JP4842449B2

JP4842449B2 - Porous material and column for chromatography

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Publication number: JP4842449B2
Application number: JP2001098489A
Authority: JP
Inventors: 正浩古野; 真義大平
Original assignee: GL Sciences Inc
Current assignee: GL Sciences Inc
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2021-03-30
Also published as: JP2002296258A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロマトグラフィー用多孔質体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
クロマトグラフィーによる分離技術は、移動相である展開剤により運ばれる試料と充填剤間の何らかの相互作用により保持される力の、各試料間の違いを利用して分離しようとするものである。試料が固定相に捕集される機構は、分配、吸着及びイオン交換や、分子サイズによるものなどに大別される。これらの相互作用のうち、代表的なものは、充填剤の表面の所謂固定相への分配・吸着力を利用し、分別的な捕集及び脱離を連続的に繰返して試料を分離する操作により分離を行う。固定相は、固体吸着媒体の粒子を充填したカラムに保持して形成される。
【０００３】
固定相は、通常充填粒子自体であるか、粒子を担体として分析試料に適した分離剤をコーティング、又は分析試料に適した化学的修飾剤を粒子に化学的に結合させることによって保持されている。従って、充填剤は、充填粒子そのもの、又は固定相を担持する粒子も含む。
【０００４】
クロマトグラフィー分離システムは、試料の分析に広く用いられているが、通常にカラムを使用する場合、実際の使用上の欠点として、再現性の問題が上げられる。即ち、充填カラムは再現性が保証されないために、実験室間或いは同一実験室でも必ずしも同一の結果が得られるとは限らず、保持時間による試料の同定などは相対的な結果に頼らざるを得なかった。
【０００５】
カラムの再現性を阻害する要因としては、充填材粒子内部構造の再現性に問題があると云われている。又、カラムの再現性にとっては、カラム充填剤因子によるものも大きく、充填ロットにより、充填剤が本来持っている分離性能を充分発揮させていない場合がある。
【０００６】
これらの原因としては、充填カラムの内部構造を考えなければならない。例えば、全多孔性のシリカゲル粒子をカラムに充填した場合、カラム全体として見たとき、細孔は粒子間の細孔と粒子内細孔の２つの穴からなり、試料はこの２つの孔間を行き来しながら分離される。この２つの穴のうち、粒子間細孔は充填時に決定されるので、充填時の僅かな違いにより、その構造は変化する。又、その際、粒子同士がぶつかり合うため、充填剤が破壊される現象もしばしば見られ、そのため表面の改質層が剥がれ、異常吸着を発生されることもある。又、充填には非常に手間がかかり、トラブルも多く、均一に充填されないなどの不良品が多発するため、製品歩留まりが悪く、検査の費用を含め、コストの上昇を招いている。
【０００７】
従来知られている充填型のクロマトグラフィー用カラムは構造を大別して次の２種類に分類される。即ち、１）表面多孔性又は全多孔性のシリカゲル又は樹脂製充填剤１をガラス、プラスチック又はステンレス鋼製の円筒状の容器２に充填した構造（図２）、２）無孔性球状のシリカゲル又は樹脂製充填剤３を充填した構造（図３）である。
【０００８】
例えば、表面多孔性又は全多孔性のシリカゲル粒子１でカラム２を充填した場合、粒子間細孔４と粒子内細孔５の二重構造（ダブルポア）をとる（図２，図７）。この場合、充填粒子１の細孔内表面への試料の内流的な吸着及び分配による試料の分離と分子サイズによる分離が同時に起こり、単純な吸着・分配による分離とはならない（ダブルポアによる分離）。又無孔性の充填剤を詰めた場合はシングルポア（図３，図８）であるが、粒子による包囲状態により、図３に示すように形成される空間４の形状の大きさが様々に変化し、相変わらず分離モードが複雑になる。又、無孔性カラムは粒子が小さいため、特に充填は難しい。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
以上のことからこれまで幾つかの充填に頼らないカラムが提唱されてきた。これら充填に頼らないカラムも詳細に検討すると、ダブルポア型とシングルポア型の２つの構造がある。例えば、多孔性の樹脂を容器２内で結合させ、充填剤とした例がある。この構造では、容器内で充填粒子を結合させるため、再現性に問題があること、又、分子サイズによる分離が生じるため、単純な吸着・分配による分離とはならない（ダブルポアによる分離）（図４）。即ち、この場合も充填剤の有する機能が充分発揮されず、分離モードが単純ではない。
【００１０】
又、ゾル・ゲル法多孔質ガラスの製法を用いて、マクロな貫通孔と壁内に微細な拡散孔を持ったロッド状のガラスを用い、カラムとすることが提案されている（特開平６−２６５５３４）。この場合も多孔性の樹脂を容器内で結合させたものと基本的に同様の構造をしており（図４）、従来の充填カラムと同様に貫通孔であるマクロ細孔と壁内細孔の二重構造（ダブルポア）（図７）をとることにより、吸着・分配と分子サイズによる分離が同時に生じるため、単純な分離とはならない。又、ゾル・ゲル法多孔質ガラスの製法を用いて作製したガラスは脆く、周辺シールなどに問題があること、分相構造の再現性の不安定さによる再生産性に問題があるなど、従来の問題を解決するに至っていない。
【００１１】
叉、これらの方法では、骨格としては、単一系になるため、スルーポアと分離に必要なメソポアの割合は、均一系合成条件によりコントロールすることが特徴となっている。従って、広範囲の分析目的に応じたロッドを自由に作成することは困難となる。叉、たとえできたとしても、単一系のため、ロッド構造に無理が生じ、ＨＰＬＣに必要な耐圧性が得られ難い。例えば、従来方法によるアクリルアミド樹脂ロッドでは、膨潤を避けるために、架橋剤であるメチレンビスアクリルアミドやメタクリレートなどを多量に加えて作成する。そのため、合成において、相反応利用が必要となり、他種の溶媒や緩衝溶媒を用いる。使用できる溶媒は限定されるため、ある程度の範囲となってしまう。
【００１２】
又、分相法の多孔質ガラスを用い、骨格６にシングルポア７を持つ多孔質体クロマトグラフィー用カラムが提唱されている（特開平７−１２０４５０）（図５）。これは、実用的且つ生産性に富んだ手法ではあるが、実質的に表面積の小さな保持容量の小さなものしか提供させておらず、より高性能なカラムが望まれており、且つそれに適応した分離システムの確立が必要となる。
【００１３】
一方、分析試料の前処理に使用されることの多い固相抽出法とは、試料を固相に負荷して保持させ、洗浄後に目的成分を溶出させる方法である。そのため、一旦流量を小さくする必要が生じ、低流量での確実な分配が不可欠となる。固相のスルーポアが大きいことは低流量域での分配により効果的であり、又スルーポア表面に形成されるメソポアは、試料成分との接触を大きくすることができ、その分固相の保持によい影響を与えることが期待される。
【００１４】
しかし、実際の固相抽出では、目的成分以外に多量のマトリクス成分が混在することになり、それらの成分の負荷量が問題となり、従来のガラスの単一スルーポアのものは使用できなかった。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は以上の各種の問題点から、シングルポア型の分離の必要性に対応できる多孔質体の強度の大なるものであり、且つ実質的に表面積の大なる保持容量の大なるモノリス型カラム等の多孔質体を提案するもので、マクロ細孔を持つ骨格体のマクロ細孔に、解放構造のミクロ多孔質体を充填形成させたことを特徴とするクロマトグラフィー用多孔質体を提案するものである。
【００１６】
ここでクロマトグラフィーとは、試料を展開剤を介して固定相中で移動させ、固定相に対する吸着、離脱により試料を分離する操作である。従って、広い意味に使用され、具体的にガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーに限定されず、固相抽出法等を含む概念であり、カラムや固相が具体的に使用されるものである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の構成は、骨格体８の上面から下面まで貫通しているマクロ細孔９，９，…の内部に、解放構造のミクロ細孔１０，１０，…を持つ多孔質体３が充填され一体化した構造を持つ多孔質体であり、モノリス型多孔質カラムに形成する。
【００１８】
