JP4867012B2 - Retrovirus production vector - Google Patents
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Description
本発明は、目的の表現型に関与する遺伝子を効率よく同定するための方法およびそれに使用するレトロウイルス産生用ベクターに関する。 The present invention relates to a method for efficiently identifying a gene involved in a target phenotype, and a retrovirus production vector used therefor.
これまで培養細胞に変異を生じさせた後、その原因遺伝子を同定するという研究は行われてきたが、その手法としてゲノムＤＮＡに化学物質を用いて点突然変異を入れた後に異常な形質をもつ細胞を同定し、その細胞にcDNAライブラリー中の多種のcDNAを導入して形質を復帰させることで、原因遺伝子を同定するというのが主なものであった。しかし、この手法だと原因遺伝子を得るまでに、多大な労力と時間が必要であった。
染色体上に遺伝子を導入し、細胞の表現型と遺伝子の挿入位置の関連から目的遺伝子を同定するという遺伝子トラップ法が開発され、その目的で使用されるレトロウイルスベクターがいくつか報告されている（特許文献１および非特許文献１）。しかしながら、これらのレトロウイルスベクターでも遺伝子同定の効率において改善の余地があった。
A gene trap method has been developed in which a gene is introduced into a chromosome and the target gene is identified from the relationship between the phenotype of the cell and the insertion position of the gene, and several retroviral vectors used for that purpose have been reported ( Patent Document 1 and Non-Patent Document 1). However, these retroviral vectors also have room for improvement in gene identification efficiency.
上述のように、化学物質を用いて細胞の形質を変化させた後、その原因遺伝子を同定するのは多大な労力と時間を要した。本発明ではレトロウイルスベクターをゲノムDNAに挿入することで遺伝子の機能を不活性化すると共に、そのベクターの性質を利用してベクターが挿入された遺伝子を簡便に同定しようというものである。 As described above, after changing the character of a cell using a chemical substance, identifying the causative gene required a lot of labor and time. In the present invention, the function of a gene is inactivated by inserting a retroviral vector into genomic DNA, and the gene into which the vector has been inserted is easily identified using the properties of the vector.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。
その結果、一対のloxP配列、並びに該loxP配列にはさまれた、プロモーターを有さず、３’側にポリＡ付加シグナルが付加されたピューロマイシン耐性遺伝子、および、前記ピューロマイシン耐性遺伝子の下流に位置する、プロモーターを有し、３’側にポリＡ付加シグナルが付加された、β−ガラクトシダーゼとネオマイシン耐性タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を有するレトロウイルス産生用ベクターを用いることにより、目的の表現型に関与する遺伝子を効率よく同定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
The present inventors have intensively studied to solve the above problems.
As a result, a pair of loxP sequences, and a puromycin resistance gene sandwiched between the loxP sequences, having no promoter and having a poly A addition signal added on the 3 ′ side, and downstream of the puromycin resistance gene By using a vector for retrovirus production having a gene encoding a fusion protein of β-galactosidase and neomycin resistance protein having a promoter and a poly A addition signal added on the 3 ′ side, which is located in The inventors have found that genes involved in the phenotype can be efficiently identified, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）一対のloxP配列、並びに
該loxP配列にはさまれた、
プロモーターを有さず、３’側にポリＡ付加シグナルが付加されたピューロマイシン耐性遺伝子、および、前記ピューロマイシン耐性遺伝子の下流に位置する、プロモーターを有し、３’側にポリＡ付加シグナルが付加された、β−ガラクトシダーゼとネオマイシン耐性タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子
を有するレトロウイルス産生用ベクター。
（２）前記ピューロマイシン耐性遺伝子の前にスプライスアクセプター部位−ＩＲＥＳが付加された、（１）のベクター。
（３）（１）または（２）のベクターを細胞に導入するステップ、
ベクターが導入された細胞から表現型が変化した細胞を選択するステップ、および
該表現型が変化した細胞において染色体上のベクターの挿入位置に存在する遺伝子を同定するステップ、を含む、表現型に関与する遺伝子の同定方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) A pair of loxP sequences, as well as sandwiched between the loxP sequences,
A puromycin resistance gene having no promoter and a poly A addition signal added on the 3 ′ side, and a promoter located downstream of the puromycin resistance gene, and having a poly A addition signal on the 3 ′ side A retrovirus production vector having an added gene encoding a fusion protein of β-galactosidase and neomycin resistance protein.
