JP4881739B2

JP4881739B2 - Ｌ−アルギニン、ｌ−オルニチンまたはｌ−シトルリンの製造法

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Publication number: JP4881739B2
Application number: JP2006537780A
Authority: JP
Inventors: 正人池田; 哲郎中野; 敏三橋; 幹朗林; 建児田中
Original assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Current assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date: 2004-09-28
Filing date: 2005-09-28
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2025-09-28
Also published as: EP1801206A4; ES2340405T3; DE602005020165D1; WO2006035831A1; ATE462000T1; CN101027389B; EP1801206B1; CN101027389A; US20090123980A1; BRPI0516176A; BRPI0516176B1; US7741081B2; EP1801206A1; JPWO2006035831A1

Description

本発明は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンの製造法に関する。

微生物において、Ｌ−アルギニンはＬ−グルタミン酸から８段階の反応を経て生合成される。Ｌ−オルニチンおよびＬ−シトルリンは、Ｌ−アルギニンの生合成経路上の中間体である。Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチンおよびＬ−シトルリンの生合成も、他のアミノ酸と同様に調節を受けている。
例えば、コリネ型細菌では、アルギニン・リプレッサー（以下、ＡｒｇＲという）によって、Ｌ−アルギニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子から構成されるオペロン（以下、アルギニン・オペロンと略す）の転写が抑制されている（特許文献１参照）。また、コリネ型細菌では、Ｌ−グルタミン酸からＬ−アルギニンに至る生合成経路上の第２番目の酵素であるＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．２．８、以下、ＡｒｇＢと略すこともある）がＬ−アルギニンによるフィードバック阻害を受けることが知られている（非特許文献２参照）。

Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンも他のアミノ酸と同様に微生物を用いて生産される。そして、他のアミノ酸の場合と同様に、突然変異やＤＮＡ組換え等の手法を用いてこれらのアミノ酸の生産性を向上させる研究が行なわれている。
例えば、アルギニンの生合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片でコリネバクテリウム・グルタミカムを形質転換し、さらに突然変異処理を施すことにより、アルギニンの生産性の向上したコリネバクテリウム・グルタミカムＫ６５（ＦＥＲＭＢＰ−１１１５）株が取得されたことが報告されている（特許文献２参照）。

また、アルギニン生合成系酵素の抑制が解除されたコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（非特許文献１参照）、アルギニン生合成系酵素の抑制が解除され、さらにＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が脱感作されており、かつＬ−アルギニンの膜透過性の増大したコリネバクテリウム・グルタミカム（非特許文献３参照）等が突然変異法を用いて取得されている。

また、ＡｒｇＲをコードするＤＮＡを破壊したコリネ型細菌（特許文献１参照）がＤＮＡ組換え法を用いて取得されている。
しかし、これまでに、ＡｒｇＢとＡｒｇＲをコードするＤＮＡの両方に変異が導入された株において、ＡｒｇＢまたはＡｒｇＲをコードするＤＮＡにどのような変異を導入すればＬ−アルギニンの生産性が向上するかについての報告はない。
特開２００２−５１７９０号公報特開昭６３−７９５９７号公報Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ＆ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７９年，第４３巻，ｐ．１０５−１１１ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９６６年，第９１巻，ｐ．６１７Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ＆ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７２年，第３６巻，ｐ．１６７５−１６８４

本発明の目的は、効率のよいＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンの製造法を提供することにある。

本発明は以下の（１）〜（１８）に関する。
（１）（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２０〜３８番目のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２０〜３８番目のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換され、かつ第１〜１９番目または３９〜２９４番目のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
（２）（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６〜３１番目のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６〜３１番目のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換され、かつ第１〜２５番目または第３２〜２９４番目のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
を有し、かつＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
（３）（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６または３１番目のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６および３１番目のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）上記（ｉ）または（ｉｉ）のアミノ酸配列において、置換された部位以外の１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
を有し、かつＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
（４）（ｉ）配列番号３、５、７、９および１１で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号３、５および７で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において、それぞれの配列の第２６番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号９で表されるアミノ酸配列において、第３１番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または
（ｉｖ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、第２６および３１番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
（５）上記（１）〜（４）のいずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（６）配列番号４、６、８、１０および１２で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ。
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−アラニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第３１番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−メチオニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコードするＤＮＡ、または
（ｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−アラニン以外のアミノ酸であり、かつ第３１番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−メチオニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコードするＤＮＡ
であり、かつＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（８）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−バリン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−イソロイシンであり、第３１番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−バリンである、上記（７）のＤＮＡ。
（９）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ
（ｉ）配列番号２で表される塩基配列の５’末端から第７６〜７８番目の領域に相応する領域がグアニン−チミジン−チミジン、シトシン−チミジン−グアニン、もしくはアデニン−チミジン−シトシンである塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号２で表される塩基配列の５’末端から第９１〜９３番目の領域に相応する領域がグアニン−チミジン−グアニンである塩基配列を有するＤＮＡ、または
（ｉｉｉ）配列番号２で表される塩基配列の５’末端から第７６〜７８番目の領域に相応する領域がグアニン−チミジン−チミジン、シトシン−チミジン−グアニン、もしくはアデニン−チミジン−シトシンであり、かつ第９１〜９３番目の領域に相応する領域がグアニン−チミジン−グアニンである塩基配列を有するＤＮＡ
であり、かつＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１０）上記（５）〜（９）のいずれか１つのＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（１１）上記（１０）の組換え体ＤＮＡを導入して得られる微生物。
（１２）上記（５）〜（９）のいずれか１つのＤＮＡを有する微生物。
（１３）アルギニン・リプレッサーのアルギニン・オペロンの転写抑制活性が低下または喪失していることを特徴とする上記（１１）または（１２）の微生物。
（１４）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ活性が低下または喪失していることを特徴とする上記（１１）〜（１３）のいずれか１つの微生物。
（１５）アルギニノコハク酸シンターゼ活性が低下または喪失していることを特徴とする上記（１１）〜（１４）のいずれか１つの微生物。
（１６）微生物がコリネバクテリウム属に属する微生物である、上記（１１）〜（１５）のいずれか１つの微生物。
（１７）微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物である、上記（１１）〜（１６）の微生物。
（１８）上記（１１）〜（１７）のいずれか１つの微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンを生成、蓄積させ、該培養物からＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンを採取することを特徴とするＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンの製造法。

本発明により、効率のよいＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンの製造法を提供することができる。

本発明のポリペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２０〜３８番目のアミノ酸配列で１以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有し、かつＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ活性（以下、ＡｒｇＢ活性という）を有するポリペプチドをあげることができる。
配列番号１で表されるアミノ酸配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株のＡｒｇＢのアミノ酸配列であり、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされる。なお、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡは、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬにＮＣｇｌ１３４２として登録されている。

配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２０〜３８番目のアミノ酸配列からなる領域は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）のＡｒｇＢのアミノ酸配列と立体構造〔Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１０，３２９−３４２，（２００２）〕との関係および該アミノ酸配列とコリネバクテリウム・グルタミカムのＡｒｇＢのアミノ酸配列との相同性からα−ヘリックスを形成すると推測される領域である。