マクロ細孔９，９，…の軸方向には垂直な断面は、円形又は長径と短径が異なる楕円形など円形に近いものが好ましい。マクロ細孔９，９，…の直径は、０．１〜１０ミクロンであってもよく、より好ましくは、０．５〜５ミクロンである。マクロ細孔９，９，…より小さい解放構造を持つミクロ細孔１０，１０，…は５〜１０００ｎｍであってもよく、好ましくは１０〜５００ｎｍである。マクロ細孔９，９，…より小さいと云うことは、相対的なものであり、例えばマクロ細孔９，９，…が０．１ミクロンの時、ミクロ細孔１０，１０，…は５ｎｍ以上、１００ｎｍ未満であり、マクロ細孔９，９，…が１０ミクロンの時、ミクロ細孔１０，１０，…は５ｎｍ以上、１００００ｎｍ未満であってもよいが、実質的に１０００ｎｍ以下である。と云うことを意味している。
【００１９】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や固相抽出における粒子を詰めた充填剤タイプにおいて、液体抵抗圧力は、その粒子径が小さくなるほど高くなることが知られており、ＨＰＬＣでは、粒子径１〜４０μｍ程度、固相では、２０μｍ〜１００μｍ程度が一般的となっている。
【００２０】
マクロ細孔径を持つモノリスカラムにおいては、マクロ細孔径が、充填剤タイプの粒子径と同様に考えられる。詳細は、文献ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．２０Ｎｏ．１（１９９９）に示されているように、骨格を形成するマクロ細孔は、液体抵抗と理論段数に影響し、充填タイプに比べて、同一理論段数を得る圧力は、１０分の１になることは知られている。この文献は、同一組成から作成されるマクロ細孔とミクロ細孔からなるモノリスカラムであって、本発明とは異なる。しかし、液抵抗においては、マクロ細孔を持つ骨格の影響が大きく、同じ理論となる。本発明においても、ＨＰＬＣや固相抽出におけるモノリスのマクロ細孔径は、充填タイプ粒子径の１０分の１程度となり、０．１〜１０μｍが実用的となる。
【００２１】
分離に影響を大きく与えるところは、ミクロ細孔となる。本発明のモノリスカラムでは、マクロ細孔径を形成後にミクロ細孔を形成するために、上記報告文献と異なり、より広い範囲のミクロ細孔を作成でき、マクロ細孔とミクロ細孔の比も自由に作成される。
【００２２】
そのため、本発明カラムでは、ミクロ細孔の範囲は、分離目的成分の液体中での分子の大きさによって決定される。化学物質には、多くのものが存在するが、液体中になると、タンパクなどの高次構造を持つものでも、液体親和力により、最大で１０００ｎｍあれば、十分細孔内部に入れることになる。５ｎｍ以下においては、ミクロ細孔容積をいくら大きくしても、マクロ細孔の影響が出てしまい、本発明でのミクロ細孔形成による利点を生かすことが出来ず、コントロールすることは無意味となる。
【００２３】
カラム１２は柱状体に形成するのがよい。柱状体の高さ（長さ）は特に制限はないが、１ｍｍ位から１０ｍであってもよい。柱状体の断面は略円形に近いのが望ましい。柱状体の最大径は特に制限されないが、１ｍｍから５０ｃｍであっても良い。多孔質柱状体は、上記で定義されたマクロ細孔９，９，…が、上面から下面まで貫通しており、屈曲しながら、及び／又は連通していてもよい。即ち、カラムの構造を移動相が通過する細孔の構造から考えた場合、固形多孔質ガラスの場合、滑らかな内面を持つ円筒状の細孔が集合・分散を繰返しながらジャングルジムのように絡み合っていると見なせる。
【００２４】
マクロ細孔９，９，…を持つ多孔質体の材質は、マクロ細孔９，９，…の径を上記の大きさに制御し得る材質であれば、特に制限されないが、多孔質セラミック、多孔質ガラスなどの無機質の多孔体、例えば、多孔質ガラスが望ましい。多孔質ガラスの例としては、組成がＮａＯ―Ｂ_２Ｏ_３―ＳｉＯ_２―ＣａＯ系のものが挙げられ、Ａｌ_２Ｏ_３，ＺｒＯ_２，ＺｎＯ_２，ＴｉＯ_２，ＳｎＯ_２，ＭｇＯ_２など種々の酸化物を添加したガラスを用いて製造する場合もある。多孔質ガラスは、例えば、けい砂、硼酸、ソーダ灰及びアルミナを混合し、１２００〜１４００℃に溶融する。
【００２５】
これを８００〜１１００℃にて成形後、未分相硼けいガラスを得、熱処理によりＳｉＯ_２相とＢ_２Ｏ_３―Ｎａ_２Ｏ―ＣａＯ相に分相させ、酸処理によって、ＳｉＯ_２骨格を残した多孔質体を製造する。細孔径は、用途によって、熱処理時の条件を変化させることにより、０．１〜１０ミクロンの細孔分布の均一なものが用途に応じて製造可能である。
【００２６】
多孔質セラミックの例としては、シリカ、アルミナシリケート質Ａ（硬磁気粒子を燒結したもの）、けい砂質、アルミナ質、アルミナシリト質Ｂ（シャモット粒子を燒結したもの）、多孔質ムライト質、けいそう土質のものなどがある。多孔質セラミックは、例えば、一定範囲の粒子径の陶磁器粒子（硬磁気粉砕物、シリカ、アルミナ、シャモットなど）と気孔形成材、例えば結晶セルロース（旭化成：アビセル）と適当な分散溶媒と混合・成形・燒結して製造する。細孔径５００μ程度から０．１μ程度又はそれを越える範囲のもので、細孔分布の均一なものが用途に応じて製作可能である。
【００２７】
次に、マクロ細孔９，９，…を持つ骨格体８のマクロ細孔９，９，…内にミクロ多孔質体を作成するためのモノマーを含浸させ、予め加えていた触媒等を利用し、マクロ細孔９，９，…内で重合させることにより、マクロ細孔９，９，…より小さく、解放構造を持ち、ミクロ細孔１０，１０，…を持つ多孔質体１１が充填され、一体化した構造を持つ多孔質柱状体を作成する。この場合、ミクロ多孔質体１１を作成するためのモノマーとは、有機、無機のどちらの材料でもよく、無機系であればテトラエトキシランに塩酸などの触媒を加え、調整したゾルを含浸させた後に、熟成させることにより、ミクロ細孔の多孔質シリカガラスを形成させることができる。又、有機系の場合、各種の樹脂が選択でき、例えばアクリルアミドモノマーを含浸させた後、重合させることにより、ポリアクリルアミドゲル多孔質体を得ることができる。
【００２８】
本発明のモノリス型（一体型）クロマトグラフィー用カラムは、液―液分配系、液―固吸着系、気―液分配系及び液―固（液）イオン交換系の全てのカラムクロマトグラフィー系に適用することができる。即ち、大気圧下の液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、超臨界クロマトグラフィーなどに適用し得る。又、前処理などを目的とする固相抽出用固相としても適用し得る。
【００２９】
本発明の多孔質カラムのミクロ細孔１０，１０，…には、従来の充填材に用いられている分離試料に適したコーティング剤及び／又は化学的修飾剤を適用して細孔の表面を修飾・改質し得る。コーティング剤としては、例えばポリエチレングリコール、シリコンオイルなどが挙げられる。又、化学的修飾剤としては、トリメチルクロロシラン（ＴＭＳ）、ジメチル―ｎ―オクチルクロロシラン、ジメチル―ｎ―オクタデシルクロロシラン（ＯＤＳ）などのアルキルクロロシラン、ｒ―アミノプロピルトリエトキシシランなどアミノアルコキシシラン、その他エポキシシランなど各種シラン処理剤が挙げられる。更に、表面修飾剤の修飾基にタンパク質などの高分子化合物又は低分子化合物が結合していてもよい。又、柱状体は変形させてＵ字又はコイル状のカラムとしてもよい。
【００３０】
本発明のモノリス型多孔質カラムは、強固な骨格体８である多孔質ガラスや多孔質セラミックのマクロ細孔９，９，…中に脆いゾル・ゲル法多孔質ガラスもしくは多孔質ポリマーを固定することにより、骨格体全体としては、大変強固な構造を持つことになった。従って、周囲のシールは従来フィルターなどで利用されるような、テフロンもしくはポリプロピレンなどのリングに強固に嵌め込むことで容易に実施できる。
【００３１】
従来タイプの充填材では、水溶離液での必要圧力は数Ｍｐａである。又、ゾルーゲルロッドカラムにおいては、スルーポアとメソポアを同時に作るため、空間を大きくする必要があり、脆くなってしまう。そのため、高圧に適用できないものになる。一方一般的なＨＰＬＣに用いられるインジェクション機能は、切換バルブによるもので、常用圧力が低くても、注入時には圧力変動が生じる。バイパスなどの利用により、解消は可能であるが高価になる。
【００３２】
以下、図に示す本発明カラムを用いた分離装置について説明すれば、溶離液を送液するポンプ１４と試料を注入するインジェクター１５と本発明カラム１２及び検出器１６により構成される。検出器１６も用途に応じ、電気化学検出器、分光光度計、ＲＩ検出器、蛍光検出器等各種選択できること勿論である。
【００３３】
本発明のカラムで構築したＨＰＬＣシステムは、硬い骨格を持つカラム１２のため、圧力変動が大きい安価なインジェクター１５又はインジェクションシステムを用いることができる。又、分析圧力が低いので、ポリプロピレン製などのバルブも使用できる。当然用いるポンプ１４も、安価な低圧ポンプを用いることができる。
【００３４】
従来の高圧システムを用いて、通常使用例の十倍以上の流速を流し高速分析することも可能となる。十倍以上の液を流すことは、カラム両端につけるフィルターの目詰り原因となるが、１つの硬い骨格を持つ本カラムを用いたシステムでは、フィルターを取付ける必要がなく、このような目詰りの心配は要らない。
【００３５】
又、カラム長を通常使用例の十倍にして、流速を通常にすることも可能になる。理論数段は、長さに比例するため、従来の十倍の段数が得られることになる。充填タイプでは、圧力も比例して十倍になり、このようなことは不可能である。ゾル・ゲル利用ロッドでは、カラム内部でゲル化するため、長いものを作成することは不可能に近い。又、出来たとしても、強度不足で折れ易い。
【００３６】
