JP4868767B2 - 氷結晶成長抑制剤及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は合成物質に関するものであり、より詳細には不凍タンパク質が有するような不凍活性を示す物質に関するものである。

不凍タンパク質の不凍活性は、非特許文献１にその概略が説明されている。すなわち不凍タンパク質（Ａｎｔｉ−Ｆｒｅｅｚｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＦＰと称される場合もある）は、極地に生息する魚、昆虫、植物などに含まれる特殊なタンパク質である。例えば通常の魚類の体液は、−０．８℃前後で凍結するのに対して、ＡＦＰを体内に有する魚類の体液は−２℃以下まで下がっても凍結しないという特徴がある。海水は−１．９℃程度で凍ってしまうため、ＡＦＰを体内に有する魚類は体液が凍ることなく生息が可能となる。

凝固点の降下は、一般には、凝固点降下温度が溶質のモル濃度と正比例するモル凝固点降下則によって説明されることが多い。しかしＡＦＰのモル濃度と凝固点降下温度とは正比例しない。すなわちＡＦＰは、モル凝固点降下則とは異なる作用で体液の凍結を防止しており、生体内で成長した氷結晶の成長面に特異的に吸着し、氷結晶の成長を阻害することによって体液の凍結を防止している。

氷結晶の成長について図１、図２−ａ、図２−ｂを参照しながらより具体的に説明すると、以下の通りである。図１はＡＦＰが存在しない場合の氷晶の成長を示す概念図であり、図２−ａ及び図２−ｂはＡＦＰが存在する場合の氷晶の成長の一例を示す概念図である。図１に示すように、一般に氷の最小核が形成されると、この最小核はａ軸方向及びｃ軸方向の両方に成長する。ただしａ軸方向の成長速度はｃ軸方向の成長速度より約１００倍程度速いため、円盤状の氷の核（氷晶）１が形成される。これに対して図２−ａに示すように、ＡＦＰが存在する場合、氷の最小核ができるとただちにａ軸方向の面（プリズム面）に接着又は吸着し、ａ軸方向の氷の成長を抑止するため、六方晶状の氷晶２が形成されることとなる。そしてこの六方晶状の氷晶２は図２−ｂに示すように、ｃ軸方向に小さな六方柱を積み重ねるようにして成長し、バイピラミッド型氷晶３となる。なおＡＦＰはｃ軸方向の成長を抑止する場合もあり、このときは六方晶状のまま（図２−ａ参照）となる。いずれにせよＡＦＰが存在すると、氷晶が通常（扁平円盤型）とは異なる形態となる。

ＡＦＰが有する不凍活性は、前述したような氷晶形態の変化で特徴づけられるだけでなく、以下のような点でも特徴づけられる。すなわちｃ軸方向などの結晶成長が抑制されているため、氷晶同士の合一も抑制される。従って氷結晶の粗大化が抑制されることも不凍活性の一つといえる。

さらに熱ヒステリシスを示すことも不凍活性の一つである。すなわちＡＦＰが溶解した水溶液を過冷却して一度完全に凍結させ、系の温度を徐々に上昇させると融解する。この融解温度（融点）よりも僅かに温度を下げて長時間放置すると、通常であるならば凍結が始まる（すなわち融点と凝固点とは一致する）が、ＡＦＰが存在していると凍結は始まらず、さらに温度を下げることによって初めて凍結が始まる。前記融解温度（融点）と、再度の凍結温度（凝固点）との差は熱ヒステリシスと称されており、この熱ヒステリシスがあることも不凍活性の認定要件の一つをなす。

すなわち不凍活性とは、１）氷晶形態が変化する（非扁平円盤形となる）こと、２）氷晶の合一が抑制されること、３）熱ヒステリシスがあることを意味する。なお１）氷晶形態が変化すること、及び２）氷晶の合一が抑制されることは、いずれも氷晶の成長が抑制されることが原因となっており同一視することができるため、本明細書では１）氷晶形態が変化し（非扁平円盤形となり）、２）熱ヒステリシスがあれば、不凍活性があるとする。