アミノ酸が置換される部位は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２０〜３８番目のアミノ酸配列中であればいずれの部位であってもよいが、第２６〜３１番目の部位であることが好ましい。
置換されるアミノ酸の数は、置換後のアミノ酸配列を有するポリペプチドがＡｒｇＢ活性を有しており、好ましくはＬ−アルギニンによるフィードバック阻害の低減または解除されたＡｒｇＢ活性を有していれば特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１または２個である。

ポリペプチドがＬ−アルギニンによるフィードバック阻害の低減または解除されたＡｒｇＢ活性を有していることは、Ｌ−アルギニンの存在下でのＡｒｇＢ活性が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのＬ−アルギニンの存在下でのＡｒｇＢ活性より高いことをもって確認することができる。Ｌ−アルギニンの濃度は５ｍｍｏｌ／ｌ以上であることが好ましく、１０ｍｍｏｌ／ｌ以上であることがさらに好ましい。

ポリペプチドのＡｒｇＢ活性は、たとえば、ＡＴＰおよびＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸を基質としたホスホエノールピルビン酸−ｐｙｒｕｖａｔｅｋｉｎａｓｅ系との反応で生成するピルビン酸を、２，４−ジニトロフェニルヒドラゾンとして比色定量する方法〔Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７，２５１−２５５（１９７０）〕、ＡＴＰおよびＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸をヒドロキシルアミンとともに反応させ、生成するアセチルグルタミン酸５−リン酸をヒドロキサム酸として定量する方法〔Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７，２６９−２７２（１９７０）〕等の方法により測定することができる。

置換されるアミノ酸は、置換後のアミノ酸配列を有するポリペプチドがＡｒｇＢ活性を有しており、好ましくはＬ−アルギニンによるフィードバック阻害の低減または解除されたＡｒｇＢ活性を有していれば特に限定されるものではなく、天然型と非天然型とを問わない。
天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。

以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
本発明のポリペプチドとしては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６または３１番目のいずれか一方、あるいは両方のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有し、かつＡｒｇＢ活性を有するポリペプチドをあげることができる。

本発明のポリペプチドでは、置換された部位以外のアミノ酸配列においては、ＡｒｇＢ活性を有している限り、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
置換されるアミノ酸は、上記の配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から２０〜３８番目のアミノ酸配列中で置換することが可能なアミノ酸と同様である。

欠失、置換または付加は、同一配列での１または複数のアミノ酸の欠失、置換または付加を意味し、欠失、置換または付加が同時に生じてもよい。
本発明のポリペプチドがＡｒｇＢ活性を有するためには、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。

本発明において、アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ〔Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）〕やＦＡＳＴＡ〔ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）〕を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。

本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより具体的な例としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６番目のアラニンがバリンに置換された配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６番目のアラニンがロイシンに置換された配列番号５で表されるアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６番目のアラニンがイソロイシンに置換された配列番号７で表されるアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第３１番目のメチオニンがバリンに置換された配列番号９で表されるアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６番目のアラニンおよび第３１番目のメチオニンがそれぞれバリンに置換された配列番号１１で表されるアミノ酸配列等があげられる。

本発明のＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡがあげられ、具体例として、配列番号３、５、７、９および１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをそれぞれコードする配列番号４、６、８、１０および１２で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
また、本発明のＤＮＡとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−アラニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第３１番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−メチオニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−アラニン以外のアミノ酸であり、かつ第３１番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−メチオニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−バリン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−イソロイシンであるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｖ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第３１番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−バリンであるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｖｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−バリン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−イソロイシンであり、かつ第３１番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−バリンであるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｖｉｉ）配列番号２で表される塩基配列の５’末端から第７６〜７８番目の領域に相応する領域がグアニン−チミジン−チミジン、シトシン−チミジン−グアニン、もしくはアデニン−チミジン−シトシンである塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｖｉｉｉ）配列番号２で表される塩基配列の５’末端から第９１〜９３番目の領域に相応する領域がグアニン−チミジン−グアニンである塩基配列を有するＤＮＡ、または
（ｉｘ）配列番号２で表される塩基配列の５’末端から第７６〜７８番目の領域に相応する領域がグアニン−チミジン−チミジン、シトシン−チミジン−グアニン、もしくはアデニン−チミジン−シトシンであり、かつ第９１〜９３番目の領域に相応する領域がグアニン−チミジン−グアニンである塩基配列を有するＤＮＡ
であり、かつＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをあげることができる。

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、配列番号１、３、５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列、より好ましくは配列番号２、４、６、８、１０または１２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。

ハイブリダイゼーションは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ１：ＣｏｒｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）（以下、ＤＮＡクローニングと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、上記ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、配列番号２、４、６、８、１０または１２で表される塩基配列と少なくとも７５％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。

本発明の微生物としては、本発明のＤＮＡを有する微生物であればいずれでもよいが、アルギニン・リプレッサー（ＡｒｇＲ）のアルギニン・オペロンの転写抑制活性が低下または喪失している微生物であることが好ましい。
本発明の微生物の種類は特に限定されないが、例えばコリネ型細菌をあげることができる。

コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、またはミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物をあげることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・ハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｅｒｃｕｌｉｓ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）等をあげることができ、具体的には、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０６０、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３８２６（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０２０（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３８６９（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１３８７０、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１５８０６、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｌｌｕｎａｅＡＴＣＣ１５９９１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｅｒｃｕｌｉｓＡＴＣＣ１３８６８、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｌｉｕｍＡＴＣＣ１５９９０、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａＡＴＣＣ１７９６５、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓＡＴＣＣ９２４４等をあげることができる。

ブレビバクテリウム属に属する微生物としては、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）等をあげることができ、具体的には、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１４０６８、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍＡＴＣＣ１３８２５、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓＡＴＣＣ１９２４０等をあげることができる。

ミクロバクテリウム属に属する微生物としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）等をあげることができ、具体的には、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１５３５４等をあげることができる。
本発明の微生物のＡｒｇＲのアルギニン・オペロン転写抑制活性は、親株の活性と比べて低下していればよいが、５０％以下であることが好ましく、１０％以下であることがより好ましく、５％以下であることがさらに好ましく、活性がゼロ、すなわち喪失していることが最も好ましい。

親株は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンを生成する能力を有し、ＡｒｇＢがＬ−アルギニンによりフィードバック阻害を受け、かつアルギニン・オペロンの転写がＡｒｇＲにより抑制される微生物であれば、野生株であってもよいし、該野生株から人工的に育種された育種株であってもよい。また、これらの性質を有していれば、以下に述べる本発明のＤＮＡを導入する際に用いられる宿主微生物も、親株として用いることができる。

本発明において、野生株とは、本発明の微生物と分類学上同じ種に属する微生物であって、かつ自然界で最も高頻度に出現する表現型を有する微生物をいう。
例えば、本発明の微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物である場合、野生株としては、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株をあげることができる。

