JP4873437B2

JP4873437B2 - Analysis method of melatonin

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Publication number: JP4873437B2
Application number: JP2001102847A
Authority: JP
Inventors: 潔財津; 健司濱瀬; 辰之介冨田
Original assignee: Kyushu University NUC
Current assignee: Kyushu University NUC
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2001-04-02
Publication date: 2012-02-08
Anticipated expiration: 2021-04-02
Also published as: JP2002234872A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、メラトニンオキサイドが発する強い蛍光を利用したメラトニンの分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
急速に都市化、情報化の進んだ現代社会は２４時間化しており、人々のライフスタイルの多様化と共に睡眠覚醒症候群を含む生体リズム障害が急増している。これらの疾患は成人の社会生活を困難とし、幼児期、高齢者においては生活支援者の生活にも重大な問題を生じる。
【０００３】
また、このリズム障害は投与薬物の副作用の減弱と薬効の増強を目的とする時間治療、すなわち薬物投与のタイミングを最適化する治療の導入を困難とし、様々な疾患において治療法に制限を与える。
【０００４】
更にまた、例えば、未熟児や新生児の医療現場におけるような微量の試料しか採取できない場合において、生体成分や薬物などの微量分析が要請されるときには、蛍光分析法が広く利用されている。特に誘導体化試薬を用いる蛍光誘導体化法はそれ自体吸収や蛍光を持たない様々な分析対象に対して高感度かつ選択的な分析を可能にする極めて有効な手段であるといえる。
【０００５】
また、これまで蛍光標識を目的としてＤＮＳ−Ｃｌ、ＮＢＤ−Ｆなどの数多くの優れた試薬が開発されているけれども、これらの蛍光標識試薬にしても、安定性、感度、溶解性などにおいて問題を有するものも少なくない。例えば、ＤＮＳ誘導体は感度が不足するという欠点が、またＮＢＤ誘導体は光で分解されるという問題を有している。更に、当然のことながら、それらの蛍光標識試薬を用いた分析法や分析装置も問題を有する結果になっている。
【０００６】
上記したようなリズム障害の著効薬として、また生体リズムのマーカーとして最近注目されているのが、松果体から血液中に分泌されるホルモンであるメラトニンがあり、血中メラトニン濃度のモニターは重要である。
【０００７】
メラトニンは松果体においてＬ−トリプトファンからセロトニン、Ｎ−アセチルセロトニンを経て生合成されるインドールホルモンであり、夜間に生合成、分泌が亢進するという顕著な概日リズムを示すことが知られている。
【０００８】
メラトニンの分析方法としては、例えば、メラトニン自身の持つ蛍光を測定してメラトニンの量を求める自然蛍光法や、放射線ラベル体を使用してメラトニンの量を求めるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が知られている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、哺乳類における内因性メラトニン含量は極微量であり、上述した従来の分析法ではメラトニンなどのインド−ル誘導体の血中濃度を測定するためには数ミリリットルの血液が必要であった。これは注射による静脈採血が必要な血液量であり、被験者に多大な負担を与えることから、特に頻繁に採血が必要な概日リズム測定などは非常に困難であった。
【００１０】
また、ＲＩＡはラジオアイソトープを使用しなければならないので、取り扱いが危険であり、特別の施設が必要である。
【００１１】
また、この発明は、特に蛍光性を有するインド−ルオキサイド誘導体を提供することを主な目的とする。更に、この発明は、強い蛍光性を有し、蛍光標識試薬の母核となり得るインド−ルオキサイド誘導体の製造方法を提供することを別の目的とする。
【００１２】
この発明はできるだけ微量の採血でメラトニンなどのインド−ルオキサイド誘導体の量を分析・測定できるようにした高感度なインド−ルオキサイド誘導体の分析方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、一般式（Ｉ）：
【００１４】
【化６】

【００１５】
（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ水素原子、炭素原子数が１ないし６の低級アルキルオキシ基またはハロゲン原子を意味し、Ｒ_５は水素原子またはアルデヒド基を意味し、Ｒ_６は水素原子を意味し、Ｒ_７は水素原子またはアシルアミノ−オキソアルキレン基を意味する。ただし、Ｒ_５が水素原子を意味するときは、Ｒ_７は水素原子またはアシルアミノ−オキソアルキレン基を意味し、Ｒ_５がアルデヒド基を意味するときは、Ｒ_７は水素原子を意味する）で示されるインド−ルオキサイド誘導体を提供する。
【００１６】
また、この発明に係るインド−ルオキサイド誘導体は、その好ましい１態様として、一般式（Ｉ）において、Ｒ_２が炭素原子数が１ないし６の低級アルキルオキシ基を意味することを特徴とする。更に好ましい１態様として、一般式（Ｉ）において、Ｒ_２がメチルオキシ基を意味することを特徴とするインド−ルオキサイド誘導体が提供される。
【００１７】
更に、この発明に係るインド−ルオキサイド誘導体は、その好ましい１態様として、一般式（Ｉ）において、Ｒ_５が水素原子を意味し、Ｒ_７がアセトアミノメチルカルボニル基を意味することを特徴とする。また、別の好ましい１態様として、一般式（Ｉ）において、Ｒ_５がアルデヒド基を意味し、Ｒ_７が水素原子を意味することを特徴とするが提供される。
【００１８】
更にまた、この発明は、反応式：
【００１９】
【化７】

【００２０】
に示すように、一般式（ＩＩ）：
【００２１】
【化８】

【００２２】
（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ水素原子、低級アルキルオキシ基またはハロゲン原子を意味し、Ｒ’_５は水素原子を意味し、Ｒ_６は水素原子を意味し、Ｒ’_７はカルボン酸残基またはアシルアミノアルキレン基を意味する。）で示されるインド−ル誘導体を酸化して、上記一般式（Ｉ）で示されるインド−ルオキサイド誘導体を得ることを特徴とするインド−ルオキサイド誘導体の製造方法を提供する。
【００２３】
この発明に係るインド−ル誘導体の分析方法は、一般式（ＩＩ）で示されるインド−ル誘導体を酸化させて一般式（Ｉ）で示されるインド−ルオキサイド誘導体を得る酸化工程と、該酸化工程で得られたインド−ルオキサイド誘導体の蛍光強度を測定してインド−ル誘導体の量を求める測定工程とを備えたことを特徴とするものである。
【００２４】
また、この発明で使用する分析装置は、一般式（ＩＩ）で示されるインド−ル誘導体を酸化させて一般式（Ｉ）で示されるインド−ルオキサイド誘導体を得る酸化部と、このインド−ルオキサイド誘導体の蛍光強度を測定してインド−ル誘導体の量を求めるインド−ル誘導体測定部とを備えたことを特徴とするものである。
【００２５】
【発明の実施の形態】
この発明に係るインド−ルオキサイド誘導体は、一般式（Ｉ）：
【００２６】
【化９】

【００２７】
（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ水素原子、炭素原子数が１ないし６個の低級アルキルオキシ基またはハロゲン原子を意味し、Ｒ_５は水素原子またはアルデヒド基を意味し、Ｒ_６は水素原子を意味し、Ｒ_７は水素原子またはアシルアミノ−オキソアルキレン基を意味する。ただし、Ｒ_５が水素原子を意味するときは、Ｒ_７はアシルアミノ−オキソアルキレン基を意味し、Ｒ_５がアルデヒド基を意味するときは、Ｒ_７は水素原子を意味する。）で示される。
【００２８】
上記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４において示される炭素原子数が１ないし６個の低級アルキルオキシ基の低級アルキルは、炭素原子数が１ないし６個の１価直鎖状もしくは分岐状飽和脂肪族炭化水素基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｉ−プロピル基、ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ヘキシル基などが挙げられる。また、ハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子、フッ素原子などが挙げられる。
【００２９】
また、上記一般式（ＩＩ）において、Ｒ'_７で示されるカルボン酸残基は、炭素原子数が２ないし７のカルボン酸のアルキル分子から１個の水素原子が脱離して得られた残基を意味し、例えば、カルボキシルメチル基、カルボキシルエチル基、カルボキシルプロピル基などが挙げられる。
【００３０】
また、Ｒ'_７で示されるカルボン酸残基は、アシルアミノアルキレン基のアシルは、炭素原子数が２ないし７の脂肪酸残基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどが挙げられる。更にまた、アシルアミノアルキレン基のアルキレンは、炭素原子数が２ないし６の２価飽和脂肪族炭化水素基を意味し、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレンなどが挙げられる。
【００３１】
更に、上記一般式（Ｉ）において、Ｒ_７で示されるアシルアミノ−オキソアルキレン基は、上記アシルアミノアルキレン基におけるアルキレンにオキソ基か置換基として存在する基を意味し、そのオキソアルキレンとしては、例えば、オキソエチレン、オキソプロピレン、オキソブチレンなどが挙げられる。
【００３２】
この発明に係るインド−ルオキサイド誘導体は、強い蛍光を有すると共に、光や熱に対しても安定であることから、優れた蛍光母核となることができる。
【００３３】
この発明に係る上記一般式（Ｉ）で示されるインド−ルオキサイド誘導体は、反応式：
【００３４】
【化１０】

