mM Mg2+、5 mM ATP、10
mMグルコース、0.1 mM EGTA、及び10 mM HEPES（TrisによりpH 7.4に調整した）を含有し、バス溶液は、141 mM Na+、152.4
mM Cl-、152.4 mM H2PO4 -、5 mM K+、1.7
mM Mg2+、2 mM Ca2+、10 mMグルコース、0.1 mM EGTA、及び10 mM HEPES（TrisによりpH
7.4に調整した）を含有する。sample-1 SeV/CFTRを発現するCOS7細胞中の膜電流におけるフォルスコリン（forskolin）の効果を、ホールセル記録法（whole-cell
recording）により調べた（図１４）。その結果、フォルスコリン濃度依存的に内向き電流が観察され（下向きにトレースが下がる）、それが、グリベンクラミド（glibenclamide）(塩化物チャネル遮断剤）により抑制された（上向きに推移した）。一度洗浄した後、再びフォルスコリンを加えると内向き電流が再現され、グリベンクラミドにより再び抑制されることから、観察された電流の変化が特異的な薬剤誘導反応であることが確認された。
【００６９】
次に、それぞれの薬剤誘導反応の時間依存性を調べた（図１５）。sample-1 SeV/CFTRを発現するCOS7細胞において、フォルスコリンはCl-電流を誘導し、塩化物チャネルに特徴的な、時間非依存的な反応が観察された。グリベンクラミド（300μM）はフォルスコリン誘導性Cl-電流を阻害した。
【００７０】
図１６は、上記のデータをもとに導き出した、sample-1 SeV/CFTRを発現するCOS7細胞におけるフォルスコリンの存在下または非存在下の電流と電圧の関係を示す。直線は、外因性のCl電流がなければ原点で交差する。得られたグラフでは、直線は10〜20mVで交差していた。これは、COS7細胞にCFTRにより誘導される電流以外（フォルスコリン非依存性）の他のCl電流が流れていることを示唆する。図１７は、フォルスコリン投与中に記録された電流からフォルスコリン投与前に記録された電流を差し引いた、フォルスコリンの存在下および非存在下における膜電流の差異（正味の膜電流）を示す。
【００７１】
産業上の利用可能性
本発明は、従来の遺伝子導入用ベクターでは十分な遺伝子導入効率が得られなかった気道上皮細胞に対して、効率よく外因性遺伝子を導入するための組換えセンダイウイルスベクター、およびそのベクターを用いた外因性遺伝子導入方法を提供する。本発明の組換えセンダイウイルスベクターは、粘液で覆われた気道上皮細胞に短時間接触させるだけで効率よく遺伝子を導入することが可能である。また、本発明のベクターは、マウス以外の大型哺乳動物に由来する気道上皮細胞に対しても感染することができる。したがって、本発明のベクターにより、気道上皮細胞への遺伝子導入が有効な遺伝子治療が可能となった。さらに、本発明のベクターは気道上皮細胞の先端表面だけでなく、CFTRが主として発現している粘膜下組織腺にも遺伝子を導入することができるので、CFTRが欠損している疾患であるＣＦに対する遺伝子治療に使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の組換えセンダイウイルスベクター及びカチオン性脂質複合体のマウス肺及び鼻へのインビボにおける遺伝子導入効率を示す。エラーバーはSEMを表す。
【図２】 マウス鼻において、鼻腔滴注（短時間接触）及び鼻腔灌流（長時間接触）により評価された本発明の組換えセンダイウイルスベクター（Ａ）及びカチオン性脂質複合体（Ｂ）の遺伝子導入効率を示す。エラーバーはSEMを表す。
【図３】 マウス鼻の鼻腔滴注による、本発明の組換えセンダイウイルスベクター及びアデノウイルスベクターの遺伝子導入効率を示す。エラーバーはSEMを表す。
【図４】 本発明の組換えセンダイウイルスベクター及びアデノウイルスベクターを鼻腔滴注により導入したβ-galのマウス細気管支、気管、及び鼻における遺伝子発現をX-gal染色により検出した顕微鏡写真である。
【図５】 本発明の組換えセンダイウイルスベクター及びアデノウイルスベクターを鼻腔滴注により導入したβ-galのマウス気管及び鼻における遺伝子発現をX-gal染色により検出した顕微鏡写真である。NCは繊毛のない分泌細胞を、BCは基底細胞を表す。
【図６】 本発明の組換えセンダイウイルスベクターを鼻腔滴注より導入したβ-galのケナガイタチ肺での遺伝子発現を示す。R1は右葉上部、R4は右葉下部、L1は左葉上部を示す。
【図７】 本発明の組換えセンダイウイルスベクターを鼻腔滴注より導入したβ-galのケナガイタチ肺での遺伝子発現を示す顕微鏡写真である。図中、aは、左葉上部、bは右葉中央、cは粘膜下組織腺、dは対照である。また、Lmは気管支腔、smは粘膜下組織を示す。
【図８】 本発明の組換えセンダイウイルスベクター及びカチオン性脂質複合体のヒト健常ドナーから採取したヒト鼻上皮細胞への遺伝子導入効率を示す。エラーバーはSEMを表す。
【図９】 本発明の組換えセンダイウイルスベクター及びカチオン性脂質複合体のヒツジ気管細胞への遺伝子導入効率を示す。Fは無処理の細胞、MDは粘液を除去した細胞を表す。エラーバーはSEMを表す。
【図１０】 本発明の組換えセンダイウイルスベクター及びカチオン性脂質複合体のムチン添加ヒツジ気管細胞への遺伝子導入効率を示す。Fは無処理の細胞、MDは粘液を除去した細胞を表す。エラーバーはSEMを表す。
【図１１】 本発明の組換えセンダイウイルスベクター及びアデノウイルスベクターのヒツジ気管細胞の端部及び中央部への遺伝子導入効率を示す。エラーバーはSEMを表す。
【図１２】 本発明の組換えセンダイウイルスベクター及びアデノウイルスベクターによりヒツジ気管細胞への導入されたGFPのシグナルを検出した顕微鏡写真を示す。
【図１３】 通常のホールセル法の形態を模式的に示す。
【図１４】 sample-1 SeV/CFTRを発現するCOS7細胞における、-60mVでのフォルスコリン誘導性内部電流の経時的変化を示す。膜電位は保持電位-60mVで維持された。縦方向の振動は、15秒間隔で-100mVから+60mVまでの短形パルス（期間、1秒）を示す。点線は電流レベル0を示す。
【図１５】 sample-1 SeV/CFTRを発現するCOS7細胞中の膜電流におけるフォルスコリンの効果を示す。膜電位は保持電位-60mVで維持された。点線は電流レベル0を示す。グリベンクラミド（300μM）はフォルスコリン誘導性Cl電流を阻害した。
【図１６】 10μMフォルスコリンの存在下または非存在下において得られた電流と電圧の関係を示す。膜電流の振幅は、少なくとも100ミリ秒のコマンドパルス値（期間、1秒）を使用して測定した。直線は、最小二乗法により適合させた。
【図１７】 sample-1 SeV/CFTRを発現するCOS7細胞において、10μMフォルスコリンの投与中に記録された膜電流からフォルスコリンの投与前に記録された膜電流を差し引くことによって得られた正味の膜電流を示す。膜電位は保持電位-60mVで維持された。点線は電流レベル0を示す。
【配列表】
Technical field
The present invention relates to a recombinant Sendai virus vector for introducing an exogenous gene into airway epithelial cells and a method for introducing an exogenous gene using the vector.