(2) The vector according to (1), wherein a splice acceptor site -IRES is added before the puromycin resistance gene.
(3) introducing the vector of (1) or (2) into a cell;
Selecting a cell having a phenotypic change from cells into which the vector has been introduced, and identifying a gene present at the insertion position of the vector on the chromosome in the cell having the phenotype changed. To identify genes to be identified.
本発明のベクターでは、ピューロマイシン耐性遺伝子はプロモーターを有していないため、目的細胞内で発現している遺伝子のみを解析することができる。そして、レトロウイルスベクターを用いることにより、挿入部位の遺伝子がその変異形質の原因であるか、迅速簡便に確認することが可能である。更にベクター内部の配列を用いることにより、容易に挿入部位を同定できる。
本発明のベクターはレトロウイルスベクターであるため、培養細胞のゲノムに効率よく挿入される。更に両端にloxP配列を持つため、変異細胞にCre recombinaseを一過性に発現させることで、このベクターをゲノムから切り出して排除することが可能であり、その結果、変異細胞の形質を復帰させることが非常に容易に行える。更に、ベクター内部の配列を利用してRT-PCRやinverse PCRを行うことにより、挿入された部位の同定を容易に行うことが出来る。
In the vector of the present invention, since the puromycin resistance gene does not have a promoter, only the gene expressed in the target cell can be analyzed. By using a retroviral vector, it is possible to quickly and easily confirm whether the gene at the insertion site is the cause of the mutation. Furthermore, the insertion site can be easily identified by using the sequence inside the vector.
Since the vector of the present invention is a retroviral vector, it is efficiently inserted into the genome of cultured cells. Furthermore, because it has a loxP sequence at both ends, it is possible to excise and eliminate this vector from the genome by transiently expressing Cre recombinase in the mutant cells. Can be done very easily. Furthermore, the inserted site can be easily identified by performing RT-PCR or inverse PCR using the sequence inside the vector.
本発明のベクターは、
一対のloxP配列、並びに
該loxP配列にはさまれた、プロモーターを有さず、３’側にポリＡ付加シグナルが付加されたピューロマイシン耐性遺伝子、および、前記ピューロマイシン耐性遺伝子の下流に位置する、プロモーターを有し、３’側にポリＡ付加シグナルが付加された、β−ガラクトシダーゼとネオマイシン耐性タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を有する、
レトロウイルス産生用ベクターである。
The vector of the present invention is
A pair of loxP sequences, a puromycin resistance gene sandwiched between the loxP sequences, having no promoter and having a poly A addition signal added on the 3 ′ side, and located downstream of the puromycin resistance gene A gene encoding a fusion protein of β-galactosidase and neomycin resistance protein having a promoter and a poly A addition signal added on the 3 ′ side,
This is a retrovirus production vector.
loxP配列としてはP1ファージのloxP配列が挙げられ、具体的には、配列番号７の塩基配列を有する配列が挙げられる。
ピューロマイシン耐性遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、枯草菌のPuromycin耐性遺伝子が挙げられ、具体的には配列番号１の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
ポリＡ付加シグナルは特に制限されず、公知の配列を使用することができる。例えば、マウスPGK（phosphoglycerokinase）遺伝子のpolyA付加シグナルが例示される。
ピューロマイシン耐性遺伝子の前にはＳＡ（スプライス受容配列）−ＩＲＥＳ（Internal ribosomal entry site：リボゾーム内部侵入配列）が付加されていることが好ましい。
ＳＡ配列としては、例えば、ヒトbcl-2遺伝子（GeneBank Accession NO. AY220759）のSA配列が挙げられる。
ＩＲＥＳ配列としては、EMCV（Encephalomyocarditis virus）由来のＩＲＥＳ配列が挙げられる。
The loxP sequence includes the loxP sequence of P1 phage, and specifically includes a sequence having the base sequence of SEQ ID NO: 7.
The type of puromycin resistance gene is not particularly limited, and examples thereof include the puromycin resistance gene of Bacillus subtilis, and specifically, a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1.
