JP4883666B2

JP4883666B2 - 培養用容器及び培養用ユニット

Info

Publication number: JP4883666B2
Application number: JP2005017355A
Authority: JP
Inventors: 喜春白川部; 亜三子二瓶; 明井上
Original assignee: Seiko Instruments Inc
Current assignee: Seiko Instruments Inc
Priority date: 2005-01-25
Filing date: 2005-01-25
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2025-01-25
Also published as: JP2006204123A

Description

本発明は、例えば細胞などの生体試料を培養する培養用容器及び培養用ユニットに関する。

一般に、例えばガラスまたはプラスチックで構成されたシャーレを培養用容器として用い、細胞などの生体試料を培養する方法として、シャーレ内に生体試料を配置し、このシャーレを生体試料が増殖するために十分な培養環境中で保存、維持することによって目的となる生体試料を培養するものがある。ここで、圧力や温度をかけることによって、より生体試料を生体環境に近い模擬環境で増殖させる方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
特開２００１−２３８６６３号公報

しかしながら上記従来の培養用容器には、以下の問題がある。すなわち、上記従来の培養用容器では、生体試料を培養した後で培養した試料の観察を行ったり、また観察時に生体試料に対して刺激を与えたりすることが必要なときに、培養した生体試料を刺激を与える機能を有する他の容器に移し換えたり、外部から刺激を与えたりする必要がある。このとき、培養環境からの移動による剥離などを伴う物理的な強大な負荷が生体試料にかかり、生体試料が破壊される場合がある。また、移し変えることによって温度やＰＨ環境、周囲のイオン状態なども培養環境と著しく変化することによっても負荷が加わることで、より自然な環境での迅速な観察が困難であるという問題がある。
また、例えば生体試料に対して物理的刺激を与えることで細胞分裂を促して生体試料の培養を促進させるときに、容器を介して外部から例えば振動刺激のような刺激を与えるか、または容器を収納した装置そのものを加振などすることによって行っている。しかしながらこれらの方法では、生体試料に与える振動刺激を独立して制御することができず、一括に多様化した培養の促進を行うことが不可能である。

本発明は、前述の課題に鑑みてなされたもので、培養後に生体試料を移し換えることなく培養から観察までを行うことができると共に、容器内にある生体試料に振動刺激をそれぞれ独立して与えることができる培養用容器及び培養用ユニットを提供することを目的とする。

本発明は、前記課題を解決するために、以下の構成を採用した。すなわち、本発明にかかる培養用容器は、上面に培養対象となる試料を載置する試料載置部を備える培養用容器において、前記試料載置部の複数箇所に前記試料を載置可能な凹部が形成され、前記凹部ごとに前記試料に対して独立して振動刺激を与えることが可能な振動刺激印加部が設けられていることを特徴とする。

この発明によれば、試料を振動刺激印加部の上に載置することで、試料の底面に対して振動刺激印加部から振動刺激が与えられるので、試料の培養後に試料を他の容器に移し換えることなく観察を行うことができる。したがって、試料に対して物理的な負荷や環境変化による負荷を与えることなく自然な環境で培養後の観察を行うことが可能となる。また、各試料が同じ培液である同一環境内に載置された状態でも異なる振動刺激を与えることができ、振動刺激の強度のみによって各試料の培養状態が変化するので、誤差要因が小さくなり、より効率のよい培養試験を行うことができる。
ここで、培養対象となる複数の試料がそれぞれ異なる振動刺激印加部の上に載置されるように振動刺激印加部を形成すると、試料に対してそれぞれ独立して振動刺激を与えられるので、それぞれの試料に対して異なる強度の振動刺激を加えることや、複数の試料のうちの所望の試料のみに振動刺激を印加することができる。
また、試料が複数の振動刺激印加部の上に載置されるように振動刺激印加部を形成すると、例えば試料と接触している複数の振動刺激印加部のうちの一部から振動刺激を与えることによって、試料に対して部分的に振動刺激の印加を行うことができる。これにより、試料の培養促進のための局所的な振動刺激を与えることができる。また、複数の振動刺激印加部のそれぞれで所望の強度の振動刺激を試料に対して印加することで、試料に対して所望の強度分布を有する振動刺激を与えることができる。

また、本発明にかかる培養用容器は、底部と該底部の周縁部からほぼ垂直上方に向かって設けられた周壁部とを備え、前記底部の上面に前記試料載置部が一体的に形成されていることが好ましい。
この発明によれば、容器の外面に振動刺激印加部からの配線などを設け、培養用容器の外部から振動刺激印加部による刺激の強度を制御することができる。

また、本発明にかかる培養用容器は、底部と、該底部の周縁部からほぼ垂直上方に向かって設けられた周壁部と、上面に前記試料載置部が設けられた試料載置部材とを備え、該試料載置部材が、前記底部に対して着脱自在に設けられていることが好ましい。
この発明によれば、振動刺激印加部が形成された試料載置部材を底部から着脱自在とすることで、培養用容器の適用範囲が広がる。

