JP4842415B2 - Preventive or therapeutic agent for diseases contributed by reduced function of NOS - Google Patents

Description

［式中、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ水素原子を表すか、または一緒になって単結合を表し、Ｒ¹およびＲ²が水素原子を表す場合には、Ｒ³は−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃、−ＣＨ（ＯＣＯＣＨ₃）ＣＨ（ＯＣＯＣＨ₃）ＣＨ₃、−ＣＨ₃、−ＣＨ₂ＯＨ又はフェニル基を表し、Ｒ¹およびＲ²が一緒になって単結合を表す場合には、Ｒ³は−ＣＯＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃を表す］
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、ＮＯＳの機能低下が寄与する疾患を予防および／または治療するための薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血管内皮は血管トーヌスや血栓の形成に重要な役割を果たす場であることは知られていたが、１９８０年に初めて内皮由来弛緩因子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｌａｘｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：ＥＤＲＦ）の存在が報告された。その後、１９８７年にＥＤＲＦの本体が一酸化窒素（ＮＯ）であることが証明された。ＮＯは、Ｌ−アルギニンが酸化され、Ｎ^G−ヒドロキシル−Ｌ−アルギニンからＬ−シトルリンになる際に産生され、その反応はＮＯ合成酵素（ＮＯｓｙｎｔｈａｓｅ：ＮＯＳ）という酵素によって触媒される。なお、ＮＯＳは、血管内皮、神経系、腎臓、血小板、心筋、平滑筋など幅広く存在し、産生されるＮＯは、極めて多彩な作用を有するため、全身の循環調節において重要な役割を果たす。ＮＯの産生低下が認められる疾患としては、高血圧、高脂血症、動脈硬化、虚血性心疾患、心不全、血栓症等の循環器疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺高血圧、ＡＲＤＳ等の呼吸器疾患、肝障害、肝硬変、胃腸粘膜障害、肥厚性幽門狭窄症、膵炎等の消化器疾患、脳虚血、脳梗塞、脳循環不全、老年性痴呆等の脳血管障害、腎障害、インポテンス等の腎・泌尿器疾患、妊娠中毒症等の産婦人科疾患、その他感染症・免疫疾患、糖尿病、熱傷等その他薬剤性にＮＯ産生の低下が認められる疾病が数多く知られている。また、ＮＯＳについてはその遺伝子がクローニングされ、構造解析が行われた。その結果、ＮＯＳ遺伝子には補酵素として、カルモジュリン（ＣａＭ）、フラビン、ＮＡＤＰＨの結合部位に加えて、本発明の有効成分である式（Ｉ）の化合物に含まれる、（６Ｒ)−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（以下、「ＢＨ４」という）の結合部位が存在することが判明した。さらに、ＢＨ４が実際にＮＯＳの機能制御に関与することも示唆されている。
【０００３】
一方、実験動物にＮＯＳ阻害薬を静脈注射すると、血圧が上昇することが報告されている（Ｓａｋｕｍａ Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７０：６０７−６１１，１９９２）。さらに、ＤＯＣＡ−食塩高血圧ラット、ＳＨＲ−ＳＰラット、Ｄａｈｌ−Ｓラット、Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ高血圧ラット等の高血圧モデル動物において内因性ＮＯの産生が低下しているとの報告がある。
【０００４】
しかしながら、これらのモデル系におけるＮＯの産生低下の原因は明らかにされていなかった。また、高血圧モデル動物として頻用される高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）ではＮＯの生成はむしろ亢進しているという報告も多い（Ｄｏｍｉｎｉｚａｋ ＡＦら，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ２５：１２０２−１２１１，１９９５）。ＳＨＲの場合は高血圧状態に対してＮＯを過剰に放出し、血圧を低下させようとするものの、ＮＯの作用が不十分な状態と考えることもできる（Ｎａｖａ Ｅら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９２：Ｉ−３４７，１９９５）。即ち従来、高血圧に対するＮＯの関連性が指摘されてはいたものの、ＮＯＳの活性と高血圧との関連は必ずしも明らかにされていなかった。さらに、高血圧における血管弛緩反応の低下にはまだその本態が不明な内皮由来過分極因子（ＥＤＨＦ）反応の低下や内皮由来血管物質（ＥＤＣＦ）の増加が関与している可能性も残されている。
【０００５】
このように、従来、ＮＯの血管弛緩作用、ならびにＢＨ４によるＮＯＳ機能制御についてはある程度知見が得られていた。しかしながら、ＮＯの産生低下の原因およびＮＯＳの活性と高血圧との関連は明らかにされておらず、もとより高血圧と生体内のＢＨ４との関係はもちろんＢＨ４の降圧作用については全く知られていなかった。
【０００６】
また、多くの産業化した国々では心血管疾患は最も多い死因となっている。これまでも血圧降下剤、高脂血症用剤、利尿剤、血管拡張剤、抗血小板薬など様々な薬物が臨床に用いられているが、その多くは血圧、コレステロールなどの指標の改善を目標としたものであり、発症の予防、悪化・進行の抑制、長期予後の観点からは未解決の部分が多い。近年、以上の疾患に関わるような血管疾患についての分子レベルからの究明により、内皮細胞をはじめとする血管を治療の場とする治療戦略が考えられており、そこでのＥＤＲＦの本体であるＮＯの産生制御、あるいは抗酸化作用を有する物質の適用が最も期待される治療法のひとつであることが提唱されている（Gibbons，G.H.，Dzau，V.J.，Science. Vol.272，689-693, １９９６年）。しかし、未だこの治療戦略を満足する薬剤や治療法は確立していない。
【０００７】
なお、従来からこうした疾病のうち狭心症や心不全などの治療に外因性のＮＯ供与剤として、硝酸剤（ニトログリセン製剤など）が有効とされているが、長期連用に際しては、耐性という問題をかかえている。すなわち、硝酸剤からＮＯを産生するには、チオール基（ＳＨ基）が不可欠であり、硝酸剤の長期連用により、このＳＨ基が枯渇してしまうのである。さらにＮＯ発生には代謝酵素を必要とし、また反応途中でニトロソチオールなど他のＮＯ関連物質が生じ、長期使用において、他の生体内物質のバランスを乱すことが考えられる。また、β遮断薬やＫ⁺チャネル開口薬の性質をあわせもつ新しいタイプのＮＯ供与剤も開発されているが、これらも上記ＮＯ供与剤の域を脱するものではない。したがって、発症の予防、悪化・進行の抑制、長期予後の観点から内因性ＮＯ機能を維持賦活し、内皮細胞機能を改善することが最も理想的な治療法と考えられる。
【０００８】
その観点から、生体内で自発的なＮＯ産生を行うこと、すなわちＮＯＳの活性化を図ることが最も優れた方法であると考えられ、これまでもＮＯＳの基質であるＬ−アルギニンの効果が以下の疾患などで検討されてきた。例えば、高血圧（Higashi,Y.ら，Hypertension 1995，25，898-902）、狭心症（Egashira，K.ら，Circulation 1996，94，130-134）、心不全（Rector T.S.ら，Circulation 1996，93，2135-2141）などの疾患である。
【０００９】
しかしながら、アセチルコリンによる内皮依存性血管拡張反応の低下、基礎的およびエンドセリン受容体（ＥＴ_B）刺激による腎ＮＯ産生の低下しているモデル（Ｈｉｒａｔａ Ｙ，Ｈａｙａｋａｗａ Ｈ，０ｍａｔａ Ｍら：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｌ９９５：９１：１２２９−１２３５）としてよく知られている、ＤＯＣＡ食塩高血圧ラットにおいて、Ｌ−アルギニン長期投与により内皮依存性血管拡張反応と腎ＮＯ産生は回復するものの、その効果は部分的であると報告されている（Ｈａｙａｋａｗａ Ｈ，Ｈｉｒａｔａ Ｙ，Ｏｍａｔａ Ｍら：Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｌ９９４：２３：７５２−７５６）。また、高血圧患者に対し、Ｌ−アルギニン投与を行うと正常者同様血圧低下が起きるが、正常者にみられる腎血流の増大、濾過分画の低下、腎血管抵抗の減弱がみられず、血中ｃＧＭＰは高血圧患者で有意に低下していたと報告されている（ＨｉｇａｓｈｉＹ．０ｈｓｈｉｍａ Ｔ，Ｋａｊｉｙａｍａ Ｇら：Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｌ９９６：２５：８９８−９０２）。これらのことは、Ｌ−アルギニンという基質の多寡によらない腎循環におけるＮＯ産生不全があること、ひいては単にＮＯＳの酵素としての活性が低下しているだけでないことを示唆している。すなわち、Ｌ−アルギニン−ＮＯ系の循環調節への関与、内皮依存性血管拡張反応低下の機序として、基質であるＬ−アルギニンの利用障害または不足等では説明できず、ＮＯＳの活性あるいは量的変化等について、さらなる検討を要する状況である。
【００１０】
また、高血圧治療の目的は高血圧に起因する心血管系の合併症を予防して患者の生命を延長し、かつ充実した生活を送らせることにある。このためには生涯にわたる長期的な血圧の管理が必要であり、減塩、肥満の是正、運動療法などの一般療法の基礎の上に、降圧薬による薬物療法が長期間にわたって行われることとなる。
【００１１】
現在では、サイアザイド系利尿薬、β遮断薬、Ｃａ拮抗薬、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、α₁遮断薬が主な降圧剤として治療に用いられている。しかし、これらの薬物は、以下に示すような望ましい降圧剤としての条件をすべて満たしているとは言えず、それぞれ一長一短があると考えられている。
【００１２】
望ましい降圧剤としての条件とは、
１．作用が温和で効果が安定している。
２．使用初期の副作用が少ない。
３．循環動態、臓器機能への影響が望ましい方向に作用する。
４．長期連用において心血管系に対する危険因子に悪影響がなく、むしろ改善させる。
５．治療に対する患者のコンプライアンスをよくする。
６．種々の合併症、偶発症による使用禁忌がない。
７．治療により、さらに充実した生活が期待できる。
【００１３】
具体的には、現在使用されている降圧剤には以下のような問題点がある。
【００１４】
サイアザイド系利尿薬では、塩分制限が守りにくい場合や、体液貯留傾向のある場合にはよい適応となるが、耐糖能異常、高尿酸血症、腎機能障害、高脂血症、低Ｋ血症を認める患者に投与するのは避けた方がよいとされている。
【００１５】
β遮断薬は、若年者や頻脈傾向のある場合には投与の好適応となるが、気管支喘息や慢性閉塞性肺疾患を伴う患者や、末梢動脈に閉塞性の病変をもつ患者、レイノー症状を有する患者には使用するのを避けた方が無難であると考えられている。また、インスリン分泌にも影響を与えるため、糖尿病を合併した高血圧症患者にも使用しにくいという欠点がある。
【００１６】
Ｃａ拮抗薬の副作用としては、ジヒドロピリジン誘導体では血管拡張作用による顔面紅潮、頭痛があり、強い降圧作用による低血圧、めまい、反射性交感神経緊張による頻脈、動悸を生じることがある。
【００１７】
ＡＣＥ阻害薬の副作用としては、起立性低血圧、空咳、血管性浮腫、高Ｋ血症などがある。主として腎より排泄されるので、腎機能障害例では用量と高Ｋ血症に注意しなければならない。また、胎児への障害が報告され、妊婦への投与禁忌のものもある。
【００１８】
α₁遮断薬では、起立性低血圧などの副作用を招かないように注意する必要がある。
【００１９】
このように、高血圧治療薬としては、様々な作用を有した薬剤が数多く存在するが、副作用や長期連用の安全性、またＱＯＬの改善という点では、まだ全てを十分に満たした薬剤は存在しないというのが現状である。加えて、高血圧治療は、その第１目標とされている高血圧の臓器障害の進展を予防して、心不全や腎不全、脳卒中などの発症やそれによる死亡率を減少させることにあり、確かに降圧薬療法により心不全や脳卒中の死亡率は改善したとされているが、高血圧による腎不全の患者の増加は阻止されていない。また、急性あるいは慢性糸球体腎炎などでは糸球体障害が原因となって高血圧が引き起こされる。高血圧を有する慢性糸球体腎炎では予後が悪く、高血圧の存在は独立した慢性糸球体腎炎の予後増悪因子でもあることが明らかにされている。しかし、慢性糸球体腎炎に伴う高血圧の治療は確立されていない。
【００２０】
以上のように、真に望ましい条件を備えた治療薬が要望され、とりわけ、腎保護作用をもあわせ持つ薬剤の開発は切望されている。
【００２１】
なお、本発明の治療剤の有効成分である式（Ｉ）の化合物は公知化合物であり、悪性高フェニルアラニン血症、うつ病、パーキンソン病、その他の治療薬としての用途が知られている。例えば、特開昭５９−２５３２３号公報、同５９−７６０８６号公報、同６１−２７７６１８号公報、同６３−２６７７８１号公報を参照。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＮＯＳの機能低下が寄与する疾患に対し、内因性ＮＯ産生低下抑制作用および内皮細胞機能調節作用により循環動態、臓器機能を改善させ、諸合併症の進展を抑制し、患者の日常生活の質を高めるべく、副作用がなく安全な治療剤を提供することを目的とする。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは種々の検討の結果、ＮＯＳの機能低下が寄与する疾患ではＢＨ４レベルも低下しているのではないかとの仮説をたてた。そこで、ＤＯＣＡ−食塩高血圧ラットおよびＤＯＣＡ−食塩ＳＨＲに対するＢＨ４の投与を試みた。その結果、当該ＤＯＣＡ−食塩高血圧ラットでは実際にＢＨ４レベルが、さらに驚くべきことにＮＯＳ発現レベルも低下していることを認め、ＢＨ４の投与によって、内因性ＮＯ産生低下抑制作用による、生理的に極めて自然な優れた血圧上昇抑制効果が得られることを見いだした。また、ＤＯＣＡ−食塩ＳＨＲでも実際にＢＨ４レベルが低下していることを認め、さらにまた、病理組織学的に壊死性糸球体炎および壊死性血管炎を認め、ＢＨ４の投与によって、血圧上昇抑制効果とともに、内皮細胞機能調節作用による、上記病理組織学的所見の顕著な改善効果が得られることを見いだし、ＢＨ４がＮＯＳの機能賦活作用を有するとの知見を得て、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、ＢＨ４類製剤による、ＮＯＳの機能低下が寄与する疾患の効果的な治療に関するものである。
【００２４】
従って、本発明は、式（Ｉ）：
【化３】