The poly A addition signal is not particularly limited, and a known sequence can be used. For example, a polyA addition signal of mouse PGK (phosphoglycerokinase) gene is exemplified.
It is preferable that SA (splice acceptor sequence) -IRES (Internal ribosomal entry site) is added before the puromycin resistance gene.
Examples of the SA sequence include the SA sequence of the human bcl-2 gene (GeneBank Accession NO. AY220759).
Examples of the IRES sequence include an IRES sequence derived from EMCV (Encephalomyocarditis virus).
ピューロマイシン耐性遺伝子の下流には、プロモーターを有し、３’側にポリＡ付加シグナルが付加された、β−ガラクトシダーゼとネオマイシン耐性タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子が配置されている。
β−ガラクトシダーゼ（lacZ）とネオマイシン耐性タンパク質（neo）との融合タンパク質をコードする遺伝子（β-geo）は、両タンパク質の機能が発揮されるように融合されたタンパク質をコードする遺伝子であればよく、例えば、Gene. 1997 Sep 1;196(1-2):187-9に開示されたような遺伝子を使用することができる。なお、大腸菌由来のlacZ遺伝子の配列としてGeneBank Accession NO. V00296（配列番号４）が例示され、大腸菌由来の
ネオマイシン耐性遺伝子の配列としてGeneBank Accession NO. E16475（配列番号６）が例示される。例えば、これらの遺伝子をＯＲＦの読み枠が一致するように連結させてβ-geo遺伝子を得ることもできる。
β-geo遺伝子を発現させるためのプロモーターは特に制限されないが、構成的に発現するプロモーターが好ましく、例えば、PGK promoter: GeneBank Accession NO. CR847878（配列番号３）が例示される。
本発明のベクターは、通常の遺伝子組換え手法によって各遺伝子を連結して得ることができる。
A gene encoding a fusion protein of β-galactosidase and neomycin resistance protein having a promoter and a poly A addition signal added to the 3 ′ side is arranged downstream of the puromycin resistance gene.
The gene (β-geo) that encodes the fusion protein of β-galactosidase (lacZ) and neomycin resistance protein (neo) may be any gene that encodes a fused protein so that the functions of both proteins can be exerted. For example, a gene as disclosed in Gene. 1997 Sep 1; 196 (1-2): 187-9 can be used. In addition, GeneBank Accession NO. V00296 (SEQ ID NO: 4) is exemplified as the sequence of the lacZ gene derived from E. coli, and GeneBank Accession NO. E16475 (SEQ ID NO: 6) is exemplified as the sequence of the neomycin resistance gene derived from E. coli. For example, these genes can be linked so that the reading frames of the ORF match to obtain a β-geo gene.
The promoter for expressing the β-geo gene is not particularly limited, but a constitutively expressed promoter is preferable, and examples thereof include PGK promoter: GeneBank Accession NO. CR847878 (SEQ ID NO: 3).
The vector of the present invention can be obtained by linking each gene by an ordinary gene recombination technique.
本発明のベクターは、目的の表現型に関連する遺伝子を同定するために使用することができる。
すなわち、本発明の遺伝子同定方法は、上記本発明のベクターを細胞に導入するステップ、
ベクターが導入された細胞から表現型が変化した細胞を選択するステップ、および
該表現型が変化した細胞において染色体上のベクターの挿入位置に存在する遺伝子を同定するステップ、を含む、表現型に関与する遺伝子の同定方法である。
The vectors of the present invention can be used to identify genes associated with the phenotype of interest.
That is, the gene identification method of the present invention comprises a step of introducing the vector of the present invention into a cell,
Selecting a cell having a phenotypic change from cells into which the vector has been introduced, and identifying a gene present at the insertion position of the vector on the chromosome in the cell having the phenotype changed. This is a method for identifying a gene to be used.
