JP4847696B2

JP4847696B2 - Matrix metalloproteinase inhibitor

Info

Publication number: JP4847696B2
Application number: JP2004338616A
Authority: JP
Inventors: 俊史秋澤; 正治矢原; 徹数岡
Original assignee: MORIKAWA KENKODO CO., LTD.
Current assignee: MORIKAWA KENKODO CO., LTD.
Priority date: 2004-11-24
Filing date: 2004-11-24
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2024-11-24
Also published as: JP2006143685A

Description

本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix
metalloproteinase：以下、ＭＭＰと略記することがある）阻害剤に関する。 The present invention relates to a matrix metalloprotease (matrix).
metalloproteinase: Hereinafter, it may be abbreviated as MMP).

ＭＭＰは細胞外マトリックスを分解する酵素群で、19種のヒトＭＭＰが報告されている〔岡田保典産科と婦人科9 (7): 1115-1124,
2000（非特許文献１）〕。例えば、ゼラチナーゼであるＭＭＰ２は細胞外マトリックスの構成要素であるゼラチン、ラミニン、アグリカン、コラーゲン、フィブロネクチンおよびエラスチンを分解する酵素であり、この酵素の働きを阻害することにより癌細胞の浸潤と転移が抑制されることが報告されている〔Imren S.他、Cancer Res 56:
2891-2895, 1996（非特許文献２）〕。 MMP is an enzyme group that degrades extracellular matrix, and 19 types of human MMP have been reported [Yoshinori Okada, Obstetrics and Gynecology 9 (7): 1115-1124,
2000 (Non-Patent Document 1)]. For example, gelatinase MMP2 is an enzyme that degrades gelatin, laminin, aggrecan, collagen, fibronectin and elastin, which are components of the extracellular matrix. By inhibiting the action of this enzyme, invasion and metastasis of cancer cells are suppressed. [Imren S. et al., Cancer Res 56:
2891-2895, 1996 (non-patent document 2)].

ＭＭＰ２は特に乳癌の転移に深く関与している〔中島元夫日本婦人科腫よう学会雑誌16巻：2号1998年（非特許文献３）〕。マトリライシンと呼ばれるＭＭＰ７は癌細胞特異的に産生され、ＭＭＰ２と同様にゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンおよびエラスチンを分解する。胃癌や大腸癌ではＭＭＰ７の発現と癌転移との相関が報告されている。また、細胞膜と結合するＭＴ１−ＭＭＰはプロテオグリカン、ゼラチン、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチンを分解し、大腸癌細胞や乳癌細胞の遊走を引き起こすことが知られている〔Koshikawa N.他、J Cell Biol
148: 615-624, 2000（非特許文献４）〕。 MMP2 is particularly deeply involved in breast cancer metastasis [Motoo Nakajima Journal of Japanese Gynecological Oncology 16: 2 1998 (Non-patent Document 3)]. MMP7 called matrilysin is produced specifically for cancer cells and, like MMP2, degrades gelatin, laminin, collagen, fibronectin and elastin. In gastric cancer and colorectal cancer, a correlation between the expression of MMP7 and cancer metastasis has been reported. MT1-MMP that binds to cell membrane is known to degrade proteoglycan, gelatin, laminin, collagen and fibronectin, causing migration of colon cancer cells and breast cancer cells [Koshikawa N. et al., J Cell Biol.
148: 615-624, 2000 (Non-Patent Document 4)].

細胞外マトリックスは哺乳動物の組織において細胞間のすきまを埋めている生体高分子であるが、この細胞外マトリックスの代謝はこれらのＭＭＰとＭＭＰ阻害因子（ＴＩＭＰ：tissue inhibitors of matrix metalloproteinase）とのバランスにより調節されている。細胞外マトリックス成分の構造異常や、合成・分解の代謝バランスの崩れは、腫瘍転移、アレルギー（例：関節炎疾患、慢性関節リウマチ）、骨吸収疾患（例：骨粗鬆症）、歯周病、角膜腫瘍、皮膚の潰瘍化、糖尿病に付随するコラーゲン崩壊などの疾患の原因となる。よって、ＭＭＰ（ＭＭＰ活性）を阻害する物質は、これら６つの疾患に対する治療または予防薬として利用できる可能性がある。 The extracellular matrix is a biopolymer that fills the gaps between cells in mammalian tissues, and the metabolism of this extracellular matrix is a balance between these MMPs and TMP (tissue inhibitors of matrix metalloproteinase). It is adjusted by. Structural abnormalities of extracellular matrix components and disruption of synthesis / degradation metabolic balance include tumor metastasis, allergy (eg, arthritic disease, rheumatoid arthritis), bone resorption disease (eg, osteoporosis), periodontal disease, corneal tumor, It causes diseases such as skin ulceration and collagen breakdown associated with diabetes. Therefore, a substance that inhibits MMP (MMP activity) may be used as a therapeutic or prophylactic agent for these six diseases.