［式中、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ水素原子を表すか、または一緒になって単結合を表し、Ｒ¹およびＲ²が水素原子を表す場合には、Ｒ³は−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃、−ＣＨ（ＯＣＯＣＨ₃）ＣＨ（ＯＣＯＣＨ₃）ＣＨ₃、−ＣＨ₃、−ＣＨ₂ＯＨ又はフェニル基を表し、Ｒ¹およびＲ²が一緒になって単結合を表す場合には、Ｒ³は−ＣＯＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃を表す］
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、ＮＯＳの機能低下が寄与する疾患を予防または治療するための薬剤である。
【００２５】
本明細書において、ＮＯＳの機能低下とは、血管内皮、神経系、腎臓、血小板、心筋、平滑筋など幅広く存在するＮＯＳが、何らかの理由で発現が減少し、または発現はしていてもこれらの細胞の機能低下によってＮＯＳ活性が発揮されていないことを意味する。ＮＯＳの機能低下の典型例は、内因性ＮＯのレベルの低下である。ＮＯＳの機能低下が寄与する疾患とは、ＮＯＳの機能低下が原因となって発症する疾患、ＮＯＳの機能低下が症状を悪化させる疾患、ＮＯＳの機能低下が治癒を遅らせる疾患等を含み、例えば高血圧、高脂血症、動脈硬化、冠血管攣縮、虚血性心疾患、心不全、血栓症、肺高血圧、脳循環不全、脳血管攣縮、糸球体腎炎、慢性腎不全、糖尿病、術後再狭窄、アカラシア、門脈圧亢進症、肝障害、胃腸粘膜障害、肥厚性幽門狭窄症、腸炎、インポテンス、網脈絡膜症などにおいて、ＮＯＳの機能低下が寄与する場合が挙げられる。
【００２６】
ＢＨ４は、これらの疾患を有する患者に投与されたとき、体内でのＮＯＳの産生を刺激し、または低下した内皮細胞の機能を回復させることによりＮＯＳの機能を正常化して、これらの疾患を予防または治療することができる。
【００２７】
したがって、本発明の治療または予防対象は、ＢＨ４によるＮＯＳの機能賦活作用によって処置できる疾患である。
【００２８】
本発明の有効成分である式（Ｉ）で表される化合物には次のものおよびそれらの薬学的に許容される塩が含まれる：
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）
【化４】

（６Ｒ，Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン
１',２'−ジアセチル−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン
【化５】