本発明のベクターを導入する細胞はレトロウイルスが感染可能な細胞であればその由来する動物種や組織は特に制限されず、一般的な培養細胞を使用することができる。ベクターの導入は公知の方法に従って行うことができる。
以下、一般的な方法を例示する。
まず、ウイルス産生細胞（パッケージング細胞）に本発明のベクターを導入する。導入方法は公知のトランスフェクション法によればよく、リポフェクション法などが好ましい。ベクターが導入されたウイルス産生細胞を培養し、その培養上清をウイルス上清として得る。
次に、目的の細胞にウイルス液を適当に希釈して加える。すなわち、コンフルエントに近い状態に培養した細胞から培地を除き、ウイルス上清を添加する。一定時間インキュベートした後、ウイルス上清を除いて新鮮な培地に交換して培養をする。
本発明のベクターが導入された細胞のうち、本発明のベクターに含まれるピューロマイシン耐性遺伝子が内因性遺伝子のプロモーター領域に挿入された場合にのみ、内因性遺伝子のプロモーターからピューロマイシン耐性遺伝子が発現する。したがって、ピューロマイシンでベクター導入細胞を選択することにより、内因性遺伝子のプロモーター領域に挿入された細胞を得ることができる。ピューロマイシンの濃度は、例えば、０．５−１０μg/mlである。
さらに、ネオマイシンによる選択を組合わせてもよい。
さらに、本発明のベクターはβ-geo遺伝子を持つため、lacZ染色によってもベクターの導入を確認できるという利点を有している。
As long as the cell into which the vector of the present invention is introduced is a cell capable of infecting a retrovirus, the animal species and tissue from which it is derived are not particularly limited, and general cultured cells can be used. The vector can be introduced according to a known method.
Hereinafter, a general method will be exemplified.
First, the vector of the present invention is introduced into a virus producing cell (packaging cell). The introduction method may be a known transfection method, and a lipofection method is preferred. Virus-producing cells into which the vector has been introduced are cultured, and the culture supernatant is obtained as a virus supernatant.
Next, the virus solution is appropriately diluted and added to the target cells. That is, the medium is removed from the cells cultured in a state close to confluence, and the virus supernatant is added. After incubation for a certain period of time, the virus supernatant is removed and the medium is replaced with a fresh medium and cultured.
Of the cells into which the vector of the present invention has been introduced, the puromycin resistance gene is expressed from the promoter of the endogenous gene only when the puromycin resistance gene contained in the vector of the present invention is inserted into the promoter region of the endogenous gene. To do. Therefore, cells inserted into the promoter region of the endogenous gene can be obtained by selecting vector-introduced cells with puromycin. The concentration of puromycin is, for example, 0.5-10 μg / ml.
Further, selection with neomycin may be combined.
Furthermore, since the vector of the present invention has a β-geo gene, it has an advantage that the introduction of the vector can be confirmed by lacZ staining.
本発明のベクター（loxPに挟まれた部分）が内因性遺伝子のプロモーターに挿入されると、内因性遺伝子は発現せず、それによって細胞の表現型が変化する。したがって、目的の表現型を示したピューロマイシン耐性細胞において、挿入位置の遺伝子配列を解析することにより、表現型を生じる原因となった遺伝子を同定することができる。
遺伝子配列の解析は、ベクター内部の配列に基づいて作成したプライマーを使用したRT-PCRやinverse PCRなどによって行うことができる。
なお、当該遺伝子が発現していないことを確認するために、遺伝子を同定した後に、その遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲやノザンブロット、ウエスタンブロットなどで確認することが好ましい。
When the vector of the present invention (part sandwiched between loxPs) is inserted into the promoter of an endogenous gene, the endogenous gene is not expressed, thereby changing the phenotype of the cell. Therefore, in a puromycin-resistant cell showing the target phenotype, the gene that caused the phenotype can be identified by analyzing the gene sequence at the insertion position.
Analysis of the gene sequence can be performed by RT-PCR or inverse PCR using a primer prepared based on the sequence in the vector.
In order to confirm that the gene is not expressed, it is preferable to confirm the expression level of the gene by RT-PCR, Northern blot, Western blot or the like after identifying the gene.
なお、表現型が変化したとは、ベクター導入前と比較して表現型が変化したことを言い、この表現型は目的に応じて任意に設定することができる。例えば、細胞の形状の変化、
細胞内構成物の変化、アポトーシスの有無、細胞の増殖率、目的タンパク質の発現やサイトカインの産生などが例示される。
表現型の変化は、顕微鏡による観察、細胞染色、サイトカインアッセイなどによって確認することができる。
The phrase “phenotype has changed” means that the phenotype has changed compared to before the introduction of the vector, and this phenotype can be arbitrarily set according to the purpose. For example, changes in cell shape,
Examples include changes in intracellular components, presence / absence of apoptosis, cell growth rate, expression of target proteins, production of cytokines, and the like.