[0002]
Background art
With the advance of molecular cloning technology, many genes whose mutations cause important human diseases have been identified and isolated. In human patients, genes that are deficient or mutated can be replaced by ex vivo technology, in which cells are transformed in vitro with DNA itself, DNA contained in liposomes, or appropriate chromosomally integrated vectors. It is carried out by converting and introducing it into the host organ (ex vivo gene therapy).
[0003]
Gene therapy provides a therapeutic means for introducing a desired gene into a subject and expressing it in vivo. The gene transfer is performed by transforming a subject cell or tissue ex vivo and introducing the transformant back into the host. It is also possible to administer the gene directly to the subject.
[0004]
Nabel et al. (Science (1990) 249: 1285-1288) performed in vivo transformation in porcine arteries using liposomes containing β-gal expression plasmids to produce site-specific gene expression in the arterial wall. Observed. Ex vivo treatment has several drawbacks. For example, when only differentiated and replicating cells are transformed, the function of the introduced gene is lost when those cells mature and die. In addition, the ex vivo method can transform a limited number of cells, but can only transform cells that are initially removed from the body.
[0005]
Thus, in gene therapy, it is extremely important to appropriately select a gene to be introduced, a target cell for expressing the transgene, a gene introduction method suitable for the target tissue, and an administration route.
[0006]
Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive genetic disease that causes an inborn error of metabolism. CF patients are frequently seen in the United States and Europe, and have one disease per 2,000 to 2,500 children. As a main symptom, mucus secretions due to exocrine abnormalities accumulate in organs such as lungs, airways, pancreas, liver, and small intestine. Current treatment of CF is centered on lung transplantation and antibiotic treatment of lung infections, but lung infections are especially fatal.
[0007]
Cystic fibrosis transmembrane conductance, the causative gene of CF
regulator (CFTR) gene has been clarified (Riordan, JR et al., Science 245: 1066-1073, 1989), and the development of CF gene therapy that introduces a normal CFTR gene vector into airway epithelial cells is expected Has been. Since ex vivo treatment cannot be applied to the lungs and upper respiratory tract, exogenous genes may be introduced in vivo in CF gene therapy.
[0008]
The following attempts have been made regarding vector administration to the lung. Hazinski et al. (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1991)
4: 206-209) disclose the introduction of DNA via liposomes into the intact lungs of rodents. Cationic liposome and fusion gene composed of three genes: (1) Chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene linked to Rous sarcoma virus (RSV) promoter, (2) Mouse breast cancer virus (MMTV) ) The CAT gene linked to the promoter and (3) the cytomegalovirus-β-galactosidase (CMV-β-gal) fusion gene were complexed. This liposome / DNA complex was administered to the rat cervical trachea, and a detectable level of gene expression was observed.
[0009]
Brigham et al. (Am. J. Med. Sci. (1989) 298: 278-281) disclose in vivo transformation of the CAT gene into mouse lung via a liposome vehicle. Transformation was performed by intravenous, intratracheal, or intraperitoneal injection. Intravenous and intratracheal administration showed CAT gene expression in the lung, but not by intraperitoneal administration.
[0010]
Canonico et al. (Clin. Res. (1991) 39: 219A) describe the expression of the human alpha-1 antitrypsin gene under the control of the CMV promoter in cultured bovine lung epithelial cells. The gene was introduced into cultured cells via liposomes. The presence of alpha-1 antitrypsin was detected in lung tissue sections of New Zealand white rabbits administered intravenously with the gene construct complexed with liposomes.
[0011]
Further, US Pat. No. 5,958,893 discloses a method for introducing a gene encoding CFTR having a reduced molecular weight using currently available vectors such as adenovirus vectors and cationic liposomes.