【００３５】
に示すように、一般式（ＩＩ）：
【００３６】
【化１１】

【００３７】
（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ水素原子、低級アルキルオキシ基またはハロゲン原子を意味し、Ｒ’_５は水素原子を意味し、Ｒ_６は水素原子を意味し、Ｒ’_７はカルボン酸残基またはアシルアミノアルキレン基を意味する。）で示されるインド−ル誘導体を酸化することによって得ることができる。
【００３８】
この発明における酸化反応は、酸化剤を使用して常法に従って行うことができる。使用する酸化剤としては、インド−ル骨格の３位の置換基であるアシルアミノアルキレン基のアルキレン分子にオキソ基を導入することができる酸化剤、またはインド−ル骨格の１位のアミノ基にアルデヒド基を付加するとともに、その３位の置換基であるカルボン酸残基を脱離することができる酸化剤であればいずれでも使用することができるが、特に好ましい酸化剤としては過酸化水素が挙げられる。また、この発明における酸化反応は、水、炭酸ナトリウムなどの無機溶媒中において、加熱下で行うのが好ましいが、これらに何ら限定されるものではなく、適宜条件は変更することができる。
【００３９】
この発明に係るインド−ル誘導体の分析方法は、上記反応式において、一般式（ＩＩ）で示されるインド−ル誘導体を酸化させて、一般式（Ｉ）で示されるインド−ルオキサイド誘導体を得る酸化工程と、該酸化工程で得られたインド−ルオキサイド誘導体の蛍光強度を測定してインド−ル誘導体の量を求める測定工程とを備えたことを特徴とするものである。
【００４０】
この発明に係るインド−ル誘導体の分析方法において、前記インド−ル誘導体の酸化は、Ｒ’_７で示されるアシルアミノアルキレン基の側鎖アルキレンのみを酸化する条件下またはインド−ル骨格１位のアミノ基にアルデヒド基を置換すると同時に、その３位のカルボン酸残基を脱離する条件下おいて行わせるのが好ましい。また、前記インド−ル誘導体の酸化はアルカリ性下、特にｐＨ１０〜１２で行わせるのが好ましい。
【００４１】
また、インド−ル誘導体の酸化は、例えばＨ_２Ｏ_２とＮａ_２ＣＯ_３からなる酸化剤を用いて行うことができるが、これら以外の酸化剤を用いて行ってもよい。
【００４２】
また、前記酸化工程と前記測定工程の間に、前記インド−ルオキサイド誘導体を有機溶媒で抽出する抽出工程を設けてもよい。この場合、抽出工程を加えることによりインド−ル誘導体の定量における再現性が低下するおそれがあるので、内標準物質を加えて分析するのが好ましい。
【００４３】
内標準物質としては、酸化によって蛍光誘導体化されてクロマトグラム上で良好なピークを与える物質、例えば５−メトキシインドール−３−酢酸（ＭＩＡＡ）を使用することができる。
【００４４】
また、この発明で使用する分析装置は、上記反応式において、一般式（ＩＩ）で示されるインド−ル誘導体を酸化させて一般式（Ｉ）で示されるインド−ルオキサイド誘導体を得る酸化部と、このインド−ルオキサイド誘導体の蛍光強度を測定してインド−ル誘導体の量を求めるインド−ル誘導体測定部とを備えたことを特徴とするものである。
【００４５】
ここで、前記酸化部は側鎖アルキレンのみを酸化する条件下においてインド−ル誘導体を酸化させる装置であることが好ましい。また、前記酸化部は前記インド−ル誘導体をアルカリ性下において酸化させる装置であることが好ましい。アルカリ性下としてはｐＨ１０〜１２が、側鎖メチレンのみを酸化できるので、なお好ましい。
【００４６】
また、インド−ル誘導体の酸化は、例えばＨ_２Ｏ_２とＮａ_２ＣＯ_３からなる酸化剤を用いて行うことができるが、これら以外の酸化剤を用いて行ってもよい。
【００４７】
また、前記酸化部で得られたものからインド−ルオキサイド誘導体を有機溶媒で抽出し、これを前記測定部に供給する抽出部を設けてもよい。この場合、抽出部を設けることによりインド−ル誘導体定量における再現性が低下するおそれがあるので、内標準物質を加えて分析するのが好ましい。
【００４８】
内標準物質としては、インド−ル誘導体と同様にインドール骨格を持ち、酸化によって蛍光誘導体化されてクロマトグラム上で良好なピークを与える物質、例えばＭＩＡＡを使用することができる。
【００４９】
前記インド−ル誘導体測定部にはミクロＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を使用し、高感度化して分析することが好ましい。
【００５０】
【実施例】
（実施例１）
メラトニンオキサイド（ＭＥＬｏｘｉｄｅ）の合成法
【００５１】
【化１２】

【００５２】
メラトニン（ＭＥＬ）５００ｍｇと炭酸ナトリウム１ｇを水５０ｍｌに溶解し、８０℃加熱下、３Ｍ過酸化水素水１２０ｍｌを添加して１０時間酸化反応を行った。反応の進行は、反応液の蛍光スペクトルを測定することによって追跡した。図１に、反応０時間（Ａ）、６時間後（Ｂ）および１０時間後（Ｃ）におけるスペクトルを示している。また図１の各図において、点線は２８０ｎｍで励起したときのスペクトルを示しており、主として３５０ｎｍに蛍光を示す原料であるメラトニンを示している。一方、実線は２４５ｎｍで励起したスペクトルであり、生成物であるメラトニンオキサイドを示している。このように時間の経過とともにメラトニンが減少し、３７４ｎｍに蛍光を示すメラトニンオキサイドが増加していることが示されている。反応終了後、反応液を酢酸エチルで洗浄し、水層を凍結乾燥した。
【００５３】
得られたメラトニンオキサイドの物理的性質は次の通りであった。

^１Ｈ−ＮＭＲ／重メタ（Ｈ１：１．９５ｐｐｍ；Ｈ２：見えない；Ｈ３：４．３０ｐｐｍ；Ｈ４：７．９４ｐｐｍ；Ｈ５：見えない；Ｈ６：７．５１ｐｐｍ；Ｈ７：７．３３ｐｐｍ；Ｈ８：３．９０ｐｐｍ；Ｈ９：７．６８ｐｐｍ）
【００５４】
（実施例２）
１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡｏｘｉｄｅ）の合成法
【００５５】
【化１３】