これまでにＭＭＰを阻害する物質が幾つか報告されている。例として、ヒドロキサム誘導体〔特開平８−８１４４３（特許文献１）〕、フラボノイド類〔特開平８−１０４６２８（特許文献２）、特開２０００−８００３５（特許文献３）〕、エスクレチン誘導体〔特開平８−１８３７８５（特許文献４）〕、スルホニルアミノ酸誘導体〔特開平９−３０９８７５（特許文献５）〕、テルペン類〔特開平１１−１３９９４７（特許文献６）〕、タンニン類〔特開２０００−３４４６７２（特許文献７）〕などが知られている。その他、有効成分は特定できていないが、ユーカリなどの植物エキスに、ＭＭＰの阻害作用があることも報告されている〔特開２００１−６４１９２（特許文献８）、特開２００１−１９２３１６（特許文献９）〕。
特開平８−８１４４３特開平８−１０４６２８特開２０００−８００３５特開平８−１８３７８５特開平９−３０９８７５特開平１１−１３９９４７特開２０００−３４４６７２特開２００１−６４１９２特開２００１−１９２３１６岡田保典産科と婦人科9(7): 1115-1124, 2000 Imren S.他、Cancer Res 56: 2891-2895, 1996 中島元夫日本婦人科腫よう学会雑誌16巻：2号1998年 Koshikawa N.他、J Cell Biol 148: 615-624, 2000 Several substances that inhibit MMP have been reported so far. Examples include hydroxam derivatives [JP-A-8-81443 (Patent Document 1)], flavonoids [JP-A-8-104628 (Patent Document 2), JP-A 2000-80035 (Patent Document 3)], esculetin derivatives [JP-A-8 183785 (Patent Document 4)], sulfonyl amino acid derivatives [JP-A-9-309875 (Patent Document 5)], terpenes [JP-A-11-139947 (Patent Document 6)], tannins [JP-A 2000-344672 (Patent Document 5). Document 7)] is known. In addition, although an active ingredient has not been specified, it has been reported that plant extracts such as eucalyptus have an inhibitory action on MMP [JP 2001-64192 (Patent Document 8), JP 2001-192316 (Patent Document). 9)].
JP-A-8-81443 JP-A-8-104628 JP2000-80035 JP-A-8-183785 JP-A-9-309875 JP-A-11-139947 JP 2000-344672 A JP 2001-64192 A JP 2001-192316 A Okada Yasunori Obstetrics and Gynecology 9 (7): 1115-1124, 2000 Imren S. et al., Cancer Res 56: 2891-2895, 1996 Motoo Nakajima Journal of Gynecological Oncology 16: 2 1998 Koshikawa N. et al., J Cell Biol 148: 615-624, 2000

本発明の目的は、ＭＭＰ阻害物質の各種分野における利用を促進するために、ＭＭＰを阻害する新たな有効成分とその供給源を開発することにある。 An object of the present invention is to develop a new active ingredient that inhibits MMP and its source in order to promote the utilization of MMP inhibitors in various fields.

本発明者は、研究を重ねた結果、或る種のプロポリスやその起源植物に含有されていることがあるアルテピリンＣにきわめて優れたＭＭＰの阻害能があることを見出し本発明を導き出した。 As a result of repeated research, the present inventor has found that artepilin C, which may be contained in certain propolis and its plant origin, has a very excellent ability to inhibit MMPs, and has derived the present invention.

かくして、本発明は、下記の構造式（Ｉ）で示される化合物であるアルテピリンＣを含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤を提供するものである。 Thus, the present invention provides a matrix metalloprotease (MMP) inhibitor characterized by containing artepilin C, which is a compound represented by the following structural formula (I).