本発明カラムでは、強度の高いスルーポアだけの状態で、機械加工ができ、自由な大きさのものが作成できる。特に、ガラス製のものでは、溶融時に引けば、円形などの自由な形で、自由な長さに引くことが出来る。その後に、２次細孔を形成し、必要に応じて化学処理をすればＨＰＬＣ分離に使えることになる。このように、本発明カラムを用いたＨＰＬＣシステムでは、従来の十倍以上の長さのカラムを用いることも可能となる。
【００３７】
更に、本発明のモノリス型多孔質カラムの場合、背圧が低いこと、叉、低流速領域でも効果的な分離が得られることなどから低圧力、低流量でも流速が安定するポンプとを用いることが望ましく、特に背圧が低くても流速の変化が起こり難い超微量ポンプシステムと組合せることが可能となる。これらポンプシステムと本発明クロマトグラフィー用カラムは、一体のシステムとして機能する。
【００３８】
【実施例】
本発明の多孔質カラムを実施例により具体的に説明するが、以下の記載は本発明を制限するものではない。
〔実施例１〕多孔質ガラスの製造法
ＳｉＯ_２５９．０、Ｂ_２Ｏ_３２５．０、ＺｒＯ_２５．０、Ａｌ_２Ｏ_３３．０、ＣａＯ３．０、Ｎａ_２Ｏ５．０各重量％を溶融し、直径約４ｍｍのロッドを５４０℃にて７時間処理し、次いで７５０℃にて約３２時間処理して分相させた。相分離物を９０℃にて１Ｎ硫酸（酸（ｍｌ）／ガラス（ｇ）の比＝１７０）を用いて２日間酸処理し、その後、０．５Ｎ―ＮａＯＨ（酸（ｍｌ）／ガラス（ｇ）の比＝１７０）を用いて６時間アルカリ処理した。得られたガラスロッドを熱蒸留水で洗浄し、乾燥後、デシケーター中で保存した。得られたガラスロッドの細孔容積は、０．６ｍｌ／ｇであり、中心細孔直径２ミクロンであった。細孔径分布の測定は、水銀圧入法により測定した。得られた多孔質ガラス材を機械加工により柱状体に成形した。
【００３９】
上記のようにして得られた直径４ｍｍ×長さ１００ｍｍの２μｍマクロ細孔を持つＳｉＯ_２の骨格の骨格体を、５％塩酸水溶液２００ｍＬに全体を浸し、１２０℃で８時間還流し活性化する。活性化後にテフロンチューブに入れ、加熱収縮させ、液体を流せる状態にしておく。テトラエトキシシラン９ｍＬ、水１１ｍＬ、メタノール４ｍＬ、ジメチルホルムアミド４ｍＬ、アンモニア水４ｍＬを０℃で１０分間減圧撹拌し活性化させる。この液を上記骨格体に０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で１０分間流す。空気層が入り込まないように封入する。全体を１分間に２℃の昇温スピードで、６０℃に上げ、６時間ホールドし、マクロ細孔表面に結合しながらゲル化する。室温に戻し、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１０ｍＬを連続して０．１ｍＬ／ｍｉｎの流速で流し、未反応液を追い出す。封入し、８０℃で６時間熟成させ、ミクロ細孔を持つ多孔質体にする。窒素吸着測定法により、表面積４００ｍ^２／ｇ、細孔径２０ｎｍであることを確認した。室温に戻し、水５ｍＬ、アセトン５ｍＬ、ヘキサン２０ｍＬの順に流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで洗浄する。ここで、マクロ細孔とミクロ細孔の比が、０．１〜２００倍であること、マクロ細孔相とミクロ細孔相の容量比が、０．１〜２０００倍であることは推奨される。
【００４０】
このようにして得られた柱状体をＰＥＥＫ樹脂製のホルダー１３に装着して、高速液体クロマトグラフに接続し、溶離液条件９５％ヘキサン／５％イソプロパノール流速１ｍＬ／ｍｉｎで、１．ベンゼン、２．ニトロベンゼン、３．ｏ―ニトロアニゾールを分析した。図９はマクロポアのみの未処理多孔質カラム（表面積４０ｍ^２／ｇ以下）によるクロマトグラム、図１０はミクロポアを持つシリカゲルを充填した従来カラムによるクロマトグラム、図１１は処理後のミクロ細孔作成多孔質カラムによるクロマトグラムである。マクロポアだけでは分離が得られないミクロ細孔を形成させることにより、従来のシリカゲル充填カラムと同様なデータが得られた。
【００４１】
〔実施例２〕
直径４ｍｍ×長さ１００ｍｍの２μｍマクロ細孔を持つＳｉＯ_２の骨格の骨格体を、柱状体に成形し、実施例１と同様の方法で活性化する。活性化後にテフロンチューブに入れ、加熱収縮させ、液体を流せる状態にしておく。１００ｍＬブタノールと１０ｍＬテトラブトキシチタンの混合液に、１００ｍＬの５％塩酸水溶液を、０℃を保持しながら添加し、３０分間減圧撹拌し、活性化したゾル反応液を得る。この液を上記骨格体に０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で５０分間流す。空気層が入り込まないように封入する。全体を１分間に２℃の昇温スピードで８０℃に上げ６時間ホールドし、マクロ細孔表面に結合しながらゲル化する。ジメチルホルムアミド１０ｍＬ、１０％水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬを連続して０．１ｍＬ／ｍｉｎの流速で流し、未反応液を追い出す。封入し、１２０℃で１２時間熟成させ、ミクロ細孔を持つ多孔質体にする。窒素吸着測定法により、表面積１００ｍ^２／ｇ、細孔径２０ｎｍであることを確認した。室温に戻し、水５ｍＬ、アセトン５ｍＬ、ヘキサン２０ｍＬの順に流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで洗浄する。
【００４２】
このようにして得られた柱状体をＰＥＥＫ樹脂製のホルダーに装着して、高速液体クロマトグラフに接続し、溶離液条件ヘキサン／エタノール／メタノール＝90/90/1(w/w)、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで分析したところ、塩基性表面を持つチタニア特有の酸性化合物フェノールが中性ベンジルアルコールより遅れて溶出するという分離が得られた（図１２）。図中数字はサンプル名で、１はベンジルアルコール、２はフェノール、３はアニリンを表す。参考比較として、シリカゲル充填カラムタイプのデータを図１３に示す。分離順だけでなく、全体の保持としてもチタニア２次孔径を持つ本発明カラムのほうが大きくなった。
【００４３】
〔実施例３〕
直径５０ｍｍ×長さ２ｍｍの４μｍマクロ細孔を持つＳｉＯ_２の骨格の骨格体を円盤状に成形し、実施例1と同様の方法で活性化させる。液の出入口のある耐圧ステンレス反応槽に入れる。テトラメトキシシラン１００ｍＬ、０．０１Ｍ塩酸水溶液２００ｍＬを４０℃で、１時間撹拌し、ゾル水溶液を得る。この水溶液で上記反応槽を満たす。１２０℃にて１２時間放置する。４０℃に下げ、０．１％アンモニアメタノール液で置換しながら、高圧ポンプで流す。８０℃に保持し、４時間放置する。４０℃に下げ、二酸化炭素超臨界状態でメタノール液を流し出す。メタノール液が完全になくなるまで二酸化炭素で洗浄する。窒素吸着測定法により、表面積２００ｍ^２／ｇ、細孔径３０ｎｍであることを確認した。
【００４４】
次に、２０％オクタデシルトリクロロシラントルエン溶液を高圧ポンプで送りこみ、１２０℃で８時間放置する。次に、二酸化炭素超臨界状態で洗浄する。オクタデシル化多孔質固相が得られる。この多孔質固相を濾過器にセットして、分子量４４万の蛋白質フェリチン０．０１％水溶液３０ｍＬを流したところ、目詰りは生じず簡単に流すことが出来た。従来の固相では、このような減圧方法では、目詰りが生じて流れない場合があり、加圧方法が取られるが、この多孔質固相では、簡単に流すことが出来た。次に。１％アンモニア水溶液／１０％ＡＣＮで洗浄した。
【００４５】
２次細孔は、シリカゲルであるが、1次細孔はガラス骨格のため、アルカリ耐久性もあり、ろ液において、シリカゲル固相のようなアルカリ溶融物の溶出が見られなかった。次に、1％アンモニアアセトニトリル溶液で脱着後の蛋白回収率をＵＶ吸収法で測定した結果、８８％以上の回収率が得られた。充填タイプ固相では、充填剤の溶出を防ぐため、樹脂フィルターなどを使用するが、樹脂フィルターは疎水性であり、アルカリ条件下では疎水性の高まる蛋白質の吸着原因となり、回収は難しい。本固相では、フィルター無しで用いることが出来、高い回収率が得られた。
【００４６】
〔実施例４〕
直径４ｍｍ×長さ１００ｍｍの２μｍマクロ細孔を持つＳｉＯ_２の骨格の多孔質体を、実施例1と同様の方法で活性化する。活性化後にテフロンチューブに入れ、加熱収縮させ、液体を流せる状態にしておく。減圧蒸留したスチレン０．５ｇ／ブタノール１ｍＬ溶液とスチレンジビニルベンゼン０．３ｇ／ジメチルホメムアミド１ｍＬ溶液とを、０℃で１０分間撹拌混合する。０℃撹拌混合しながら、その溶液に０．１％アゾビスイソブチロニトリル／エタノール溶液１ｍＬを２分間かけて滴下添加した。更に、ビニルトリメトキシシラン１ｍＬ／エタノール３ｍＬ溶液を加えてよく撹拌した。
【００４７】
このモノマー溶液の上澄み均一相（５００回転で遠心分離）を、０℃を保持しながら、上記マクロ多孔質体にシリンジを用いて導入し、空気相が入り込まないように封入した。８０℃で４８時間反応し、シリコン骨格でスルーポア相と結合したスチレン―シリコンポリマー相を作成し、ミクロ細孔を持つ多孔質体を得た。窒素吸着法により、表面積２００ｍ^２／ｇ、ミクロ細孔径３０ｎｍであることを確認した。室温に戻し、イソプロパノール１Ｌ、アセトン１Ｌ、水１Ｌの順に、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで洗浄した。高速液体クロマトグラフに接続し、農薬を逆相分配分析した。その結果を図１４のクロマトグラムに示す。そのデータ詳細は次の通りである。