このような不凍活性を有するＡＦＰは、種々の応用開発が研究されている。例えば冷凍食品の品質やきめ（テクスチャー）改善用途（特許文献１〜１４など）、生体組織及び体液の耐凍性改善用途（特許文献１５〜１７など）、氷蓄熱システム用途（特許文献１８など）などの開発が活発である。上記ＡＦＰ以外にも特願２００３−３６２４２７号においてポリアクリルアミドの水溶液が氷晶形態を変化させ、かつ熱ヒステリシスを有するとの開示がある。

西村紳一郎，「不凍糖タンパク質の合成−不凍魚の秘密をさぐる− 」，現代化学，東京化学同人，１９９９年４月，第３３７号，第５６−６２頁 国際公開第９６／３９８７８号パンフレット 国際公開第９６／１１５８６号パンフレット 国際公開第９８／４６９９号パンフレット 国際公開第９８／４１４７号パンフレット 国際公開第９８／４１４８号パンフレット 特開２０００−１５７１９５号公報 国際公開第９９／３７１６４号パンフレット 国際公開第９９／３７６７３号パンフレット 国際公開第００／５３０２５号パンフレット 国際公開第００／５３０２６号パンフレット 国際公開第００／５３０２７号パンフレット 国際公開第００／５３０２８号パンフレット 国際公開第００／５３０２９号パンフレット 国際公開第９９／３７６７３号パンフレット 国際公開第９１／１０３６１号パンフレット 国際公開第９７／３６５４７号パンフレット 国際公開第００／００５１２号パンフレット 特開平８−７５３２８号明細書 特許第３１１１２１９号明細書

しかし、不凍タンパク質は極めて高価であり、今のところ１００万円／ｇもする。さらには熱によって変性しやすく、また生体に適用する場合には抗原抗体反応を引き起こす虞もある。

なお特許文献１９にはポリビニルアルコールを利用した冷熱輸送方法が開示されており、実施例の欄にはポリビニルアルコールを用いると粒状氷結晶が再結晶しないことが示されている。しかし不凍活性の重要な要件である熱ヒステリシスに関してどのような挙動を示すかについては、全く示されていない。

本発明は上記の様な事情に着目してなされたものであって、その目的は、不凍タンパク質の不凍活性を利用した種々の用途開発を、不凍タンパク質を使用することなく達成する点にある。

本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、タンパク質系以外にも不凍活性を有する重合体（例えばポリアクリル酸のアンモニウム塩）が存在することを見つけ、当該物質は濃度１０ｍｇ／ｍｌの水溶液が非扁平円盤型の氷晶を析出させこと、及び濃度１０ｍｇ／ｍｌの水溶液が０．０２０℃以上の熱ヒステリシスを示すことを明らかにし、本発明を完成した。この重合体は不凍タンパク質（ＡＦＰ）に代えて種々の用途に使用できる。

すなわち本発明に係る氷結晶成長抑制剤は、濃度１０ｍｇ／ｍｌの水溶液が非扁平円盤型の氷晶を析出させる非タンパク質系重合体を含んでなる。この氷結晶成長抑制剤は、氷蓄熱システムの熱媒体に添加することができ、また冷凍食品に添加することができる。

また本発明に係る氷結晶成長開始温度低下剤は、濃度１０ｍｇ／ｍｌの水溶液が０．０２０℃以上の熱ヒステリシスを示す非タンパク質系重合体を含んでなる。この氷結晶成長開始温度低下剤は、氷付着を防止するために付着箇所に散布又は塗布することができる。また凍結又は霜害を防止するために地面又は農作物に散布又は塗布することができる。

本発明に係る水の凝固コントロール剤は、濃度１０ｍｇ／ｍｌの水溶液が、０．０２０℃以上の熱ヒステリシスを示し、かつ非扁平円盤型の氷晶を析出させる非タンパク質系重合体を含んでなる。この水の凝固コントロール剤は、氷点下での生体組織の損傷又は体液の凍結を防止するために生体組織又は体液に注入することができる。