[0012]
However, it has been reported that gene introduction efficiency is low when genes are introduced into airway epithelial cells via adenovirus. It is thought that the cause is that the adenoviral particle has a low rate of uptake into the apical plasma membrane because both the αβγ3 integrin and the CAR receptor, which are adenoviral receptors, are not present on the apical surface of airway epithelial cells ( Goldman,
M. et al., Gene Ther. 3: 811-818, 1996, Boucher, R.C., J. Clin. Invest 103: 441-445,
1999). In addition, when cationic liposomes are used, it has been reported that airway mucus hinders its uptake and that gene transfer efficiency can be increased by removing the mucosa (Kitson,
C. et al., Gene Ther. 6: 534-546, 1999, Zabner, J. et al., J. Biol. Chem. 270: 18997-19007,
1995, Fasbender, A. et al., Gene Ther. 4: 1173-1180, 1997).
[0013]
To date, there is no known vector system or gene transfer method that can efficiently introduce an exogenous gene into airway epithelial cells. Therefore, development of a vector for efficient gene transfer into airway epithelial cells is eagerly desired.
[0014]
Sendai virus belonging to the Paramyxoviridae family is very useful as a vector for gene transfer, and its development is in progress. (Kato, A. et al., EMBO J.
16: 578-598, 1997, WO 97/16538, WO 97/16539). Sendai virus vectors have low toxicity and the introduced genes are expressed at very high levels. Moreover, since the gene insert in the viral vector is not introduced into the host chromosome, it is excellent in safety. It has been shown that the transformation ability of Sendai virus vector is different from that of adenovirus (Goldman,
M. et al., Gene Ther. 3: 811-818, 1996, Boucher, R.C., J. Clin. Invest 103: 441-445,
1999). For example, adenovirus is more likely to infect damaged sites compared to uninjured sites (Kiston, C. et al., Gene Ther. 6: 534-546,
1999, Zabner, J. et al., J. Biol. Chem. 270: 18997-19007, 1995, Fasbender, A., et al., Gene
Ther. 4: 1173-1180, 1997). These reports suggest that Sendai virus vectors complement the shortcomings of adenovirus.
[0015]
Disclosure of the invention
An object of the present invention is to provide a vector for exogenous gene introduction into airway epithelial cells and an exogenous gene introduction method using the vector.
[0016]
The present inventors examined the gene transfer efficiency into airway epithelial cells derived from various animals in vitro and in vivo by recombinant Sendai virus vector, adenovirus vector and cationic lipid complex carrying exogenous genes. As a result, it was found that the efficiency of exogenous gene introduction into the respiratory epithelial cells of the recombinant Sendai virus vector was remarkably superior to that of the adenovirus vector and the cationic lipid complex.
[0017]
In addition, the present inventors have efficiently used exogenous genes not only to permissive mouse airways but also to non-permissive beaks, sheep, and human airway epithelial cells, which are large animals, using recombinant Sendai virus vectors. It was found that transformation was possible. Furthermore, it has been found that not only the tip surface of epithelial cells but also intact submucosal tissue glands are infected. The present invention was completed based on these findings.
[0018]
Specifically, the present invention relates to a composition for introducing an exogenous gene into an airway epithelial cell, comprising a recombinant Sendai virus vector carrying an exogenous gene.
[0019]
The present invention also provides a method for introducing an exogenous gene into airway epithelial cells, which comprises contacting a composition containing a recombinant Sendai virus vector carrying an exogenous gene with airway epithelial cells coated with mucus. .
[0020]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
[0021]
In the present specification, the term “recombinant Sendai virus vector” means a reconstituted virus and virus-like particle from recombinant Sendai virus cDNA, and the structure part of Sendai virus having infectivity with recombinant Sendai virus RNA. Including. Here, the term “infectivity” refers to the ability to introduce nucleic acids and the like into the cell via the ability of the virus to adhere to the cell, and various mechanisms including the fusion of the virus membrane with the host cell membrane. This means the ability to be introduced inside the cell. The recombinant Sendai virus vector may be a ribonucleoprotein (RNP).
[0022]
“Gene” includes RNA and cDNA.
[0023]
“Airway epithelial cells” means goblet cells and Clara cells in addition to multi-row ciliated epithelial cells, which are present on the inner surface of the airway in the nasal cavity, larynx, trachea or any induced airway, or lung Present on the surface of gas exchange alveoli, including type I and type II alveolar cells.
[0024]
The recombinant Sendai virus vector used in the present invention holds a recombinant Sendai virus gene. The genome of the native Sendai virus follows the 3 'short leader region, followed by the nucleocapsid (N) gene, phospho (P) gene, matrix (M) gene, fusion (F) gene, hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene, And the large (L) gene, and the short 5 'trailer region in this order.
[0025]
The Sendai virus gene, which is the starting material for creating a recombinant Sendai virus vector, is expressed in cells infected with the exogenous gene retained by the reconstituted recombinant Sendai virus vector infecting respiratory epithelial cells. It may be deleted or modified as much as possible. For example, DI particles (J.
Virol. 68: 8413-8417, 1994) can also be used.
[0026]
For gene therapy, it is preferable that the recombinant Sendai virus vector has infectivity but lacks transmission ability. In order to make the transmission power lack, it is preferable to delete at least one of the F gene, the HN gene, and the M gene. Such vectors include, for example, the Sendai virus Z strain gene lacking the F gene. As a further example, pSeV18+b (+) (Yu,
D. et al., Genes to Cells 2: 457-466, 1997) or pSeV (+) (Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-587,
1997).
[0027]
A recombinant Sendai virus gene is obtained by inserting an exogenous gene into the Sendai virus gene. Any exogenous gene can be used so long as it encodes a protein that is to be expressed in the target airway epithelial cells. For example, for CF gene therapy, the CFTR gene (Riordan,
J.R. et al., Science 245: 1066-1073, 1989). The exogenous gene may be a gene encoding a natural protein, or the above gene modified by deletion, substitution or insertion, and a gene encoding a protein having a function equivalent to that of the natural protein. There may be. For example, a modified CFTR gene is disclosed in US Pat. No. 5,958,893. Examples of other exogenous genes include α-1 antitrypsin (Long et al.,
Biochem. 23: 4828-2837, 1984), genes encoding DNase, superoxide dismutase (SOD), catalase and the like.