セピアプテリン
【化６】

６−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリン
【化７】

６−ヒドロキシメチル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリン
【化８】

６−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリン
【化９】

以上の化合物で、好ましい化合物は５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン類又はその塩であり、更にそのうちでも最も好ましい化合物はＢＨ４又はその塩である。
【００２９】
本発明で有効成分として使用する式（Ｉ）で表される化合物は公知化合物である。例えば、特開昭５９−２５３２３号公報、同５９−７６０８６号公報、同６１−２７７６１８号公報、同６３−２６７７８１号公報参照。これらは適当な塩として用いてもよく、そのような塩としては薬理的に無毒性の酸、例えば、塩酸、リン酸、硫酸、ホウ酸等の鉱酸、及び、酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマル酸、メシル酸等の有機酸との塩が例示される。
【００３０】
本発明の薬剤は前記した疾患に有効である。例えば、高血圧においては、本態性高血圧のみならず、急激な経過をとり腎臓、網膜などの小動脈壁の壊死をもたらす悪性高血圧や、腎障害を伴う腎性高血圧も対象となる。具体的には、本態性高血圧、腎性高血圧、腎血管性高血圧、妊娠高血圧、老年性高血圧、副腎性高血圧のすべてに有効である。
【００３１】
本発明の治療剤は、式（Ｉ）で表される化合物を一般の医薬製剤に用いられる担体と、常法によって経口、直腸又は非経腸（静脈内、髄液中への投与を含む）投与に適する製剤形態にすることにより製造される。
【００３２】
これら医薬製剤に用いられる担体としては、用いられる剤形によるが、一般的に賦形剤、結合剤、崩壊剤などが挙げられる。
【００３３】
賦形剤の代表的な例としては澱粉、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、セルロース等があり、結合剤としてはポリビニルピロリドン、澱粉、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴムなどがある。又、崩壊剤の例としてはデンプン、寒天、ゼラチン末、セルロース、ＣＭＣなどがあるが、一般に用いられている賦形剤、結合剤、崩壊剤であればこれら以外でもよい。
【００３４】
本発明の治療剤は、好ましくは上記担体以外に、有効成分を安定化するための酸化防止剤を含有する。酸化防止剤は医薬製剤に一般に使用されているものから適宜選択され、例えば、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、Ｌ−システイン、ｄｌ−α−トコフェロール、天然トコフェロール等があげられる。使用する量は、活性成分（１種またはそれ以上）を安定化させる量であればよいが、一般的には活性成分１に対し重量で０.２ないし２.０が好ましい。
【００３５】
経口投与に適する本発明の製剤は各々所定量の活性成分（１種またはそれ以上）を含有する錠剤、舌下錠、カプセル剤、粉末、散剤、顆粒剤もしくは細粒剤として、またはシロップ、エマルジョン若しくは頓服剤のような非水性液中の懸濁液として提供できる。
【００３６】
例えば、顆粒剤は、活性成分（１種またはそれ以上）と１種またはそれ以上の前記担体、酸化防止剤等の補助成分を均一に混合して造粒し、ふるいを用いてメッシュをそろえることにより提供される。錠剤は、活性成分（１種またはそれ以上）を、場合により１種またはそれ以上の補助成分と共に、圧縮または成形により製造できる。カプセル剤は、活性成分（１種またはそれ以上）を、場合により１種またはそれ以上の補助成分と均一に混合した粉末または顆粒を適当なカプセルに充填機等を用いて充填して製造する。直腸投与用の製剤は、カカオ脂などの慣用の担体を使用し、座薬として提供できる。非経腸投与用製剤は、殺菌窒素浄化容器中に活性成分（１種またはそれ以上）を乾燥固体として密封して提供できる。この乾燥固体製剤は非経腸投与時に、所定量の無菌水に分散もしくは溶解して患者に投与することができる。
【００３７】
これらの製剤の製造においては、有効成分及び通常の担体の他に前述の酸化防止剤を加えて製剤することが好ましく、又所望により緩衝剤、風味付与剤、表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、滑沢剤等から選ばれる１種またはそれ以上の補助成分をさらに含有してもよい。
【００３８】
活性成分、すなわち、式（Ｉ）で表される化合物の投与量は投与経路、処置される症状、および処置を受ける患者によって変わることは勿論のことであるが、最終的には医師の判断にまかせられる。
【００３９】
例えば、高血圧を処置するのに適当な投与量は、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の範囲にあり、代表的な好適投与量は０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日である。
【００４０】
所望の投与量は上記の活性成分を１日１回投与してもよいが、１日中の適当な間隔で２〜４回分割投与してもよい。
【００４１】
活性成分は単独で、そのまま他の成分と混合せずに投与することもできるが、投与量の調節を容易にするため等の理由から適用疾患に応じた他の活性成分を医薬製剤として投与することもできる。
【００４２】
また、本発明の製剤は、有効成分として式（Ｉ）で表される化合物と共に、ＮＯＳの基質または補酵素もしくは補因子の、例えばＬ−アルギニン、フラビン類（例えば、ＦＡＤ、ＦＭＮ等）およびカルシウムよりなる群から選ばれる少なくとも１種を補助的有効成分として含有してもよい。これら、有効成分の混合により、式（Ｉ）で表される化合物の単独使用に比べて、一層優れた治療効果を期待できる。本発明製剤中における上記各成分の比率は特に限定されないが、例えば、重量で式（Ｉ）で表される化合物の１に対して、Ｌ−アルギニン、フラビン類およびカルシウムよりなる群から選ばれる少なくとも１種を０.１〜１０の範囲、好ましくは０.５〜２の範囲とすることができる。
【００４３】
この混合製剤により、例えば高血圧を治療する際の適当な投与量は、有効成分の合計量として０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の範囲にあり、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日である。
【００４４】
治療に当たり、式（Ｉ）で表される化合物を単独で有効成分として含む製剤および他の有効成分とともに含む製剤の選択は、年齢、症状等に応じて医師により適宜選択される。
【００４５】
本発明に用いられる活性成分は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）およびその塩が最も好ましいが、（６Ｒ,Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン、１',２'−ジアセチル−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン、セピアプテリン、６−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリン、６−ヒドロキシメチル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリンまたは６−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリンおよびそれらの塩等の類似化合物でもよい。しかし、生体内に存在する天然体であるＢＨ４が好ましいことは言うまでもない。このＢＨ４・２塩酸塩のラットに対する急性毒性は経口投与で２ｇ／ｋｇ（体重）以上であり、ほとんど毒性は見い出されない。また、光学活性体でない（６Ｒ,Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリンも、特開昭５９−２５３２３号公報におけるパーキンソン病の治療にも見られるように毒性は弱く、本発明の治療に用いられることは可能である。これら以外の式（Ｉ）に属する化合物も、急性毒性は殆ど見いだされない。
【００４６】
以下の実施例に従ってさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００４７】
【実施例】
実施例１ （顆粒剤、細粒剤）
ポリビニルピロリドン（コリドン３０）１部（重量部）を滅菌精製水に溶かし、これにアスコルビン酸１０部およびＬ−システイン・塩酸塩５部を加え均一な溶液とした後、ＢＨ４・２塩酸塩１０部を加え均一とした。
この溶液を賦形剤（マンニトールまたは乳糖）５９部および崩壊剤［コーンスターチまたはヒドロキシプロピルセルロース（ＬＨ−２２）］１５部に加え、練合、造粒、乾燥した後、篩別した。
【００４８】
実施例２ （錠剤）
実施例１で作った活性成分の均一溶液に乳糖５８部、微結晶セルロース１５部を混合したのち、さらにステアリン酸マグネシウム１部を加え混合し打錠した。
【００４９】
実施例３ （カプセル剤）
実施例１で作成した剤形のものをカプセルに充填した。但し滑沢剤としてステアリン酸マグネシウムを０.２％添加して製剤したものを用いた。
【００５０】
実施例４ （注射用剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 1.5ｇ
アスコルビン酸 1.5ｇ
Ｌ−システイン・塩酸塩 0.5ｇ
マンニトール 6.5ｇ
上記成分を滅菌精製水に溶かし、１００ｍｌとし除菌したものを、１ｍｌ又は２ｍｌずつバイアル又はアンプルにとり凍結乾燥密封した。
【００５１】
実施例５ （注射用剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 ２.０ｇを無酸素で滅菌精製水に溶かし、１００ｍｌとした溶液を、除菌し、実施例４と同様に密封した。
【００５２】
実施例６ （座薬用剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 150部
アスコルビン酸 150部
Ｌ−システイン・塩酸塩 50部
上記成分を用い、均一な粉末にしたものをカカオ脂９９５０部に分散させた。
【００５３】
実施例７ （顆粒剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 ５部
アスコルビン酸 ５部
Ｌ−システイン・塩酸塩 ２部
上記成分を用いて均一な溶液とした。
一方マンニトール５５部、ポリビニルピロリドン１部、ヒドロキシプロピルセルロース１４部、ならびにＬ−アルギニンもしくはカルシウム５部を均一に混合したものに上記の溶液を加え、練合、造粒、乾燥した後、篩別した。
【００５４】
実施例８ （顆粒剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 ５部
アスコルビン酸 ５部
Ｌ−システイン・塩酸塩 ５部
マンニトール ５２部
ポリビニルピロリドン（コリドン３０）１部
ヒドロキシプロピルセルロース(ＬＨ−２２)１２部
Ｌ−アルギニンまたはカルシウム １０部
上記成分を用い実施例７と同様に造粒し、篩別した。
【００５５】
実施例９ （顆粒剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 ５部
アスコルビン酸 ５部
Ｌ−システイン・塩酸塩 ２部
上記成分を使用し均一溶液とした。
一方、Ｌ−アルギニンまたはカルシウム１０部、マンニトール５０部、ポリビニルピロリドン（コリドン３０）１部およびヒドロキシプロピルセルロース（ＬＨ−２２）９部を均一に混合したものに上記溶液を練合、造粒、乾燥した後、篩別した。
【００５６】
実施例１０
ＤＯＣＡ−食塩高血圧ラットの作成
８週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手）に片腎摘出（対照群を除く）を行なった。その後、以下の３つの実験群にわけて比較検討した。
１）飲料水のみを与えた群（対照群） 被験数 ｎ＝３
２）片腎摘出１週間後よりデオキシコルチコステロン酢酸塩（deoxycorticosterone acetate：ＤＯＣＡ）３０ｍｇ／ｋｇ体重を週１回皮下投与し、１％食塩水を与え，ＤＯＣＡ−食塩高血圧ラットを作成した群（ＤＯＣＡ群） ｎ＝６
３）ＤＯＣＡ−食塩高血圧ラットに、ＢＨ４（１０ｍｇ／ｋｇ体重／日）を経口投与した群（ＤＯＣＡ＋ＢＨ４群） ｎ＝５
各群を実験終了５週目まで観察した。実験開始時、２週間後、４週間後、５週間後（観察終了時）に代謝ケージにより２４時間尿を採取した。観察終了時、フェノバルビタール麻酔下で腹部大動脈より採血、その後腎臓を生理食塩水で潅流後摘出し、組織学的検討および免疫組織学的検討を行った。
【００５７】
血圧測定
血圧はtail-cuff法により、実験開始時、２週間後、４週間後、５週間後において測定した。
【００５８】
尿中ＮＯ ₂ ／ＮＯ ₃ の測定
Ｇｒｉｅｓｓ法に基づきＣｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社のＮｉｔｒａｔｅ−Ｎｉｔｒｉｔｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ，ｋｉｔ Ｎｏ.７８０００１を用いて測定した。尿中ＮＯ₂／ＮＯ₃の値が大きいほどＮＯＳの活性が高いことを意味する。
【００５９】
尿中ＢＰ測定
Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｎｉｘｏｎの方法(Anal. Biochem. 102;176-188, 1980)に基づきＨＰＬＣ分析を行い、ＢＨ４の代謝物であるビオプテリン（ＢＰ）を測定した。尿中ＢＰの値の推移によりＢＨ４投与の影響を考察する。
【００６０】
腎組織ＮＯＳ免疫染色
摘出した腎組織を凍結、その薄切切片上で腎組織における内皮型ＮＯＳ（Ｅ−ＮＯＳ）および脳型ＮＯＳ（Ｂ−ＮＯＳ）の発現をそれぞれに特異的な抗体、抗Ｅ−ＮＯＳ抗体および抗Ｂ−ＮＯＳ抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ社より入手）を用いた免疫染色で検討した。
【００６１】
ＮＯＳ ｍＲＮＡ発現測定
ａ）腎組織からの全ＲＮＡの抽出
腎組織からのＲＮＡ抽出は、グアニジウム・塩化セシウム抽出法によって行った。
詳細には、先ず、摘出した腎臓の皮質部分より少量の組織を採取し、直ちに融解溶液４Ｍグアニジニウムチオシアネート（Guanidinium thiocyanate）に加え、ガラス／テフロンホモジェナイザーにて破砕した。この細胞融解溶液を５.７Ｍ塩化セシウム上に重層し、８０,０００ｒｐｍにて２時間遠心後、その後沈殿物を０.１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰ）溶液にて溶解した。これに２.５Ｍ酢酸アンモニウムとエタノールを加え、−２０℃にて１時間沈殿させ、これを１０,０００ｒｐｍにて４℃、２０分間遠心し沈殿を得た。沈殿を約１μｇ／μｌの濃度に０.１％ＤＥＰ溶液にて溶解し、使用時まで−２０℃で保存した。
【００６２】
ｂ）逆転写酵素（ＲＴ）反応
全ＲＮＡよりＭｏＭＬＶ逆転写酵素を用いｃＤＮＡを合成した。
詳細には、全ＲＮＡ、プライマー、バッファー、Ｈ₂Ｏを混合した試料を９５℃で２分間加熱後、氷冷した。次に３７℃で３０分間保温し、プライマーをＲＮＡにアニールさせた。これに０.２Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５ｍＭデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）混合液、ＲＮａｓｉｎ、ＭｏＭＬＶ逆転写酵素を加え、９０℃で５分間加熱後、氷冷し反応を停止した。
【００６３】
ｃ）ＰＣＲ
ＲＴ法によって得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
詳細には、検出目的であるＥ−ＮＯＳおよび内部対照として用いるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）に対するそれぞれの５'側プライマー、３'側プライマー、ＰＣＲバッファー、２.５ｍＭｄＮＴＰ混合液、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを混合しＲＴ反応液を加えた。ミネラルオイルを重層し、遠心後、自動ＰＣＲ装置にて反応を開始した。１サイクルを９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃３０秒とし、これを３０サイクル繰り返してＰＣＲ産物を得た。なお、Ｅ−ＮＯＳ検出およびＭＤＨ検出用に用いたプライマーは、Ujiie.K.ら、Am.J.Physiol.267(Renal Fluid Electrolyte Physiol.36):F296-F302.1994に従った。具体的には、Ｅ−ＮＯＳ検出に用いたプライマーの塩基配列は、５'側プライマー：ＴＡＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＡＴＣＣＡＣ（配列番号１）、３'側プライマー：ＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣ（配列番号２）である。ＭＤＨ検出用に用いたプライマーの塩基配列は、５'側プライマー：ＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＧＣＧＴＡＴＡＣＡＡＣＣＣ（配列番号３）、３'側プライマー：ＴＴＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＡＴＧＧＣＣＴＣＧ（配列番号４）である。
【００６４】
ｄ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびサザンハイブリダイゼーションによるＮＯＳ ｍＲＮＡ発現の測定
ＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、サザンハイブリダイゼーションによるＮＯＳ ｍＲＮＡ発現の測定を行った。
詳細には、先ず、ＰＣＲ反応液を５％ポリアクリルアミドで電気泳動し、泳動終了後ゲルをメンブレンフィルターに転写した。Ｅ−ＮＯＳ検出およびＭＤＨ検出のため、γ³²Ｐ−ＡＴＰで５’末端をラベルしたプローブを用いてメンブレンフィルター上でハイブリダイゼーションを行った（Ｕｊｉｉｅ．Ｋ.ら、１９９４，上述）。Ｅ−ＮＯＳ検出用のプローブの塩基配列は、ＣＴＧＧＡＡＣＡＡＴＴＴＣＣＡＴＣＣＧ（配列番号５）であり、ＭＤＨ検出用のプローブの塩基配列は、ＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡ（配列番号６）であった。その後、−７０℃で数時間オートラジオグラフィーを行い、感光したオートラジオグラフィーはデンシトケーターを用いて解析を行った。結果を図４に示す。
オートラジオグラフィーの結果に基づき、Ｅ−ＮＯＳＰＣＲ産物量をハウスキーピング遺伝子であるＭＤＨＰＣＲ産物量により標準化し、Ｅ−ＮＯＳ遺伝子発現を半定量化した。
【００６５】
統計
測定値は平均±標準誤差で表し、群間の統計はｔｗｏ−ｗａｙＡＮＯＶＡにより行った。以下、ｐ＜０．０５を有意水準とした。
血圧の推移を以下の表１および図１に示す。ＤＯＣＡ群は観察４週目において高血圧を呈した。ＤＯＣＡ群の血圧上昇は他の２群に比して有意であった。これに対し、ＤＯＣＡ＋ＢＨ４群では観察終了時まで対照群と同様に正常血圧にとどまった。
【表１】