本発明の好ましい態様に従えば、本発明のＭＭＰ阻害剤を構成するアルテピリンＣはアレクリンに由来する。本発明の別の好ましい態様に従えば、本発明のＭＭＰ阻害剤を構成するアルテピリンＣはプロポリス、特にブラジル産のプロポリスに由来する。
さらに、本発明に従えば、上記のごとき本発明のＭＭＰ阻害剤の用途として該阻害剤を含有する飲食用または口腔用組成物が提供される。 According to a preferred embodiment of the present invention, artepilin C constituting the MMP inhibitor of the present invention is derived from aleklin. According to another preferred embodiment of the present invention, artepilin C constituting the MMP inhibitor of the present invention is derived from propolis, particularly Brazilian propolis.
Furthermore, according to the present invention, as a use of the MMP inhibitor of the present invention as described above, a food or drink composition or oral cavity composition containing the inhibitor is provided.

本発明は、これまでに認識されていなかったアルテピリンＣから成る新しいタイプのＭＭＰ阻害剤とそれを含有する各種組成物を可能にするものである。 The present invention enables a new type of MMP inhibitor consisting of artepilin C, which has not been recognized before, and various compositions containing it.

本発明に従うＭＭＰ阻害剤を構成するアルテピリンＣ（３，５−ジピレニル−４−ヒドロキシケイ皮酸）は、既述の式（Ｉ）で表わされるように、クマル酸などとともにケイ皮酸（桂皮酸）の類縁体であるが、驚くべきことに、クマル酸やケイ皮酸に比べて、著しく高いＭＭＰ阻害能を有することが本発明者によって見出され、この事実はこれまでに認識されていなかった。 Artepilin C (3,5-dipyrenyl-4-hydroxycinnamic acid) constituting the MMP inhibitor according to the present invention is composed of cinnamic acid (cinnamic acid) together with coumaric acid and the like, as represented by the aforementioned formula (I). But surprisingly, it was found by the present inventor to have a significantly higher ability to inhibit MMP compared to coumaric acid and cinnamic acid, and this fact has not been recognized so far. It was.

アルテピリンＣは、合成によっても得ることはできるが、プロポリス（特にブラジル産プロポリス）およびその起源植物に一つであるアレクリン（Baccharis dracunculifolia）の抽出物に含有されていることが知られており〔例えば、Y.K. Park他、J. Agri. Food.
Chem., Vol.52, No.5: 1100-1103, 2004（非特許文献５）〕、これらを原料とすることが好ましい。
Y.K. Park他、J. Agri. Food. Chem., Vol.52, No.5:1100-1103, 2004 Artepilin C can be obtained by synthesis, but is known to be contained in extracts of propolis (especially Brazilian propolis) and alekrin (Baccharis dracunculifolia), which is one of its origin plants [for example, , YK Park et al., J. Agri. Food.
Chem., Vol. 52, No. 5: 1100-1103, 2004 (Non-patent Document 5)], preferably using these as raw materials.
YK Park et al., J. Agri. Food. Chem., Vol. 52, No. 5: 1100-1103, 2004

プロポリスはブラジル、中国、オーストラリア、ヨーロッパなど世界各国で採取されているが、その地域に生育しているプロポリスの源となる植物が異なるため、プロポリスに含まれる成分の種類や量に差がある場合もある〔熊澤茂則：ミツバチ科学、22(1): 1-8, 2001（非特許文献６）〕。ブラジル産プロポリスは、一般に、アレクリンを起源植物としており、アルテピリンＣの入手源として好適である。
熊澤茂則：ミツバチ科学、22(1):1-8, 2001 Propolis is collected in various countries such as Brazil, China, Australia, Europe, etc., but there are differences in the types and amounts of ingredients contained in propolis because the source plant of propolis growing in that region is different There is also [Shigenori Kumazawa: Bee Science, 22 (1): 1-8, 2001 (Non-patent Document 6)]. Brazilian propolis generally originates from alectrin and is suitable as a source of artepilin C.
Shigenori Kumazawa: Bee Science, 22 (1): 1-8, 2001

プロポリスまたはアレクリンからアルテピリンＣを得るには、一般に、それらを抽出操作に供して抽出物とする。抽出は、アルコール、疎水性有機溶媒、または超臨界状態の二酸化炭素などを用いて行なうことができるが、本発明者は、エタノール８０％と水２０％（体積比）とから成る抽出剤を用いることにより、プロポリス（特にブラジル産）またはアレクリン（特にその新芽もしくは葉）からアルテピリンＣが効率的に抽出できることを見出している。 In order to obtain artepiline C from propolis or aleklin, they are generally subjected to an extraction operation to obtain an extract. The extraction can be performed using alcohol, a hydrophobic organic solvent, or carbon dioxide in a supercritical state, but the present inventor uses an extractant composed of 80% ethanol and 20% water (volume ratio). Thus, it has been found that artepilin C can be efficiently extracted from propolis (especially from Brazil) or aleklin (especially its sprouts or leaves).