本発明の微生物は、親株を、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の突然変異誘発物質を用いて処理し、得られた株をアルギニンアナログであるアルギニンハイドロキサメートを含有する培地を用いて培養した際に親株と比べて生育速度が速い株を選択し、さらに通常の微生物の培地を用いて培養した際に親株と比べてＬ−アルギニンの生産性が向上した微生物の中から選択して得てもよいが、より簡便には、本発明のＤＮＡを導入する方法を用いて得ることができる。

以下、本発明の微生物の取得法として本発明のＤＮＡを導入して得る方法について説明する。
本発明のＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列と相同性の高い塩基配列を有し、かつＡｒｇＢ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡから調製して得ることができる。

配列番号２で表される塩基配列との高い相同性とは、少なくとも７５％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有することである。
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列と相同性の高い塩基配列を有し、かつＡｒｇＢ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、これらのＤＮＡを有する微生物から調製して得ることができるが、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成しても得ることができる。

これらのＤＮＡを有する微生物としては、例えば、コリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・クレナタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｅｎａｔｕｍ）等をあげることができ、例えば、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＫ６５（ＦＥＲＭＢＰ−１１１５）、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１３８７０、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｆｆｉｃｉｅｎｓＪＣＭ４４５４９等をあげることができるが、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡを有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２が好ましく用いられる。

上記配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列と相同性の高い塩基配列を有し、かつＡｒｇＢ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する微生物を公知の方法〔例えば、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０，８３３（１９９６）〕により培養する。
培養後、例えば斎藤らの方法〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）〕に準じて該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。

ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬにＮＣｇｌ１３４２として登録されているコリネバクテリウム・グルタミカムのＡｒｇＢをコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号２で表される塩基配列）または該塩基配列を含む領域の塩基配列（例えば、配列番号３０で表される塩基配列）に基づいてプライマーを調製し、単離精製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ〔ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９９０）］を行い、ＡｒｇＢをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を調製する。

プライマーとしては、例えば、配列番号３０で表される塩基配列に基づいて設計した配列番号１３〜１８で表される塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
また、単離精製した染色体ＤＮＡを用いて、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法に準じてＤＮＡライブラリーを作製し、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡクローニング等の実験書に記載されているコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法等により、得られたＤＮＡライブラリーからＡｒｇＢをコードするＤＮＡを含むクローンを取得することもできる。

ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、公知のコリネバクテリウム・グルタミカムのＡｒｇＢをコードするＤＮＡまたはその一部、該ＤＮＡの塩基配列をもとに合成したＤＮＡなどの他、公知のＡｒｇＢをコードするＤＮＡの塩基配列をもとに合成したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲなどにより取得したＤＮＡ断片などをあげることができる。
例えば、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号１３〜１８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーとしてコリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片などを例示することができる。

コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法等により取得したＡｒｇＢをコードするＤＮＡを有するＤＮＡ断片をそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等を用いたジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕により、該ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。

さらに、決定された塩基配列に基づいたプライマーを調製し、染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法〔ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９９０）〕により、ＡｒｇＢをコードするＤＮＡを有するＤＮＡ断片を取得することができる。
また、決定されたＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡ断片を調製することもできる。

上記のようにして得られるＡｒｇＢをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列と相同性の高い塩基配列を有し、かつＡｒｇＢ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに、必要に応じてモレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法、例えば、ＰＣＲを用いる方法等により部位特異的変異を導入することにより本発明のＤＮＡを取得することができる。

このようにして得られた本発明のＤＮＡをプラスミドベクター等のベクターに常法を用いて組み込み、本発明の組換え体ＤＮＡを調製する。
ベクターとしては、本発明のＤＮＡを導入する微生物（以下、宿主微生物という）に導入可能なベクターであれば特に限定されるものではなく、例えば、ｐＨＳＧ２９９〔Ｇｅｎｅ，６１，６３−７４（１９８７）〕、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０〔エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒＳ３２〔エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＰＡＣ３１（国際公開９８／１２３４３号パンフレット）、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８号）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＧ１（特開平６−２７７０８２号）、ｐＣＳ２９９Ｐ（国際公開００／６３３８８号パンフレット）等があげられるが、宿主微生物中では自立複製できないベクターを用いると本発明の組換え体ＤＮＡを宿主微生物の染色体に組み込むことができるので好ましい。

宿主微生物としては、上記であげた微生物を用いることができる。
宿主微生物中で自立複製できないベクターは、特に限定されないが、抗生物質に対する耐性に関与する遺伝子を有するベクターであれば、相同組換えにより宿主微生物の染色体上に本発明の組換え体ＤＮＡが組み込まれた微生物を容易に選択できるので好ましく、さらにバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するレバンシュークラーゼ（ＥＣ：２．４．１．１０）をコードするＤＮＡ（ｓａｃＢ）を有するベクターであれば、宿主微生物の染色体上に元来存在しているＡｒｇＢをコードするＤＮＡが本発明のＤＮＡに置換された微生物を容易に選択できるので好ましい。このようなベクターとしては、例えば、実施例１で示すプラスミドｐＥＳＢ３０等をあげることができる。

本発明の組換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入する。
本発明の微生物のＡｒｇＲの活性を低下または喪失させる変異の導入は、この宿主微生物への本発明のＤＮＡの導入操作の前に行なってもよいし、宿主微生物に本発明のＤＮＡを導入した後に行なってもよい。
ＡｒｇＲの活性を低下または喪失させるには、ＡｒｇＲの活性を低下または喪失させる微生物をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の突然変異誘発物質で処理し、突然変異処理前と比べてＬ−アルギニンの生産性が向上した微生物の中から選択して得てもよいし、ＡｒｇＢをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入する方法と同様の方法を用いてＡｒｇＲをコードするＤＮＡに塩基の置換、欠失または付加等を行なって得てもよい。

塩基の置換、欠失または付加等を行なう部位は、ＡｒｇＲの活性を低下または喪失することができる部位であれば限定されないが、ＡｒｇＲへのＬ−アルギニンの結合領域中または該結合領域を含む領域であれば、該活性を効率よく低下または喪失させることができるので好ましい。
Ｌ−アルギニンの結合領域としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のＡｒｇＲをコードするＤＮＡの塩基配列である配列番号１９で表される塩基配列においては、第４５〜２４０番目の領域をあげることができる。他の微生物のＡｒｇＲをコードするＤＮＡにおいても、該領域に相応する領域中またはその近傍がＬ−アルギニンの結合領域である。

置換、欠失または付加等を行なう塩基の数は、ＡｒｇＲの活性を低下または喪失することができる数であれば限定されない。
宿主微生物への本発明のＤＮＡの導入は、本発明の組換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入することのできる方法であれば、いずれの方法を用いてもよい。
例えば、電気穿孔法〔Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５２，５４１（１９９９）〕やプロトプラスト法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９，３０６（１９８４）〕等をあげることができる。