【００６６】
尿中ＮＯ₂／ＮＯ₃の推移を表２および図２に示す。ＤＯＣＡ群では尿中ＮＯ₂／ＮＯ₃が経時的に減少し、観察終了時には測定感度以下になった。これに対しＤＯＣＡ＋ＢＨ４群では増加した。ＤＯＣＡ群での減少は他の２群に比して有意であり、対照群とＤＯＣＡ＋ＢＨ４群では有意差は認められなかった。
【表２】

【００６７】
尿中ＢＰの推移を表３および図３に示す。ＤＯＣＡ群ではＢＰが経時的に減少した。これに対し、ＤＯＣＡ＋ＢＨ４群ではＢＰが経時的に増加した。ＤＯＣＡ群での減少は他の２群に比して有意であり、対照群とＤＯＣＡ＋ＢＨ４群間では有意差は認められなかった。
【表３】

【００６８】
体重は表４に示すとおりいずれの群でも経時的に増加し、３群間で有意差を認めなかった。
【表４】

免疫染色の結果、ＤＯＣＡ群では小血管でのＥ−ＮＯＳ、マクラ・デンサ（ｍａｃｕｌａ ｄｅｎｓａ）でのＢ−ＮＯＳの発現がともに減少し、ＤＯＣＡ＋ＢＨ４群ではこれらの発現は対照群と同等かやや増強して観察された。
【００６９】
（ＮＯＳ ｍＲＮＡ発現測定結果）
測定の結果、図４に示される通り、ＤＯＣＡ＋ＢＨ４群ではＤＯＣＡ群に対し、Ｅ−ＮＯＳのｍＲＮＡ発現が有意に増加された。
以上、ＤＯＣＡ−食塩高血圧ラットにおいては、血圧上昇と尿中ＮＯ₂／ＮＯ₃の減少、腎組織ＮＯＳ発現の減少がみられ、血管内皮細胞の機能障害が見られた。さらに、当該モデルラットでは、尿中ＢＰが減少していることが明らかにされた。一方、経口投与したＢＨ４により血圧上昇が抑制され、尿中ＮＯ₂／ＮＯ₃の増加と腎組織ＮＯＳの発現の増加が見られたことから、ＢＨ４がＮＯＳの機能を賦活（ＮＯＳ量／ＮＯＳ活性の制御）することにより内因性ＮＯ産生低下に伴う疾患の治療に有用であることが示された。
【００７０】
実施例１１
ＤＯＣＡ−食塩ＳＨＲの作成
８週齢のＳＨＲ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手）に片腎摘出（対照群を除く）を行なった。その後、以下の３つの実験群にわけて比較検討した。
１）飲料水のみを与えた群（対照群） 被験数 ｎ＝８
２）片腎摘出１週間後よりデオキシコルチコステロン酢酸塩（deoxycorticosterone acetate：ＤＯＣＡ）３０ｍｇ／ｋｇ体重を週１回皮下投与し、１％食塩水を与え，ＤＯＣＡ−食塩ＳＨＲを作成した群（ＤＯＣＡ群） ｎ＝４
３）ＤＯＣＡ−食塩ＳＨＲに、ＢＨ４（１０ｍｇ／ｋｇ体重／日）を経口投与した群（ＤＯＣＡ＋ＢＨ４群） ｎ＝６
各群を実験終了６週目まで観察した。実験開始時、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後（観察終了時）に代謝ケージにより２４時間尿を採取した。観察終了時、フェノバルビタール麻酔下で腹部大動脈より採血、その後腎臓を生理食塩水で潅流後摘出し、組織学的検討を行った。
【００７１】
血圧測定
血圧はtail-cuff法により、実験開始時、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後において測定した。
【００７２】
尿中ＢＰ測定
Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｎｉｘｏｎの方法に基づきＨＰＬＣ分析を行い、ＢＨ４の代謝物であるビオプテリン（ＢＰ）を測定した。尿中ＢＰの値の推移によりＢＨ４投与の影響を考察する。
【００７３】
病理組織学的所見
６週後の採尿、血圧測定を終了した後、麻酔下で開腹し、腹部大動脈から脱血し、同部より生理食塩水を注入、灌流を行った。摘出した腎臓を、１０％ホルムアルデヒド溶液中で固定し、パラフィン包埋後、ミクロトームにて４μm に薄切し腎組織標本を作製した。ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色およびｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ−Ｓｈｉｆｆ染色を行った。ラット腎組織標本内に見られる病理学的所見、すなわち壊死性糸球体炎、および壊死性細動脈炎の出現頻度を比較検討した。
【００７４】
統計
測定値は平均±標準誤差で表し、群間の統計はｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより行った。以下、ｐ＜０．０５を有意水準とした。
血圧の推移を以下の表５および図５に示す。ＤＯＣＡ群は観察３週目において顕著な高血圧を呈した。ＤＯＣＡ群の血圧上昇は他の２群に比して有意であった。これに対し、ＤＯＣＡ＋ＢＨ４群では観察終了時まで対照群と同様のレベルにとどまった。
【表５】

【００７５】
尿中ＢＰの推移を表６および図６に示す。ＤＯＣＡ群ではＢＰが経時的に減少した。これに対し、ＤＯＣＡ＋ＢＨ４群ではＢＨ４が経時的に増加した。ＤＯＣＡ群での減少は他の２群に比して有意であり、対照群とＤＯＣＡ＋ＢＨ４群間では有意差は認められなかった。
【表６】

【００７６】
腎組織標本内に見られる病理組織学的所見の出現頻度を表７および図７に示す。ＤＯＣＡ群では壊死性糸球体炎の出現率と壊死性血管炎の出現率が他の２群に比して有意に高く認められた。
【表７】

以上、ＤＯＣＡ−食塩ＳＨＲにおいては、血圧上昇と壊死性糸球体炎と壊死性血管炎等の病理組織学的所見が見られた。さらに、当該モデルラットでは、尿中ＢＰが減少していることが明らかにされた。一方、経口投与したＢＨ４により血圧上昇が抑制され、病理組織学的所見の顕著な改善が見られたことから、ＢＨ４がＮＯＳの機能を賦活することにより内皮細胞機能の低下に伴う疾患の治療に有用であることが示された。
【００７７】
【発明の効果】
以上説明したとおり、本発明はＮＯＳの機能低下が寄与する疾患を有効に予防および／または改善する治療剤を提供するものである。また、本発明の治療剤の有効成分は生体内にもともと存在する物質なので長期間使用しても副作用等の心配がない。
【００７８】
【配列表】
【００７９】