以上のようにして得られるプロポリス抽出物またはアレクリン抽出物は精製または濃縮または希釈して、あるいはそのままの状態で各種の組成物、特に飲食用または口腔用組成物の成分として用いられるのに好適である。界面活性剤を用いて水に乳化させて使用することもできるし、単独または副原材料と混合してカプセルや錠剤に包含して製剤化することもできる。プロポリス抽出物またはアレクリン抽出物を混合して得られた飲食組成物（例：菓子、パン、飴、ガム、飲料水など）は癌転移などの疾病予防を目的として利用できる。また、プロポリス抽出物やアレクリン抽出物を歯磨き粉またはうがい液等に混合して得られた口腔組成物は歯周病予防のために利用することもできる。プロポリスおよびアレクリンの成分であるアルテピリンＣも如上のプロポリス抽出物やアレクリン抽出物と同様の仕様・態様で利用できる。 The propolis extract or alectrin extract obtained as described above is suitable to be used as a component of various compositions, particularly for food and drink or oral composition, after purification, concentration or dilution, or as it is. is there. It can be used by emulsifying it in water using a surfactant, or it can be used alone or mixed with a secondary raw material to be included in a capsule or tablet. A food and drink composition (eg, confectionery, bread, rice cake, gum, drinking water, etc.) obtained by mixing a propolis extract or an alectrin extract can be used for the purpose of preventing diseases such as cancer metastasis. Oral compositions obtained by mixing propolis extract or alectrin extract with toothpaste or gargle can also be used to prevent periodontal disease. Artepilin C, which is a component of propolis and aleklin, can also be used in the same specifications and manner as the above propolis extract and alectrin extract.

（財）日本健康・栄養食品協会の「健康補助食品の摂取量、取扱方法表示の手引き」によれば、飲用組成物としてプロポリス抽出物の１日当りの摂取量は２０ミリグラムから１００ミリグラム（体重５０キログラム当り）であることが望ましいとされる。プロポリス抽出物含有飲食品は国内において１０年以上の販売実績があり、食経験上および科学的に安全であることが認められている。実際、急性毒性試験を実施し、大人の一度の経口摂取量が乾重量８グラムを超えない限り安全性に問題がないことを確認している。 According to the Japan Health and Nutrition Foods Association's “Guidelines for Health Supplement Supplements and Handling Instructions”, the daily intake of propolis extract as a drinking composition is 20 to 100 milligrams (weight 50 Per kilogram). Propolis extract-containing foods and drinks have been sold for more than 10 years in Japan, and are recognized to be safe in terms of food experience and scientifically. In fact, acute toxicity tests have been conducted, and it has been confirmed that there is no problem with safety unless the oral intake of an adult exceeds 8 grams of dry weight.

プロポリス抽出物に対するアルテピリンＣの含有比率を考慮すると、飲食用組成物として利用する場合、アルテピリンＣの１日当りの経口摂取量は3ミリグラムから15ミリグラムが望ましい。アレクリン抽出物を飲食用組成物に使用する場合も、アルテピリンＣの摂取量が同様の基準になるようにするのが好ましい。 Considering the content ratio of artepilin C to the propolis extract, the daily intake of artepilin C is preferably 3 to 15 milligrams when used as a composition for eating and drinking. Also when using an Aleklin extract for a composition for eating and drinking, it is preferable that the intake of Artepilin C is based on the same standard.