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：テトラヒドロフラン／１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）＝３７／６３
オーブン温度：４０℃
検出器：２３０ｎｍ
サンプル：１．アシュラム２．オキシン銅３．チウラム４．メコプロップ５．トリクロピル６．イプロジオン７．ベンスリド
【００４８】
〔実施例５〕
直径４ｍｍ×長さ１００ｍｍの２μｍマクロ細孔を持つＳｉＯ_２の骨格の多孔質体を、実施例1と同様の方法で活性化する。液を廃棄し、アクリロプロピルトリメトキシシラン５ｍＬ、メタノール１００ｍＬを加え、全体を浸し、８０℃で１２時間還流し、ビニル基を結合する。メタノールで数回デカンテーション洗浄後、テフロンチューブに入れ、加熱収縮させ、液体を流せる状態にする。
【００４９】
水洗浄後、減圧蒸留したアクリル酸アミド０．５％／メタノール１０ｍＬ／ジメチルホルムアミド１ｍＬ／０．１ｍｇアゾビスイソブチロニトリルのモノマー溶液を０℃を保持しながら、上記マクロ多孔質体にシリンジを用いて導入し、空気層が入り込まないように封入した。８０℃で４８時間反応し、スルーポア骨格と結合したアクリルアミドポリマー層を作成し、ミクロ細孔を持つ多孔質体を得た。ゲル透過クロマトグラフィーにより、ミクロ細孔径は１００ｎｍであることを確認した。室温に戻し、イソプロパノール１Ｌ、アセトン１Ｌ、水１Ｌの順に、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで洗浄した。高速液体クロマトグラムに接続し、０．１Ｍリン酸アンモニウム水溶液から０．０１Ｍリン酸アンモニウム水溶液まで５分間グラジエントし、蛋白質の分析を行った。その結果を図１５のクロマトグラムに示す。図中数字はサンプル名で、１はシトクロームＣ、２はリボヌクレアーゼ、３はリゾチームを表す。
【００５０】
〔実施例６〕
テトラブトキシシラン１００ｍＬを１Ｍ塩酸水溶液３００ｍＬ、プロパノール溶液４００ｍＬを８０℃で撹拌しながら、プロパノール及び水を除去し、水酸化ゲルを得た。このゲルを粉砕機により粉砕撹拌、１μｍ粒子を得た。この粒子１０ｇと結晶性セルロース０．１ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム０．１ｇ、ポリビニルアルコール０．１ｇを濃塩酸１０ｍＬに分散撹拌した溶液を円柱状の型に流し込み、１３００℃で燒結し、直径４ｍｍ×長さ１００ｍｍ、細穴直径２μｍの円柱状の多孔質セラミックを得た。テフロンチューブに押しこみ、液体を流せる状態にしておく。
【００５１】
１００ｍＬエタノールと１０ｍＬテトラエトキシシランの混合液に、１００ｍＬの５％塩酸水溶液を、０℃を保持しながら添加し、３０分間減圧撹拌し、活性化したゾル反応液を得る。この液を上記マクロ多孔質体に０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で１０分間流す。空気層が入り込まないように封入する。全体を１分間に２℃の昇温スピードで８０℃に上げ、６時間ホールドし、マクロ細孔表面に結合しながらゲル化する。室温に戻し、ジメチルホルムアミド１０ｍＬ、１０％水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬを連続して０．１ｍＬ／ｍｉｎの流速で流し、未反応液を追い出す。封入し、１２０℃で１２時間熟成させる。テフロンチューブから出し、４００℃で２０時間焼成し、ミクロ細孔を持つ多孔質体にした。窒素吸着測定法により、表面積２５０ｍ^２／ｇ、ミクロ細孔径２０ｎｍであることを確認した。オクタデシルクロロシラン１０ｇ／トルエン１００ｍＬ溶液に、多孔質体を浸し、６０℃で２４時間反応させた。得られたオクタデシル化多孔質体をピークチューブに押しこみ、両端にジョイントを接続しカラムとした。高速液体クロマトグラフに接続し、溶離液条件アセトニトリル／水３０／７０流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで分析したところ、極性の高い順（ニトロアニソール、ニトロベンゼン、ベンゼンの順）に溶出し、逆相分配挙動の多孔質カラムが得られた。その結果を図１６のクロマトグラムに示す。図中数字はサンプル名で、１はＯ―ニトロアニソール、２はニトロベンゼン、３はベンゼンを表す。
【００５２】
【発明の効果】
本発明請求項１及び請求項５によれば、そのモノリス型（一体型）クロマトグラフィー用多孔質体は、従来の充填カラムとは異なり、充填時の影響を受けないばかりではなく、均一な径を有する多孔体、即ち、シングルポアの多孔体の中を移動相が通過する構造中で分離が行われるものであり、これまで実用化されてきた充填構造と同じ二重構造を持たず、従ってシンプルな分離機構であるばかりではなく、潜在的に高理論段数が得られる。
【００５３】
叉、マクロ細孔の内部にマクロ細孔より小さく解放構造を持つミクロ細孔を持つ多孔質体が充填され、一体化した構造を持つため、単純な多孔質体であるクロマトグラフィー用カラムと比べ、高負荷・高段数になる。叉、ベースになるマクロ多孔質体の製法・再現性は実績があり、生産性が高い。叉、低圧力下、低流量でも流速が安定するポンプと組合せ最適化することにより、環境負荷の少ないクロマトグラフィー用カラム分離システムが構築できる。
【００５４】
本方法では、液の流れるスルーポアは既に形成されている状態に、分離を目的とするメソポアを形成するため、架橋剤の有無などの合成への影響はない。スルーポア表面と化学結合していることが望ましいが、従来方法で空間内に別のモノリス構造を物理的に作成しても良いことになる。スルーポアを形成している骨格とメソポアを形成する部分を独立して作成できるため、スルーポアとメソポアの比の範囲は大きくなる。叉、スルーポア骨格とメソポア骨格とを同一成分で作成させ、骨格境界面をなくすこともできる。既にスルーポア骨格が固まっており、メソポア形成条件の検討だけで、自由に多孔質ロッドが作成できる。
【００５５】
分離面において、スルーポア骨格成分とメソポア骨格成分を変えることができるので、両方の特徴を引き出すことができるようになる。例えば、スルーポア骨格は、耐圧の高いセラミックを用いて、メソポア骨格にはポリマーを形成させる。スルーポア骨格としては、耐圧があり、膨潤収縮は起きない。分離に関与するメソポアには、ポリマーを用いるため、ポリマー独自の分離や高い耐薬品性が得られる。両方を混合系で作成したハイブリッドタイプより、元の材質の特徴を大きく出すことができ、より広範囲な分析に用いることができる。叉、当然、メソポアをハイブリッドで形成することもできる。
【００５６】
又、請求項２によれば、請求項１の効果に加えて、マクロ細孔を有する骨格体が始めに多孔質ガラス又は多孔質セラミック、それだけで形成されるため、極めて強固に形成され、全体構造の強度が確保できる。
【００５７】
又、請求項３によれば、請求項１の効果に加えて、ミクロ多孔質体が多孔質ガラス又は多孔質ポリマーであるため、有機系、無機系の選択が自在であり、試料に応じた材質の然もミクロ細孔も選択ができ、材質に応じた分離、耐薬品性が所望に応じて特定提供できる。
【００５８】
又、請求項４によれば、マイクロ細穴の直径０．１〜１０μｍが実用範囲であり、ミクロ細孔の直径５１０００ｎｍが実用範囲である。この範囲であれば、各試料の分離に影響の大なるミクロ細孔を広い範囲で形成でき、且つマクロ細孔とミクロ細穴の比も自由に作成できる。
【００５９】
更に、請求項６によれば、本発明の多孔質体又はカラムを用いることにより、目詰りがなく、フィルターを用いる必要がない。このため、多量の溶液を高速で流し、高速分析が可能となる。又、低圧、低流量でも変化が少ないので、超微量ポンプシステムと組合せることが可能である等その利用範囲は極めて大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のモノリス型（一体型）多孔質カラムをクロマトグラフィー用カラムとした一例を模式的に示した図のカラムの軸方向の断面図
【図２】従来の充填カラムの軸方向の断面の一部の模式図
【図３】従来の充填カラムの軸方向の断面の一部の模式図
【図４】一体型カラムの軸方向の断面の一部の模式図
【図５】従来の一体型カラムの軸方向の断面の一部の模式図
【図６】本発明の構造の断面の一部の模式図
【図７】従来のカラムの細孔分布のグラフ図（ダブルポア型）
【図８】本発明カラムの細孔分布のグラフ図（シングルポア型）
【図９】従来のカラムによる処理例のクロマトグラム
【図１０】従来のカラムによる処理例のクロマトグラム
【図１１】本発明カラムによる処理例のクロマトグラム
【図１２】本発明カラムによる処理例のクロマトグラム
【図１３】従来のカラムによる処理例の比較クロマトグラム
【図１４】本発明カラムによる処理例のクロマトグラム
【図１５】本発明カラムによる処理例のクロマトグラム
【図１６】本発明カラムによる処理例のクロマトグラム
【図１７】本発明カラムを使用した分離装置の概略説明図
【符号の説明】
８骨格体
９マクロ細孔
１０多孔質体[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a porous body for chromatography.