【００８０】

【００８１】

【００８２】

【００８３】

【００８４】

【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、対照群（−○−）、ＤＯＣＡ群（−△−）およびＢＨ４を経口投与したＤＯＣＡ−食塩高血圧ラット（ＤＯＣＡ＋ＢＨ４群、−□−）の血圧経時変化を示す。
【図２】 図２は、対照群（−○−）、ＤＯＣＡ群（−△−）およびＢＨ４を経口投与したＤＯＣＡ−食塩高血圧ラット（ＤＯＣＡ＋ＢＨ４群、−□−）の尿中ＮＯ₂／ＮＯ₃経時変化を示す。
【図３】 図３は、対照群（−○−）、ＤＯＣＡ群（−△−）およびＢＨ４を経口投与したＤＯＣＡ−食塩高血圧ラット（ＤＯＣＡ＋ＢＨ４群、−□−）の尿中ＢＰ経時変化を示す。
【図４】 図４は、Ｅ−ＮＯＳ ｍＲＮＡの腎組織における発現を測定した結果を示す。
【図５】 図５は、対照群（−●−）、ＤＯＣＡ群（−△−）およびＢＨ４を経口投与したＤＯＣＡ−食塩ＳＨＲ（ＤＯＣＡ＋ＢＨ４群、−□−）の血圧経時変化を示す。
【図６】 図６は、対照群（−●−）、ＤＯＣＡ群（−△−）およびＢＨ４を経口投与したＤＯＣＡ−食塩ＳＨＲ（ＤＯＣＡ＋ＢＨ４群、−□−）の尿中ＢＰ経時変化を示す。
【図７】 図７は、腎組織標本内に見られる病理学的所見を示し、左より対照群、ＤＯＣＡ群およびＤＯＣＡ＋ＢＨ４群について、それぞれ、壊死性糸球体炎および壊死性血管炎の出現頻度を示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a compound of formula (I):
[Chemical 2]

[Wherein R¹And R²Each represents a hydrogen atom or together represent a single bond, R¹And R²R represents a hydrogen atom, R^ThreeIs —CH (OH) CH (OH) CH_Three, -CH (OCOCH_Three) CH (OCOCH_Three) CH_Three, -CH_Three, -CH₂OH or phenyl group, R¹And R²Together represent a single bond, R^ThreeIs —COCH (OH) CH_ThreeRepresents]
Or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, for use in the prevention and / or treatment of a disease contributed by reduced NOS function.
[0002]
[Prior art]
Vascular endothelium is known to play an important role in the formation of vascular tonus and thrombus, but in 1980, the existence of endothelium-derived relaxing factor (EDRF) was reported for the first time. Later, in 1987, the body of EDRF was proved to be nitric oxide (NO). NO is oxidized by L-arginine and N^G-Produced when hydroxyl-L-arginine is converted to L-citrulline, and the reaction is catalyzed by an enzyme called NO synthase (NOS). Note that NOS exists in a wide range such as vascular endothelium, nervous system, kidney, platelets, heart muscle, smooth muscle, and NO produced has an extremely diverse action and therefore plays an important role in systemic circulation regulation. Diseases with reduced NO production include high blood pressure, hyperlipidemia, arteriosclerosis, ischemic heart disease, heart failure, cardiovascular diseases such as thrombosis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, pulmonary hypertension, ARDS, etc. Respiratory disease, liver disorder, cirrhosis, gastrointestinal mucosal disorder, hypertrophic pyloric stenosis, gastrointestinal disorders such as pancreatitis, cerebral ischemia, cerebral infarction, cerebral circulatory failure, cerebrovascular disorder such as senile dementia, renal disorder, impotence Numerous diseases such as renal and urological diseases such as pregnancy, gynecological diseases such as pregnancy toxemia, other infectious diseases / immune diseases, diabetes, burns, etc., in which a decrease in NO production is recognized. The NOS gene was cloned and structural analysis was performed. As a result, the NOS gene contains (6R) -L-erythro as a coenzyme contained in the compound of formula (I) as an active ingredient of the present invention in addition to the binding sites of calmodulin (CaM), flavin, and NADPH. It was found that a binding site for -5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (hereinafter referred to as "BH4") exists. Furthermore, it has been suggested that BH4 is actually involved in NOS function control.
[0003]
On the other hand, it has been reported that blood pressure rises when a NOS inhibitor is intravenously injected into experimental animals (Sakuma I. et al. Circ. Res. 70: 607-611, 1992). Furthermore, it has been reported that endogenous NO production is reduced in hypertensive model animals such as DOCA-salt hypertensive rats, SHR-SP rats, Dahl-S rats, Goldblat hypertensive rats and the like.
[0004]
However, the cause of the decrease in NO production in these model systems has not been clarified. In addition, there are many reports that NO production is rather enhanced in spontaneously hypertensive rats (SHR) frequently used as hypertensive model animals (Dominizak AF et al., Hypertension 25: 1202-1121, 1995). In the case of SHR, NO is excessively released with respect to the hypertensive state to lower the blood pressure, but it can be considered that the action of NO is insufficient (Nava E et al. Circulation 92: I-347, 1995). ). That is, conventionally, the relationship between NO and hypertension has been pointed out, but the relationship between NOS activity and hypertension has not necessarily been clarified. Furthermore, there is a possibility that the decrease in the vascular relaxation response in hypertension is associated with a decrease in the endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) response and an increase in the endothelium-derived vascular substance (EDCF), whose nature is still unknown. .
[0005]
Thus, to date, some knowledge has been obtained about the vasorelaxant action of NO and NOS function control by BH4. However, the cause of the decrease in NO production and the relationship between NOS activity and hypertension have not been clarified, and the relationship between hypertension and BH4 in the body as well as the antihypertensive effect of BH4 were not known at all.
[0006]
Also, cardiovascular disease is the most common cause of death in many industrialized countries. Various drugs such as antihypertensive agents, hyperlipidemia agents, diuretics, vasodilators and antiplatelet agents have been used in the past, many of which aim to improve indicators such as blood pressure and cholesterol There are many unresolved parts from the viewpoint of prevention of onset, suppression of deterioration and progression, and long-term prognosis. In recent years, investigations from the molecular level of vascular diseases related to the above-mentioned diseases have led to therapeutic strategies for treating blood vessels such as endothelial cells as treatment sites. It is proposed that one of the most promising treatments is the production control or the application of a substance having an antioxidant action (Gibbons, GH, Dzau, VJ, Science. Vol.272, 689-693, 1996). ). However, drugs and treatment methods that satisfy this treatment strategy have not yet been established.
[0007]
In the past, nitrates (nitroglycene preparations, etc.) have been effective as exogenous NO donors for the treatment of angina pectoris and heart failure among these diseases, but they have the problem of tolerance during long-term use. ing. That is, in order to produce NO from a nitric acid agent, a thiol group (SH group) is indispensable, and this SH group is depleted by long-term continuous use of the nitric acid agent. Furthermore, metabolic enzymes are required for NO generation, and other NO-related substances such as nitrosothiol are generated during the reaction, and the balance of other in-vivo substances may be disturbed during long-term use. Β-blockers and K⁺New types of NO donors that combine the properties of channel openers have also been developed, but these do not depart from the scope of the NO donor. Therefore, it is considered that the most ideal treatment method is to maintain and activate endogenous NO function and improve endothelial cell function from the viewpoint of prevention of onset, suppression of deterioration / progression, and long-term prognosis.
[0008]
From that point of view, it is considered that the most excellent method is to spontaneously produce NO in vivo, that is, to promote the activation of NOS. The effect of L-arginine, which is a substrate for NOS, has been described below. It has been studied for various diseases. For example, hypertension (Higashi, Y. et al., Hypertension 1995, 25, 898-902), angina (Egashira, K. et al., Circulation 1996, 94, 130-134), heart failure (Rector TS et al., Circulation 1996, 93). , 2135-2141).
[0009]
However, the reduction of endothelium-dependent vasodilator response by acetylcholine, basal and endothelin receptors (ET_B) Long-term administration of L-arginine in DOCA-salt hypertensive rats, well known as a model of reduced renal NO production upon stimulation (Hirata Y, Hayaka H, 0mata M, et al .: Circulation 1995: 91: 1229-1235) Can restore the endothelium-dependent vasodilator response and renal NO production, but its effects have been reported to be partial (Hayakawa H, Hirata Y, Omata M et al .: Hypertension l994: 23: 752-756). In addition, when L-arginine is administered to hypertensive patients, blood pressure decreases as in normal subjects, but increase in renal blood flow, decrease in filtration fraction, and decrease in renal vascular resistance seen in normal subjects are not observed, Blood cGMP has been reported to be significantly reduced in hypertensive patients (HigashiY.0hshima T, Kajiyama G, et al .: Hypertension 1996: 25: 898-902). These facts suggest that there is NO production deficiency in the renal circulation that does not depend on the amount of the substrate L-arginine, and that the activity of NOS as an enzyme is not merely reduced. That is, the involvement of the L-arginine-NO system in the circulation regulation and the mechanism of the decrease in endothelium-dependent vasodilator response cannot be explained by the impaired use or deficiency of the substrate L-arginine. It is a situation that requires further examination of changes.
[0010]
The purpose of hypertension treatment is to prevent cardiovascular complications caused by high blood pressure, prolong the patient's life, and lead to a fulfilling life. This requires lifelong long-term blood pressure management, and drug therapy with antihypertensive drugs will be given over a long period of time on the basis of general therapy such as salt reduction, correction of obesity, and exercise therapy. .
[0011]
Currently, thiazide diuretics, β-blockers, Ca antagonists, angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors, α₁Blockers are used for treatment as the main antihypertensive agent. However, these drugs do not satisfy all the conditions as desirable antihypertensive agents as shown below, and are considered to have advantages and disadvantages, respectively.
[0012]
Desirable conditions as an antihypertensive agent are:
1. The action is mild and the effect is stable.
2. There are few side effects at the beginning of use.
3. The effect on the circulatory dynamics and organ function works in the desired direction.
4). There is no adverse effect on risk factors for the cardiovascular system in long-term continuous use, but rather it is improved.
5. Improve patient compliance with treatment.
6). There are no contraindications for use due to various complications and accidents.
7). A better life can be expected by treatment.
[0013]
Specifically, the currently used antihypertensive agent has the following problems.
[0014]
With thiazide diuretics, it is a good indication if salt restriction is difficult to observe or fluid retention tends to occur, but glucose intolerance, hyperuricemia, renal dysfunction, hyperlipidemia, hypokemia It is said that it should be avoided to administer to patients who recognize this.
[0015]
β-blockers are well-adapted for young people and those with a tendency to tachycardia, but patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease, patients with obstructive lesions in peripheral arteries, Raynaud's symptoms It is believed that it is safer to avoid using it for patients who have the disease. Moreover, since it also affects insulin secretion, there is a drawback that it is difficult to use even for hypertensive patients with diabetes.
[0016]
As side effects of Ca antagonists, dihydropyridine derivatives have hot flushes and headaches due to vasodilatory effects, and may cause hypotension due to strong antihypertensive action, dizziness, tachycardia due to reflex sympathetic tone, and palpitation.
[0017]
Side effects of ACE inhibitors include orthostatic hypotension, dry cough, angioedema, and hyperkemia. Since it is excreted mainly from the kidney, it is necessary to pay attention to the dose and hyperkemia in patients with impaired renal function. In addition, damage to the fetus has been reported, and some are contraindicated for pregnant women.
[0018]
α₁With blockers, care must be taken not to cause side effects such as orthostatic hypotension.
[0019]
As described above, there are many drugs with various actions as antihypertensive drugs, but there are still no drugs that satisfy all of them in terms of side effects, long-term safety, and improvement of QOL. That is the current situation. In addition, hypertension treatment is to prevent the development of organ damage due to hypertension, which is the first goal, and to reduce the onset and mortality due to heart failure, renal failure, and stroke. Drug therapy is said to improve heart failure and stroke mortality, but does not prevent the increase in patients with renal failure due to hypertension. In acute or chronic glomerulonephritis, hypertension is caused by glomerular damage. The prognosis is poor in chronic glomerulonephritis with hypertension, and the presence of hypertension has been shown to be an independent prognostic exacerbation factor of chronic glomerulonephritis. However, treatment for hypertension associated with chronic glomerulonephritis has not been established.
[0020]
As described above, there is a demand for therapeutic drugs with truly desirable conditions, and in particular, development of drugs that also have a renal protective action is eagerly desired.
[0021]
The compound of formula (I), which is an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention, is a known compound, and its use as a malignant hyperphenylalaninemia, depression, Parkinson's disease, and other therapeutic agents is known. For example, see JP-A-59-25323, 59-76086, 61-277618, and 63-267781.
[0022]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention improves the circulatory dynamics and organ function by suppressing the decrease in endogenous NO production and the function of regulating endothelial cell function, and suppresses the development of various complications for the diseases contributed by the decrease in NOS function. The purpose is to provide a safe therapeutic agent without side effects in order to improve the quality of life.
[0023]
[Means for Solving the Problems]
As a result of various studies, the present inventors have hypothesized that BH4 levels may also be reduced in diseases to which reduced function of NOS contributes. Therefore, administration of BH4 to DOCA-saline hypertensive rats and DOCA-saline SHR was attempted. As a result, in the DOCA-salt hypertensive rat, it was observed that the BH4 level actually decreased, and surprisingly, the NOS expression level was also decreased. It has been found that an extremely natural and excellent blood pressure increase suppressing effect can be obtained. In addition, it was confirmed that BH4 levels were actually decreased even in DOCA-salt SHR, and further, necrotizing glomerulitis and necrotizing vasculitis were observed histopathologically. At the same time, it has been found that the above-mentioned histopathological findings can be significantly improved by regulating the function of endothelial cells, and the knowledge that BH4 has a function of activating NOS has been obtained, thereby completing the present invention. It was. That is, the present invention relates to an effective treatment of a disease contributed by a decrease in NOS function by a BH4 class preparation.
[0024]
Accordingly, the present invention provides a compound of formula (I):
[Chemical Formula 3]