The phenotypic change can be confirmed by microscopic observation, cell staining, cytokine assay and the like.
本発明のベクターにおいては一対のloxP配列に上記ピューロマイシン耐性遺伝子とβ-geo遺伝子がはさまれている。したがって、ベクター導入細胞をCre組換え酵素（Cre Recombinase：例えば、GenBankに Accession No. X03453）で処理することで、染色体上に挿入された遺伝子を除去することができる。
このことから、表現型の変化がベクターの挿入によることを確認するために、選択されたベクター導入細胞をCre組換え酵素で処理し、その表現型が元に戻ることを確認することが好ましい。この際に、β−ガラクトシダーゼ染色を行えば挿入遺伝子の除去が目視で確認できる。
In the vector of the present invention, the puromycin resistance gene and the β-geo gene are sandwiched between a pair of loxP sequences. Therefore, the gene inserted on the chromosome can be removed by treating the vector-introduced cell with Cre recombinase (for example, Accession No. X03453 in GenBank).
Therefore, in order to confirm that the phenotypic change is due to the insertion of the vector, it is preferable to treat the selected vector-introduced cell with Cre recombinase and confirm that the phenotype is restored. In this case, if β-galactosidase staining is performed, the removal of the inserted gene can be confirmed visually.
図１に本発明のベクターとそれが導入される前後の染色体上の遺伝子の模式図を示す。
まず、上段はベクター導入前の培養細胞中の野生型遺伝子Ｘである。これによって通常の表現型が示されている。
次に、ベクターがexon1とexon2の間（↓の箇所）に挿入されると（中段）、exon1からの転写がすぐ下流で止まると同時にexon2, 3の転写が生じず、挿入された遺伝子座に存在する遺伝子の転写、発現が著しく低下することとなる。その代わりに、ピューロマイシン耐性遺伝子とβ−geo遺伝子が発現する。これによって表現型に変化が生じる。
そして、このベクターの両端には矢頭で示される２つのloxP部位が存在し、この間がCre recombinaseの存在下で切り出される。切り出された後は1個のloxP部位しか存在しないため、この遺伝子座にある遺伝子の転写、発現が回復し、表現型も元に戻ることになる。
FIG. 1 shows a schematic diagram of the vector of the present invention and the genes on the chromosome before and after the introduction of the vector.
First, the upper row is the wild type gene X in the cultured cells before the introduction of the vector. This shows the normal phenotype.
Next, when the vector is inserted between exon1 and exon2 (↓) (middle), transcription from exon1 stops immediately downstream, and at the same time, transcription of exon2 and 3 does not occur. Transcription and expression of existing genes will be significantly reduced. Instead, the puromycin resistance gene and the β-geo gene are expressed. This changes the phenotype.
Then, there are two loxP sites indicated by arrowheads at both ends of this vector, and these are excised in the presence of Cre recombinase. Since there is only one loxP site after excision, transcription and expression of the gene at this locus is restored, and the phenotype is restored.