[0002]
[Prior art]
The chromatographic separation technique attempts to separate using the difference between the samples in the force retained by some interaction between the sample and the packing material carried by the developing agent as the mobile phase. The mechanism by which the sample is collected in the stationary phase is roughly divided into distribution, adsorption and ion exchange, and molecular size. Among these interactions, a typical one is the operation of separating the sample by continuously repeating fractional collection and desorption using the so-called stationary phase distribution / adsorption force of the packing material. Separation by The stationary phase is formed by being held in a column packed with particles of a solid adsorption medium.
[0003]
The stationary phase is usually the packed particle itself, or is retained by coating the particle as a carrier with a separation agent suitable for the analytical sample, or by chemically binding a chemical modifying agent suitable for the analytical sample to the particle. . Thus, the filler includes the filled particles themselves or particles that carry a stationary phase.
[0004]
Chromatographic separation systems are widely used for analysis of samples. However, when a column is usually used, the problem of reproducibility is raised as a practical disadvantage. In other words, since the reproducibility of packed columns is not guaranteed, the same result is not always obtained between laboratories or in the same laboratory, and sample identification based on retention time must rely on relative results. There wasn't.
[0005]
It is said that there is a problem in the reproducibility of the internal structure of the filler particles as a factor that hinders the reproducibility of the column. Also, the reproducibility of the column is largely due to the column packing factor, and depending on the packing lot, the separation performance inherent to the packing may not be sufficiently exhibited.
[0006]
For these causes, the internal structure of the packed column must be considered. For example, when a fully porous silica gel particle is packed in a column, the pore consists of two holes, a pore between particles and a pore within the particle, as viewed as the whole column, and the sample is between these two holes. Separated while coming and going. Of these two holes, the interparticle pores are determined at the time of filling, so that the structure changes due to a slight difference at the time of filling. Further, at that time, since the particles collide with each other, a phenomenon that the filler is destroyed is often observed, and the modified layer on the surface is peeled off, and abnormal adsorption may occur. In addition, filling takes a lot of time, troubles occur, and defective products such as non-uniform filling occur frequently, resulting in poor product yield and an increase in costs including inspection costs.
[0007]
Conventionally known packed chromatography columns are roughly classified into the following two types. That is, 1) a structure in which a surface porous or total porous silica gel or resin filler 1 is filled in a cylindrical container 2 made of glass, plastic or stainless steel (FIG. 2), 2) a nonporous spherical silica gel Or it is the structure (FIG. 3) with which the resin filler 3 was filled.
[0008]
For example, when the column 2 is packed with silica gel particles 1 having surface porosity or total porosity, a double structure (double pore) of interparticle pores 4 and intraparticle pores 5 is taken (FIGS. 2 and 7). In this case, sample separation by in-stream adsorption and distribution of the sample to the pore inner surface of the packed particle 1 and separation by molecular size occur simultaneously, and separation by simple adsorption / distribution does not occur (separation by double pores). . When the non-porous filler is packed, it is a single pore (FIGS. 3 and 8), but the shape of the space 4 formed as shown in FIG. The separation mode is still complicated. Also, nonporous columns are particularly difficult to pack because of the small particles.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
From the above, some columns that do not rely on packing have been proposed so far. When these columns that do not rely on packing are examined in detail, there are two structures, a double pore type and a single pore type. For example, there is an example in which a porous resin is bonded in the container 2 to form a filler. In this structure, packing particles are combined in a container, so there is a problem in reproducibility, and separation by molecular size occurs, so separation by simple adsorption / distribution does not occur (separation by double pores) (FIG. 4). ). That is, also in this case, the function of the filler is not sufficiently exhibited, and the separation mode is not simple.
[0010]
It has also been proposed to use a sol-gel method porous glass manufacturing method to form a column using rod-shaped glass having macro through-holes and fine diffusion holes in the wall (Japanese Patent Laid-Open No. Hei 6). -265534). In this case as well, the structure is basically the same as that obtained by bonding a porous resin in the container (FIG. 4), and the macropores and the pores in the wall are through-holes as in the conventional packed column. By taking the double structure (double pore) (Fig. 7), adsorption / distribution and separation by molecular size occur at the same time, so it is not a simple separation. In addition, the glass produced using the sol-gel method porous glass manufacturing method is brittle, there are problems with the peripheral seals, etc., and there is a problem with reproducibility due to instability of reproducibility of the phase separation structure. The problem has not been solved.
[0011]
In addition, in these methods, since the skeleton is a single system, the ratio of the through pores and the mesopores required for the separation is controlled by the homogeneous synthesis conditions. Therefore, it is difficult to freely create a rod corresponding to a wide range of analysis purposes. Even if it can be done, the rod structure is unreasonable because it is a single system, and it is difficult to obtain the pressure resistance required for HPLC. For example, an acrylamide resin rod according to a conventional method is prepared by adding a large amount of methylenebisacrylamide or methacrylate as a cross-linking agent in order to avoid swelling. Therefore, it is necessary to use a phase reaction in the synthesis, and other types of solvents and buffer solvents are used. Since the solvent which can be used is limited, it will become a certain range.
[0012]
Further, a column for porous chromatography using a phase separation porous glass and having a single pore 7 in a skeleton 6 has been proposed (Japanese Patent Laid-Open No. 7-120450) (FIG. 5). Although this is a practical and productive technique, it offers only a small surface area and a small holding capacity, and a higher performance column is desired and an adaptive separation. A system needs to be established.
[0013]
On the other hand, the solid-phase extraction method often used for pretreatment of an analysis sample is a method in which a sample is loaded and held on a solid phase, and a target component is eluted after washing. Therefore, it is necessary to reduce the flow rate once, and reliable distribution at a low flow rate is indispensable. The large through-pores in the solid phase are effective due to the distribution in the low flow rate region, and the mesopores formed on the surface of the through-pores can increase the contact with the sample components, which is good for holding the solid phase. Expected to have an impact.
[0014]
However, in actual solid-phase extraction, a large amount of matrix components are mixed in addition to the target component, and the load of these components becomes a problem, and conventional glass single-through pores cannot be used.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
In view of the above-mentioned various problems, the present invention is a monolithic column having a large porous body capable of meeting the need for a single pore type separation and having a substantially large surface area and a large holding capacity. Proposing a porous material for chromatography, which is characterized by filling the macropores of the skeleton with macropores with the microporous material of open structure. Is.
[0016]
Here, chromatography is an operation in which a sample is moved in a stationary phase via a developing agent, and the sample is separated by adsorption and desorption from the stationary phase. Therefore, it is used in a broad sense, and is not limited to gas chromatography or liquid chromatography, and is a concept including a solid phase extraction method and the like, and specifically uses a column and a solid phase.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the configuration of the present invention, the porous body 3 having micropores 10, 10,... Having an open structure is filled inside the macropores 9, 9,. It is a porous body with an integrated structure and is formed in a monolithic porous column.
[0018]
The cross section perpendicular to the axial direction of the macropores 9, 9,... Is preferably a circular shape or an elliptical shape having a major axis and a minor axis different from each other. The diameter of the macropores 9, 9,... May be 0.1 to 10 microns, more preferably 0.5 to 5 microns. The micropores 10, 10,... Having a smaller open structure than the macropores 9, 9,... May be 5 to 1000 nm, preferably 10 to 500 nm. It is relative that it is smaller than the macropores 9, 9,..., For example, when the macropores 9, 9,. When the macropores 9, 9,... Are 10 microns, the micropores 10, 10,... May be 5 nm or more and less than 10000 nm, but are substantially 1000 nm or less. It means that.
[0019]
In the packing type packed with particles in high performance liquid chromatography (HPLC) or solid phase extraction, it is known that the liquid resistance pressure increases as the particle diameter decreases. In HPLC, the particle diameter is about 1 to 40 μm. In the solid phase, about 20 μm to 100 μm is common.