【００５６】
５−メトキシインドール−３−酢酸（ＭＩＡＡ）を、実施例１と同様にして酸化反応をなって１−ホルミル−５−メトキシインドールを得た。
【００５７】
得られた１−ホルミル−５−メトキシインドールの物理的性質は次の通りであった。
^１Ｈ−ＮＭＲ／重メタ（Ｈ１：見えない；Ｈ２：７．９０ｐｐｍ；Ｈ３：６．３０ｐｐｍ；Ｈ４：７．５０ｐｐｍ；Ｈ５：３．９０ｐｐｍ；Ｈ６：７．３５ｐｐｍ；Ｈ７：７．６５ｐｐｍ）
【００５８】
（実験例１）
メラトニンオキサイドの蛍光測定
メラトニンオキサイドを１０％メタノールに溶解して１０μＭの濃度の溶液にした。この溶液を用いてこの化合物の蛍光測定を行った。
【００５９】
なお、コントロールとして、メラトニンを同様にメタノールに溶解して１０μＭの濃度の溶液にした。この溶液を用いて蛍光測定を行った。
【００６０】
図２にメラトニンオキサイドについての励起・蛍光スペクトルを示した。図３にコントロールとしてのメラトニンについての励起・蛍光スペクトルを示した。図２および図３に示す励起・蛍光スペクトルから、メラトニンの励起極大波長は２８０ｎｍ、蛍光極大波長は３５０ｎｍであるのに対して、メラトニンオキサイドの励起極大波長は２４７ｎｍ、蛍光極大波長は３７８ｎｍとなり、ストークスシフトの増加が認められた。また蛍光強度は酸化反応によって増加し、メラトニンオキサイドはメラトニンの６．５倍の発光を示した。
【００６１】
（実験例２）
１−ホルミル−５−メトキシインドールの蛍光測定
実験例１と同様にして、１−ホルミル−５−メトキシインドールを１０％メタノールに溶解して１０μＭの濃度の溶液にした。この溶液を用いてこの化合物の蛍光測定を行った。
【００６２】
なお、コントロールとして、５−メトキシインドール−３−酢酸をメタノールに溶解して１０μＭの濃度の溶液にした。この溶液を用いて蛍光測定を行った。
【００６３】
図４に１−ホルミル−５−メトキシインドールについての励起・蛍光スペクトルを示した。図５にコントロールとしての５−メトキシインドール−３−酢酸についての励起・蛍光スペクトルを示した。図４および図５に示すように、５−メトキシインドール−３−酢酸においてもメラトニンと同様に波長シフトが認められ、５−メトキシインドール−３−酢酸の励起極大波長は２７９ｎｍ、蛍光極大波長は３５１ｎｍであるのに対して、１−ホルミル−５−メトキシインドールの励起極大波長は２４３ｎｍ、蛍光極大波長は３７４ｎｍとなり、ストークスシフトの増加が認められた。また１−ホルミル−５−メトキシインドールも強い蛍光を示し、その蛍光強度は５−メトキシインドール−３−酢酸の６．３倍であった。
【００６４】
（比較実験例１、２）
メラトニンオキサイドおよび１−ホルミル−５−メトキシインドールの蛍光特性と比較するために、市販の蛍光標識試薬のうち現在アミノ酸などの分析に広く用いられているＮＢＤ−ＦならびにＤｎｓ−Ｃｌを用いてアミノ酸を誘導体化して生成した蛍光誘導体の励起・蛍光スペクトルを測定した。ＮＢＤ−Ｆを用いた場合の蛍光誘導体（ＮＢＤ−Ａｌａ）の励起・蛍光スペクトルを図６に示し、Ｄｎｓ−Ｃｌを用いた場合の蛍光誘導体（Ｄｎｓ−Ａｌａ）の励起・蛍光スペクトルを図７に示した。
【００６５】
図６の結果から、蛍光誘導体（ＮＢＤ−Ａｌａ）の励起極大波長は４７２ｎｍ、蛍光極大波長は５３６ｎｍであることが、図７の結果から、蛍光誘導体（Ｄｎｓ−Ａｌａ）の励起極大波長は３２８ｎｍ、蛍光極大波長は５４２ｎｍであることが判明した。またそれぞれの蛍光強度は２３．６４ならびに９．１７３であった。
【００６６】
上記実験例ならびに比較実験例に使用した化合物についての励起・蛍光極大波長、蛍光強度ならびにＳ／Ｎ比を表１に示した。表１に示した結果から明らかなように、メラトニンオキサイドの蛍光強度は、ＮＢＤ−Ａｌａの８０倍、Ｄｎｓ−Ａｌａの２００倍であり、１−ホルミル−５−メトキシインドールの蛍光強度もＮＢＤ−Ａｌａの７０倍、Ｄｎｓ−Ａｌａの１８０倍であることが判明した。
【００６７】
なおＳ／Ｎ比は、各化合物の蛍光強度とそれぞれの測定波長における測定溶媒の蛍光強度の比を表したものであって、ＨＰＬＣで測定する際の感度の指標となると考えられる。ＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａにおいては、それぞれの蛍光特性は低かったが、これらはノイズレベルも低かったためにＳ／Ｎ比はそれぞれ高い値を示した。しかし、メラトニンオキサイドならびに１−ホルミル−５−メトキシインドールはＳ／Ｎ比についてもより高い値を示した。したがって、この発明に係るインドールオキサイド誘導体は高感度分析に使用できる。
【００６８】
【表１】