[0028]
Recombinant Sendai virus vectors having exogenous genes are, for example, Kato, A. et al. (1997, EMBO J. 16: 578-587) and Yu, D. et al. (1997,
Based on the description in Genes Cells 2: 457-466), it can be constructed as follows.
[0029]
First, a DNA sample containing a cDNA base sequence of a desired gene is prepared. It is preferable that the DNA sample can be confirmed as a single plasmid by electrophoresis at a concentration of 25 ng / μl or more. However, if the NotI recognition site is included in the target cDNA sequence, it is removed in advance. In order to amplify and recover a desired gene fragment from this sample, a NotI restriction enzyme cleavage site sequence; a transcription termination sequence (E), an intervening sequence (I), and a transcription initiation sequence (S) sequence described below; As a primer pair including a partial sequence, a forward-side synthetic DNA sequence and a reverse-side synthetic DNA sequence (antisense strand) are prepared.
[0030]
For the synthetic DNA sequence on the forward side, select any 2 or more oligo DNAs from the 5 'side, preferably 4 bases that do not contain sequences derived from the NotI recognition site of GCG or GCC, more preferably ACTT, and the 3' side. The NotI recognition site gcggccgc is added to, and any 9 bases as a spacer sequence or a number obtained by adding a multiple of 6 to 9 is added to the 3 ′ side thereof. Further, a sequence corresponding to 25 bases of ORF including the start codons ATG to ATG of the desired cDNA is added to the 3 ′ side. However, the vicinity of 25 bases is selected from the desired cDNA so that the 3 ′ end of the forward-side synthetic oligo DNA is either G or C.
[0031]
The reverse-side synthetic DNA sequence is selected from the 5 ′ side by selecting any two or more oligo DNAs, preferably 4 bases not including sequences derived from GCG and GCC NotI recognition sites, more preferably ATCC, and 3 ′ A NotI recognition site gcggccgc is added to the side, and an oligo DNA of an inserted fragment for adjusting the length is added to the 3 ′ side. The length of this oligo DNA, including the NotI recognition site gcggccgc, is designed so that the total number of complementary strand bases of cDNA and the number of EIS bases of Sendai virus genome derived from Sendai virus described later is a multiple of 6 (so-called “Rule of 6 (rule
of six) "; Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72: 891-899, 1998, Calain, P. and Roux, L.,
J. Virol. 67: 4822-4830, 1993). Complementary strand sequence of Sendai virus S sequence, preferably 5'-CTTTCACCCT-3 ', I sequence, preferably 5'-AAG-3', and E sequence on the 3 'side of the insert, preferably 5'-TTTTTCTTACTACGG-3 ', reverse-side synthetic oligo DNA by adding a complementary sequence such that the end corresponding to 25 bases is either G or C, counting backward from the start codon of the desired cDNA sequence Prepare the 3 'end of.
[0032]
For PCR, a usual method using ExTaq polymerase (Takara Shuzo) can be used. Vent polymerase (NEB) is preferably used. The amplified fragment of interest is digested with NotI and then inserted into the NotI site of the plasmid vector pBluescript. The base sequence of the obtained PCR product is confirmed with a sequencer, and a plasmid with the correct sequence is selected. This was cut with NotI and Sendai virus genomic cDNA plasmid, for example, pSeV18+b (+) (Yu,
D. et al., Genes to Cells 2: 457-466, 1997) or pSeV (+) (Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-587,
1997), to obtain a recombinant Sendai virus cDNA with exogenous cDNA inserted. It is also possible to obtain a recombinant Sendai virus cDNA by directly inserting into the NotI site without using the plasmid vector pBluescript.
[0033]
A recombinant viral vector can be obtained by transcribing the recombinant Sendai virus cDNA produced as described above in vitro or in a cell to reconstitute the virus. Reconstitution of virus from cDNA can be carried out using a known method (WO 97/16538, WO 97/16539).
[0034]
Reconstitution from cDNA can be performed as follows.
[0035]
On a 6-well plastic plate, monkey kidney-derived cell line LLCCMK2 was obtained using minimal essential medium (MEM) containing 10% fetal calf serum (FCS) and antibiotics (100 units / ml penicillin G and 100 μg / ml streptomycin). 70-80% confluent (1x106Cells). Recombinant vaccinia virus vTF7-3 inactivated by UV irradiation expressing T7 polymerase (Fuerst,
T.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1:
569-579, 1996) is infected with 2 PFU / cell. One hour after infection, 60-2 μg, more preferably 3-5 μg of the above-mentioned recombinant Sendai virus cDNA is transformed into a plasmid (24-0.5 μg pGEM-N, 12-0.25 μg pGEM-P, and 24-0.5 μg pGEM-L, more preferably 1 μg pGEM-N, 0.5 μg pGEM-P, and 1 μg pGEM-L) (Kato, A Et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996) and transfection by a transfection method such as a lipofection method using Superfect (QIAGEN). Transfected cells are treated with serum-free MEM containing 100 μg / ml rifampicin (Sigma) and cytosine arabinoside (AraC), more preferably 40 μg / ml cytosine arabinoside (AraC) (Sigma). Incubate and set optimal drug concentration to minimize vaccinia virus cytotoxicity and maximize virus recovery (Kato,
A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996). Forty-eight hours after transfection, the cells are collected, and freeze-thaw is repeated three times to disrupt the cells. Thereafter, the cells are inoculated into the chorioallantoic membrane of 10-day-old hen eggs. After 3 days, chorioallantoic fluid is collected and the virus titer is determined by measuring hemagglutination activity (HA). HA is an “end-point dilution method” (Kato,
A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996). For samples for which HA has not been confirmed, further inoculate the eggs of the growing chicken. The titer of recovered Sendai virus is 108~Ten9
The vaccinia virus vTF7-3, which was PFU / ml and contained together, was 10Three~TenFour PFU / ml or less. 10 samples6Dilute to double and re-amplify with eggs to remove vaccinia virus. The recombinant virus obtained by the passage in the second or third breeding chicken egg is preserved to obtain a recombinant Sendai virus vector in which the desired cDNA is incorporated. The ability of stored viruses to form plaques is generally 109
It has a titer of PFU / ml or 10,240 HA unit / ml, and it is believed that the titer is maintained when the virus is stored at -80 ° C.