プロポリス抽出物、アレクリン抽出物またはアルテピリンＣを歯磨き粉等に混合して得られた口腔組成物を歯周病予防のために利用する場合、歯磨き粉に対するプロポリス抽出物、アレクリン抽出物またはアルテピリンＣの含有率は特に限定されるものではないが、十分な効果を期待するためには少なすぎるのは好ましくなく、例えば、プロポリス抽出物濃度は３％（Ｗ／Ｗ）以上が望ましい。
以下に、本発明の特徴を更に具体的に示すため実施例を記すが、本発明はこれらの実施例に限定されない。 When the oral composition obtained by mixing propolis extract, alectrin extract or artepilin C with toothpaste etc. is used for periodontal disease prevention, the content of propolis extract, alectrin extract or arteline C relative to toothpaste Although there is no particular limitation, it is not preferable that the amount is too small in order to expect a sufficient effect. For example, the propolis extract concentration is desirably 3% (W / W) or more.
Examples are given below to illustrate the features of the present invention more specifically, but the present invention is not limited to these examples.

桂皮酸類縁体によるＭＭＰ阻害活性測定
市販されている高純度アルテピリンＣおよびその類似体であるクマル酸や桂皮酸を入手した（入手先：和光純薬工業（株））。それらを用いて３種のＭＭＰ〔マトリライシン（ＭＭＰ−７）、膜結合型のＭＴ１−ＭＭＰ、およびゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）〕に対する阻害率を測定した。これらのＭＭＰの活性型タンパク質の調製は公知の方法（特許文献７：特開２０００−３４４６７２）に従って大略次のように行なった。
まず、これら3種のｃDNAを発現ベクターに組み込み、大腸菌に感染させ、その大腸菌内で大量発現させた。発現したタンパク質をアフィニティーカラムで精製し、再構成（リフォールディング）を行った。MMP−７とMT1−MMPはトリプシンと反応させて、活性型のタンパク質を調整した。一方、MMP−２についてはｐ‐ＡＭＰＡ（p-aminophenylmercuric
acetate：ｐ−アミノフェニル酢酸第二水銀）と反応させ、活性型のタンパク質を調整した。 Measurement of MMP inhibitory activity with cinnamic acid analogs Commercially available high-purity artepilin C and analogs thereof such as coumaric acid and cinnamic acid were obtained (source: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Using them, the inhibition rates against three types of MMPs [matrilysin (MMP-7), membrane-bound MT1-MMP, and gelatinase (MMP-2)] were measured. These active proteins of MMP were prepared according to a known method (Patent Document 7: Japanese Patent Laid-Open No. 2000-344672) in the following manner.
First, these three kinds of cDNAs were incorporated into an expression vector, infected with E. coli, and expressed in large quantities in the E. coli. The expressed protein was purified with an affinity column and reconstituted (refolded). MMP-7 and MT1-MMP were reacted with trypsin to prepare an active protein. On the other hand, for MMP-2, p-AMPA (p-aminophenylmercuric
acetate: mercuric acetate p-aminophenyl acetate) to prepare an active protein.

次に、アルテピリンＣ、３種のクマル酸（オルト−クマル酸、メタ−クマル酸、パラ−クマル酸の構造異性体）、桂皮酸を50％エタノールで10mg／mlに調製した。次にこれらの３標品を２倍ずつ1024倍まで希釈し、それぞれの標品ごとに11サンプルを調製した。これに、上記のように調製した活性型ＭＭＰのそれぞれを加え、37℃で15分間プレインキュベーション後、蛍光性ペプチド基質のＭＯＣＡｃ／ＤＮＰペプチド120μl（4.16μM）を加えて、37℃に保ちながら蛍光マイクロプレートリーダー（検出条件：励起波長320nm、蛍光波長390nm）で15分ごとに、120分間経時的に測定を行なった。測定後に20mM ＥＤＴＡ20μlを加えて反応を停止させ、蛍光ＵＶ検出器付ＨＰＬＣに5μl注入してペプチドの検出を行なった（検出条件：70％アセトニトリル／0.1%ＴＦＡ／30nm、ＵＶ280nm、流量1.0ml／分）。なお、阻害率の算出は次の計算法に従った。 Next, Artepilin C, three types of coumaric acid (structural isomers of ortho-coumaric acid, meta-coumaric acid, para-coumaric acid) and cinnamic acid were prepared to 50 mg ethanol to 10 mg / ml. Next, these three preparations were diluted 2 times to 1024 times, and 11 samples were prepared for each preparation. To this, each of the activated MMPs prepared as described above was added, and after preincubation at 37 ° C. for 15 minutes, 120 μl (4.16 μM) of the MOCAc / DNP peptide as a fluorescent peptide substrate was added, and fluorescence was maintained while maintaining at 37 ° C. Measurement was carried out over 120 minutes every 15 minutes with a microplate reader (detection conditions: excitation wavelength 320 nm, fluorescence wavelength 390 nm). After the measurement, 20 μl of 20 mM EDTA was added to stop the reaction, and 5 μl was injected into the HPLC with a fluorescence UV detector to detect the peptide (detection conditions: 70% acetonitrile / 0.1% TFA / 30 nm, UV 280 nm, flow rate 1.0 ml / min). ). The inhibition rate was calculated according to the following calculation method.