野生型のＡｒｇＢはＬ−アルギニンによりフィードバック阻害されるので、該フィードバック阻害が低減または解除されていない微生物は、アルギニンアナログであるアルギニンハイドロキサメートを含有する培地中では、該フィードバック阻害が低減または解除された微生物と比べて生育速度が遅い。また、ＡｒｇＲの活性が低下または喪失していない微生物は、Ｌ−アルギニンの蓄積によりアルギニン・オペロンの転写が抑制され、ＡｒｇＢ発現量が低くなり、アルギニンハイドロキサメートを含有する培地中では、さらに生育速度が遅い。

したがって、上記方法により、本発明のＤＮＡを宿主微生物に導入して得た微生物に本発明のＤＮＡが導入されていることは、アルギニンハイドロキサメートを含有する培地中での生育速度を、該微生物と宿主微生物とで比較し、該微生物の生育速度が、宿主微生物と比べて向上していることをもって確認することができる。また、該微生物からプラスミドまたは染色体を常法により調製し、塩基配列を調べて確認することもできる。

該微生物のＡｒｇＲの活性が低下または喪失していることは、該微生物および宿主微生物におけるアルギニン・オペロンの発現をノーザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第３版）等を用いて比較することにより確認することができる。ノーザンハイブリダイゼーション法に用いるプローブは、アルギニン・オペロンを構成する遺伝子の塩基配列の一部または全部を有するＤＮＡをあげることができる。例えば、上記で述べた、ＡｒｇＢをコードするＤＮＡをＤＮＡライブラリーから選択するために用いられるＤＮＡがあげられる。

また、宿主微生物としてアルギニン・オペロンにレポーター遺伝子を組み込んだ微生物を用いて、該レポーター遺伝子の発現量を宿主微生物と比較して確認することもできる。
本発明の微生物は、本発明のＤＮＡを有し、ＡｒｇＲの活性が低下または喪失した微生物であればいずれの微生物であってもよいが、本発明の微生物をＬ−オルニチンの製造に用いる場合は、Ｌ−アルギニンの生合成経路上の酵素であるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．１．３．３、以下、ＡｒｇＦという）の活性が親株と比べて低下または喪失している微生物であることが好ましい。ＡｒｇＦ活性が親株と比べて低下または喪失した株は、ＡｒｇＢおよびＡｒｇＲへ変異を導入する場合と同様に、突然変異処理により得てもよいし、ＡｒｇＢやＡｒｇＲに部位突然変異を導入する方法と同様な方法を用いてＡｒｇＦをコードするＤＮＡに塩基の置換、欠失または付加等を行って得てもよい。なお、ＡｒｇＦをコードするＤＮＡは公知であり、例えばＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬに記載の塩基配列情報を用いることができる。ＡｒｇＦをコードするＤＮＡとしては例えば、配列番号３１で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。

また、本発明の微生物をＬ−シトルリンの製造に用いる場合は、Ｌ−アルギニンの生合成経路上の酵素であるアルギニノコハク酸シンターゼ（ＥＣ：６．３．４．５、以下、ＡｒｇＧという）の活性が親株と比べて低下または喪失している微生物であることが好ましい。ＡｒｇＧ活性が親株と比べて低下または喪失した株は、ＡｒｇＢおよびＡｒｇＲへ変異を導入する場合と同様に、突然変異処理により得てもよいし、ＡｒｇＢやＡｒｇＲに部位突然変異を導入する方法と同様な方法を用いてＡｒｇＧをコードするＤＮＡに塩基の置換、欠失または付加等を行って得てもよい。なお、ＡｒｇＧをコードするＤＮＡは公知であり、例えばＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬに記載の塩基配列情報を用いることができる。ＡｒｇＧをコードするＤＮＡとしては例えば、配列番号３２で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。

本発明の微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンを生成、蓄積させ、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンを採取することにより、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンを製造することができる。
本発明の微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法であればいずれの方法でもよい。

培地としては、本発明の微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、本発明の微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、マルトース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。

その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ニコチンアミド、ニコチン酸等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸等で代用することもできる。
培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は２０〜４２℃が好ましく、３０〜４０℃がさらに好ましい。培地のｐＨは５〜９の範囲で、中性付近に維持することが好ましい。培地のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、ｐＨ緩衝液等を用いて行う。

本発明の微生物の作製に用いた本発明の組換え体ＤＮＡが、誘導性のプロモーターを有している場合は、必要に応じて、該プロモーターに適したインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、組換え体ＤＮＡとして、ｌａｃプロモーターを有する組換え体ＤＮＡを用いた場合は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を培地に添加してもよく、ｔｒｐプロモーターを有する組換え体ＤＮＡを用いた場合はインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

培養期間は通常１〜６日間であり、培養物中にＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンが生成、蓄積する。
培養終了後、培養物から菌体などの沈殿物を除去し、活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法を併用することにより、培養物中に蓄積したＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンを回収することができる。

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

ＡｒｇＢアミノ酸置換用プラスミドの造成
（１）相同組換え用ベクターの調製
カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を有するプラスミドｐＨＳＧ２９９〔Ｇｅｎｅ，６１，６３（１９８７）〕をＰｓｔＩで処理し、切断部位にＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するレバンシュークラーゼ遺伝子ｓａｃＢを含む２．６キロベースペア（以下、ｋｂと略す）のＤＮＡ断片〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，１１９５（１９９２）〕を連結し、プラスミドｐＥＳＢ３０を得た。

ｐＥＳＢ３０をＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で処理し、アガロース・ゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出、精製した。得られたＤＮＡ断片の両末端をＤＮＡブランティングキット（ＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｔ、宝酒造社製）を用い、添付のプロトコールに従って平滑化した。平滑化したＤＮＡ断片をフェノール・クロロホルムで処理し、これをエタノール沈殿に供して濃縮した後、Ｔａｑポリメラーゼ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｉｓ社製）およびｄＴＴＰ存在下で７０℃、２時間反応させ、３’末端にチミンを１塩基付加して、プラスミドｐＥＳＢ３０−Ｔを調製した。
（２）第２６番目のアラニンがバリンに置換されたＡｒｇＢをコードするＤＮＡの調製
配列番号３０で表される塩基配列の第１９〜３８番目の塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡ）および配列番号３０の第１０２７〜１０４７番目の塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡ（配列番号１４で表される塩基配列からなるＤＮＡ）をＤＮＡ合成機を用いて合成した。

なお、配列番号３０で表される塩基配列の第４５１〜１３３２番目の塩基配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムのＡｒｇＢである配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする領域である。該領域の塩基配列を配列番号２として示す。
また、配列番号２で表される塩基配列の７７番目のシトシンをチミジンに置換した配列番号４で表される塩基配列（配列番号１で表されるアミノ酸配列の２６番目のアラニンがバリンに置換された、配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする）の６８〜８９番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ）、および配列番号４で表される塩基配列の６５〜８７番目の塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号１６で表される塩基配列からなるＤＮＡ）をＤＮＡ合成機を用いて合成した。