[0036]
As long as the recombinant Sendai virus cDNA is reconstituted within the cell, the host cell used for reconstitution is not particularly limited. In addition to LLCMK2 cells and human-derived cells, cultured cells such as monkey kidney-derived CV-1 cells and hamster kidney-derived BHK cells can be used as the cell line used as the host.
[0037]
The reconstituted recombinant Sendai virus may have an adhesion factor, a ligand, a receptor, etc. bound to the envelope surface so that it can adhere to specific cells.
[0038]
As the composition containing the recombinant Sendai virus vector of the present invention, chorioallantoic fluid containing the above virus vector can be used.
[0039]
The composition of the present invention may contain a physiologically acceptable medium such as deionized water and 5% dextrose aqueous solution. Other auxiliaries such as stabilizers and biocides may be contained. Furthermore, the recombinant Sendai virus vector-containing composition may be formulated as a lyophilized product. In that case, in addition to the above-mentioned auxiliary agent, stabilizers such as albumin and Prionex (Prionex (registered trademark), Penta Farm Japan) may be contained.
[0040]
An exogenous gene contained in the recombinant Sendai virus can be introduced into the airway epithelial cell by contacting the composition containing the recombinant Sendai virus vector with the airway epithelial cell coated with the mucous membrane. When cationic lipids are used for gene transfer into airway epithelial cells, airway mucus becomes a serious obstacle to cationic lipid gene transfer, and mucus must be removed in order to introduce exogenous genes. In contrast, the Sendai virus-containing composition of the present invention can easily introduce an exogenous gene by simply contacting the airway epithelial cell covered with mucus.
[0041]
The exogenous gene introduction method of the present invention is useful for gene therapy for expressing an exogenous gene expected to treat an airway epithelial cell disease or an endogenous gene of a protein deficient in the cell. . For example, the viral vector-containing composition of the present invention containing the CFTR gene is effective for treating CF. Gene therapy can be performed by administering the viral vector-containing composition of the present invention to an affected respiratory tract epithelial cell in vivo or ex vivo, and expressing an exogenous gene in the cell. In vivo gene transfer can be performed, for example, by local administration such as instillation into the nasal cavity, lungs, or the like, or inhalation using a nebulizer. Examples of nebulizers include those that are commercially available for the treatment of asthma.
[0042]
The virus-containing composition of the present invention can be applied to any mammal such as human, mouse, rabbit, sheep, cow, monkey and the like.
[0043]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.
[0044]
Example 1
Construction and reconstitution of recombinant Sendai virus vector
The recombinant Sendai virus was constructed according to a known method (Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-598, 1997, Hasan, M.K. et al.,
J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997). First, an 18 bp spacer sequence (5 '-(G) -CGGCCGCAGATCTTCACG-3') with a NotI restriction site, the sequence of the cloned Sendai virus genomic cDNA (pSeV (+)) leader sequence and N-protein Inserted into the adjacent locus between the 5 'end of the hepatitis delta virus antigenomic strand (antigenomic)
plasmid pSeV18 containing a self-cleaving ribozyme site from+b (+) was obtained. E. coli LacZ, including nuclear translocation signals, luciferase, green fluorescent protein (GFP), and the entire cDNA of E. coli LacZ with primers containing a NotI site and a new set of Sendai virus E and S signal sequence tags for exogenous genes It was amplified by the polymerase chain reaction used and inserted into the NotI site of the cloned genome. The full length of the template Sendai virus genome containing the exogenous gene was rearranged into multiple 6 nucleotides. Plasmids encoding the template Sendai virus genome containing exogenous genes, N-protein, P-protein, and L-protein (pGEM-N, pGEM-P, pGEM-L) were obtained from commercially available cationic lipid GL-67- DOPE-PEG (Genzyme
Co. Ltd.) and vaccinia virus vT7-3 (Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
8122-8126, 1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996) and transformed into LLCMK2 cells. After 40 hours, the cells were broken by repeating freezing and thawing three times and injected into the chorioallantoic membrane of 10-day-old embryonated chicken eggs. Thereafter, the virus was recovered and vaccinia virus was removed by passage in eggs. Hemagglutination activity (HA) using chicken erythrocytes (Kato,
A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996), and the virus-containing chorioallantoic fluid is stored as a recombinant Sendai virus vector-containing composition of the present invention at −80 ° C. until just before use. did.
[0045]
Example 2
In vivo gene transfer into the nasal cavity and lungs of mice by nasal instillation or nasal perfusion
2-1. Comparison between Sendai virus vector and cationic lipid
pCMV-luciferase by inserting the HindIII-BamHI fragment of the pGL3-control vector (Promega) into the multiple cloning site of pcDNA3 (Invitrogen) under the control of the human cytomegalovirus immediate early (CMV-IE) promoter Built. pCMV-luciferase with GL-67-DOPE-PEG (Genzyme
Co. Ltd.) to obtain GL-67-pCMV-luc.
[0046]
In order to examine the effect of the gene transfer efficiency of the vector on the lung and the effect of the contact time on the gene transfer efficiency, each vector was administered by instillation into the nasal cavity and perfusion. First, Sendai virus vector (SeV-luc) or GL-67-pCMV containing the luciferase gene obtained in Example 1 at various concentrations of 100 μl in the nasal cavity of male balb / c mice (6-8 weeks old). -luc (80μg
DNA / animal) was instilled according to known methods (Yonemitsu, Y. et al., Gene Ther. 4: 631-638, 1997).