【００６９】
（実験例３）
メラトニンオキサイドと１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡｏｘｉｄｅ）との安定性
メラトニンオキサイドならびにと１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡｏｘｉｄｅ）との安定性を測定するために、これらの化合物を２０％アセトニトリル水溶液に溶解し、採光下において２５℃で所定時間放置して、それぞれの残存率を逆相ＨＰＬＣによって測定した。分離カラムにはＯＤＳ−１２０ＴＳＱＡ(4.6 mm i.d. x 150 mm)を用い、移動相は０．０１％ＴＦＡを含む２０％アセトニトリル水溶液（ＣＨ_３ＣＮ／ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ＝２０／０．０１／８０(v/v)）を１ｍｌ／ｍｉｎの割合で４０℃で送液した。検出は２１０ｎｍの紫外吸収で行った。その結果を図８に示す。図８において、（Ａ）は各化合物の混合物を調製した直後、（Ｂ）はその混合物を１日放置した後、（Ｃ）はその混合物を３日放置した後の結果を示している。
【００７０】
（実験例４）
ＮＢＤ−ＡｌａとＤｎｓ−Ａｌとの安定性
ＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａを、採光下において２５℃で所定時間放置した以外は実験例３と同様にしてそれぞれの安定性を測定した。測定結果を図９に示す。図９において、（Ａ）は各化合物の混合物を調製した直後、（Ｂ）はその混合物を１日放置した後、（Ｃ）はその混合物を３日放置した後の結果を示している。
【００７１】
（実験例５）
メラトニンオキサイド、１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡｏｘｉｄｅ）ならびにＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａの安定性
メラトニンオキサイド、１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡｏｘｉｄｅ）ならびにＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａを、採光下において４℃、２５℃、６０℃で所定時間それぞれ放置した以外は実験例３と同様にしてそれぞれの安定性を測定した。測定結果を図１０に示す。図１０において、（Ａ）は各化合物の混合物を４℃で放置した後、（Ｂ）はその混合物を２５℃で放置した後、（Ｃ）はその混合物を６０℃で放置した後の結果を示している。図示する結果から、ＮＢＤ−Ａｌａはいずれの温度においても採光下６時間で完全に分解した。これに対して、メラトニンオキサイド、１−ホルミル−５−メトキシインドールおよびＤｎｓ−Ａｌａは、ほとんど分解されなかった。
【００７２】
（実験例６）
メラトニンオキサイド、１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡｏｘｉｄｅ）ならびにＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａの安定性
メラトニンオキサイド、１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡｏｘｉｄｅ）ならびにＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａを、遮光下で放置する以外は実験例５と同様にしてそれぞれの安定性を測定した。その測定結果を図１１に示す。図１１において、（Ａ）は各化合物の混合物を４℃で放置した後、（Ｂ）はその混合物を２５℃で放置した後、（Ｃ）はその混合物を６０℃で放置した後の結果を示している。図示するように、遮光下では４℃、２５℃においては、各化合物ともほとんど分解されずほぼ１００％の残存率を示したが、６０℃で加熱して３日間放置した場合には、ＮＢＤ−Ａｌａの残存率はほぼ５０％になった。これに対して、メラトニンオキサイド、１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡｏｘｉｄｅ）およびＤｎｓ−Ａｌａはいずれの条件下においてもほぼ１００％の残存率を示した。
【００７３】
これらの結果からして、メラトニンオキサイドは光ならびに熱に対して著しく安定であるのに対して、市販されているＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａは光ならびに熱に対して不安定であるといえる。
【００７４】
（実施例３）
図１２に示す工程図に従って、実施例３を説明する。
メラトニン標品の水溶液１００μｌに３００ｍＭのＮａ_２Ｃｏ_３水溶液１０μｌと１０ｍＭのＨ_２Ｏ_２水溶液１０μｌを加え、９０℃で３０分間誘導化（酸化）反応を行った。
【００７５】
この反応液２０μｌを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、励起波長２４５ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出した結果、図１３のクロマトグラムが得られた。クロマトグラム中でmelatoninと表記したピークがメラトニンオキサイドである。
【００７６】
（比較例１）
一方、比較のために、酸化処理をしないメラトニン（５０ｆｍｏｌ）について、上記実施例３と同様に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にてメラトニンを分析したところ、図２０のクロマトグラムが得られた。
【００７７】
図１３と図２０のメラトニンの強度を比較してみると、この実施例３による強度は比較例１による強度の１０倍になっていることがわかる。
【００７８】
（実施例４）
図１４に示す工程図に従って、実施例４を説明する。
まず、Wistar系雄性ラット（６週齢、ＳＰＦ）から松果体を１個摘出し、これを氷冷したメタノール（５００μｌ）と共にミクロホモジナイザーですりつぶし、得られたホモジネートを遠心分離器にかけ、遠心力４５００Ｇ、５分で分離し、上澄み液（上清）をマイクロピペットで採取した。
【００７９】
次に、遠心分離した上清をマイクロピペットで採取し、これをミクロガラスチューブ内に入れ、１００℃で乾固させた。
【００８０】
次に、この残渣に水４０μｌ加えて良く撹拌した後、２ＭのＮａ_２ＣＯ_３水溶液を５μｌ、５０ｍＭのＨ_２Ｏ_２水を５μｌ加え、１００℃で３０分間誘導化（酸化）反応を行なわせた。
【００８１】
この誘導体化反応で得られた反応溶液の一部を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、励起波長２４５ｎｍの光を照射し、蛍光波長３８０ｎｍの光の強度を測定したところ、図１５のクロマトグラムのようになった。このクロマトグラム中、矢印で示したピークがメラトニンである。
【００８２】
次に、この反応溶液に水で飽和させた酢酸エチル２５０μｌを加え、メラトニン誘導体の抽出を行った。この抽出操作は３回繰り返し、上層を合わせて蒸発乾固した。
【００８３】
次に、この残渣に１０％ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏを４０μｌ加えて良く撹拌し、その２０μｌを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、励起波長２４５ｎｍの光を照射し、蛍光波長３８０ｎｍの光の強度を測定したところ、図１６のクロマトグラムが得られた。このクロマトグラム中、矢印で示したピークがメラトニンである。
【００８４】
図１５と図１６のクロマトグラムを比較してみると、抽出操作により抽出前に存在した様々な夾雑成分が除去され、メラトニンの選択的分析が可能になっていることがわかる。
【００８５】
（実施例５）
図１７に示す工程図に従って、実施例５を説明する。
実施例４と同様に、まず、Wistar系雄性ラット（６週齢、ＳＰＦ）の松果体を１個摘出し、これを氷冷したメタノール（５００μｌ）と共にミクロホモジナイザーですりつぶし、得られたホモジネートを遠心分離器にかけ、遠心力４５００Ｇ、５分で分離し、上清をマイクロピペットで採取した。
【００８６】
次に、遠心分離した上清に５ｎＭのＭＩＡＡ（５−メトキシインドール−３−酢酸）／ＭｅＯＨ溶液を５０μｌ加え、マイクロガラスチューブ内に入れ、１００℃で乾固させた。
【００８７】
次に、この残渣に水４０μｌ加えて良く撹拌した後、２ＭのＮａ_２ＣＯ_３水溶液を５μｌ、５０ｍＭのＨ_２Ｏ_２水を５μｌ加え、１００℃で３０分間誘導化（酸化）反応を行なわせた。
【００８８】
次に、この反応溶液に水で飽和させた酢酸エチル２５０μｌを加え、メラトニン誘導体の抽出を行った。この抽出操作は３回繰り返し、上層を合わせて蒸発乾固させた。
【００８９】
次に、この残渣に１０％ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏを４０μｌ加えて良く撹拌し、その２０μｌを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、励起波長２４５ｎｍの光を照射し、蛍光波長３８０ｎｍの光の強度を測定したところ、図１８のクロマトグラムのようになった。このクロマトグラム中、矢印で示したピークがメラトニンである。
【００９０】
また、遠心分離したものの上澄み液であって、ＭＩＡＡを添加しないものを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、励起波長２４５ｎｍの光を照射し、蛍光波長３８０ｎｍの光の強度を測定したところ、図１９のクロマトグラムのようになった。このクロマトグラム中、矢印で示したピークがメラトニンである。
【００９１】
図１８のクロマトグラムと図１９のクロマトグラムを対比してみると、ＭＩＡＡ誘導体の保持時間付近に妨害ピークは存在せず、ＭＩＡＡ誘導体はクロマトグラム上で良好に定量可能であることがわかる。
【００９２】
（実施例６）
図２１、図２２に示す実施例６について説明ずる。
図２１は１ｆｍｏｌのメラトニンを酸化させ、通常の逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析したものである。図２２は同じく１ｆｍｏｌのメラトニンを酸化させ、ミクロＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析したものである。共にメラトニンピークは矢印で示した。図２１と図２２を比較すると、ミクロＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）の導入によって検出感度が１０倍以上向上していることが分かる。従って前記酸化工程とミクロＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）の導入によって従来法と比較し、１００倍以上高感度なメラトニン分析が可能である。
【００９３】
【発明の効果】
この発明に係るインド−ルオキサイド誘導体は、強い蛍光を有すると共に、光ならびに熱にも安定であるなどという優れた特性を有している。
【００９４】
また、この発明にかかる分析方法は、メラトニンなどのインド−ル誘導体を酸化させて、インド−ルオキサイド誘導体として、このメラトニンオキサイドなどのインド−ルオキサイド誘導体の蛍光強度を測定するので、メラトニンなどのインド−ル誘導体の微量測定が可能になるという効果がある。
【００９５】
従って、この発明によれば、血中メラトニン定量が数十ミリリットルと極めて微量の血液で可能となり、指尖からの非疼痛性採血法が適用可能になり、被験者の負担を極めて軽減し、個人レベルでのメラトニン日内リズム解析などが可能になり、生体リズム障害時における詳細なメラトニンリズム計測が可能となり、リズム障害時における原因究明と従来経験的に行われてきたメラトニン治療に科学的指針を与え、効果的な投薬設計が可能になるという効果がある。
【００９６】
また、この発明によれば、夾雑物を含む実際のヒト血液について夾雑物の影響を受けず、メラトニンなどの濃度を正確に定量分析することができるという効果がある。
【００９７】
また、この発明によれば、メラトニン血中濃度を生体リズムのマーカーとして様々な疾病における時間治療の導入が可能となるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】メラトニンオキサイドの蛍光強度を示し、（Ａ）は反応時間０時間、（Ｂ）は反応時間６時間後、（Ｃ）は反応時間１２時間後の蛍光強度を示す。
【図２】メラトニンオキサイドの励起・蛍光極大波長を示す。
【図３】メラトニンの励起・蛍光極大波長を示す。
【図４】１−ホルミル−５−メトキシインドールの励起・蛍光極大波長を示す。
【図５】５−メトキシインドール−３−酢酸の励起・蛍光極大波長を示す。
【図６】ＮＢＤ−Ａｌａの励起・蛍光極大波長を示す。
【図７】Ｄｎｓ−Aｌaの励起・蛍光極大波長を示す。
【図８】メラトニンオキサイド、ＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Aｌaの混合物の残存率を示すクロマトグラム。
【図９】メラトニンオキサイド、ＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Aｌaの混合物の遮光下での残存率を示すクロマトグラム。
【図１０】メラトニンオキサイド、ＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Aｌaの混合物の採光下での分解率を示す。
【図１１】メラトニンオキサイド、ＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Aｌaの混合物の遮光下での分解率を示す。
【図１２】実施例３の操作を示す工程図である。
【図１３】実施例３の操作で処理された反応液のクロマトグラムである。
【図１４】実施例４の操作を示す工程図である。
【図１５】実施例４の操作において溶媒抽出される前の液のクロマトグラムである。
【図１６】実施例４の操作で処理された抽出液のクロマトグラムである。
【図１７】実施例５の操作を示す工程図である。
【図１８】実施例５の操作で処理された抽出液のクロマトグラムである。
【図１９】実施例５の操作でＭＩＡＡを添加しなかった抽出液のクロマトグラムである。
【図２０】比較例１の操作で酸化せずに分析したメラトニン標品のクロマトグラムである。
【図２１】メラトニンオキサイドを通常の逆相ＨＰＬＣで分析したクロマトグラムである。
【図２２】メラトニンオキサイドをミクロＨＰＬＣで分析したクロマトグラムである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
This invention Melatonin oxide Using strong fluorescence emitted by Melatonin of Analysis method Is.
[0002]
[Prior art]
Rapidly urbanized and information-oriented modern society has become 24 hours, and with the diversification of people's lifestyle, biological rhythm disorders including sleep-wake syndrome are rapidly increasing. These diseases make adult social life difficult, and cause serious problems in the lives of life supporters in early childhood and the elderly.
[0003]
In addition, this rhythm disorder makes it difficult to introduce a time treatment aiming at reducing the side effects and enhancing the efficacy of the administered drug, that is, a treatment that optimizes the timing of drug administration, and restricts the treatment method in various diseases.
[0004]
Furthermore, for example, in the case where only a very small amount of sample can be collected in the medical field of premature babies and newborns, a fluorescence analysis method is widely used when a trace amount analysis of biological components and drugs is required. In particular, the fluorescence derivatization method using a derivatization reagent can be said to be an extremely effective means that enables highly sensitive and selective analysis with respect to various analytes that themselves do not have absorption or fluorescence.
[0005]
In addition, many excellent reagents such as DNS-Cl and NBD-F have been developed for the purpose of fluorescent labeling. However, these fluorescent labeling reagents have problems in stability, sensitivity, solubility, and the like. Many have. For example, a DNS derivative has a drawback that sensitivity is insufficient, and an NBD derivative has a problem that it is decomposed by light. Furthermore, as a matter of course, analysis methods and analyzers using these fluorescent labeling reagents also have problems.
[0006]
Recently, melatonin, a hormone secreted in the blood from the pineal gland, has been attracting attention as a potent drug for rhythm disorders as described above, and as a marker for biological rhythms. is important.
[0007]
Melatonin is an indole hormone biosynthesized from L-tryptophan via serotonin and N-acetyl serotonin in the pineal gland, and is known to exhibit a remarkable circadian rhythm that biosynthesis and secretion increase at night. .
[0008]
As a method for analyzing melatonin, for example, a natural fluorescence method for determining the amount of melatonin by measuring the fluorescence of melatonin itself, and a radioimmunoassay (RIA) for determining the amount of melatonin using a radiolabeled body are known. .
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
By the way, the endogenous melatonin content in mammals is extremely small, and the conventional analysis method described above requires several milliliters of blood in order to measure the blood concentration of indole derivatives such as melatonin. This is a blood volume that requires intravenous blood collection by injection and places a great burden on the subject. Therefore, it is very difficult to measure circadian rhythms that require blood sampling frequently.
[0010]
In addition, since RIA must use radioisotopes, handling is dangerous and special facilities are required.
[0011]
In addition, the main object of the present invention is to provide an indo-oxide derivative having particularly fluorescence. Furthermore, another object of the present invention is to provide a method for producing an indole oxide derivative which has strong fluorescence and can serve as a mother nucleus of a fluorescent labeling reagent.
[0012]
This invention is a highly sensitive indole oxide derivative that can analyze and measure the amount of indole oxide derivative such as melatonin by collecting as little blood as possible. Aim to provide analytical methods .
[0013]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present invention provides a general formula (I):
[0014]
[Chemical 6]