[0020]
In a monolith column having a macropore diameter, the macropore diameter is considered to be the same as the particle size of the filler type. For details, see the literature chromatography, vol. 20No. 1 (1999), the macropores forming the skeleton affect the liquid resistance and the number of theoretical plates, and the pressure to obtain the same number of theoretical plates is 1/10 compared to the filling type. It is known. This document is a monolith column composed of macropores and micropores made from the same composition, and is different from the present invention. However, in the liquid resistance, the influence of the skeleton having macropores is large and the same theory. Also in the present invention, the macropore diameter of the monolith in HPLC or solid phase extraction is about 1/10 of the packed type particle diameter, and 0.1 to 10 μm is practical.
[0021]
Micropores have a large influence on separation. In the monolith column of the present invention, in order to form micropores after forming the macropore diameter, a wider range of micropores can be created, and the ratio of macropores to micropores is also free, unlike the above report literature. To be created.
[0022]
Therefore, in the column of the present invention, the range of the micropores is determined by the size of molecules in the liquid of the separation target component. Many chemical substances exist, but when they are in a liquid, even those having a higher-order structure such as a protein can be sufficiently placed inside the pores if they have a maximum of 1000 nm due to liquid affinity. At 5 nm or less, no matter how much the micropore volume is increased, the effect of macropores is exerted, and the advantages of micropore formation in the present invention cannot be utilized, and control is meaningless. Become.
[0023]
The column 12 is preferably formed in a columnar body. The height (length) of the columnar body is not particularly limited, but may be from about 1 mm to 10 m. It is desirable that the cross section of the columnar body is nearly circular. The maximum diameter of the columnar body is not particularly limited, but may be 1 mm to 50 cm. In the porous columnar body, the macropores 9, 9,... Defined above penetrate from the upper surface to the lower surface, and may be bent and / or communicated. In other words, considering the structure of the column from the structure of the pores through which the mobile phase passes, in the case of solid porous glass, cylindrical pores with a smooth inner surface are entangled like jungle gym while repeating aggregation and dispersion. Can be considered.
[0024]
The material of the porous body having the macro pores 9, 9,... Is not particularly limited as long as the material can control the diameter of the macro pores 9, 9,. An inorganic porous material such as porous glass, for example, porous glass is desirable. As an example of porous glass, the composition is NaO-B ₂ O ₃ ―SiO ₂ -CaO-based materials can be mentioned, Al ₂ O ₃ , ZrO ₂ , ZnO ₂ , TiO ₂ , SnO ₂ , MgO ₂ In some cases, it is produced using glass to which various oxides are added. The porous glass is, for example, mixed with silica sand, boric acid, soda ash and alumina and melted at 1200 to 1400 ° C.
[0025]
After molding at 800 to 1100 ° C., an unbranched borosilicate glass is obtained, and SiO 2 is obtained by heat treatment. ₂ Phase and B ₂ O ₃ -Na ₂ The phase is separated into O—CaO phase, and by acid treatment, SiO 2 ₂ A porous body having a skeleton is produced. By changing the conditions at the time of heat treatment depending on the application, a pore having a uniform pore distribution of 0.1 to 10 microns can be produced according to the application.
[0026]
Examples of porous ceramics include silica, alumina silicate A (hard magnetic particles sintered), siliceous sand, alumina, alumina silicate B (chamotte particles sintered), porous mullite, silicate There are things of soil. Porous ceramics are, for example, mixed and molded with ceramic particles (hard magnetic pulverized product, silica, alumina, chamotte, etc.) with a certain range of particle diameters and pore-forming materials such as crystalline cellulose (Asahi Kasei: Avicel)・ Made by sintering. Those having a pore size in the range of about 500 μm to about 0.1 μm or more and having a uniform pore distribution can be manufactured according to the application.
[0027]
Next, a monomer for creating a microporous body is impregnated in the macropores 9, 9,... Of the skeleton body 8 having the macropores 9, 9,. , By polymerizing within the macropores 9, 9,..., The porous body 11 is filled with a porous body 11 that is smaller than the macropores 9, 9,. Create a porous columnar body with an integrated structure. In this case, the monomer for producing the microporous body 11 may be either an organic or inorganic material. If inorganic, the catalyst such as hydrochloric acid is added to tetraethoxylane and the adjusted sol is impregnated. Later, microporous porous silica glass can be formed by aging. In the case of an organic system, various resins can be selected. For example, a polyacrylamide gel porous body can be obtained by impregnating an acrylamide monomer and then polymerizing it.
[0028]
The monolithic (integrated) chromatography column of the present invention is applicable to all column chromatography systems including liquid-liquid distribution systems, liquid-solid adsorption systems, gas-liquid distribution systems, and liquid-solid (liquid) ion exchange systems. Can be applied. That is, it can be applied to liquid chromatography under atmospheric pressure, high performance liquid chromatography, gas chromatography, supercritical chromatography and the like. It can also be applied as a solid phase for solid phase extraction for pretreatment purposes.
[0029]
To the micropores 10, 10,... Of the porous column of the present invention, a coating agent and / or a chemical modifier suitable for the separation sample used in the conventional packing material is applied so as to cover the surface of the pores. Can be modified / modified. Examples of the coating agent include polyethylene glycol and silicone oil. Chemical modifiers include alkylchlorosilanes such as trimethylchlorosilane (TMS), dimethyl-n-octylchlorosilane, dimethyl-n-octadecylchlorosilane (ODS), aminoalkoxysilanes such as r-aminopropyltriethoxysilane, and other epoxies. Various silane treating agents such as silane are exemplified. Furthermore, a high molecular compound such as a protein or a low molecular compound may be bonded to the modifying group of the surface modifier. The columnar body may be deformed to form a U-shaped or coiled column.
[0030]
In the monolith type porous column of the present invention, a brittle sol-gel method porous glass or a porous polymer is fixed in the macropores 9, 9,... As a result, the entire skeleton body has a very strong structure. Therefore, the surrounding seal can be easily implemented by firmly fitting in a ring such as Teflon or polypropylene, which is conventionally used in a filter or the like.
[0031]
In the conventional type filler, the required pressure in the water eluent is several MPa. In addition, in the sol-gel rod column, since the through pore and the mesopore are formed at the same time, it is necessary to enlarge the space, and it becomes brittle. Therefore, it cannot be applied to high pressure. On the other hand, the injection function used in general HPLC is based on a switching valve, and even when the normal pressure is low, pressure fluctuation occurs during injection. The use of a bypass or the like can be solved but becomes expensive.
[0032]
Hereinafter, the separation apparatus using the column of the present invention shown in the figure will be described. The separation apparatus includes a pump 14 for feeding an eluent, an injector 15 for injecting a sample, the column 12 of the present invention, and a detector 16. As a matter of course, the detector 16 can be selected from various types such as an electrochemical detector, a spectrophotometer, an RI detector, and a fluorescence detector according to the application.
[0033]
Since the HPLC system constructed with the column of the present invention is a column 12 having a hard skeleton, an inexpensive injector 15 or injection system having a large pressure fluctuation can be used. Further, since the analysis pressure is low, a valve made of polypropylene or the like can be used. Of course, an inexpensive low-pressure pump can also be used as the pump 14 used.
[0034]
Using a conventional high-pressure system, it is possible to perform a high-speed analysis at a flow rate more than ten times that of a normal use example. Flowing more than ten times the liquid causes clogging of the filter attached to both ends of the column. However, in a system using this column with one hard skeleton, it is not necessary to install a filter. Don't worry.
[0035]
In addition, the column length can be made ten times that of the normal use example, and the flow rate can be made normal. Since the theoretical number of stages is proportional to the length, the number of stages ten times that of the prior art can be obtained. In the filling type, the pressure is proportionally increased tenfold, and this is impossible. With a sol-gel rod, gelation occurs inside the column, so it is almost impossible to create a long rod. Moreover, even if it can be done, it is easy to break because of insufficient strength.
[0036]
In the column of the present invention, machining can be performed with only a high-strength through-pore, and a free-sized column can be produced. In particular, in the case of glass, if it is drawn at the time of melting, it can be drawn to a free length in a free shape such as a circle. After that, if secondary pores are formed and subjected to chemical treatment as necessary, it can be used for HPLC separation. Thus, in the HPLC system using the column of the present invention, it is possible to use a column that is ten times longer than the conventional column.
[0037]
Furthermore, in the case of the monolith type porous column of the present invention, a pump whose flow rate is stable even at low pressure and low flow rate should be used because of low back pressure and effective separation even in a low flow rate region. In particular, it can be combined with an ultra-micro pump system in which a change in flow rate hardly occurs even when the back pressure is low. These pump system and the chromatography column of the present invention function as an integrated system.
[0038]
【Example】
The porous column of the present invention will be specifically described with reference to examples, but the following description does not limit the present invention.