[0047]
Nasal perfusion was performed by inserting a catheter into the 5 mm nasal cavity and perfusing 150 μl of each of the above vector solutions at a rate of 5 to 6 μl / min using a peristaltic pump (P-1 type, Pharmacia Biotech). . Two days after the gene transfer treatment, mice were sacrificed under anesthesia by injecting an excessive amount of pentobarbital intraperitoneally. Nasal turbinates, trachea, and lungs were removed and luciferase activity was measured.
[0048]
As a control, the exogenous gene was pSeV18 as described in Example 1.+Using b (+), gene transfer treatment was performed as described above. In the following examples, pSeV18 was also used as a control.+b (+) was used.
[0049]
Luciferase activity was measured as follows according to a known method (Yonemitsu, Y. et al., Gene Ther. 4: 631-638, 1997). First, the tissue is washed with PBS, chopped with scissors in a 1X lysis buffer containing a protease inhibitor cocktail, centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and 30 μl of the supernatant is measured for 100 μl of luciferase activity Added to buffer (Promega). Immediately after pre-incubation at 20 ° C for 10 seconds, turn the light intensity with integration of 10 seconds Turner TD20e luminometer (Turner
TD20e luminometer (Turner Co.). Under these conditions, 1 pg of recombinant luciferase (Promega) is 2.6 x 101It was equal to RLU. Protein concentration is determined using a commercially available protein assay system (Bio-Rad
Laboratories Ltd., Hertfordshire, UK) according to the Bradford method according to a standard curve corresponding to bovine serum albumin. Data were expressed as RLU / mg protein and each sample was measured more than once.
[0050]
The results compared with the gene transfer efficiency of SeV-luc and GL-67-pCMV-luc are shown in FIG. 1 (lung) and FIG. 2 (nose), respectively. As is clear from FIG. 1, the lung transformed with SeV-luc showed a luciferase activity 10,000 times higher than that of GL-67-pCMV-luc in a dose-dependent manner. The expression level of the luciferase gene by SeV was about 10,000 times higher than that of GL-67-pCMV-luc regardless of the length of contact time. From these results, it can be seen that the Sendai virus vector can efficiently introduce genes into the lungs and nose of mice just by contacting the epithelial cells.
[0051]
2-2. Comparison between Sendai virus vector and adenovirus vector
An adenoviral vector containing SeV-luc or luciferase gene, AdCMV-luciferase (Ade-luc) (Kendall, J.M. et al., Cell
Calcium 19: 133-142, 1996) was instilled into the nasal cavity of mice by the same method as in Example 1, and the turbinates, trachea, and lungs were excised and luciferase activity was measured.
[0052]
In addition, a Sendai virus vector (SeV-NLS-lacZ) and an adenovirus vector (AdCMV-nls-lacZ) retaining the nuclear translocation signal of the simian virus large T antigen and the lacZ gene were prepared, and the same method as in 2-1 above Instilled into the nasal cavity of the mouse. The bronchus, trachea, and nasal turbinates are removed, and each tissue is ice-cold 0.1M containing 0.25% glutaraldehyde and 2% paraformaldehyde.
Fix with PBS solution for 10 minutes, X-gal staining for 3 hours at room temperature with rotary shaking (solution: 5 mM potassium ferrous cyanide, 5 mM ferric cyanide, 2 mM magnesium chloride, 1 mg / ml
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). X-gal stained tissues were re-fixed, embedded in paraffin, and 5 μm sections were examined under a light microscope. The results are shown in FIGS.
[0053]
As shown in FIG. 3, cells transformed with SeV-luc showed gene expression 5,000 times higher than cells transformed with Ade-luc.
[0054]
X-gal positive epithelial cells were distributed in the bronchiole at the same frequency when transformed with any of the vectors (FIG. 4). On the other hand, almost no blue cells were detected in the trachea or nose of mice treated with AdCMV-nls-lacZ, but X-gal positive cells were frequently observed in mice treated with SeV-NLS-lacZ. . As shown in FIG. 5, blue cells were found not only in columnar cells having cilia but also in secretory cells (NC) having no cilia. In contrast, no blue signal was detected in basal cells (BC).
[0055]
These results indicate that it is possible to introduce a gene into airway epithelial cells into which a gene cannot be introduced with an adenovirus vector, using the Sendai virus vector.
[0056]
Example 3
Gene transfer to the lungs
Anesthetize kenagai (weighing 500-600g), 3x10 as in Example 2.8Or 3x1093 ml of BSS solution containing pfu / ml of purified SeV-lacZ was administered intranasally (n = 3 for each group). The control (n = 2) contains 3 ml SeV-luc (109pfu / ml) was administered. Forty-eight hours after infection, the scallops are sacrificed, the trachea cannulated in situ, and ice-cold fixative (2% formalin, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM)
MgCl2The lungs were inflated with a PBS solution containing 5 mM EGTA, pH 7.3). The trachea and lungs were excised as a lump, and X-gal staining was performed in the same manner as in Example 2. Each lung is divided into 7 parts: trachea, 4 right lobes [upper (R1), middle (R2, R3) and lower (R4)] and two left lobes [upper (L1) and lower (L2)] Detach and count the β-Gal positive cells in airway epithelial cells and submucosal glands using a lens with a counting line (point
counting) under the microscope. To obtain the percentage of blue cells per airway, examine 10 20x magnified fields per airway and from 3 randomly collected from different areas of the lung lobe (proximal, central, distal) Eight airways were examined for each lung lobe. The repeated measurement error (ERM) expressed as coefficient of variation (CV) was 18%. CV within the same animal is 3 x 108Between 24% and 43% in animals receiving pfu / ml, 3 x 109Between 8% and 14% in animals that received pfu / ml.