[0015]
(Wherein R ₁ , R ₂ , R ₃ And R ₄ Each represents a hydrogen atom, a lower alkyloxy group having 1 to 6 carbon atoms or a halogen atom; ₅ Means a hydrogen atom or an aldehyde group, R ₆ Means hydrogen atom, R ₇ Means a hydrogen atom or an acylamino-oxoalkylene group. However, R ₅ Is a hydrogen atom, R ₇ Means a hydrogen atom or an acylamino-oxoalkylene group, R ₅ R represents an aldehyde group, R ₇ Represents a hydrogen atom).
[0016]
In addition, the indo-oxide derivative according to the present invention has, as one preferred embodiment thereof, in general formula (I), R ₂ Means a lower alkyloxy group having 1 to 6 carbon atoms. As a more preferred embodiment, in the general formula (I), R ₂ An indoleoxide derivative is provided, characterized in that denotes a methyloxy group.
[0017]
Furthermore, the indo-oxide derivative according to the present invention has, as a preferred embodiment, R in the general formula (I) ₅ Means a hydrogen atom, R ₇ Means an acetaminomethylcarbonyl group. As another preferred embodiment, in the general formula (I), R ₅ Means an aldehyde group and R ₇ Is characterized by meaning a hydrogen atom.
[0018]
Furthermore, the present invention provides a reaction formula:
[0019]
[Chemical 7]

[0020]
As shown in general formula (II):
[0021]
[Chemical 8]

[0022]
(Wherein R ₁ , R ₂ , R ₃ And R ₄ Each represents a hydrogen atom, a lower alkyloxy group or a halogen atom, and R ′ ₅ Means hydrogen atom, R ₆ Means hydrogen atom, R ' ₇ Means a carboxylic acid residue or an acylaminoalkylene group. The indole derivative represented by formula (I) is oxidized to obtain the indole oxide derivative represented by the above general formula (I).
[0023]
The method for analyzing an indole derivative according to the present invention comprises an oxidation step of oxidizing an indole derivative represented by the general formula (II) to obtain an indole oxide derivative represented by the general formula (I); And a measuring step for measuring the fluorescence intensity of the indole oxide derivative obtained in the step to determine the amount of the indole derivative.
[0024]
Also, this invention Analyzer used in Oxidizes the indole derivative represented by the general formula (II) to obtain the indole oxide derivative represented by the general formula (I), and the fluorescence intensity of the indole oxide derivative is measured. And an indole derivative measuring unit for determining the amount of the indole derivative.
[0025]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The indo-oxide derivatives according to the present invention have the general formula (I):
[0026]
[Chemical 9]

[0027]
(Wherein R ₁ , R ₂ , R ₃ And R ₄ Each represents a hydrogen atom, a lower alkyloxy group having 1 to 6 carbon atoms or a halogen atom; ₅ Means a hydrogen atom or an aldehyde group, R ₆ Means hydrogen atom, R ₇ Means a hydrogen atom or an acylamino-oxoalkylene group. However, R ₅ Is a hydrogen atom, R ₇ Means an acylamino-oxoalkylene group and R ₅ R represents an aldehyde group, R ₇ Means a hydrogen atom. ).
[0028]
In the general formulas (I) and (II), R ₁ , R ₂ , R ₃ And R ₄ The lower alkyl of the lower alkyloxy group having 1 to 6 carbon atoms in the formula means a monovalent linear or branched saturated aliphatic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, for example, Examples thereof include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an i-propyl group, a butyl group, an i-butyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, and a hexyl group. Examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and a fluorine atom.
[0029]
In the general formula (II), R ′ ₇ Means a residue obtained by elimination of one hydrogen atom from an alkyl molecule of a carboxylic acid having 2 to 7 carbon atoms, such as a carboxylmethyl group, a carboxylethyl group And carboxylpropyl group.
[0030]
R ' ₇ The acyl of the acylaminoalkylene group means a fatty acid residue having 2 to 7 carbon atoms, and examples thereof include acetyl, propionyl, butyryl and the like. Furthermore, the alkylene of the acylaminoalkylene group means a divalent saturated aliphatic hydrocarbon group having 2 to 6 carbon atoms, and examples thereof include ethylene, propylene, butylene and the like.
[0031]
Further, in the above general formula (I), R ₇ The acylamino-oxoalkylene group represented by represents an oxo group or a group present as a substituent in the alkylene in the acylaminoalkylene group. Examples of the oxoalkylene include oxoethylene, oxopropylene, oxobutylene and the like. It is done.
[0032]
The indo-oxide derivative according to the present invention has strong fluorescence and is stable against light and heat, and therefore can be an excellent fluorescent nucleus.
[0033]
The indo-loxide derivative represented by the general formula (I) according to the present invention has a reaction formula:
[0034]
[Chemical Formula 10]