１．レトロウイルスベクターの構築
pBluescript（Stratagene）にクローニングされている、SA-IRES （奈良先端大学院大学 石田靖雅助教授から分与：Nucleic Acids Res. 1999 Dec 15;27(24):e35）から1.25kb のSA-IRESをNot I-EcoRI で切り出し、別のpBluescript に入ったPuromycin耐性遺伝子(Puror polyA) のmultiple cloning siteにSA-IRES-Puror polyAとなるように挿入した。次にさらに別のpBluescript にクローニングされている、PGKβgeo polyA（東京大学広川研究室からの分与）から4.7kbのPGKβgeo polyAをSal IとXho Iで切り出し、前記pBluescript にクローニングされた、SA-IRES-Puror polyAのpolyAの後ろに挿入し、SA-IRES-Puror polyA-PGKβgeo polyAを作成した。ここから7.15kbのSA-IRES-Puror polyA-PGKβgeo polyAをNot IとXho Iで切り出し、loxPを両端にもつretrovirusを作成するためのベクターである、pGenloxP（奈良先端大学院大学 石田靖雅助教授から分与：Nucleic Acids Res. 1999 Dec 15;27(24):e35）のcloning siteに挿入した。
なお、PGKβgeo polyAとは、PGKプロモーター、βガラクトシダーゼ（lacZ）、ネオマイシン耐性遺伝子（neo）、ポリＡ付加シグナルが並んだ配列である。
レトロウイルスベクターの構造を図１中に示す。
1. Retroviral vector construction
SA-IRES cloned from pBluescript (Stratagene) (from Nara Institute of Science, Assistant Professor Masaru Ishida: Nucleic Acids Res. 1999 Dec 15; 27 (24): e35) excised with -EcoRI, was inserted so that the SA-IRES-Puro r polyA to multiple Cloning site of Puromycin resistance gene containing a different pBluescript (Puro r polyA). Next, a 4.7-kb PGKβgeo polyA cloned from PGKβgeo polyA (distributed from the Hirokawa Laboratory at the University of Tokyo), which has been cloned into another pBluescript, was excised with Sal I and Xho I, and cloned into the pBluescript, SA-IRES was inserted into the back of the polyA of -Puro r polyA, it was to create a SA-IRES-Puro r polyA- PGKβgeo polyA. Here excised SA-IRES-Puro r polyA- PGKβgeo polyA of 7.15kb in Not I and Xho I, a vector for creating a retrovirus with loxP across, minutes from PGenloxP (Nara Institute of Ishida YasushiMasashi Associate Professor Yo: Inserted into the cloning site of Nucleic Acids Res. 1999 Dec 15; 27 (24): e35).
PGKβgeo polyA is a sequence in which a PGK promoter, β-galactosidase (lacZ), neomycin resistance gene (neo), and poly A addition signal are arranged.
The structure of the retroviral vector is shown in FIG.
２．ウイルス産生
PlatE (293細胞由来のretrovirus産生細胞): 10% FCS,1μg/ml puromycin, 10μg/ml blasticidine, 10μg/ml penicillin-streptomycin添加culture medium(DMEM)で培養した。
約2.5×106個のPlatE細胞を6cm dishに蒔き直した。
翌日6cm dish１枚に対して、FCSを含まないDMEM 200μlとFugene（ROCHE） 9μlを混和しretrovirus DNAを3μg加えた溶液をdishに滴下した．48時間後にvirus溶液として培養上清を回収した。
2. Virus production
PlatE (293 cell-derived retrovirus-producing cells): cultured in culture medium (DMEM) supplemented with 10% FCS, 1 μg / ml puromycin, 10 μg / ml blasticidine, 10 μg / ml penicillin-streptomycin.
About 2.5 × 10 6 PlatE cells were seeded in a 6 cm dish.
On the next day, 200 µl of DMEM without FCS and 9 µl of Fugene (ROCHE) were mixed into one 6 cm dish, and a solution containing 3 µg of retrovirus DNA was added dropwise to the dish. After 48 hours, the culture supernatant was recovered as a virus solution.
３．Virus感染
PC12細胞（ラット副腎髄質褐色細胞腫由来培養細胞）は、10% FCS添加culture medium(DMEM)で培養した。
PC12細胞のculture mediumに、上記で調製したvirus溶液を1/10量加えdishに入れた。3時間培養後にculture mediumを追加し、48時間後から選別用の薬剤を添加した。
3. Virus infection
PC12 cells (cultured cells derived from rat adrenal medullary pheochromocytoma) were cultured in a culture medium (DMEM) supplemented with 10% FCS.
1/10 amount of the virus solution prepared above was added to the culture medium of PC12 cells and placed in dish. After 3 hours of culture, a culture medium was added, and a drug for selection was added after 48 hours.
４．Selection
・Puromycin
ウイルス感染の48 時間後にG418 700μg/ml, Puromycin 0.3μg/mlを含む培地に換え、1-2回/wごとに液がえをしながら3-4週間培養した。コロニーが形成されたら顕微鏡下でpick upし、96 well plateに移してG418 700μg/mlを含む培地で培養した。
4). Selection
・ Puromycin
Forty-eight hours after virus infection, the medium was replaced with medium containing G418 700 μg / ml and Puromycin 0.3 μg / ml, and the cells were cultured for 3-4 weeks while the liquid was removed every 1-2 times / w. When colonies were formed, they were picked up under a microscope, transferred to a 96-well plate, and cultured in a medium containing G418 700 μg / ml.