[Wherein R¹And R²Each represents a hydrogen atom or together represent a single bond, R¹And R²R represents a hydrogen atom, R^ThreeIs —CH (OH) CH (OH) CH_Three, -CH (OCOCH_Three) CH (OCOCH_Three) CH_Three, -CH_Three, -CH₂OH or phenyl group, R¹And R²Together represent a single bond, R^ThreeIs —COCH (OH) CH_ThreeRepresents]
Or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient for preventing or treating a disease contributed by a decrease in NOS function.
[0025]
In the present specification, NOS function decline refers to NOS that exists widely such as vascular endothelium, nervous system, kidney, platelets, heart muscle, smooth muscle, etc. It means that NOS activity is not exerted due to a decrease in cell function. A typical example of NOS functional decline is a reduction in endogenous NO levels. Diseases contributed by NOS dysfunction include diseases that develop due to NOS dysfunction, diseases in which NOS dysfunction worsens symptoms, diseases in which NOS dysfunction delays healing, etc. , Hyperlipidemia, arteriosclerosis, coronary vasospasm, ischemic heart disease, heart failure, thrombosis, pulmonary hypertension, cerebral circulation failure, cerebral vasospasm, glomerulonephritis, chronic renal failure, diabetes, postoperative restenosis, achalasia Examples include cases in which reduced function of NOS contributes to portal hypertension, liver disorders, gastrointestinal mucosal disorders, hypertrophic pyloric stenosis, enteritis, impotence, retina choroidopathy, and the like.
[0026]
When administered to patients with these diseases, BH4 normalizes NOS function by stimulating NOS production in the body or restoring reduced endothelial cell function to prevent these diseases. Or can be treated.
[0027]
Therefore, the therapeutic or preventive subject of the present invention is a disease that can be treated by the function activation effect of NOS by BH4.
[0028]
The compounds represented by the formula (I) which are the active ingredients of the present invention include the following and their pharmaceutically acceptable salts:
(6R) -L-erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (BH4)
[Formula 4]

(6R, S) -5,6,7,8-tetrahydrobiopterin
1 ', 2'-Diacetyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin
[Chemical formula 5]

Sepiapterin
[Chemical 6]

6-Methyl-5,6,7,8-tetrahydropterin
[Chemical 7]

6-hydroxymethyl-5,6,7,8-tetrahydropterin
[Chemical 8]

6-Phenyl-5,6,7,8-tetrahydropterin
[Chemical 9]