[Example 1] Method for producing porous glass
SiO ₂ 59.0, B ₂ O ₃ 25.0, ZrO ₂ 5.0, Al ₂ O ₃ 3.0, CaO 3.0, Na ₂ Each 5.0% by weight of O 5.0 was melted, and a rod having a diameter of about 4 mm was treated at 540 ° C. for 7 hours and then treated at 750 ° C. for about 32 hours to cause phase separation. The phase separation was acid-treated at 90 ° C. using 1N sulfuric acid (ratio of acid (ml) / glass (g) = 170) for 2 days, and then 0.5N-NaOH (acid (ml) / glass (g ) Ratio = 170) for 6 hours. The obtained glass rod was washed with hot distilled water, dried, and stored in a desiccator. The resulting glass rod had a pore volume of 0.6 ml / g and a central pore diameter of 2 microns. The pore size distribution was measured by a mercury intrusion method. The obtained porous glass material was formed into a columnar body by machining.
[0039]
SiO having 2 μm macropores with a diameter of 4 mm and a length of 100 mm obtained as described above. ₂ The whole skeleton is immersed in 200 mL of 5% aqueous hydrochloric acid solution and refluxed at 120 ° C. for 8 hours to activate. After activation, the tube is put in a Teflon tube, heated and contracted, and allowed to flow. Tetraethoxysilane (9 mL), water (11 mL), methanol (4 mL), dimethylformamide (4 mL), and ammonia water (4 mL) are stirred at 0 ° C. for 10 minutes under reduced pressure to activate. This solution is allowed to flow through the skeleton for 10 minutes at a flow rate of 0.5 mL / min. Seal so that the air layer does not enter. The whole is raised to 60 ° C. at a heating rate of 2 ° C. per minute, held for 6 hours, and gelled while bonded to the macropore surface. The temperature is returned to room temperature, and 10 mL of 0.01N aqueous sodium hydroxide solution is continuously flowed at a flow rate of 0.1 mL / min to drive off the unreacted solution. Sealed and aged at 80 ° C. for 6 hours to form a porous body having micropores. Surface area of 400m by nitrogen adsorption measurement ² / G and a pore diameter of 20 nm were confirmed. It returns to room temperature, and wash | cleans in order of 5 mL of water, 5 mL of acetone, and 20 mL of hexane at the flow rate of 0.2 mL / min. Here, it is recommended that the ratio of macropores to micropores is 0.1 to 200 times, and the volume ratio of macropore phases to micropore phases is 0.1 to 2000 times. The
[0040]
The columnar body thus obtained was mounted on a PEEK resin holder 13 and connected to a high performance liquid chromatograph, and the eluent condition was 95% hexane / 5% isopropanol flow rate 1 mL / min. Benzene, 2. Nitrobenzene, 3. o-Nitroanisole was analyzed. FIG. 9 shows an untreated porous column with a macropore only (surface area of 40 m ² / G or less), FIG. 10 is a chromatogram of a conventional column packed with silica gel having micropores, and FIG. 11 is a chromatogram of a micropore-prepared porous column after treatment. By forming micropores that cannot be separated by macropores alone, data similar to that of a conventional silica gel packed column was obtained.
[0041]
[Example 2]
SiO with 2μm macropores 4mm in diameter x 100mm in length ₂ The skeleton of this skeleton is formed into a columnar body and activated in the same manner as in Example 1. After activation, the tube is put in a Teflon tube, heated and contracted, and allowed to flow. To a mixed solution of 100 mL butanol and 10 mL tetrabutoxytitanium, 100 mL of 5% hydrochloric acid aqueous solution is added while maintaining 0 ° C., and stirred under reduced pressure for 30 minutes to obtain an activated sol reaction solution. This liquid is allowed to flow through the skeleton at a flow rate of 0.5 mL / min for 50 minutes. Seal so that the air layer does not enter. The whole is raised to 80 ° C. at a heating rate of 2 ° C. per minute, held for 6 hours, and gelled while bonded to the surface of the macropores. 10 mL of dimethylformamide and 100 mL of 10% aqueous sodium hydroxide solution are continuously flowed at a flow rate of 0.1 mL / min to drive off the unreacted solution. Sealed and aged at 120 ° C. for 12 hours to form a porous body having micropores. Surface area of 100m by nitrogen adsorption measurement ² / G and a pore diameter of 20 nm were confirmed. It returns to room temperature, and wash | cleans in order of 5 mL of water, 5 mL of acetone, and 20 mL of hexane at the flow rate of 0.2 mL / min.
[0042]
The columnar body thus obtained was mounted on a PEEK resin holder, connected to a high performance liquid chromatograph, eluent conditions hexane / ethanol / methanol = 90/90/1 (w / w), flow rate 1 When analyzed at 0.0 mL / min, a separation that the acidic compound phenol specific to titania having a basic surface elutes later than neutral benzyl alcohol was obtained (FIG. 12). The numbers in the figure are sample names, 1 is benzyl alcohol, 2 is phenol, and 3 is aniline. As a reference comparison, FIG. 13 shows data of a column type packed with silica gel. The column of the present invention having a titania secondary pore size was larger not only in the order of separation but also as the overall retention.
[0043]
Example 3
SiO with 4μm macropores of 50mm diameter x 2mm length ₂ A skeleton body of this skeleton is formed into a disc shape and activated in the same manner as in Example 1. Place in a pressure-resistant stainless steel reactor with a liquid inlet / outlet. Tetramethoxysilane 100 mL and 0.01 M hydrochloric acid aqueous solution 200 mL are stirred at 40 ° C. for 1 hour to obtain an aqueous sol solution. The reaction tank is filled with this aqueous solution. Leave at 120 ° C. for 12 hours. The temperature is lowered to 40 ° C., and a high pressure pump is used while replacing with 0.1% ammonia methanol solution. Hold at 80 ° C. and leave for 4 hours. The temperature is lowered to 40 ° C., and methanol solution is poured out in a carbon dioxide supercritical state. Wash with carbon dioxide until methanol is completely removed. Surface area 200m by nitrogen adsorption measurement ² / G and a pore diameter of 30 nm were confirmed.
[0044]
Next, a 20% octadecyltrichlorosilane toluene solution is fed with a high-pressure pump and left at 120 ° C. for 8 hours. Next, it wash | cleans in a carbon dioxide supercritical state. An octadecylated porous solid phase is obtained. When this porous solid phase was set in a filter and 30 mL of a protein ferritin 0.01% aqueous solution having a molecular weight of 440,000 was flowed, clogging did not occur and the flow could be easily performed. In a conventional solid phase, such a decompression method may cause clogging and may not flow, and a pressurization method is used. However, in this porous solid phase, it was possible to flow easily. next. Washed with 1% aqueous ammonia / 10% ACN.
[0045]
The secondary pore is silica gel, but the primary pore is a glass skeleton, so that it has alkali durability. In the filtrate, elution of an alkali melt like a silica gel solid phase was not observed. Next, as a result of measuring the protein recovery after desorption with 1% ammonia acetonitrile solution by the UV absorption method, a recovery rate of 88% or more was obtained. In the filling type solid phase, a resin filter or the like is used in order to prevent the elution of the filler. However, the resin filter is hydrophobic, which causes adsorption of proteins with increased hydrophobicity under alkaline conditions and is difficult to recover. This solid phase can be used without a filter, and a high recovery rate was obtained.
[0046]
Example 4
SiO with 2μm macropores 4mm in diameter x 100mm in length ₂ The porous body having the skeleton is activated in the same manner as in Example 1. After activation, the tube is put in a Teflon tube, heated and contracted, and allowed to flow. A styrene 0.5 g / butanol 1 mL solution distilled under reduced pressure and a styrene divinylbenzene 0.3 g / dimethylformamide 1 mL solution are stirred and mixed at 0 ° C. for 10 minutes. While stirring at 0 ° C., 1 mL of a 0.1% azobisisobutyronitrile / ethanol solution was added dropwise to the solution over 2 minutes. Further, 1 mL of vinyltrimethoxysilane / 3 mL of ethanol was added and stirred well.
[0047]
The supernatant homogenous phase of this monomer solution (centrifugation at 500 rpm) was introduced into the macroporous body using a syringe while maintaining 0 ° C., and sealed so that the air phase did not enter. By reacting at 80 ° C. for 48 hours, a styrene-silicon polymer phase bonded with a through-pore phase by a silicon skeleton was prepared, and a porous body having micropores was obtained. Surface area 200m by nitrogen adsorption method ² / G and the micropore diameter was confirmed to be 30 nm. It returned to room temperature and wash | cleaned in order of 1 L of isopropanol, 1 L of acetone, and 1 L of water at the flow rate of 0.2 mL / min. It was connected to a high performance liquid chromatograph, and pesticides were analyzed for reverse phase partition. The result is shown in the chromatogram of FIG. The details of the data are as follows.
Flow rate: 0.5 mL / min
Eluent: Tetrahydrofuran / 10 mM acetate buffer (pH 3.5) = 37/63
Oven temperature: 40 ° C
Detector: 230 nm
Sample: 1. Ashram 2. Oxin copper Thiuram 4. 4. Mecoprop Triclopyr 6. Iprodione 7. Benslide
[0048]
Example 5
SiO with 2μm macropores 4mm in diameter x 100mm in length ₂ The porous body having the skeleton is activated in the same manner as in Example 1. The liquid is discarded, 5 mL of acrylopropyltrimethoxysilane and 100 mL of methanol are added, the whole is immersed, and refluxed at 80 ° C. for 12 hours to bond vinyl groups. After decantation washing several times with methanol, put in a Teflon tube and heat shrink to make the liquid flowable.