・Aerolysin
細胞表面のGPI（glycosylphosphatidylinositol）アンカー型蛋白質を欠損した株を得るために、Aerolysinという毒物に対して耐性となった細胞を選択した。上記で得られたG418・Puromycin耐性株について、 0.8nMとなるようにAerolysin（Protox Therapeutics社（カナダ）から購入）を添加し、目的とする変異株の細胞のみが残存するようにAerolysinの濃度を徐々に増加しながら3-4週間培養した。 colonyが形成されたらこれを96 well plateに移して培養を継続した。
なお、GPIアンカーは糖脂質であり細胞表面に発現される蛋白質の修飾に用いられる。Aerolysinは細胞表面にGPIアンカー型蛋白質を持つ細胞を殺す働きのある毒素であり、Aerolysin 存在下ではGPIアンカーの合成に異常を来した細胞株のみ生き残る。
・ Aerolysin
In order to obtain a strain lacking the GPI (glycosylphosphatidylinositol) anchor type protein on the cell surface, cells that became resistant to the toxic substance called Aerolysin were selected. For the G418 / Puromycin resistant strain obtained above, add Aerolysin (purchased from Protox Therapeutics (Canada)) to 0.8 nM, and adjust the concentration of Aerolysin so that only the target mutant cells remain. The cells were cultured for 3-4 weeks while gradually increasing. When colony was formed, it was transferred to a 96 well plate and culture was continued.
The GPI anchor is a glycolipid and is used for modifying proteins expressed on the cell surface. Aerolysin is a toxin that kills cells with GPI-anchored proteins on the cell surface. In the presence of Aerolysin, only cell lines that have abnormally synthesized GPI anchors survive.
得られた変異株の中から神経伝達物質を含む小胞に異常を生じた細胞を選択した。
選択された細胞（D1株、D4株）について神経伝達物質を含む小胞に存在する蛋白（クロモグラニンA (CgA), シナプトフィシン(SYPH））の抗体（CgA抗体は矢内原研究所、SYPH抗体はchemicon社のものを購入）で染色した。
図２に示されるように、ウイルス導入前の細胞ではCgA, SYPHは細胞の突起などに豊富に存在するが、ウイルスを導入した細胞ではCgA, SYPHの量の低下と分布の異常が認められた。
From the obtained mutant strains, cells having abnormalities in vesicles containing neurotransmitters were selected.
Antibodies (chromogranin A (CgA), synaptophysin (SYPH)) present in vesicles containing neurotransmitters for selected cells (D1 and D4 strains) (CagA antibody is Yauchihara Laboratory, SYPH antibody is chemicon) Were purchased).
As shown in Fig. 2, CgA and SYPH were abundant in cell protrusions in cells before virus introduction, but the amount of CgA and SYPH decreased and distribution was abnormal in cells into which virus was introduced. .
Cre
Cre recombinaseを発現するアデノウイルスベクター（タカラバイオより購入）で細胞を処理することによって、細胞から挿入されたDNAを除去した。
その結果、挿入されたDNAをCre recombinaseによって除去すると（右列）、神経伝達物質を含む小胞はベクターを挿入する前の分布に戻ることが分かる。このことからCgA, SYPHの分布異常がベクターのゲノムへの挿入によって生じることが判明した。
Cre
The inserted DNA was removed from the cells by treating the cells with an adenoviral vector expressing Cre recombinase (purchased from Takara Bio).
As a result, when the inserted DNA is removed by Cre recombinase (right column), it can be seen that the vesicles containing neurotransmitters return to the distribution before the insertion of the vector. From this, it was clarified that abnormal distribution of CgA and SYPH was caused by insertion of the vector into the genome.