Of these compounds, preferred compounds are 5,6,7,8-tetrahydrobiopterins or salts thereof, and the most preferred compound is BH4 or a salt thereof.
[0029]
The compound represented by the formula (I) used as an active ingredient in the present invention is a known compound. For example, see JP-A-59-25323, 59-76086, 61-277618, and 63-267781. These may be used as suitable salts, such as pharmacologically non-toxic acids, for example, mineral acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, boric acid, and acetic acid, formic acid, maleic acid, Examples thereof include salts with organic acids such as fumaric acid and mesylic acid.
[0030]
The drug of the present invention is effective for the aforementioned diseases. For example, hypertension includes not only essential hypertension, but also malignant hypertension that takes a rapid course and causes necrosis of small arterial walls such as the kidney and retina, and renal hypertension accompanied by kidney damage. Specifically, it is effective for all of essential hypertension, renal hypertension, renovascular hypertension, pregnancy hypertension, senile hypertension, and adrenal hypertension.
[0031]
The therapeutic agent of the present invention comprises a compound represented by formula (I) used as a carrier for general pharmaceutical preparations and oral, rectal or parenteral (including intravenous and cerebrospinal fluid administration) by a conventional method. It is manufactured by making it into a preparation form suitable for administration.
[0032]
The carriers used in these pharmaceutical preparations generally include excipients, binders, disintegrants and the like depending on the dosage form used.
[0033]
Typical examples of the excipient include starch, lactose, sucrose, glucose, mannitol, cellulose and the like, and examples of the binder include polyvinylpyrrolidone, starch, sucrose, hydroxypropylcellulose, gum arabic and the like. Examples of the disintegrant include starch, agar, gelatin powder, cellulose, CMC, and the like, but any other commonly used excipient, binder, and disintegrant may be used.
[0034]
The therapeutic agent of the present invention preferably contains an antioxidant for stabilizing the active ingredient in addition to the carrier. The antioxidant is appropriately selected from those generally used in pharmaceutical preparations, and examples thereof include ascorbic acid, N-acetylcysteine, L-cysteine, dl-α-tocopherol, natural tocopherol and the like. The amount used may be any amount that stabilizes the active ingredient (one or more), but generally it is preferably 0.2 to 2.0 by weight with respect to the active ingredient 1.
[0035]
Formulations according to the invention suitable for oral administration are tablets, sublingual tablets, capsules, powders, powders, granules or fine granules each containing a predetermined amount of active ingredient (s) or syrups, emulsions Alternatively, it can be provided as a suspension in a non-aqueous liquid such as a dose.
[0036]
For example, a granule is prepared by uniformly mixing an active ingredient (one or more) and one or more auxiliary ingredients such as the above-mentioned carrier, antioxidant, etc., and preparing a mesh using a sieve. Provided by. A tablet may be made by compression or molding the active ingredient (one or more), optionally with one or more accessory ingredients. Capsules are produced by filling the active ingredient (one or more), optionally with one or more auxiliary ingredients, uniformly into powder or granules in suitable capsules using a filling machine or the like. Formulations for rectal administration can be provided as suppositories using conventional carriers such as cocoa butter. A preparation for parenteral administration can be provided by sealing the active ingredient (one or more) as a dry solid in a sterile nitrogen purification container. At the time of parenteral administration, this dry solid preparation can be dispersed or dissolved in a predetermined amount of sterile water and administered to a patient.
[0037]
In the preparation of these preparations, it is preferable to add the above-mentioned antioxidants in addition to the active ingredients and the usual carriers, and if necessary, buffering agents, flavoring agents, surfactants, thickeners, lubricants. One or more auxiliary components selected from agents, lubricants and the like may be further contained.
[0038]
The dose of the active ingredient, i.e. the compound of formula (I), will of course vary depending on the route of administration, the condition being treated, and the patient being treated. It is left to me.
[0039]
For example, a suitable dose for treating hypertension is in the range of 0.1-50 mg / kg (body weight) / day, with a typical preferred dose of 0.5-10 mg / kg (body weight) / day. It is.
[0040]
The desired dose may be the above active ingredient administered once a day, but may be divided into 2 to 4 divided doses at appropriate intervals throughout the day.
[0041]
The active ingredient can be administered alone without being mixed with other ingredients, but other active ingredients according to the applicable disease are administered as a pharmaceutical preparation for the purpose of facilitating dosage adjustment. You can also
[0042]
The preparation of the present invention comprises a compound represented by the formula (I) as an active ingredient, a NOS substrate or a coenzyme or cofactor such as L-arginine, flavins (for example, FAD, FMN, etc.) and calcium. You may contain at least 1 sort (s) chosen from the group which consists of as an auxiliary | assistant active ingredient. By mixing these active ingredients, a further excellent therapeutic effect can be expected as compared with the single use of the compound represented by the formula (I). The ratio of each of the above components in the preparation of the present invention is not particularly limited. For example, at least selected from the group consisting of L-arginine, flavins and calcium with respect to 1 of the compound represented by formula (I) by weight. One type can be in the range of 0.1 to 10, preferably in the range of 0.5 to 2.
[0043]
With this mixed preparation, for example, an appropriate dose for treating hypertension is in the range of 0.1 to 50 mg / kg (body weight) / day as the total amount of active ingredients, preferably 0.5 to 10 mg / kg. (Weight) / day.
[0044]
In the treatment, selection of a preparation containing the compound represented by formula (I) alone as an active ingredient and a preparation containing other active ingredients is appropriately selected by a doctor according to age, symptoms and the like.
[0045]
The active ingredient used in the present invention is most preferably (6R) -L-erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (BH4) and salts thereof, but (6R, S) -5,6,7, 8-tetrahydrobiopterin, 1 ′, 2′-diacetyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin, sepiapterin, 6-methyl-5,6,7,8-tetrahydropterin, 6-hydroxymethyl-5,6 , 7,8-tetrahydropterin or similar compounds such as 6-phenyl-5,6,7,8-tetrahydropterin and their salts. However, it goes without saying that BH4, which is a natural body existing in the living body, is preferable. The acute toxicity of BH4 · 2 hydrochloride to rats is 2 g / kg (body weight) or more by oral administration, and almost no toxicity is found. In addition, (6R, S) -5,6,7,8-tetrahydrobiopterin which is not an optically active substance is also less toxic as seen in the treatment of Parkinson's disease in JP-A-59-25323. It can be used for treatment. In addition to these compounds, acute toxicity is hardly found in the compounds belonging to the formula (I).
[0046]
Although it demonstrates still in detail according to the following examples, this invention is not limited to these Examples.
[0047]
【Example】
Example 1 (granule, fine granule)
Dissolve 1 part (parts by weight) of polyvinylpyrrolidone (Kollidon 30) in sterilized purified water, add 10 parts of ascorbic acid and 5 parts of L-cysteine / hydrochloride to make a uniform solution, and then 10 parts of BH4 · 2 hydrochloride. To make it uniform.
This solution was added to 59 parts of an excipient (mannitol or lactose) and 15 parts of a disintegrant [corn starch or hydroxypropyl cellulose (LH-22)], kneaded, granulated, dried, and then sieved.
[0048]
Example 2 (Tablets)
After mixing 58 parts of lactose and 15 parts of microcrystalline cellulose into the uniform solution of the active ingredient prepared in Example 1, 1 part of magnesium stearate was further added, mixed and tableted.
[0049]
Example 3 (Capsule)
Capsules filled with the dosage form prepared in Example 1 were filled. However, a lubricant prepared by adding 0.2% magnesium stearate was used.
[0050]
Example 4 (Injection preparation)
BH4 ・ 2 hydrochloride 1.5g
Ascorbic acid 1.5g
L-cysteine ・ hydrochloride 0.5g
Mannitol 6.5g
The above components were dissolved in sterilized purified water and sterilized to 100 ml, and 1 ml or 2 ml each was placed in a vial or ampoule and freeze-dried and sealed.
[0051]
Example 5 (Injection preparation)
BH4 · 2 hydrochloride (2.0 g) was dissolved in sterilized purified water without oxygen to sterilize the solution, and sealed in the same manner as in Example 4.
[0052]
Example 6 (suppository)
150 parts of BH4 · 2 hydrochloride
Ascorbic acid 150 parts
50 parts of L-cysteine hydrochloride
Using the above components, a uniform powder was dispersed in 9950 parts of cocoa butter.
[0053]
Example 7 (Granule)
5 parts of BH4 · 2 hydrochloride
Ascorbic acid 5 parts
L-Cysteine hydrochloride 2 parts
A uniform solution was prepared using the above components.
On the other hand, 55 parts of mannitol, 1 part of polyvinylpyrrolidone, 14 parts of hydroxypropyl cellulose, and 5 parts of L-arginine or calcium were added to the above solution, kneaded, granulated, dried, and then sieved. .
[0054]
Example 8 (Granule)
5 parts of BH4 · 2 hydrochloride
Ascorbic acid 5 parts
5 parts of L-cysteine hydrochloride
52 parts of mannitol
1 part of polyvinylpyrrolidone (Kollidon 30)
Hydroxypropylcellulose (LH-22) 12 parts
10 parts of L-arginine or calcium
Using the above components, granulation was carried out in the same manner as in Example 7 and sieved.
[0055]
Example 9 (granule)
5 parts of BH4 · 2 hydrochloride
Ascorbic acid 5 parts
L-Cysteine hydrochloride 2 parts
A homogeneous solution was prepared using the above components.
On the other hand, 10 parts of L-arginine or calcium, 50 parts of mannitol, 1 part of polyvinylpyrrolidone (Kollidon 30) and 9 parts of hydroxypropylcellulose (LH-22) were kneaded, granulated and dried. And then sieved.
[0056]
Example 10
Creation of DOCA-salt hypertensive rats
Eight weeks old Sprague-Dawley rats (obtained from Charles River) were subjected to unilateral nephrectomy (excluding the control group). Then, it divided into the following three experimental groups and compared.
1) Group given only drinking water (control group) Number of subjects n = 3
2) A group of deoxycorticosterone acetate (DOCA) 30 mg / kg body weight subcutaneously administered once weekly, 1% saline was given, and DOCA-salt hypertensive rats were prepared from one week after hepatectomy DOCA group) n = 6
3) A group in which BH4 (10 mg / kg body weight / day) was orally administered to DOCA-salt hypertensive rats (DOCA + BH4 group) n = 5
Each group was observed up to 5 weeks after the end of the experiment. At the start of the experiment, 2 weeks, 4 weeks, and 5 weeks (at the end of the observation), urine was collected for 24 hours using a metabolic cage. At the end of observation, blood was collected from the abdominal aorta under phenobarbital anesthesia, and then the kidney was removed after perfusion with physiological saline for histological and immunohistological studies.
[0057]
Blood pressure measurement
Blood pressure was measured by tail-cuff method at the start of the experiment, 2 weeks later, 4 weeks later and 5 weeks later.
[0058]
NO in urine ₂ / NO _Three Measurement
Based on the Griess method, it measured using Nitrate-Nitrite assay kit, Kit No. 780001 of Cyman Chemical Company. NO in urine₂/ NO_ThreeThe larger the value of, the higher the activity of NOS.
[0059]
Urinary BP measurement
HPLC analysis was performed based on the method of Fukushima and Nixon (Anal. Biochem. 102; 176-188, 1980) to measure biopterin (BP), which is a metabolite of BH4. The effect of BH4 administration will be examined based on the transition of urinary BP values.
[0060]
Kidney tissue NOS immunostaining
The excised kidney tissue was frozen, and on the sliced slices, the expression of endothelial NOS (E-NOS) and brain type NOS (B-NOS) in the kidney tissue was respectively specific antibody, anti-E-NOS antibody and anti-B -Examination was carried out by immunostaining using NOS antibody (obtained from Affinity Bioreagents).
[0061]
NOS mRNA expression measurement
a) Extraction of total RNA from kidney tissue
RNA extraction from kidney tissue was performed by guanidinium / cesium chloride extraction method.
Specifically, first, a small amount of tissue was collected from the excised kidney cortex and immediately added to the molten solution 4M guanidinium thiocyanate and crushed with a glass / Teflon homogenizer. This cell lysis solution was layered on 5.7 M cesium chloride, centrifuged at 80,000 rpm for 2 hours, and then the precipitate was dissolved in a 0.1% diethylpyrocarbonate (DEP) solution. 2.5M ammonium acetate and ethanol were added to this, and it was made to precipitate at -20 degreeC for 1 hour, this was centrifuged at 10,000 rpm at 4 degreeC for 20 minutes, and precipitation was obtained. The precipitate was dissolved in a 0.1% DEP solution at a concentration of about 1 μg / μl and stored at −20 ° C. until use.
[0062]
b) Reverse transcriptase (RT) reaction
CDNA was synthesized from total RNA using MoMLV reverse transcriptase.
In detail, total RNA, primers, buffer, H₂The sample mixed with O was heated at 95 ° C. for 2 minutes and then cooled on ice. Next, it was incubated at 37 ° C. for 30 minutes to anneal the primer to RNA. To this, 0.2M dithiothreitol (DTT), 5 mM deoxyribonucleotide (dNTP) mixed solution, RNasin, and MoMLV reverse transcriptase were added, heated at 90 ° C. for 5 minutes, and then cooled with ice to stop the reaction.
[0063]
c) PCR
PCR was performed using the cDNA obtained by the RT method as a template.
Specifically, each of 5′-side primer, 3′-side primer, PCR buffer, 2.5 mM dNTP mixed solution, Taq DNA polymerase for E-NOS for detection and malate dehydrogenase (MDH) used as an internal control was mixed and RT The reaction solution was added. Mineral oil was overlaid, and after centrifugation, the reaction was started with an automatic PCR device. One cycle was 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds, and this was repeated for 30 cycles to obtain a PCR product. In addition, the primer used for E-NOS detection and MDH detection followed Ujiie.K. Et al., Am.J.Physiol.267 (Renal Fluid Electrolyte Physiol.36): F296-F302.1994. Specifically, the base sequence of the primer used for E-NOS detection is 5′-side primer: TACGGAGCAGCAAATCCCAC (SEQ ID NO: 1), 3′-side primer: CAGGCTGCAGTCCTTTTGATC (SEQ ID NO: 2). The base sequence of the primer used for MDH detection is 5′-side primer: CAAGAAGCATGGCGTATACAACCC (SEQ ID NO: 3) and 3′-side primer: TTTCAGCTCCAGGGATGGCCTCG (SEQ ID NO: 4).
[0064]
d) Measurement of NOS mRNA expression by polyacrylamide gel electrophoresis and Southern hybridization
The PCR product was electrophoresed on a 5% polyacrylamide gel, and NOS mRNA expression was measured by Southern hybridization.
Specifically, first, the PCR reaction solution was electrophoresed with 5% polyacrylamide, and after completion of the electrophoresis, the gel was transferred to a membrane filter. Γ for E-NOS detection and MDH detection³²Hybridization was performed on a membrane filter using a probe labeled at the 5 'end with P-ATP (Ujiie K. et al., 1994, supra). The base sequence of the probe for detecting E-NOS was CTGGAACAATTTCCATCCG (SEQ ID NO: 5), and the base sequence of the probe for detecting MDH was TTGTTCTTCTCCCTGGTGGA (SEQ ID NO: 6). Thereafter, autoradiography was performed at −70 ° C. for several hours, and the exposed autoradiography was analyzed using a densitometer. The results are shown in FIG.
Based on the results of autoradiography, the amount of E-NOSPCR product was normalized by the amount of MDHPCR product, which is a housekeeping gene, and E-NOS gene expression was semi-quantified.
[0065]
statistics
The measured values were expressed as mean ± standard error, and statistics between groups were performed by two-way ANOVA. Hereinafter, p <0.05 was defined as the significance level.
The changes in blood pressure are shown in Table 1 below and FIG. The DOCA group exhibited hypertension at the 4th week of observation. The increase in blood pressure in the DOCA group was significant compared to the other two groups. In contrast, the DOCA + BH4 group remained at normal blood pressure as in the control group until the end of observation.
[Table 1]