[0035]
As shown in general formula (II):
[0036]
Embedded image

[0037]
(Wherein R ₁ , R ₂ , R ₃ And R ₄ Each represents a hydrogen atom, a lower alkyloxy group or a halogen atom, and R ′ ₅ Means hydrogen atom, R ₆ Means hydrogen atom, R ' ₇ Means a carboxylic acid residue or an acylaminoalkylene group. ) Can be obtained by oxidation.
[0038]
The oxidation reaction in this invention can be performed according to a conventional method using an oxidizing agent. As an oxidizing agent to be used, an oxidizing agent capable of introducing an oxo group into an alkylene molecule of an acylaminoalkylene group which is a substituent at the 3-position of the indole skeleton, or an amino group at the 1-position of the indole skeleton Any oxidant can be used as long as it adds an aldehyde group and can also remove the carboxylic acid residue that is a substituent at the 3-position, but hydrogen peroxide is a particularly preferred oxidant. Can be mentioned. In addition, the oxidation reaction in the present invention is preferably performed under heating in an inorganic solvent such as water and sodium carbonate, but is not limited to these, and the conditions can be changed as appropriate.
[0039]
In the method for analyzing an indole derivative according to the present invention, an indole derivative represented by the general formula (I) is obtained by oxidizing the indole derivative represented by the general formula (II) in the above reaction formula. It comprises an oxidation step and a measurement step for measuring the fluorescence intensity of the indole oxide derivative obtained in the oxidation step to determine the amount of the indole derivative.
[0040]
In the method for analyzing an indole derivative according to the present invention, the oxidation of the indole derivative may include R ′ ₇ Under the conditions of oxidizing only the side chain alkylene of the acylaminoalkylene group represented by the formula (1) or substituting the aldehyde group with the amino group at the 1-position of the indole skeleton and simultaneously removing the carboxylic acid residue at the 3-position. Preferably. The oxidation of the indole derivative is preferably carried out under alkaline conditions, particularly at pH 10-12.
[0041]
Further, the oxidation of indole derivatives is carried out by, for example, H ₂ O ₂ And Na ₂ CO ₃ Although it can carry out using the oxidizing agent which consists of, you may carry out using oxidizing agents other than these.
[0042]
Moreover, you may provide the extraction process which extracts the said indole oxide derivative with an organic solvent between the said oxidation process and the said measurement process. In this case, since the reproducibility in the determination of the indol derivative may be reduced by adding the extraction step, it is preferable to add the internal standard substance for analysis.
[0043]
As the internal standard substance, a substance that is fluorescently derivatized by oxidation and gives a good peak on the chromatogram, such as 5-methoxyindole-3-acetic acid (MIAA), can be used.
[0044]
Also, this invention Analyzer used in In the above reaction formula, an oxidation part that oxidizes an indoline derivative represented by the general formula (II) to obtain an indolpoxide derivative represented by the general formula (I), and the fluorescence of the indolpoxide derivative And an indole derivative measuring section for measuring the strength to determine the amount of the indole derivative.
[0045]
Here, it is preferable that the oxidation part is an apparatus that oxidizes an indole derivative under conditions where only the side chain alkylene is oxidized. Moreover, it is preferable that the oxidation part is an apparatus that oxidizes the indole derivative under alkaline conditions. Under alkaline conditions, a pH of 10 to 12 is still preferred because it can oxidize only the side chain methylene.
[0046]
Further, the oxidation of indole derivatives is carried out by, for example, H ₂ O ₂ And Na ₂ CO ₃ Although it can carry out using the oxidizing agent which consists of, you may carry out using oxidizing agents other than these.
[0047]
Moreover, you may provide the extraction part which extracts an indole oxide derivative with the organic solvent from what was obtained in the said oxidation part, and supplies this to the said measurement part. In this case, since the reproducibility in indole derivative determination may be reduced by providing an extraction unit, it is preferable to add an internal standard substance for analysis.
[0048]
As the internal standard substance, a substance having an indole skeleton similar to the indole derivative and fluorescently derivatized by oxidation to give a good peak on the chromatogram, such as MIAA, can be used.
[0049]
It is preferable to use micro HPLC (high performance liquid chromatography) for the indole derivative measuring part to increase the sensitivity for analysis.
[0050]
【Example】
Example 1
Method for synthesizing melatonin oxide (MEL oxide)
[0051]
Embedded image

[0052]
Melatonin (MEL) 500 mg and sodium carbonate 1 g were dissolved in 50 ml of water, and heated at 80 ° C., 120 ml of 3M hydrogen peroxide solution was added, and an oxidation reaction was performed for 10 hours. The progress of the reaction was followed by measuring the fluorescence spectrum of the reaction solution. FIG. 1 shows spectra at 0 hour (A), 6 hours (B) and 10 hours (C) after the reaction. Moreover, in each figure of FIG. 1, the dotted line has shown the spectrum when excited at 280 nm, and has shown melatonin which is a raw material which mainly exhibits fluorescence at 350 nm. On the other hand, the solid line is a spectrum excited at 245 nm, indicating the product melatonin oxide. Thus, it is shown that melatonin decreases with the passage of time, and melatonin oxide showing fluorescence at 374 nm increases. After completion of the reaction, the reaction solution was washed with ethyl acetate, and the aqueous layer was lyophilized.
[0053]
The physical properties of the obtained melatonin oxide were as follows.

¹ H-NMR / heavy meta (H1: 1.95 ppm; H2: invisible; H3: 4.30 ppm; H4: 7.94 ppm; H5: invisible; H6: 7.51 ppm; H7: 7.33 ppm; H8: 3 .90 ppm; H9: 7.68 ppm)
[0054]
(Example 2)
Synthesis method of 1-formyl-5-methoxyindole (MIAA oxide)
[0055]
Embedded image