染色体上のベクターが挿入された位置について同様に選別した他の細胞株について遺伝子配列解析を行った。
IRESsense primer: GCAAGGTCTGTTGAATGTCG（配列番号８）, antisense primer: GGTCAGGAACAGATGGAACA（配列番号９）を用い、RT-PCRを行った。
その結果、ベクターが挿入された位置はGAP43遺伝子（M16228）のプロモーター領域であることがわかった。
次に、GAP43の抗体（Sigmaより購入）を用いてウイルス感染前の細胞と感染後の細胞中のGAP43の蛋白量を定量した。図３に示されるように、予想通りベクター導入後では導入前に比べてGAP43の蛋白量が著しく低下している（10％以下）ことが判明した。
したがって、レトロウイルスベクターが染色体上のGAP43遺伝子のプロモーター領域に挿入されることによって同遺伝子の発現量が低下し、それによって小胞異常という表現型
が生じることがわかった。
以上の結果から、細胞にレトロウイルスベクターを導入して表現型を調べることにより、その表現型に関係する遺伝子がスクリーニングできることがわかった。
Gene sequence analysis was performed on other cell lines selected in the same manner at the position where the vector on the chromosome was inserted.
RT-PCR was performed using IRESsense primer: GCAAGGTCTGTTGAATGTCG (SEQ ID NO: 8) and antisense primer: GGTCAGGAACAGATGGAACA (SEQ ID NO: 9).
As a result, the position where the vector was inserted was found to be the promoter region of the GAP43 gene (M16228).
Next, GAP43 antibody (purchased from Sigma) was used to quantify the amount of GAP43 protein in cells before and after virus infection. As shown in FIG. 3, as expected, it was found that the amount of GAP43 protein was significantly reduced (10% or less) after introduction of the vector compared to before introduction.
Therefore, it was found that when the retroviral vector was inserted into the promoter region of the GAP43 gene on the chromosome, the expression level of the gene was reduced, thereby causing a phenotype of vesicular abnormality.
From the above results, it was found that genes related to the phenotype can be screened by introducing a retroviral vector into the cell and examining the phenotype.
培養細胞を用いて医学生物学的に有用な遺伝子を同定する本発明は、ほぼ全ての種類の培養細胞に用いることが可能で、非常に汎用性が高いものである。本明細書ではPC12細胞を用いて神経伝達物質を含む小胞の形成に関わる遺伝子の同定を行ったが、他にもインスリン感受性細胞を用いたインスリン作用に関与する遺伝子の同定などにも用いることが可能である。そのような遺伝子が同定できれば、生活習慣病の病態や治療にも役立つと考えられるため、基礎医学のみならず、臨床医学や製薬分野などでも役立つと思われる。
The present invention for identifying genes useful in medical biology using cultured cells can be used for almost all types of cultured cells and is very versatile. In this specification, we have identified genes involved in the formation of vesicles containing neurotransmitters using PC12 cells, but we also use them to identify genes involved in insulin action using insulin-sensitive cells. Is possible. If such a gene can be identified, it is considered useful for the pathophysiology and treatment of lifestyle-related diseases, so it may be useful not only in basic medicine but also in clinical medicine and pharmaceutical fields.
Claims (3)
該loxP配列にはさまれた、
プロモーターを有さず、３’側にポリＡ付加シグナルが付加されたピューロマイシン耐性遺伝子、および、前記ピューロマイシン耐性遺伝子の下流に位置する、プロモーターを有し、３’側にポリＡ付加シグナルが付加された、β−ガラクトシダーゼとネオマイシン耐性タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、
を有するレトロウイルス産生用ベクター。 A pair of loxP sequences, as well as sandwiched between the loxP sequences,
A puromycin resistance gene having no promoter and a poly A addition signal added on the 3 ′ side, and a promoter located downstream of the puromycin resistance gene, and having a poly A addition signal on the 3 ′ side An added gene encoding a fusion protein of β-galactosidase and neomycin resistance protein,
A retrovirus production vector comprising:
ベクターが導入された細胞から表現型が変化した細胞を選択するステップ、および
該表現型が変化した細胞において染色体上のベクターの挿入位置に存在する遺伝子を同定するステップ、を含む、表現型に関与する遺伝子の同定方法。 Introducing the vector of claim 1 or 2 into a cell;
Selecting a cell having a phenotypic change from cells into which the vector has been introduced, and identifying a gene present at the insertion position of the vector on the chromosome in the cell having the phenotype changed. To identify genes to be identified.
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