上記非タンパク質系重合体は、例えば、炭素鎖を主鎖とする高分子である。

本発明の非タンパク質系重合体は、濃度１０ｍｇ／ｍｌの水溶液が非扁平円盤型の氷晶を析出させ、また０．０２０℃以上の熱ヒステリシスを示すため、不凍タンパク質を使用しなくても、不凍活性を利用した種々の用途に利用できる。

本発明は、不凍活性を示す非タンパク質系重合体に係るものである。当該重合体は、濃度１０ｍｇ／ｍｌの水溶液としたとき、氷晶形態が変化し（非扁平円盤形となり）、かつ熱ヒステリシスを示す。

前記氷晶形態の変化とは、より詳細に説明すると、本発明の非タンパク質系重合体を濃度１０ｍｇ／ｍｌの水溶液として冷却していったとき、図１に示すような扁平円盤状の氷晶１とはならないことを意味する。例えば、図２−ａに示すような六方晶状（扁平六角柱状）の氷晶２や、図２−ｂに示すようなバイピラミッド形の氷晶３となる。このように氷晶形態が変化するのは、所定方向［例えば、ａ軸方向（プリズム面と直交する方向）、又は前記ａ軸方向とｃ軸方向（基底面と直交する方向）の両方向］の結晶の成長が抑制されているためである。

また前記熱ヒステリシスは、以下のように定義される温度である。すなわち対象物質を濃度１０ｍｇ／ｍｌの水溶液とし、当該水溶液を過冷却して一度完全に凍結させ、系の温度を徐々に上昇させて氷を溶かしていき、僅かに氷の結晶が残った段階で（例えば、視野０．１ｍｍ×０．１ｍｍ当たり、大きさ約０．０８〜０．１ｍｍの結晶が１個だけ残った段階で）再び徐々に冷却（例えば、冷却速度１℃／分程度）していき、再び氷晶を成長させる。前記僅かに氷の結晶が残った温度（融点）と、氷晶の再成長が観察され始める温度（凝固点）とを測定し、これらの温度差（融点−凝固点）を求める。前記温度差（融点−凝固点）は必然的に誤差を含むが、前記温度差が０．０２０℃以上あるとき、誤差を考慮しても熱ヒステリシスがあるといえる。従って本発明の非タンパク質系重合体とは、前記温度差（融点−凝固点）が０．０２０℃以上である物質である。

上記の熱ヒステリシスの値は大きいほど氷との相互作用が大きいと考えられるので、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌの水溶液を用いて測定した際の値が０．０３０℃以上である。

本発明の非タンパク質系重合体は、例えば、炭素鎖を主鎖とする高分子である。該高分子は、例えば以下に示すような単量体を単独重合もしくは２種以上の単量体を共重合することによって得られる。

アクリル酸、メタクリル酸等のような不飽和カルボン酸類；アクリル酸メチル等のような不飽和カルボン酸エステル類；アクリルアミド等の不飽和アミド類；アクリル酸アンモニウム等の不飽和カルボキシルアンモニウム塩類；［２−（アクリロイロキシ）エチル］アンモニウムクロライドのような不飽和４級アンモニウム塩類；メチルビニルエーテルやエチルビニルエーテル等のビニルエーテル類；酢酸ビニルのようなビニルエステル類；Ｎ−ビニルピロリドンのようなＮ−ビニル化合物；アリルアルコール、メタリルアルコールのような不飽和アルコール類；アリルアミンのような不飽和アミン類；２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸のような不飽和スルホン酸類。