斎藤らの方法〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）〕に準じてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の染色体ＤＮＡを調製し、該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡとの組み合わせ、および配列番号１４で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号１６で表される塩基配列からなるＤＮＡの組み合わせをそれぞれプライマーセットとし、ＰｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）および添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより得られた２つの約０．５ｋｂのＰＣＲ産物をそれぞれアガロース・ゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出、精製した。

さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号１４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロース・ゲル電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＫｉｔを用いて抽出、精製し、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片の塩基配列をシークエンサーを用いて決定し、該ＤＮＡ断片は配列番号４で表される塩基配列を有していることを確認した。
（３）第３１番目のメチオニンがバリンに置換されたＡｒｇＢをコードするＤＮＡの調製
配列番号２で表される塩基配列の９１番目のアデニンをグアニンに置換した配列番号１０で表される塩基配列（配列番号１で表されるアミノ酸配列の３１番目のメチオニンがバリンに置換された配列をコード）の８３〜１０２番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡ）および配列番号１０で表される塩基配列の７９〜９９番目の塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号１８で表される塩基配列からなるＤＮＡ）をＤＮＡ合成機を用いて合成した。

配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号１７で表される塩基配列を有するＤＮＡとの組み合わせ、および配列番号１４で表される塩基配列を有するＤＮＡと配列番号１８で表される塩基配列からなるＤＮＡの組み合わせをそれぞれプライマーセットとして用いる以外は（２）と同様の操作を行ない、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
得られたＤＮＡ断片の塩基配列をシークエンサーを用いて決定したところ、該ＤＮＡ断片は、配列番号１０で表される塩基配列を有していることを確認した。
（４）ＡｒｇＢの一アミノ酸置換用プラスミドの造成
上記（２）および（３）で得られた、配列番号４および１０で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を、それぞれＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）およびｄＡＴＰ存在下で７２℃、１０分間処理し、それぞれのＤＮＡ断片の３’末端にアデニンを１塩基付加した。

プラスミドｐＥＳＢ３０−Ｔ、および配列番号４または１０で表される塩基配列を有するＤＮＡを有するＤＮＡ断片にアデニン残基を付加したＤＮＡ断片をそれぞれ混合し、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、リガーゼ反応を行った。反応産物を用い、常法によりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。該菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地〔１０ｇのバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇの酵母エキス（ディフコ社製）、１０ｇの塩化ナトリウム、１６ｇのバクトアガー（ディフコ社製）を水１Ｌに含み、ｐＨ７．０に調整された培地〕上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地を用いて終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法（モレキュラー・クローニング第３版）によりプラスミドを調製した。該プラスミドの塩基配列をシークエンサーを用いて決定し、それぞれのプラスミドに、ｐＥＳＢ３０−Ｔに配列番号４または１０で表される塩基配列を有するＤＮＡがそれぞれ挿入されていることを確認した。

これらのプラスミドのうち配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡを有するプラスミドをｐＥａｒｇＢ２６と命名し、配列番号１０で表される塩基配列を有するＤＮＡを有するプラスミドをｐＥａｒｇＢ３１と命名した。
（５）ＡｒｇＢの二アミノ酸置換用プラスミドの造成
配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡとの組み合わせ、および配列番号１４で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号１６で表される塩基配列からなるＤＮＡとの組み合わせをそれぞれプライマーセットとして用い、ｐＥａｒｇＢ３１を鋳型とする以外は、上記（２）と同様な操作を行ない、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片の塩基配列をシークエンサーを用いて決定したところ、該ＤＮＡ断片は、配列番号１２で表される塩基配列を有していた。

配列番号１２で表される塩基配列を有するＤＮＡを用いる以外は、上記（４）と同様の方法を用いて、ｐＥＳＢ３０−Ｔに配列番号１２で表される塩基配列を有するＤＮＡが組み込まれたプラスミドｐＥａｒｇＢ２６３１を得た。
なお、配列番号１２で表されるＤＮＡは、配列番号１１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第２６番目のアラニンおよび第３１番目のメチオニンがそれぞれバリンに置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡである。

染色体ＡｒｇＢへのアミノ酸置換の導入
（１）野生株の染色体上のＡｒｇＢへのアミノ酸置換の導入
実施例１で調製したプラスミドｐＥａｒｇＢ２６、ｐＥａｒｇＢ３１およびｐＥａｒｇＢ２６３１をそれぞれ用い、レストらの方法〔Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５２，５４１（１９９９）〕に準じて電気穿孔法によりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株を形質転換し、カナマイシン耐性株を選択した。カナマイシン耐性株の中の１株から染色体を調製し、サザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第３版）により調べた結果、それぞれの株の染色体にｐＥａｒｇＢ２６、ｐＥａｒｇＢ３１およびｐＥａｒｇＢ２６３１がＣａｍｐｂｅｌｌタイプの相同組換えにより組み込まれていることが確認された。このような株では、染色体上に元来存在しているＡｒｇＢをコードするＤＮＡと本発明のＤＮＡが染色体上に近接して存在しており、その間で２回目の相同組換えが起こりやすくなっている。

ｓａｃＢがコードするレバンシュークラーゼはショ糖を自殺基質に転換するので、ｓａｃＢを有する微生物はショ糖を含有する培地において生育できない。しかし、元来染色体上に存在しているＡｒｇＢをコードするＤＮＡと本発明のＤＮＡとの間で２回目の相同組換えが起こった株では、いずれかのＤＮＡがｓａｃＢとともに欠失するので、ショ糖を含有する培地においても生育することができる。元来染色体上に存在しているＡｒｇＢをコードするＤＮＡが欠失した場合は、本発明のＤＮＡが、宿主微生物の染色体上に元来存在していたＡｒｇＢをコードするＤＮＡと置換された微生物を取得することができる。

このことを利用して、上記形質転換株をＳｕｃ寒天培地〔１００ｇのショ糖、７ｇの肉エキス、１０ｇのペプトン、３ｇの塩化ナトリウム、５ｇの酵母エキス（ディフコ社製）、および１５ｇのバクトアガー（ディフコ社製）を水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕上に塗布し、３０℃で１日間培養して生育するコロニーを選択した。
このようにして得られたコロニーより染色体ＤＮＡを調製し、該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号１４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとし、ＰｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）と添付のバッファーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の塩基配列をシークエンサーを用いて決定した。

このようにしてｐＥａｒｇＢ２６を導入した株の中から染色体上のＡｒｇＢをコードするＤＮＡが配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡにより置換されている株を取得し、該株をＢ２６株と命名した。
同様に、ｐＥａｒｇＢ３１を導入した株の中から染色体上のＡｒｇＢをコードするＤＮＡが配列番号１０で表される塩基配列を有するＤＮＡにより置換されている株を取得し、該株をＢ３１株と命名した。