[0056]
5-Methoxyindole-3-acetic acid (MIAA) was oxidized in the same manner as in Example 1 to obtain 1-formyl-5-methoxyindole.
[0057]
The physical properties of the obtained 1-formyl-5-methoxyindole were as follows.
¹ H-NMR / heavy meta (H1: not visible; H2: 7.90 ppm; H3: 6.30 ppm; H4: 7.50 ppm; H5: 3.90 ppm; H6: 7.35 ppm; H7: 7.65 ppm)
[0058]
(Experimental example 1)
Fluorescence measurement of melatonin oxide
Melatonin oxide was dissolved in 10% methanol to make a solution having a concentration of 10 μM. This solution was used to measure the fluorescence of this compound.
[0059]
As a control, melatonin was similarly dissolved in methanol to give a solution having a concentration of 10 μM. Fluorescence measurement was performed using this solution.
[0060]
FIG. 2 shows the excitation / fluorescence spectrum of melatonin oxide. FIG. 3 shows the excitation / fluorescence spectrum of melatonin as a control. 2 and 3, the excitation maximum wavelength of melatonin is 280 nm and the fluorescence maximum wavelength is 350 nm, whereas the excitation maximum wavelength of melatonin oxide is 247 nm and the fluorescence maximum wavelength is 378 nm. An increase in shift was observed. The fluorescence intensity increased by the oxidation reaction, and melatonin oxide emitted 6.5 times as much as melatonin.
[0061]
(Experimental example 2)
Fluorescence measurement of 1-formyl-5-methoxyindole
In the same manner as in Experimental Example 1, 1-formyl-5-methoxyindole was dissolved in 10% methanol to obtain a solution having a concentration of 10 μM. This solution was used to measure the fluorescence of this compound.
[0062]
As a control, 5-methoxyindole-3-acetic acid was dissolved in methanol to obtain a solution having a concentration of 10 μM. Fluorescence measurement was performed using this solution.
[0063]
FIG. 4 shows the excitation / fluorescence spectrum of 1-formyl-5-methoxyindole. FIG. 5 shows the excitation / fluorescence spectrum of 5-methoxyindole-3-acetic acid as a control. As shown in FIGS. 4 and 5, a wavelength shift was also observed in 5-methoxyindole-3-acetic acid as in the case of melatonin. The excitation maximum wavelength of 5-methoxyindole-3-acetic acid was 279 nm, and the fluorescence maximum wavelength was 351 nm. On the other hand, 1-formyl-5-methoxyindole had an excitation maximum wavelength of 243 nm and a fluorescence maximum wavelength of 374 nm, indicating an increase in Stokes shift. 1-Formyl-5-methoxyindole also showed strong fluorescence, and its fluorescence intensity was 6.3 times that of 5-methoxyindole-3-acetic acid.
[0064]
(Comparative Experimental Examples 1 and 2)
In order to compare with the fluorescence properties of melatonin oxide and 1-formyl-5-methoxyindole, amino acids can be obtained using NBD-F and Dns-Cl, which are widely used for analysis of amino acids among commercially available fluorescent labeling reagents. The excitation and fluorescence spectra of the fluorescent derivative produced by derivatization were measured. FIG. 6 shows the excitation / fluorescence spectrum of the fluorescent derivative (NBD-Ala) when NBD-F is used, and FIG. 7 shows the excitation / fluorescence spectrum of the fluorescent derivative (Dns-Ala) when Dns-Cl is used. Indicated.
[0065]
From the result of FIG. 6, the excitation maximum wavelength of the fluorescent derivative (NBD-Ala) is 472 nm and the maximum fluorescence wavelength is 536 nm. From the result of FIG. 7, the excitation maximum wavelength of the fluorescent derivative (Dns-Ala) is 328 nm, The fluorescence maximum wavelength was found to be 542 nm. The respective fluorescence intensities were 23.64 and 9.173.
[0066]
Table 1 shows the excitation / fluorescence maximum wavelength, fluorescence intensity and S / N ratio for the compounds used in the above experimental examples and comparative experimental examples. As is clear from the results shown in Table 1, the fluorescence intensity of melatonin oxide is 80 times that of NBD-Ala and 200 times that of Dns-Ala, and the fluorescence intensity of 1-formyl-5-methoxyindole is also NBD-Ala. It was found to be 70 times that of Dns-Ala and 180 times that of Dns-Ala.
[0067]
The S / N ratio represents the ratio between the fluorescence intensity of each compound and the fluorescence intensity of the measurement solvent at each measurement wavelength, and is considered to be an index of sensitivity when measured by HPLC. In NBD-Ala and Dns-Ala, each fluorescence characteristic was low, but since these also had a low noise level, the S / N ratio showed a high value, respectively. However, melatonin oxide and 1-formyl-5-methoxyindole also showed higher values for the S / N ratio. Therefore, the indole oxide derivative according to the present invention can be used for high sensitivity analysis.
[0068]
[Table 1]