阻害率：ＨＰＬＣによる分析結果から算出した阻害率
阻害率（％）＝(Ａ−Ｂ)／Ａ×100
Ａ＝ＭＴ１−ＭＭＰのピーク高さ
Ｂ＝各サンプルのピーク高さ Inhibition rate: Inhibition rate calculated from HPLC analysis results
Inhibition rate (%) = (A−B) / A × 100
A = Peak height of MT1-MMP
B = peak height of each sample

さらに、ＭＭＰ阻害活性の程度を定量的に比較評価するため、各サンプルの阻害率からＩＣ₅₀を算出し、評価指標として用いた。ＩＣ₅₀とは「一定条件下でＭＭＰの活性を50%阻害するために必要な検体の濃度」であり、この数値が小さいほど阻害活性が高いと言える。結果を表１に示す。 Furthermore, in order to quantitatively compare and evaluate the degree of MMP inhibitory activity, IC ₅₀ was calculated from the inhibition rate of each sample and used as an evaluation index. IC ₅₀ is the “concentration of a specimen necessary for inhibiting MMP activity by 50% under a certain condition”, and the smaller this value, the higher the inhibitory activity. The results are shown in Table 1.

表１に示すように、クマル酸や桂皮酸と比較して、アルテピリンＣは著しく高いＭＭＰ阻害活性があることを発見した。特に、ＭＴ１−ＭＭＰとＭＭＰ７に対しては、桂皮酸には阻害活性がないが、アルテピリンＣはクマル酸に比べて３〜８倍の阻害効果を有している。また、ＭＭＰ２に対しても優れた阻害活性を有している。したがって、アルテピリンＣは、ＭＭＰ阻害物質として既述のように特定の疾患に対する治療または予防の効果が期待できる。 As shown in Table 1, it was discovered that Artepilin C has significantly higher MMP inhibitory activity than coumaric acid or cinnamic acid. In particular, cinnamic acid has no inhibitory activity against MT1-MMP and MMP7, but artepilin C has a 3- to 8-fold inhibitory effect compared to coumaric acid. It also has excellent inhibitory activity against MMP2. Therefore, artepilin C can be expected to have a therapeutic or preventive effect on specific diseases as described above as an MMP inhibitor.

プロポリス抽出物によるＭＭＰ阻害活性測定
ブラジル産プロポリス原塊1グラムを粉砕し、木屑などのゴミを除去した後、抽出剤として（Ａ）エタノール99.5%＋残部水、（Ｂ）エタノール80％＋水20％、（Ｃ）エタノール50％＋水50%、（Ｄ）水、または（Ｅ）グリセリン80%＋水20%（ミセル化抽出液）のそれぞれ3mlを用いて、すり鉢で磨り潰し、３日間室温で攪拌した。その混合物を絞り、フィルターろ過（６μmメッシュ）して得られた上清を各プロポリス抽出物とした。その抽出物を濃縮後、エタノールで希釈することにより固形分濃度が20％（W／W））になるように調整した。市販されているアルテピリンCを標品として、HPLCによる分析を行い、これら5種のプロポリス抽出物に含まれるアルテピリンCを定量した。
それぞれの抽出剤を用いて得られたプロポリス抽出物の有効成分の量を表２に示し、さらに、アルテピリンＣの含有量を図１に示す。なお、表２に示す各成分の量は次のようにして求めたものである。 Measurement of MMP inhibitory activity with propolis extract After grinding 1g of Brazilian propolis ingot and removing dust such as wood chips, (A) ethanol 99.5% + remainder water, (B) ethanol 80% + water 20 %, (C) Ethanol 50% + Water 50%, (D) Water, or (E) Glycerin 80% + Water 20% (micellar extract) 3 ml each and ground in a mortar for 3 days at room temperature And stirred. The mixture was squeezed and the supernatant obtained by filter filtration (6 μm mesh) was used as each propolis extract. The extract was concentrated and diluted with ethanol to adjust the solid concentration to 20% (W / W). Analysis was performed by HPLC using commercially available artepilin C, and artepilin C contained in these five types of propolis extracts was quantified.
The amount of the active ingredient of the propolis extract obtained using each extractant is shown in Table 2, and the content of Artepilin C is shown in FIG. In addition, the quantity of each component shown in Table 2 was calculated | required as follows.