また、ｐＥａｒｇＢ２６３１を導入した株の中から染色体上のＡｒｇＢをコードするＤＮＡが配列番号１２で表される塩基配列を有するＤＮＡにより置換されている株を取得し、該株をＢ２６３１株と命名した。
（２）ＡｒｇＲ内部配列欠失用プラスミドの造成
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）〕により調製した。

配列番号１９で表される塩基配列（コリネバクテリウム・グルタミカムのＡｒｇＲをコードするＤＮＡの塩基配列）の第４３〜６２番目の塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２０で表される塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号１９で表される塩基配列の第１４２１〜１４４０番目の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡ（配列番号２１で表される塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号１９で表される塩基配列の第５３９〜５５９番目の塩基配列にタグ配列を付加してなる塩基配列の相補配列からなるＤＮＡ（配列番号２２で表される塩基配列からなるＤＮＡ）および配列番号１９で表される塩基配列の第９４１〜９６１番目の塩基配列にタグ配列を付加してなる塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ）をＤＮＡ合成機を用いて合成した。

なお、配列番号１９で表される塩基配列はコリネバクテリウム・グルタミカムＡｒｇＲをコードするＤＮＡの塩基配列を含む塩基配列である。調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２０で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号２２で表される塩基配列からなるＤＮＡとの組み合わせ、および配列番号２１で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号２３で表される塩基配列からなるＤＮＡとの組み合わせをそれぞれプライマーセットとし、ＰｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）および添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより得られた２つの約０．５ｋｂのＰＣＲ産物をそれぞれアガロース・ゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出、精製した。

さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号２０で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号２１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとし、ＰｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）および添付のバッファーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロース・ゲル電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出、精製し、ＡｒｇＲをコードする配列番号１９で表される塩基配列の第５６０〜９４０番目の領域が欠失した、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。

この断片を実施例１記載の方法に準じてプラスミドｐＥＳＢ３０−Ｔに組み込んでプラスミドｐＥｄｅｌ−ａｒｇＲを得た。
（３）ＡｒｇＲ内部配列欠失株の造成
プラスミドｐＥｄｅｌ−ａｒｇＲを用いる以外は上記（１）と同様の方法により、コリネバクテリウムグルタミカム株ＡＴＣＣ１３０３２株の染色体上のＡｒｇＲをコードするＤＮＡが配列番号１９で表される塩基配列の第５６０〜９４０番目の領域が欠失したＤＮＡで置換された株を取得した。得られた株をＲ株と命名した。
（４）ＡｒｇＲ内部配列欠失株の染色体上のＡｒｇＢへのアミノ酸置換の導入
宿主としてＲ株を用い、プラスミドとしてｐＥａｒｇＢ２６、ｐＥａｒｇＢ３１およびｐＥａｒｇＢ２６３１を用いる以外は、上記（１）と同様の方法により、染色体上のＡｒｇＢをコードするＤＮＡが、配列番号４、１０または１２で表される塩基配列を有するＤＮＡで置換され、かつ染色体上のＡｒｇＲをコードするＤＮＡが配列番号１９で表される塩基配列の第５６０〜９４０番目の領域が欠失したＤＮＡで置換された株を取得した。それぞれの株をＲＢ２６株、ＲＢ３１株およびＲＢ２６３１株と命名した。

ＡｒｇＢアミノ酸置換株によるＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンおよびＬ−シトルリン生産試験
実施例２で取得したＢ２６株、Ｂ３１株、Ｂ２６３１株、Ｒ株、ＲＢ２６株、ＲＢ３１株およびＲＢ２６３１株をＢＹ寒天培地（７ｇの肉エキス、１０ｇのペプトン、３ｇの塩化ナトリウム、５ｇの酵母エキス、１５ｇのバクトアガーを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）で３０℃、２４時間培養した。

ＢＹ寒天培地上に生育した菌体をそれぞれ種培地（２５ｇのショ糖、２０ｇのコーンスティープリカー、２０ｇのペプトン、１０ｇの酵母エキス、０．５ｇの硫酸マグネシウム７水和物、２ｇのリン酸二水素カリウム、３ｇの尿素、８ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの塩化ナトリウム、２０ｍｇのニコチン酸、１０ｍｇの硫酸鉄７水和物、１０ｍｇのパントテン酸カルシウム、１ｍｇの硫酸亜鉛７水和物、１ｍｇの硫酸銅５水和物、１ｍｇのチアミン塩酸塩、１００μｇのビオチンを水１Ｌに含み水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを１０ｇ加えた培地）６ｍｌを含む試験管に植菌し、３２℃で振盪しながら２４時間培養した。

得られた種培養液２ｍＬを、それぞれ本培養培地（６０ｇのグルコース、５ｇのコーンスティープリカー、３０ｇの硫酸アンモニウム、８ｇの塩化カリウム、２ｇの尿素、０．５ｇのリン酸二水素カリウム、０．５ｇのリン酸水素二カリウム、１ｇの硫酸マグネシウム７水和物、１ｇの塩化ナトリウム、２０ｍｇの硫酸鉄７水和物、２０ｍｇのニコチン酸、２０ｍｇのβ−アラニン、１０ｍｇの硫酸マンガン５水和物、１０ｍｇのチアミン塩酸塩、２００μｇのビオチンを水１Ｌに含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．７に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地）２０ｍＬを含むバッフルつきフラスコに植菌し、３２℃で振盪しながら４８時間培養した。

コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株を用いて同様の操作を行い、これをコントロールとした。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンおよびＬ−シトルリンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第１表に示す。

第１表に示すとおり、ＡＴＣＣ１３０３２株（コントロール）、Ｂ２６株、Ｂ３１株、Ｂ２６３１株およびＲ株ではＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンおよびＬ−シトルリンの生産は認められなかった。これに対して、ＲＢ２６株、ＲＢ３１株およびＲＢ２６３１株では、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチンおよびＬ−シトルリンの生産が認められた。

ＡｒｇＢにアミノ酸置換を有するＬ−オルニチン生産株の造成
（１）ＡｒｇＦ内部配列欠失用プラスミド造成用のＤＮＡ造成
配列番号３１で表される塩基配列の第２１〜４３番目の塩基配列にタグ配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２４で表される塩基配列からなるＤＮＡ）および配列番号３１で表される塩基配列の第１３６６〜１３８５番目の塩基配列にタグ配列を付加した塩基配列の相補配列からなるＤＮＡ（配列番号２５で表される塩基配列からなるＤＮＡ）をＤＮＡ合成機を用いて合成した。

配列番号３１で表される塩基配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムのＡｒｇＦをコードするＤＮＡの塩基配列を含む塩基配列である。
（２）ＡｒｇＦ内部配列欠失用プラスミドの造成１
斎藤らの方法〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）〕に準じてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の染色体ＤＮＡを調製した。

該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２４で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号２５で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとし、ＰｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）および添付のバッファーを用いＰＣＲを行った。ＰＣＲにより得られた約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で処理し、アガロース・ゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出、精製した。得られたＤＮＡ断片と、あらかじめＢａｍＨＩによって切断したｐＵＣ１１９（宝酒造社製）とを混合し、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、リガーゼ反応を行った。