[0069]
(Experimental example 3)
Stability of melatonin oxide with 1-formyl-5-methoxyindole (MIAA oxide)
In order to measure the stability of melatonin oxide as well as 1-formyl-5-methoxyindole (MIAA oxide), these compounds were dissolved in 20% acetonitrile aqueous solution and allowed to stand at 25 ° C. under lighting for a predetermined time. The residual rate of each was measured by reverse phase HPLC. The separation column was ODS-120TS QA (4.6 mm id x 150 mm), and the mobile phase was 20% acetonitrile aqueous solution (CH) containing 0.01% TFA. ₃ CN / TFA / H 2 O = 20 / 0.01 / 80 (v / v)) was fed at a rate of 1 ml / min at 40 ° C. Detection was performed by ultraviolet absorption at 210 nm. The result is shown in FIG. In FIG. 8, (A) shows the result immediately after preparing the mixture of each compound, (B) shows the result after leaving the mixture for 1 day, and (C) shows the result after leaving the mixture for 3 days.
[0070]
(Experimental example 4)
Stability of NBD-Ala and Dns-Al
The respective stability was measured in the same manner as in Experimental Example 3 except that NBD-Ala and Dns-Ala were allowed to stand at 25 ° C. for a predetermined time under lighting. The measurement results are shown in FIG. In FIG. 9, (A) shows the result immediately after preparing the mixture of each compound, (B) shows the result after leaving the mixture for 1 day, and (C) shows the result after leaving the mixture for 3 days.
[0071]
(Experimental example 5)
Stability of melatonin oxide, 1-formyl-5-methoxyindole (MIAA oxide) and NBD-Ala and Dns-Ala
Melatonin oxide, 1-formyl-5-methoxyindole (MIAA oxide) and NBD-Ala and Dns-Ala were the same as in Experimental Example 3 except that they were left at 4 ° C, 25 ° C, and 60 ° C for a predetermined time in the daylight. The stability of each was measured. The measurement results are shown in FIG. In FIG. 10, (A) shows the result after leaving the mixture of each compound at 4 ° C., (B) leaving the mixture at 25 ° C., and (C) showing the result after leaving the mixture at 60 ° C. Show. From the results shown in the figure, NBD-Ala was completely decomposed in 6 hours under lighting at any temperature. In contrast, melatonin oxide, 1-formyl-5-methoxyindole and Dns-Ala were hardly decomposed.
[0072]
(Experimental example 6)
Stability of melatonin oxide, 1-formyl-5-methoxyindole (MIAA oxide) and NBD-Ala and Dns-Ala
The stability of each of melatonin oxide, 1-formyl-5-methoxyindole (MIAA oxide), NBD-Ala and Dns-Ala was measured in the same manner as in Experimental Example 5 except that they were left under light shielding. The measurement results are shown in FIG. In FIG. 11, (A) left the mixture of each compound at 4 ° C., (B) left the mixture at 25 ° C., and (C) shows the result after the mixture left at 60 ° C. Show. As shown in the figure, at 4 ° C. and 25 ° C. under shading, each compound was hardly decomposed and showed a residual rate of almost 100%. However, when heated at 60 ° C. and left for 3 days, NBD- The residual rate of Ala was almost 50%. In contrast, melatonin oxide, 1-formyl-5-methoxyindole (MIAA oxide) and Dns-Ala showed a residual rate of almost 100% under any conditions.
[0073]
From these results, it can be said that melatonin oxide is extremely stable to light and heat, whereas commercially available NBD-Ala and Dns-Ala are unstable to light and heat.
[0074]
(Example 3)
Example 3 will be described with reference to the process chart shown in FIG.
300 mM Na in 100 μl of an aqueous solution of melatonin preparation ₂ Co ₃ 10 μl of aqueous solution and 10 mM H ₂ O ₂ 10 μl of an aqueous solution was added, and a derivatization (oxidation) reaction was performed at 90 ° C. for 30 minutes.
[0075]
20 μl of this reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) and detected at an excitation wavelength of 245 nm and a fluorescence wavelength of 380 nm. As a result, the chromatogram of FIG. 13 was obtained. The peak labeled melatonin in the chromatogram is melatonin oxide.
[0076]
(Comparative Example 1)
On the other hand, when melatonin (50 fmol) not subjected to oxidation treatment was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) in the same manner as in Example 3 above, the chromatogram of FIG. 20 was obtained.
[0077]
Comparing the strength of melatonin in FIG. 13 and FIG. 20, it can be seen that the strength according to Example 3 is 10 times the strength according to Comparative Example 1.
[0078]
Example 4
Example 4 will be described with reference to the process chart shown in FIG.
First, a pineal gland was removed from a Wistar male rat (6 weeks old, SPF), ground with ice-cooled methanol (500 μl) with a microhomogenizer, and the resulting homogenate was applied to a centrifuge and subjected to centrifugal force. After separation at 4500 G for 5 minutes, the supernatant (supernatant) was collected with a micropipette.
[0079]
Next, the centrifuged supernatant was collected with a micropipette, placed in a microglass tube, and dried at 100 ° C.
[0080]
Next, 40 μl of water was added to the residue and stirred well, then 2M Na ₂ CO ₃ 5 μl of aqueous solution, 50 mM H ₂ O ₂ 5 μl of water was added and a derivatization (oxidation) reaction was performed at 100 ° C. for 30 minutes.
[0081]
A portion of the reaction solution obtained by this derivatization reaction was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC), irradiated with light having an excitation wavelength of 245 nm, and the intensity of light having a fluorescence wavelength of 380 nm was measured. It became so. In this chromatogram, the peak indicated by the arrow is melatonin.
[0082]
Next, 250 μl of ethyl acetate saturated with water was added to the reaction solution, and the melatonin derivative was extracted. This extraction operation was repeated three times, and the upper layers were combined and evaporated to dryness.
[0083]
The residue is then added to 10% CH ₃ CN / H ₂ When 40 μl of O was added and stirred well, 20 μl of the sample was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC), irradiated with light having an excitation wavelength of 245 nm, and the intensity of light having a fluorescence wavelength of 380 nm was measured, the chromatogram of FIG. 16 was obtained. It was. In this chromatogram, the peak indicated by the arrow is melatonin.
[0084]
Comparing the chromatograms of FIG. 15 and FIG. 16, it can be seen that the extraction operation removes various contaminating components present before the extraction and enables the selective analysis of melatonin.
[0085]
(Example 5)
Example 5 will be described with reference to the process chart shown in FIG.
As in Example 4, first, one pineal pin of Wistar male rat (6 weeks old, SPF) was extracted, ground with ice-cooled methanol (500 μl) with a microhomogenizer, and the resulting homogenate was obtained. The mixture was centrifuged and separated at a centrifugal force of 4500 G for 5 minutes, and the supernatant was collected with a micropipette.
[0086]
Next, 50 μl of 5 nM MIAA (5-methoxyindole-3-acetic acid) / MeOH solution was added to the centrifuged supernatant, placed in a micro glass tube, and dried at 100 ° C.
[0087]
Next, 40 μl of water was added to the residue and stirred well, then 2M Na ₂ CO ₃ 5 μl of aqueous solution, 50 mM H ₂ O ₂ 5 μl of water was added and a derivatization (oxidation) reaction was performed at 100 ° C. for 30 minutes.
[0088]
Next, 250 μl of ethyl acetate saturated with water was added to the reaction solution, and the melatonin derivative was extracted. This extraction operation was repeated three times, and the upper layers were combined and evaporated to dryness.
[0089]
The residue is then added to 10% CH ₃ CN / H ₂ After adding 40 μl of O and stirring well, 20 μl thereof was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC), irradiated with light having an excitation wavelength of 245 nm, and the intensity of light having a fluorescence wavelength of 380 nm was measured. As shown in the chromatogram of FIG. became. In this chromatogram, the peak indicated by the arrow is melatonin.
[0090]
Further, the supernatant obtained by centrifugation, which did not contain MIAA, was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC), irradiated with light having an excitation wavelength of 245 nm, and the intensity of light having a fluorescence wavelength of 380 nm was measured. It became like the chromatogram. In this chromatogram, the peak indicated by the arrow is melatonin.
[0091]
Comparing the chromatogram of FIG. 18 with the chromatogram of FIG. 19, it can be seen that there is no interfering peak near the retention time of the MIAA derivative, and the MIAA derivative can be quantified well on the chromatogram.
[0092]
(Example 6)
A sixth embodiment shown in FIGS. 21 and 22 will be described.
FIG. 21 shows the result of oxidation of 1 fmol melatonin and analysis by ordinary reverse phase HPLC (high performance liquid chromatography). FIG. 22 shows the result of oxidation of 1 fmol melatonin and analysis by micro HPLC (high performance liquid chromatography). Both melatonin peaks are indicated by arrows. When FIG. 21 and FIG. 22 are compared, it can be seen that the detection sensitivity is improved 10 times or more by the introduction of micro HPLC (high performance liquid chromatography). Therefore, the introduction of the oxidation step and micro HPLC (high performance liquid chromatography) enables melatonin analysis with a sensitivity 100 times higher than that of the conventional method.
[0093]
【Effect of the invention】
The indo-oxide derivative according to the present invention has excellent properties such as strong fluorescence and stability to light and heat.
[0094]
Further, the analysis method according to the present invention oxidizes an indol derivative such as melatonin and measures the fluorescence intensity of the indo-oxide derivative such as melatonin oxide as the indo-oxide derivative. There is an effect that a trace amount of an indole derivative can be measured.
[0095]
Therefore, according to the present invention, blood melatonin quantification can be performed with a very small amount of blood such as several tens of milliliters, a non-painful blood sampling method from the fingertip can be applied, the burden on the subject can be greatly reduced, and the individual level The melatonin circadian rhythm analysis etc. is possible, and detailed melatonin rhythm measurement at the time of biological rhythm disorder is possible, the scientific investigation is given to the investigation of the cause at the time of rhythm disorder and the melatonin treatment that has been done empirically, There is an effect that an effective medication design becomes possible.
[0096]
Further, according to the present invention, there is an effect that the concentration of melatonin and the like can be accurately quantitatively analyzed without being affected by the contaminants in the actual human blood including the contaminants.
[0097]
In addition, according to the present invention, it is possible to introduce chronotherapy in various diseases using melatonin blood concentration as a biorhythm marker.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the fluorescence intensity of melatonin oxide, (A) shows the fluorescence intensity after 0 hour reaction time, (B) after 6 hours reaction time, and (C) shows the fluorescence intensity after 12 hours reaction time.
FIG. 2 shows excitation / fluorescence maximum wavelengths of melatonin oxide.
FIG. 3 shows excitation and fluorescence maximum wavelengths of melatonin.
FIG. 4 shows excitation and fluorescence maximum wavelengths of 1-formyl-5-methoxyindole.
FIG. 5 shows excitation and fluorescence maximum wavelengths of 5-methoxyindole-3-acetic acid.
FIG. 6 shows excitation and fluorescence maximum wavelengths of NBD-Ala.
FIG. 7 shows excitation and fluorescence maximum wavelengths of Dns-Ala.
FIG. 8 is a chromatogram showing the residual ratio of a mixture of melatonin oxide, NBD-Ala and Dns-Ala.
FIG. 9 is a chromatogram showing the residual ratio of a mixture of melatonin oxide, NBD-Ala and Dns-Ala under light shielding.
FIG. 10 shows the degradation rate of a mixture of melatonin oxide, NBD-Ala and Dns-Ala under daylighting.
FIG. 11 shows the decomposition rate of a mixture of melatonin oxide, NBD-Ala and Dns-Ala under light shielding.
12 is a process diagram showing an operation of Example 3. FIG.
13 is a chromatogram of a reaction solution processed by the operation of Example 3. FIG.
FIG. 14 is a process diagram showing operations of Example 4;
15 is a chromatogram of a liquid before solvent extraction in the operation of Example 4. FIG.
16 is a chromatogram of the extract processed by the operation of Example 4. FIG.
FIG. 17 is a process diagram showing operations of Example 5.
18 is a chromatogram of an extract processed by the operation of Example 5. FIG.
FIG. 19 is a chromatogram of the extract solution to which MIAA was not added in the operation of Example 5.
20 is a chromatogram of a melatonin sample analyzed without being oxidized by the operation of Comparative Example 1. FIG.
FIG. 21 is a chromatogram of melatonin oxide analyzed by conventional reverse phase HPLC.
FIG. 22 is a chromatogram of melatonin oxide analyzed by micro HPLC.

Claims

An analysis of melatonin comprising: an oxidation step of oxidizing melatonin to obtain melatonin oxide; and a measurement step of measuring the fluorescence intensity of melatonin oxide obtained in the oxidation step to determine the amount of melatonin Method.

The melatonin analysis method according to claim 1, wherein the melatonin is oxidized with hydrogen peroxide.

The method for analyzing melatonin according to claim 1 or 2, wherein the melatonin is oxidized under a condition that only side chain methylene is oxidized.

The melatonin analysis method according to claim 1, wherein the melatonin is oxidized under alkaline conditions.

The melatonin analysis method according to claim 4, wherein the melatonin is oxidized in the presence of sodium carbonate.

The method for analyzing melatonin according to any one of claims 1 to 5, further comprising an extraction step of extracting the melatonin oxide with an organic solvent between the oxidation step and the measurement step.

The melatonin analysis method according to claim 6, wherein an internal standard substance is added.