抽出剤として（エタノール80%＋水20%）を用いた場合に、特にアルテピリンＣが効率的に抽出された。そこで、このプロポリス抽出物を用いて、実施例１と同様の手法により、ＭＭＰ（ＭＴ１−ＭＭＰ）に対する阻害率およびＩＣ₅₀を求めた。なお、阻害率は、実施例１と同様にＨＰＬＣによる分析結果から算出した。表２における回収率とは、原料であるプロポリス原塊の重量に対する、得られた抽出物の重量比である。ブラジル産プロポリス抽出物のＩＣ₅₀（mg／ml）は0.038であった。 Artepilin C was particularly efficiently extracted when (80% ethanol + 20% water) was used as the extractant. Therefore, using this propolis extract, the inhibition rate against MMP (MT1-MMP) and IC ₅₀ were determined in the same manner as in Example 1. The inhibition rate was calculated from the analysis result by HPLC in the same manner as in Example 1. The recovery rate in Table 2 is the weight ratio of the obtained extract to the weight of the raw propolis mass. The IC ₅₀ (mg / ml) of the Brazilian propolis extract was 0.038.

アレクリン抽出物によるＭＭＰ阻害活性測定
アレクリンの新芽１グラムに抽出剤として３mlのエタノール80%と水20%を加え、すり鉢で磨り潰し、３日間室温で攪拌した。その混合物を絞り、フィルターろ過（６μmメッシュ）して得られた上清をアレクリン抽出物（１番絞り）とした。さらに、その絞り残渣に前記抽出剤を加え、同様に抽出した（２番絞り）。最終的に、これらの抽出物を混合し、試験用のアレクリン抽出物とした。実施例１と同様にしてＭＭＰ活性の阻害率を測定し、ＭＴ１−ＭＭＰに対するＩＣ₅₀（mg／ml）を算出したところ、0.047であった。
Measurement of MMP inhibitory activity using an Aleklin extract 3 g of ethanol 80% and water 20% were added to 1 gram of alekrin shoots as an extractant, ground in a mortar and stirred at room temperature for 3 days. The mixture was squeezed and the supernatant obtained by filter filtration (6 μm mesh) was used as the Aleklin extract (No. 1 squeeze). Further, the extractant was added to the squeezed residue and extracted in the same manner (second squeezing). Finally, these extracts were mixed to obtain a test alectrin extract. The inhibition rate of MMP activity was measured in the same manner as in Example 1, and the IC ₅₀ (mg / ml) against MT1-MMP was calculated to be 0.047.

本発明により、プロポリス抽出物またはその起源植物アレクリンの抽出物含有成分であるアルテピリンＣを用いて、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害することが可能になった。これらを阻害剤として用いることにより、腫瘍転移、アレルギー、骨吸収疾患、歯周病、角膜潰瘍、皮膚の潰瘍化、糖尿病に付随するコラーゲン崩壊などのマトリックスメタロプロテアーゼ関連疾患の予防または治療効果の期待できる組成物を提供することができる。 According to the present invention, it has become possible to inhibit the activity of matrix metalloprotease using artepilin C, which is an extract-containing component of propolis extract or its plant eleculin. Expected to prevent or treat matrix metalloproteinase related diseases such as tumor metastasis, allergy, bone resorption disease, periodontal disease, corneal ulcer, skin ulceration, collagen breakdown associated with diabetes by using these as inhibitors Possible compositions can be provided.

各種の抽出剤を用いてプロポリスを抽出した場合のアルテピリンＣの含有量を示す。ただし、各サンプル中のプロポリス抽出物の固形分としての濃度は20％（W/W）に調整した。The content of artepilin C when propolis is extracted using various extractants is shown. However, the concentration of the propolis extract in each sample as a solid content was adjusted to 20% (W / W).

Claims

A matrix metalloprotease inhibitor having MT1-MMP, MMP2 and MMP7 inhibitory activity, comprising artepilin C which is a compound represented by the following structural formula (I).