該反応産物を用い、モレキュラー・クローニング第３版記載の方法に準じてエシェリヒア・コリＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。該菌株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を用い終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法（モレキュラー・クローニング第３版）記載の方法に準じてプラスミドを調製した。該プラスミドをＮｃｏＩにより切断した後、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用いリガーゼ反応を行って自己環状化させ、エシェリヒア・コリＤＨ５α株を形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドを調製した。該プラスミドの構造を制限酵素を用いて調べたところ、該プラスミドは、ＡｒｇＦをコードするＤＮＡにおいて３６９塩基対が欠失したＤＮＡ断片を含むことを確認した。
（３）ＡｒｇＦ内部配列欠失用プラスミドの造成２
このプラスミドを鋳型とし、配列番号２４で表される塩基配列からなるＤＮＡおよび配列番号２５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとし、ＰｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）および添付のバッファーを用いてＰＣＲを行い、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片をＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）およびｄＡＴＰ存在下で７２℃、１０分間反応させ、３’末端にアデニンを１塩基付加した。実施例１で調製したｐＥＳＢ３０−Ｔおよびアデニンを付加したＤＮＡ断片およびライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、リガーゼ反応を行った。得られたプラスミドをｐＥａｒｇＦと命名した。
（４）ＡｒｇＢにアミノ酸置換を有するＡｒｇＦ内部配列欠失株の造成
宿主としてＢ２６株、Ｂ３１株、Ｒ株、ＲＢ２６株、ＲＢ３１株、およびＡＴＣＣ１３０３２株を用い、プラスミドとしてｐＥａｒｇＦを用いる以外は実施例２（１）と同様の操作を行い、それぞれの株について、染色体上のＡｒｇＦをコードするＤＮＡ内が、該ＤＮＡ内の３６９塩基対が欠失したＤＮＡに置換された株を得、それぞれＦＢ２６株、ＦＢ３１株、ＦＲ株、ＦＲＢ２６株、ＦＲＢ３１株およびＦ株と命名した。

ＡｒｇＢにアミノ酸置換を有するＡｒｇＦ内部配列欠失株によるＬ−オルニチン生産試験
実施例４で調製したＦＢ２６株、ＦＢ３１株、ＦＲ株、ＦＲＢ２６株、ＦＲＢ３１株およびＦ株ならびにＡＴＣＣ１３０３２株を、ＢＹ寒天培地で３０℃で２４時間培養し、各菌株をそれぞれ種培地（２５ｇのグルコース、０．５ｇのリン酸二水素カリウム、１．５ｇのリン酸水素二カリウム、０．５ｇの硫酸マグネシウム、２０ｇのペプトン、３ｇの尿素、５０μｇのビオチン、０．３ｇのＬ−アルギニンを水１Ｌに含み、炭酸カルシウムを１０ｇ加えた培地）６ｍｌを含む試験管に植菌し、３２℃で振盪しながら２４時間培養した。得られた種培養液２ｍＬを、それぞれ本培養培地（１００ｇのグルコース、３０ｇの硫酸アンモニウム、０．６ｇの硫酸マグネシウム、０．５ｇのリン酸二水素カリウム、０．２５ｇのＬ−アルギニン、１６ｍｇの硫酸鉄７水和物、１６ｍｇの硫酸マンガン５水和物、４．９ｍｇの硫酸亜鉛７水和物、４．９ｍｇの硫酸銅５水和物、１６ｍｇの塩化カルシウム、１６ｍｇのβ−アラニン、８ｍｇのチアミン塩酸塩、１８０μｇのビオチン、１６ｇのコーンスティープリカーを水９３０ｍＬに含み水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地）２０ｍＬを含むバッフルつきフラスコに植菌し、３２℃で振盪しながら４８時間培養した。

遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−オルニチンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第２表に示す。

第２表から明らかなように、配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡを有し、かつＡｒｇＦおよびＡｒｇＲ内に欠失を有するＦＲＢ２６株および配列番号１０で表される塩基配列を有するＤＮＡを有し、かつＡｒｇＦおよびＡｒｇＲ内に欠失を有するＦＲＢ３１株によるＬ−オルニチンの生産量は他の株によるＬ−オルニチンの生産量と比べて明らかに高かった。

ＡｒｇＢの第２６番目のアラニンがロイシンまたはイソロイシンに置換したＡｒｇＲ内部配列欠失株の造成
（１）ＡｒｇＢの一アミノ酸置換用プラスミドの造成
配列番号２で表される塩基配列の第７６〜７８番目の領域をｃｔｇに置換した配列番号６で表される塩基配列（配列番号１で表されるアミノ酸配列の２６番目のアラニンがロイシンに置換された、配列番号５で表されるアミノ酸配列をコード）の６８〜８９番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２６で表される塩基配列からなるＤＮＡ）、および配列番号６で表される塩基配列の６５〜８７番目の塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２７で表される塩基配列からなるＤＮＡ）をＤＮＡ合成機を用いて合成した。

同様に、配列番号２で表される塩基配列の第７６〜７８番目の領域をａｔｃに置換した配列番号８で表される塩基配列（配列番号１で表されるアミノ酸配列の２６番目のアラニンがイソロイシンに置換された、配列番号７で表されるアミノ酸配列をコード）の６８〜８９番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２８で表される塩基配列からなるＤＮＡ）、および配列番号８で表される塩基配列の６５〜８７番目の塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡ）をＤＮＡ合成機を用いて合成した。

実施例１の（２）において、配列番号１５および１６で表される塩基配列からなるＤＮＡのかわりに配列番号２６および２７で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いる以外は同様の操作を行ない、配列番号６で表され塩基配列を有するＤＮＡを有する約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。また、実施例１の（２）において、配列番号１５および１６で表される塩基配列からなるＤＮＡのかわりに配列番号２８および２９で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いる以外は同様の操作を行ない、配列番号８で表され塩基配列を有するＤＮＡを有する約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。

実施例１の（４）において、配列番号４または１０で表される塩基配列を有するＤＮＡを有するＤＮＡ断片のかわりに、配列番号６または８で表される塩基配列を有するＤＮＡを有するＤＮＡ断片を用いる以外は同様の操作を行ない、プラスミドｐＥＳＢ３０−Ｔに、配列番号６または８で表される塩基配列を有するＤＮＡが組み込まれたプラスミドを取得した。それぞれのプラスミドをｐＥａｒｇＢ２６ＬおよびｐＥａｒｇＢ２６Ｉと命名した。
（２）ＡｒｇＲ内部配列欠失株へのＡｒｇＢ−アミノ酸置換の導入
宿主としてＲ株を用い、プラスミドとしてｐＥａｒｇＢ２６ＬおよびｐＥａｒｇＢ２６Ｉを用いる以外は、実施例２（１）と同様の操作を行ない、Ｒ株において染色体上のＡｒｇＢをコードするＤＮＡが配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡに置換された株および染色体上のＡｒｇＢをコードするＤＮＡが配列番号８で表される塩基配列を有するＤＮＡに置換された株をそれぞれ取得した。それぞれの株を、ＲＢ２６Ｌ株、ＲＢ２６Ｉ株と命名した。
（３）ＡｒｇＢアミノ酸置換およびＡｒｇＲ内部配列欠失株によるＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンおよびＬ−シトルリン生産試験
ＲＢ２６株、ＲＢ２６Ｌ株およびＲＢ２６Ｉ株を用いる以外は、実施例３と同様の方法でこれらの株のＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンおよびＬ−シトルリンの生産性を調べた。