[0057]
Β-galactosidase activity was seen in a dose-dependent manner in airway epithelial cells (Figures 6A and 7a and b) and submucosal glands (Figures 6B and 7c). The submucosal gland is the main site of CFTR expression. No activity was seen in the control (FIG. 7d).
[0058]
Example 4
Gene transfer into nasal epithelial cells of healthy human donors
Nasal epithelial cells were collected by brushing from healthy human donors (6 men and 3 women). Phosphate buffered saline (PBS: 137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM)
Na2HPOFour, 1mM KH2POFourAfter washing twice with pH 7.2), cells are resuspended in a culture medium containing 10% fetal bovine serum (Dulbecco's modified Eagle medium; DMEM), divided into 2 or 3 groups, and a 96-well culture plate Of each well. Survival of nasal cells was confirmed by observation of cilia movement with a phase-contrast microscope and counting of trypan blue positive cells with a microscope. Vector solution (SeV-luc and GL-67-pCMV-luc) was added to each well and after 24 hours, cells were collected and washed 3 times with PBS. Thereafter, luciferase activity was measured in the same manner as in Example 2. The results are shown in FIG.
[0059]
Cells transformed with SeV-luc showed about 1,000 times higher luciferase activity than cells transformed with GL-67-pCMV-luc.
[0060]
Example 5
Gene transfer into sheep tracheal epithelial cells
5-1. Effects of mucus on gene transfer
The effect of mucus on the gene transfer efficiency of each vector was examined using a natural sheep trachea model. The natural sheep trachea model was prepared according to known methods (Kitson, C. et al.,
Gene Ther. 6: 534-546, 1999). After sacrifice, the excised sheep tracheal epithelial layer is separated into muscle and outer membrane, 0.5 cm2Ciliary movement was confirmed under a phase contrast microscope. In some tissues, mucus was removed according to known methods (Kitson,
C. et al., Gene Ther. 6: 534-546, 1999). These tissues were placed at the gas-liquid interface, and 10 μl of SeV-luc and GL-67-luc vector solutions were added dropwise to the tip surface for transformation. After 48 hours, luciferase activity was measured in the same manner as in Example 2. The results are shown in FIG.
[0061]
As shown in FIG. 9, gene transfer with SeV was not significantly affected by mucus compared to gene transfer with GL-67-luc.
[0062]
5-2. Effect of mucus viscosity on gene transfer
The same operation as in the above 5-1 was performed except that various concentrations of bovine salivary gland mucin were added immediately before gene introduction. The results are shown in FIG.
[0063]
As shown in FIG. 10, gene transfer by GL-67-luc was inhibited by addition of mucin. In addition, the luciferase activity when mucin was added to the sample was not significantly different from the luciferase activity of untreated cells, so mucin itself was not a mucus viscosity but a barrier to gene transfer via cationic lipids. It was shown that. On the other hand, it was shown that the mucin component of the serum does not affect the gene transfer efficiency by SeV, but the viscosity slightly affects the transformation through SeV.
[0064]
5-3. Site-specific gene transfer efficiency
In the same manner as in 5-1, sheep tracheal epithelial cells were transformed with SeV-luc or AdCMV-luc. After the gene introduction, the end of the tissue was incised and cut, and the luciferase activities at the end and the center were measured. The results are shown in FIG. Also, instead of SeV-luc or AdCMV-luc, high
Biotech International Ltd.) was used for gene transfer treatment in the same manner. Two days after gene introduction, a green fluorescent protein (GFP) signal was observed under a fluorescence phase contrast microscope. The results are shown in FIG.
[0065]
As shown in FIGS. 11 and 12, AdCMV-GFP was shown to be expressed at a high level at the damaged end in sheep tracheal tissue, and it was confirmed that the expression was relatively low at the uninjured center. . On the other hand, the tissue treated with SeV-luc did not show a large difference in gene expression between the end and the center.
[0066]
Example 6
Construction and electrophysiological characteristics of SeV / CFTR
A recombinant Sendai virus vector expressing CFTR, the gene responsible for CF, was constructed. CFTR gene (Riordan, J. R. et al., Science 245:
1066-1073, 1989) was amplified by PCR using a primer set containing E and S signal sequences. The primer set is shown below.
Forward primer: 5'-acttgcggccgccaaagttcaatgcagaggtcgcctctggaaaaggccagc-3 '(SEQ ID NO: 4)
Reverse primer: 5'-atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggctaaagccttgtatcttgcacctcttcttc-3 '(SEQ ID NO: 5)
[0067]
PSeV18 amplified fragment+It was inserted into the NotI site of b (+), and virus reconstitution was performed in the same manner as in Example 1.
[0068]
Infect COS7 cells with the prepared CFTR-expressing Sendai virus (sample-1 SeV / CFTR), and use the resulting infected cells to apply whole-cell patch clamp (whole-cell
Analysis by the patch clamp method. FIG. 13 shows an outline of the whole cell patch clamp method. A glass pipette holding the pipette solution was brought into contact with the cells in the bath solution, and the cell membrane was removed by applying negative pressure. At this time, the pipette solution is 145
mM NMDG+148.4 mM Cl-6.7 mM Mg2+, 5 mM ATP, 10
Contains mM glucose, 0.1 mM EGTA, and 10 mM HEPES (adjusted to pH 7.4 with Tris), bath solution is 141 mM Na+, 152.4
mM Cl-152.4 mM H2POFour -, 5 mM K+1.7
mM Mg2+, 2 mM Ca2+, 10 mM glucose, 0.1 mM EGTA, and 10 mM HEPES (pH by Tris
7.4). sample-1 The effect of forskolin on membrane current in COS7 cells expressing SeV / CFTR
recording) (FIG. 14). As a result, an inward current was observed depending on the concentration of forskolin (the trace was lowered downward), which was suppressed by glibenclamide (a chloride channel blocker) (changed upward). After washing once, when forskolin is added again, the inward current is reproduced and suppressed again by glibenclamide, confirming that the observed change in current is a specific drug-induced reaction.