また上記高分子を得るための重合方法に関しては特に制限はないが、ラジカル重合が好ましい。

上記のような不凍活性（氷晶形態を変化させる性質、及び熱ヒステリシスを示す性質）を有する炭素鎖を主鎖とする高分子は、側鎖に窒素原子を含有する官能基を有する。該官能基の例として、アミノ基又はアンモニウム基等が挙げられる。アミノ基としては、活性水素が残った１級アミノ基、２級アミノ基や３級アミノ基；活性水素がアルキル基によって置換されたアルキルアミノ基；活性水素がアルカノール基によって置換されたアルカノールアミノ基などが例として挙げられる。またアンモニウム基としては、トリメチルアンモニウムクロライド、トリエチルアンモニウムクロライド、トリエチルアンモニウムクロライドなどのアルキル基によって置換されたアンモニウム基；トリヒドロキシルエチルアンモニウムクロライドなどのアルカノール基によって置換されたアンモニウム基；−ＣＯ_２ ⁻ＮＲ^１Ｒ^２Ｒ^３Ｈ^＋（Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は水素、アルキル基またはヒドロキシル基で一部置換されたアルキル基を表す）で表されるようなカルボキシルアンモニウム基などが挙げられる。好適なアミノ基／アンモニウム基としては、−ＣＯ_２ ⁻ＮＨ_４ ^＋が挙げられる。またそのようなアミノ基及び／又はアンモニウム基を含有する重合体の好適な例としては、ポリアクリル酸アンモニウムなどが挙げられる。

また本発明の重合体の分子量は特に制限がないが、好ましくは重量平均分子量で１，０００〜１，０００，０００の範囲である。分子量が１，０００より小さいと氷結晶へ吸着した際の被覆面積が小さいので氷結晶成長抑制剤としての効果が小さくなる恐れがあり、また逆に１，０００，０００より大きいと氷結晶を分散させる効果が小さくなり、むしろ凝集剤的に働く恐れがあるので好ましくない。更に好ましい範囲としては、３，０００〜５００，０００である。

不凍活性を有する重合体は、当該不凍活性の内容に応じて種々の用途に使用できる。例えば氷晶形態を変化させる性質は、氷結晶成長抑制剤として利用できる。この場合、氷の成長を抑制することによって氷の合一化を抑制できる。前記氷結晶成長抑制剤は、例えば、氷蓄熱システムの熱媒体に添加してもよく、また冷凍食品（例えばアイスクリーム）に添加してもよい。
氷蓄熱システム用途に本発明の重合体を利用する方法の一例としては、重合体を添加した液体を冷却して氷スラリーを生成させ、該氷スラリーを配管及びポンプによって所定の場所に輸送することや同様にして得られた氷スラリーを貯蔵することで冷熱を保存することが挙げられる。氷蓄熱システム用途に使用すれば、熱媒体が氷を析出させる際に氷が合一化してシステムが運転不能となることを防止できる。なお氷そのものの量は実質的には変化しないため、システムの蓄熱能力が低下する虞はない。加えて比較的少量で効果があるので、多大な過冷却状態を引き起こさない。さらに本発明の重合体は化学的に安定なので、運転効率を保ったまま長期間の運転が可能である。
また、冷凍食品に添加すれば、食品中の氷が合一化して食感が低下するのを防止できる。

一方、本発明の重合体が有する、熱ヒステリシスを示す性質は、氷の成長開始温度低下剤として利用できる。氷結晶成長開始温度低下剤は、氷付着を防止するために付着箇所（例えば、飛行機などの翼や電線など）に散布又は塗布してもよく、凍結や霜害を防止するために地面（路面、土壌など）や農作物に散布又は塗布してもよい。本発明の重合体は、金属への腐食性が少なく、また少量添加で有効なために環境への負荷も小さいことが特徴である。

また氷の成長を抑制する性質と、熱ヒステリシスを示す性質の両方を利用する場合、本発明の重合体は、水の凝固コントロール剤として利用できる。当該水の凝固コントロール剤は、例えば、氷点下での生体組織の損傷又は体液の凍結を防止するために生体組織又は体液に注入することができる。具体的には、養殖魚の耐凍性改善、精子や臓器などの冷凍保存、冷凍手術などに利用できる。本発明の物質は非タンパク質系なので、例えば臓器保存用に用いたとしても抗原抗体反応を引き起こす虞がない。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