[0066]
NO in urine₂/ NO_ThreeTable 2 and FIG. Urinary NO in DOCA group₂/ NO_ThreeDecreased with time and became below the measurement sensitivity at the end of the observation. In contrast, it increased in the DOCA + BH4 group. The decrease in the DOCA group was significant compared to the other two groups, and no significant difference was observed between the control group and the DOCA + BH4 group.
[Table 2]

[0067]
The transition of urinary BP is shown in Table 3 and FIG. In the DOCA group, BP decreased with time. In contrast, in the DOCA + BH4 group, BP increased with time. The decrease in the DOCA group was significant compared to the other two groups, and no significant difference was observed between the control group and the DOCA + BH4 group.
[Table 3]

[0068]
As shown in Table 4, body weight increased with time in any group, and no significant difference was observed among the three groups.
[Table 4]

As a result of immunostaining, the expression of E-NOS in small blood vessels and the expression of B-NOS in macula densa decreased in the DOCA group, and these expression levels in the DOCA + BH4 group were the same or slightly increased in the DOCA + BH4 group. Observed.
[0069]
(NOS mRNA expression measurement results)
As a result of the measurement, as shown in FIG. 4, mRNA expression of E-NOS was significantly increased in the DOCA + BH4 group as compared to the DOCA group.
As described above, in DOCA-salt hypertensive rats, blood pressure increases and urinary NO.₂/ NO_ThreeDecreased, renal tissue NOS expression decreased, and vascular endothelial cell dysfunction was observed. Furthermore, it was revealed that urinary BP decreased in the model rat. On the other hand, an increase in blood pressure is suppressed by BH4 administered orally, and urinary NO₂/ NO_ThreeBH4 activates NOS function (control of NOS amount / NOS activity) and is useful for the treatment of diseases associated with decreased endogenous NO production. It was shown that.
[0070]
Example 11
Creation of DOCA-salt SHR
Eight-week-old SHR (obtained from Charles River) was subjected to unilateral nephrectomy (excluding the control group). Then, it divided into the following three experimental groups and compared.
1) Group given only drinking water (control group) Number of subjects n = 8
2) From 1 week after hepatectomy, deoxycorticosterone acetate (DOCA) 30 mg / kg body weight was subcutaneously administered once a week, 1% saline was given, and DOCA-saline SHR was prepared (DOCA) Group) n = 4
3) Group in which BH4 (10 mg / kg body weight / day) was orally administered to DOCA-saline SHR (DOCA + BH4 group) n = 6
Each group was observed up to 6 weeks after the end of the experiment. At the start of the experiment, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 5 weeks, and 6 weeks (at the end of the observation), urine was collected for 24 hours using a metabolic cage. At the end of observation, blood was collected from the abdominal aorta under phenobarbital anesthesia, and then the kidney was removed after perfusion with physiological saline, and histological examination was performed.
[0071]
Blood pressure measurement
Blood pressure was measured by the tail-cuff method at the start of the experiment, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 5 weeks, and 6 weeks.
[0072]
Urinary BP measurement
HPLC analysis was performed based on the method of Fukushima and Nixon, and biopterin (BP), which is a metabolite of BH4, was measured. The effect of BH4 administration will be examined based on the transition of urinary BP values.
[0073]
Histopathological findings
After completing urine collection and blood pressure measurement after 6 weeks, the abdomen was opened under anesthesia, the blood was removed from the abdominal aorta, and physiological saline was injected from the same part to perform perfusion. The excised kidney was fixed in a 10% formaldehyde solution, embedded in paraffin, and sliced into 4 μm with a microtome to prepare a kidney tissue specimen. Hematoxylin and eosin (HE) staining and periodic acid-Shiff staining were performed. The pathological findings found in rat kidney tissue specimens, ie, the frequency of necrotizing glomerulitis and necrotizing arteriitis, were compared.
[0074]
statistics
The measured values were expressed as mean ± standard error, and statistics between groups were performed by two-way ANOVA. Hereinafter, p <0.05 was defined as the significance level.
The changes in blood pressure are shown in Table 5 below and FIG. The DOCA group exhibited marked hypertension at the third week of observation. The increase in blood pressure in the DOCA group was significant compared to the other two groups. In contrast, the DOCA + BH4 group remained at the same level as the control group until the end of the observation.
[Table 5]

[0075]
The transition of urinary BP is shown in Table 6 and FIG. In the DOCA group, BP decreased with time. In contrast, BH4 increased with time in the DOCA + BH4 group. The decrease in the DOCA group was significant compared to the other two groups, and no significant difference was observed between the control group and the DOCA + BH4 group.
[Table 6]

[0076]
The frequency of appearance of histopathological findings found in the renal tissue specimen is shown in Table 7 and FIG. In the DOCA group, the incidence of necrotizing glomerulitis and the incidence of necrotizing vasculitis were significantly higher than in the other two groups.
[Table 7]

As described above, in DOCA-saline SHR, histopathological findings such as an increase in blood pressure, necrotizing glomerulitis, and necrotizing vasculitis were observed. Furthermore, it was revealed that urinary BP decreased in the model rat. On the other hand, BH4 administered orally suppressed blood pressure elevation and markedly improved histopathological findings. Therefore, BH4 activates the function of NOS to treat diseases associated with decreased endothelial cell function. It has been shown to be useful.
[0077]
【The invention's effect】
As described above, the present invention provides a therapeutic agent that effectively prevents and / or ameliorates a disease contributed by a decrease in NOS function. In addition, since the active ingredient of the therapeutic agent of the present invention is a substance originally present in the living body, there is no worry about side effects even if it is used for a long time.
[0078]
[Sequence Listing]
[0079]

[0080]

[0081]

[0082]

[0083]

[0084]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows changes in blood pressure over time in a control group (− ◯ −), a DOCA group (−Δ−), and DOCA-salt hypertensive rats (DOCA + BH4 group, − □ −) administered orally with BH4.
FIG. 2 shows urinary NO of a control group (− ◯ −), a DOCA group (−Δ−) and DOCA-salt hypertensive rats (DOCA + BH4 group, − □ −) to which BH4 was orally administered.₂/ NO_ThreeThe change with time is shown.
FIG. 3 shows changes in urine BP over time in a control group (− ◯ −), a DOCA group (−Δ−), and DOCA-salt hypertensive rats (DOCA + BH4 group, − □ −) to which BH4 was orally administered. .
FIG. 4 shows the results of measuring the expression of E-NOS mRNA in renal tissue.
FIG. 5 shows changes in blood pressure over time in a control group (− ● −), a DOCA group (−Δ−), and DOCA-saline SHR (DOCA + BH4 group, − □ −) to which BH4 was orally administered.
FIG. 6 shows urinary BP changes over time in a control group (− ● −), a DOCA group (−Δ−), and DOCA-saline SHR (DOCA + BH4 group, − □ −) to which BH4 was orally administered.
FIG. 7 shows pathological findings found in renal tissue specimens. From the left, the incidences of necrotizing glomerulitis and necrotizing vasculitis are shown for the control group, DOCA group and DOCA + BH4 group, respectively. Show.

Claims (4)

Formula (1):

[Wherein R ¹ and R ² represent a hydrogen atom, and R ³ represents L-erythro-CH (OH) CH (OH) CH ₃ ]
Or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient,
A therapeutic agent for hypertension involving a decrease in the expression of endothelial NOS (E-NOS) or brain-type NOS (B-NOS).   The therapeutic agent according to claim 1, wherein the hypertension is essential hypertension, renal hypertension, renovascular hypertension, senile hypertension or adrenal hypertension. Formula (I)

[Wherein, R ¹ and R ² each represent a hydrogen atom, and R ³ represents L-erythro-CH (OH) CH (OH) CH ₃ ]
Or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient,
A therapeutic agent for renal disorders involving a decrease in the expression of endothelial NOS (E-NOS) or brain NOS (B-NOS).   The therapeutic agent according to claim 3, wherein the renal disorder is necrotizing glomerulitis or necrotizing vasculitis.

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