[0069]
Next, the time dependency of each drug induction reaction was examined (FIG. 15). sample-1 In COS7 cells expressing SeV / CFTR, forskolin is Cl-A time-independent response that induced current and was characteristic of chloride channels was observed. Glibenclamide (300 μM) is forskolin-induced Cl-The current was inhibited.
[0070]
FIG. 16 shows the relationship between current and voltage in the presence or absence of forskolin in COS7 cells expressing sample-1 SeV / CFTR, derived from the above data. The straight lines intersect at the origin if there is no exogenous Cl current. In the graph obtained, the straight lines intersected at 10-20 mV. This suggests that COS7 cells carry other Cl currents (forskolin-independent) other than those induced by CFTR. FIG. 17 shows the difference in membrane current (net membrane current) in the presence and absence of forskolin, subtracting the current recorded before forskolin administration from the current recorded during forskolin administration.
[0071]
Industrial applicability
The present invention uses a recombinant Sendai virus vector for efficiently introducing an exogenous gene into airway epithelial cells, for which sufficient gene transfer efficiency could not be obtained with conventional gene transfer vectors, and the vector An exogenous gene transfer method is provided. The recombinant Sendai virus vector of the present invention can efficiently introduce a gene simply by contacting airway epithelial cells covered with mucus for a short time. The vector of the present invention can also infect airway epithelial cells derived from large mammals other than mice. Therefore, the vector of the present invention enables gene therapy in which gene transfer into airway epithelial cells is effective. Furthermore, since the vector of the present invention can introduce a gene not only to the apical surface of airway epithelial cells but also to a submucosal tissue gland in which CFTR is mainly expressed, It can be used for gene therapy.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows in vivo gene transfer efficiency of the recombinant Sendai virus vector and the cationic lipid complex of the present invention into mouse lung and nose. Error bars represent SEM.
FIG. 2: Genes of recombinant Sendai virus vector (A) and cationic lipid complex (B) of the present invention evaluated by nasal instillation (short contact) and nasal perfusion (long contact) in mouse nose Shows introduction efficiency. Error bars represent SEM.
FIG. 3 shows the gene transfer efficiency of the recombinant Sendai virus vector and adenovirus vector of the present invention by nasal instillation of the mouse nose. Error bars represent SEM.
FIG. 4 is a photomicrograph of detecting gene expression in mouse bronchiole, trachea, and nose of β-gal introduced with the recombinant Sendai virus vector and adenovirus vector of the present invention by nasal instillation by X-gal staining. .
FIG. 5 is a photomicrograph of X-gal staining detecting gene expression in mouse trachea and nose of β-gal introduced with the recombinant Sendai virus vector and adenovirus vector of the present invention by nasal instillation. NC represents secretory cells without cilia, and BC represents basal cells.
FIG. 6 shows gene expression in β-gal prickly lung introduced with the recombinant Sendai virus vector of the present invention by nasal instillation. R1 indicates the upper right lobe, R4 indicates the lower right lobe, and L1 indicates the upper left lobe.
FIG. 7 is a photomicrograph showing gene expression in β-gal poultry lung into which the recombinant Sendai virus vector of the present invention has been introduced by nasal instillation. In the figure, a is the upper left lobe, b is the center of the right lobe, c is the submucosal tissue gland, and d is the control. Lm represents bronchial cavity and sm represents submucosa.
FIG. 8 shows the gene transfer efficiency of the recombinant Sendai virus vector and the cationic lipid complex of the present invention into human nasal epithelial cells collected from a healthy human donor. Error bars represent SEM.
FIG. 9 shows gene transfer efficiency into sheep tracheal cells of the recombinant Sendai virus vector of the present invention and a cationic lipid complex. F represents untreated cells and MD represents cells from which mucus has been removed. Error bars represent SEM.
FIG. 10 shows the gene transfer efficiency of the recombinant Sendai virus vector of the present invention and a cationic lipid complex into mucin-added sheep tracheal cells. F represents untreated cells and MD represents cells from which mucus has been removed. Error bars represent SEM.
FIG. 11 shows the gene transfer efficiency of the recombinant Sendai virus vector and adenovirus vector of the present invention into the end and center of sheep tracheal cells. Error bars represent SEM.
FIG. 12 shows a photomicrograph in which a signal of GFP introduced into sheep tracheal cells was detected by the recombinant Sendai virus vector and adenovirus vector of the present invention.
FIG. 13 schematically shows a form of a normal whole cell method.
FIG. 14 shows changes over time of forskolin-induced internal current at -60 mV in COS7 cells expressing sample-1 SeV / CFTR. The membrane potential was maintained at a holding potential of -60 mV. Longitudinal vibration shows short pulses (duration, 1 second) from -100 mV to +60 mV at 15 second intervals. The dotted line indicates
FIG. 15 shows the effect of forskolin on membrane current in COS7 cells expressing sample-1 SeV / CFTR. The membrane potential was maintained at a holding potential of -60 mV. The dotted line indicates
FIG. 16 shows the relationship between current and voltage obtained in the presence or absence of 10 μM forskolin. Membrane current amplitude was measured using command pulse values (duration, 1 second) of at least 100 milliseconds. The straight line was fitted by the least squares method.
FIG. 17 shows the net obtained by subtracting the membrane current recorded before forskolin administration from the membrane current recorded during administration of 10 μM forskolin in COS7 cells expressing sample-1 SeV / CFTR. The membrane current is shown. The membrane potential was maintained at a holding potential of -60 mV. The dotted line indicates
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