結果を第３表に示す。

第３表から明らかなように、配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡを有するＲＢ２６Ｌ株および配列番号８で表される塩基配列を有するＤＮＡを有するＲＢ２６Ｉ株のいずれも配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡを有するＲＢ２６と同様に、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチンおよびＬ−シトルリンを生産した。なお、ＲＢ２６Ｌ株およびＲＢ２６Ｉ株によるこれらのアミノ酸の生産量は、ＲＢ２６株による生産量より高かった。

ＡｒｇＢアミノ酸置換およびＡｒｇＧ内部配列欠失株によるＬ−シトルリン生産
コリネバクテリウム・グルタミカムのＡｒｇＧをコードするＤＮＡの塩基配列を含む配列番号３２で表される塩基配列をもとにプライマーを合成し、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＡｒｇＧをコードするＤＮＡにおいて約４００塩基対が欠失したＤＮＡ断片を含むプラスミドを構築する。

該プラスミドからＡｒｇＧをコードするＤＮＡにおいて約４００塩基対が欠失したＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断片の３’末端にアデニンを１塩基付加する。実施例１で調製したｐＥＳＢ３０−Ｔ、アデニンを付加したＤＮＡ断片およびライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用いてリガーゼ反応を行って得られるプラスミドをｐＥａｒｇＧとする。
以上の方法は実施例４記載の方法に準じて行なうことができる。

宿主としてＢ２６株、Ｂ３１株、Ｒ株、ＲＢ２６株、ＲＢ３１株、およびＡＴＣＣ１３０３２株を用い、プラスミドとしてｐＥａｒｇＧを用いる以外は実施例２（１）と同様の操作を行い、それぞれの株について、染色体上のＡｒｇＧをコードするＤＮＡ内が、該ＤＮＡ内の約４００塩基対が欠失したＤＮＡに置換された株を調製し、それぞれＧＢ２６株、ＧＢ３１株、ＧＲ株、ＧＲＢ２６株、ＧＲＢ３１株およびＧ株とする。

ＧＢ２６株、ＧＢ３１株、ＧＲ株、ＧＲＢ２６株、ＧＲＢ３１株およびＧ株ならびにＡＴＣＣ１３０３２株を、ＢＹ寒天培地で３０℃で２４時間培養し、各菌株をそれぞれ種培地（２５ｇのグルコース、０．５ｇのリン酸二水素カリウム、１．５ｇのリン酸水素二カリウム、０．５ｇの硫酸マグネシウム、２０ｇのペプトン、３ｇの尿素、５０μｇのビオチン、０．３ｇのＬ−アルギニンを水１Ｌに含み、炭酸カルシウムを１０ｇ加えた培地）６ｍｌを含む試験管に植菌し、３２℃で振盪しながら２４時間培養する。培養により得られる種培養液２ｍＬを、それぞれ本培養培地（１００ｇのグルコース、３０ｇの硫酸アンモニウム、０．６ｇの硫酸マグネシウム、０．５ｇのリン酸二水素カリウム、０．２５ｇのＬ−アルギニン、１６ｍｇの硫酸鉄７水和物、１６ｍｇの硫酸マンガン５水和物、４．９ｍｇの硫酸亜鉛７水和物、４．９ｍｇの硫酸銅５水和物、１６ｍｇの塩化カルシウム、１６ｍｇのβ−アラニン、８ｍｇのチアミン塩酸塩、１８０μｇのビオチン、１６ｇのコーンスティープリカーを水９３０ｍＬに含み水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地）２０ｍＬを含むバッフルつきフラスコに植菌し、３２℃で振盪しながら４８時間培養する。

遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−シトルリンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量する。

本発明によれば、改変されたＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼおよびそれらをコードするＤＮＡが得られ、該ＤＮＡを有する微生物を用いることにより、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンを効率的に生産することができる。

配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims

（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６または３１番目のアミノ酸がＬ−バリン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−イソロイシンに置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６および３１番目のアミノ酸がＬ−バリン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−イソロイシンに置換されたアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）上記（ｉ）または（ｉｉ）のアミノ酸配列において、置換された部位以外の１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに比べＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が低減または解除されたＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号３、５、７、９および１１で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号３、５および７で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において、それぞれの配列の第２６番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列中の１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号９で表されるアミノ酸配列において、第３１番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列中の１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または
（ｉｖ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、第２６および３１番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列中の１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに比べＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が低減または解除されたＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
請求項１または2記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
配列番号４、６、８、１０および１２で表される塩基配列から選ばれる塩基配列からなるＤＮＡ。
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−バリン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−イソロイシンであるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第３１番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−バリン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−イソロイシンであるポリペプチドをコードするＤＮＡ、または
（ｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２６番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−バリン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−イソロイシンであり、かつ第３１番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基がＬ−バリン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−イソロイシンであるポリペプチドをコードするＤＮＡであり、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに比べＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が低減または解除されたＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ
（ｉ）配列番号２で表される塩基配列の５’末端から第７６〜７８番目の領域に相応する領域がグアニン−チミジン−チミジン、シトシン−チミジン−グアニン、もしくはアデニン−チミジン−シトシンである塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号２で表される塩基配列の５’末端から第９１〜９３番目の領域に相応する領域がグアニン−チミジン−グアニンである塩基配列からなるＤＮＡ、または
（ｉｉｉ）配列番号２で表される塩基配列の５’末端から第７６〜７８番目の領域に相応する領域がグアニン−チミジン−チミジン、シトシン−チミジン−グアニン、もしくはアデニン−チミジン−シトシンであり、かつ第９１〜９３番目の領域に相応する領域がグアニン−チミジン−グアニンである塩基配列からなるＤＮＡであり、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに比べＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が低減または解除されたＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
請求項３〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
請求項７記載の組換え体ＤＮＡを導入して得られる微生物。
請求項３〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡを有する微生物。
アルギニン・リプレッサーのアルギニン・オペロンの転写抑制活性が低下または喪失していることを特徴とする請求項８または９記載の微生物。
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ活性が低下または喪失していることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の微生物。
アルギニノコハク酸シンターゼ活性が低下または喪失していることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１項に記載の微生物。
微生物がコリネバクテリウム属に属する微生物である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の微生物。
微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物である、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の微生物。
請求項８〜１４のいずれか１項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンを生成、蓄積させ、該培養物からＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンを採取することを特徴とするＬ−アルギニン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンの製造法。