なお以下の実験例では、下記の物質の不凍活性を調べた。
ポリアクリル酸：株式会社日本触媒製、商品名「アクアリックＨＬ−４１５」、分子量：１０，０００
ポリアクリル酸ナトリウム：上記１）のポリアクリル酸を３０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０になるまで中和したもの。
ポリエチレンイミン：株式会社日本触媒製、商品名「エポミンＳＰ−２００」、分子量：１０，０００
ポリアクリル酸アンモニウム：上記１）のポリアクリル酸を２８％アンモニア水（和光純薬工業株式会社製）でｐＨ７．０になるまで中和したもの。

実験例
上記各物質の水溶液（濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を調製した。この水溶液を温度制御付き凍結ステージ（リンカム社製、ＬＫ−６００ＰＭ）にセットし、−３０℃まで冷却して完全に凍結させた後、位相差顕微鏡（倍率１００倍）で観察しながら約−１℃まで温度を上げていき（昇温速度１００℃／分）、大きさ約０．０８〜０．１ｍｍ程度の氷の単結晶が１つだけ残る状態にした。視野を０．１ｍｍ×０．１ｍｍとし（すなわち画面上に該単結晶を拡大表示させ）、この状態からゆっくりと再冷却（冷却速度１℃／分）し、氷の結晶の成長を観察した。単結晶が１つだけ残ったときの温度（融点）と、氷の結晶の成長が観察されたときの温度（凝固点）の差（熱ヒステリシス）を求めた。また上記操作によって成長させた氷の形態も観察した。結果を表１及び図３〜図６の位相差顕微鏡写真に示す。図３はポリアクリル酸アンモニウム水溶液中の氷晶を、図４は剤を一切添加しない場合の氷晶を、図５はポリアクリル酸水溶液中の氷晶を、図６はポリアクリル酸ナトリウム水溶液中の氷晶を、図７はポリエチレンイミン水溶液中の氷晶を示す。

表１及び図３〜図６から明らかなように、ポリアクリル酸アンモニウムは、酸型であるポリアクリル酸やポリアクリル酸ナトリウムと異なり、氷晶形態を変化させて、しかも熱ヒステリシスを示した。
また表１及び図７から、主鎖にアミノ基を有するポリエチレンイミンは氷晶形態を変化させることもなく、かつ熱ヒステリシスも小さいことが分かる。
図３では非扁平円盤形、図４〜図７では扁平円盤形であることが分かる。

特願２００３−３６２４２７号の実施例のデータによると、ポリアクリルアミドの熱ヒステリシスは０．０２１℃であり、本発明のポリアクリル酸アンモニウムの方が大きな熱ヒステリシスを有しているので、氷結晶成長抑制剤として優れていることが分かる。

図１は不凍活性を示さない物質の水溶液から析出する氷晶を説明するための 概念図である。 図２−ａは不凍活性を示す物質の水溶液から析出する氷晶を説明するた めの第１の概念図である。 図２−ｂは不凍活性を示す物質の水溶液から析出する氷晶を説明するた めの第２の概念図である。 図３はポリアクリル酸アンモニウム水溶液中の氷晶を示す顕微鏡写真図である。 図４は剤が一切添加されていない場合の氷晶を示す顕微鏡写真図である。 図５はポリアクリル酸水溶液中の氷晶を示す顕微鏡写真図である。 図６はポリアクリル酸ナトリウム水溶液中の氷晶を示す顕微鏡写真図である。 図７はポリエチレンイミン水溶液中の氷晶を示す顕微鏡写真図である。

符号の説明

１…扁平円盤状氷晶
２…六方晶状氷晶
３…バイピラミッド型氷晶

Claims (3)

1. 濃度１０ｍｇ／ｍｌの水溶液が０．０２０℃以上の熱ヒステリシスを示す重量平均分子量３，０００〜５００，０００のポリアクリル酸アンモニウム塩を含んでなる氷結晶成長抑制剤。
2. 請求項１の氷結晶成長抑制剤を用いた冷熱輸送用組成物。
3. 請求項２の冷熱輸送用組成物を用いた冷熱輸送方法。

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