[0049]
After washing with water, a syringe was placed on the macroporous body while maintaining a 0 ° C monomer solution of 0.5% acrylic amide / methanol 10 mL / dimethylformamide 1 mL / 0.1 mg azobisisobutyronitrile distilled under reduced pressure. It was used and sealed so that the air layer did not enter. By reacting at 80 ° C. for 48 hours, an acrylamide polymer layer bonded with a through-pore skeleton was prepared, and a porous body having micropores was obtained. It was confirmed by gel permeation chromatography that the micropore diameter was 100 nm. It returned to room temperature and wash | cleaned in order of 1 L of isopropanol, 1 L of acetone, and 1 L of water at the flow rate of 0.2 mL / min. The protein was analyzed by connecting to a high performance liquid chromatogram and gradient from 0.1 M ammonium phosphate aqueous solution to 0.01 M ammonium phosphate aqueous solution for 5 minutes. The result is shown in the chromatogram of FIG. In the figure, the numbers are sample names, 1 is cytochrome C, 2 is ribonuclease, and 3 is lysozyme.
[0050]
Example 6
While stirring 100 mL of tetrabutoxysilane with 300 mL of 1M hydrochloric acid aqueous solution and 400 mL of propanol solution at 80 ° C., propanol and water were removed to obtain a hydroxide gel. This gel was pulverized and stirred with a pulverizer to obtain 1 μm particles. A solution prepared by dispersing and stirring 10 g of these particles, 0.1 g of crystalline cellulose, 0.1 g of sodium lauryl sulfate, and 0.1 g of polyvinyl alcohol in 10 mL of concentrated hydrochloric acid was poured into a cylindrical mold, and sintered at 1300 ° C., 4 mm in diameter × long A cylindrical porous ceramic having a thickness of 100 mm and a small hole diameter of 2 μm was obtained. Push it into a Teflon tube so that the liquid can flow.
[0051]
To a mixed solution of 100 mL ethanol and 10 mL tetraethoxysilane, 100 mL of 5% hydrochloric acid aqueous solution is added while maintaining 0 ° C., and stirred under reduced pressure for 30 minutes to obtain an activated sol reaction solution. This liquid is allowed to flow through the macroporous body at a flow rate of 0.5 mL / min for 10 minutes. Seal so that the air layer does not enter. The whole is raised to 80 ° C. at a heating rate of 2 ° C. per minute, held for 6 hours, and gelled while bonded to the macropore surface. The temperature is returned to room temperature, and 10 mL of dimethylformamide and 100 mL of a 10% aqueous sodium hydroxide solution are continuously flowed at a flow rate of 0.1 mL / min to drive out the unreacted solution. Enclose and age at 120 ° C. for 12 hours. It took out from the Teflon tube, and baked at 400 degreeC for 20 hours, and made it the porous body which has a micropore. Surface area 250m by nitrogen adsorption measurement ² / G and the micropore diameter was confirmed to be 20 nm. The porous body was immersed in a solution of 10 g of octadecylchlorosilane / 100 mL of toluene and reacted at 60 ° C. for 24 hours. The obtained octadecylated porous material was pushed into a peak tube, and joints were connected to both ends to form a column. When connected to a high performance liquid chromatograph and analyzed under the eluent conditions acetonitrile / water 30/70 flow rate 1.0 mL / min, elution was performed in the order of higher polarity (nitroanisole, nitrobenzene, benzene), and reversed-phase distribution behavior. A porous column was obtained. The result is shown in the chromatogram of FIG. In the figure, the numbers are sample names, 1 is O-nitroanisole, 2 is nitrobenzene, and 3 is benzene.
[0052]
【The invention's effect】
According to the first and fifth aspects of the present invention, the porous body for monolithic (integrated) chromatography is different from the conventional packed column in that it is not affected by the packing and has a uniform diameter. In other words, the separation is performed in a structure in which a mobile phase passes through a porous body having a single pore, and does not have the same double structure as a packed structure that has been put into practical use. Not only a simple separation mechanism but also a potentially high theoretical plate number is obtained.
[0053]
In addition, the porous body is filled with a porous material having micropores that are smaller than the macropores and have an open structure, and it has an integrated structure, so compared with a chromatography column that is a simple porous material. High load and high number of stages. In addition, the manufacturing method and reproducibility of the macroporous material used as the base have a track record and high productivity. In addition, a column separation system for chromatography with a low environmental load can be constructed by optimizing the combination with a pump that stabilizes the flow rate even at a low flow rate under a low pressure.
[0054]
In this method, the mesopores for separation are formed in the state where the through-pores through which the liquid flows have already been formed, so there is no influence on the synthesis such as the presence or absence of a crosslinking agent. Although it is desirable to be chemically bonded to the through-pore surface, another monolith structure may be physically created in the space by conventional methods. Since the skeleton forming the through-pore and the portion forming the mesopore can be created independently, the range of the ratio of the through-pore to the mesopore is increased. In addition, the through-pore skeleton and the mesopore skeleton can be made of the same component, and the skeleton boundary surface can be eliminated. The through-pore skeleton has already been solidified, and porous rods can be freely created simply by examining the mesopore formation conditions.
[0055]
In the separation plane, the through-pore skeleton component and the mesopore skeleton component can be changed, so that both characteristics can be extracted. For example, the through-pore skeleton uses a ceramic with a high pressure resistance, and a polymer is formed on the mesopore skeleton. The through-pore skeleton has a pressure resistance and does not swell and shrink. Since the polymer is used for the mesopores involved in the separation, a polymer-specific separation and high chemical resistance can be obtained. Compared to the hybrid type in which both are made in a mixed system, the characteristics of the original material can be increased and used for a wider range of analysis. Naturally, mesopores can also be formed in a hybrid.
[0056]
Further, according to claim 2, in addition to the effect of claim 1, since the skeleton having macropores is first formed of porous glass or porous ceramic alone, it is formed extremely firmly, The strength of the structure can be secured.
[0057]
Further, according to claim 3, in addition to the effect of claim 1, since the microporous body is porous glass or porous polymer, it is possible to select organic or inorganic, depending on the sample. The material and the micropores can be selected, and separation and chemical resistance according to the material can be specified and provided as desired.
[0058]
Further, according to the fourth aspect, a diameter of 0.1 to 10 μm of the micro fine hole is in a practical range, and a diameter of 51000 nm of the micropore is in a practical range. Within this range, micropores that greatly affect the separation of each sample can be formed in a wide range, and the ratio of macropores to micropores can be freely created.
[0059]
Furthermore, according to claim 6, by using the porous body or column of the present invention, there is no clogging and it is not necessary to use a filter. For this reason, a large amount of solution is flowed at high speed, and high-speed analysis becomes possible. In addition, since the change is small even at a low pressure and a low flow rate, the use range is extremely large such as being able to be combined with an ultra-micro pump system.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a sectional view in the axial direction of a column of a diagram schematically showing an example in which the monolithic (integrated) porous column of the present invention is a chromatography column.
FIG. 2 is a schematic view of a part of an axial cross section of a conventional packed column.
FIG. 3 is a schematic diagram of a part of an axial section of a conventional packed column.
FIG. 4 is a schematic diagram of a part of an axial section of an integrated column.
FIG. 5 is a schematic diagram of a part of an axial section of a conventional integrated column.
FIG. 6 is a schematic diagram of a part of a cross section of the structure of the present invention.
FIG. 7 is a graph of pore distribution in a conventional column (double pore type).
FIG. 8 is a graph of the pore distribution of the column of the present invention (single pore type).
FIG. 9 shows a chromatogram of a processing example using a conventional column.
FIG. 10 shows a chromatogram of an example of treatment using a conventional column.
FIG. 11 shows a chromatogram of a treatment example using the column of the present invention.
FIG. 12 is a chromatogram of a processing example using the column of the present invention.
FIG. 13 is a comparative chromatogram of a processing example using a conventional column.
FIG. 14 is a chromatogram of a processing example using the column of the present invention.
FIG. 15 is a chromatogram of a processing example using the column of the present invention.
FIG. 16 is a chromatogram of a processing example using the column of the present invention.
FIG. 17 is a schematic explanatory diagram of a separation apparatus using the column of the present invention.
[Explanation of symbols]
8 Skeleton
9 Macropores
10 Porous material

Claims

A monomer or sol solution is gelled on the surface of the macropores of the skeleton having macropores that penetrate from the upper surface to the lower surface and aggregate and disperse, and is released by aging or baking. A method for producing a porous body for chromatography, comprising integrally forming a porous body having a micropore having a structure .

A porous body for chromatography formed by the method according to claim 1.

The porous body for chromatography according to claim 2, wherein the skeleton having macropores is porous glass or porous ceramic.

The porous body for chromatography according to claim 2, wherein the micro multi-pore body is porous glass or a porous polymer.

A single-pore microporous body with an open structure is bonded to the surface of the macropores of a solid skeleton that penetrates from the top surface to the bottom surface and has macropores that gather and disperse. Feature chromatography column.