また、本発明にかかる培養用容器は前記振動刺激印加部が、前記試料載置部に互いが異なる２方向に等間隔で行列状となるように配置されているこが好ましい。
この発明によれば、複数の試料がそれぞれ異なる複数の振動刺激印加部の上に載置されるように振動刺激印加部を形成し、それぞれの試料に対して異なる強度の振動刺激を加えるときに、振動刺激を与えた箇所の特定が容易となる。以上より、試料に対して振動刺激を与える制御が容易となる。

また、本発明にかかる培養用容器は、前記振動刺激印加部が、上面に載置された前記試料の生体情報を取得する活性センサを備えることが好ましい。
この発明によれば、振動刺激印加部上に試料を載置したときに、試料の生体情報を取得し、試料の衰弱状態などを確認しながら試料に対して振動刺激を与えることができる。これにより、より効率よく試料の培養を行うことができる。

また、本発明にかかる培養用ユニットは、上記記載の培養用容器と、前記振動刺激印加部を駆動させて前記試料に対して刺激を与える駆動手段とを備えることを特徴とする。
この発明によれば、駆動手段がそれぞれの振動刺激印加部を駆動させることで、振動刺激印加部の上に載置された試料に対して直接振動刺激が与えられる。ここで、駆動手段が各振動刺激印加部に対して振動刺激の強度を適宜設定することにより、与える振動刺激の強度分布を形成することができる。

この発明にかかる培養用容器及び培養用ユニットによれば、試料に対して直接振動刺激を与えることができ、試料の培養後に試料を他の容器に移し換えることなく観察を行うことができる。したがって、物理的な負荷や環境変化による負荷を試料に与えずに自然な環境で培養後の観察を行うことができる。また、複数の試料がそれぞれ異なる振動刺激印加部の上に載置されるように構成することで、複数の試料のそれぞれに対して異なる強度の振動刺激を印加することや、複数の試料のうちの所望の試料のみに振動刺激を印加することができる。そして、試料が複数の振動刺激印加部の上に載置されるように構成することで、試料に対して局所的に振動刺激を与えることや、試料に対して所望の強度分布を有する振動刺激を与えることができる。

以下、本発明にかかる培養用容器及び培養用ユニットの第１の実施形態について、図１及び図２を参照しながら説明する。なお、本実施形態において、シャーレ（培養用容器）１は、細胞などの生体試料を培養するために用いられる培養用容器である。

本実施形態によるシャーレ１は、図１及び図２に示すように、表面上に培養対象となる試料Ｓを載置可能な底部１１と、底部１１の周縁部からほぼ垂直上方に向かって設けられた周壁部１２とを備えている。
底部１１は、ガラスによって構成され、上面が観測対象である試料Ｓを載置する試料載置部１５となっており、行方向及び列方向に等間隔でマトリックス状となるように凹部１６が形成されている。この凹部１６は、その上面の面積が試料Ｓとほぼ同等となるように形成されている。また、底部１１は、試料載置部１５の複数箇所に試料Ｓに対して振動刺激を与える振動子（振動刺激印加部）１７と、この振動子１７に対して電流を流す導電パターン１８と、試料Ｓの生体情報を検出する活性センサ１９とを備えている。

振動子１７は、圧電材料であるＰＺＴ（チタン酸ジルコン酸鉛）によって構成されており、底部１１に形成された凹部１６に配置されている。また、各振動子１７の上に試料がそれぞれ載置されており、振動子１７が試料Ｓに対して例えば振動振幅が１０μｍ〜２０μｍ、振動周波数が１０Ｈｚ〜１０ＭＨｚである振動刺激を与えるように構成されている。なお、この振動子１７は、パターニングによって底部１１と一体的に形成されている。また、振動子１７には、ＰＺＴに限らず、ＺｎＯ（酸化亜鉛）など他の圧電材料を用いてもよい。

導電パターン１８は、透明電極であるＩＴＯ（Indium Tin Oxide：酸化インジウムスズ）によって構成されており、振動子１７と同様にパターニングによって底部１１と一体的に形成されている。そして、この導電パターン１８の一端は、底部１１の周縁部に設けられたコネクタ２１と電気的に接続されている。このコネクタ２１は、後述する駆動手段３１のコネクタ３３に接続されることで、導電されて振動子１７が振動するように構成されている。なお、試料載置部１５の表面には、振動子１７と試料Ｓとを電気的に絶縁するための絶縁層２２が形成されている。また、導電パターン１８には、ＩＴＯに限らず、他の導電性材料を用いてもよい。

活性センサ１９は、試料Ｓと接触する電極によって形成されており、試料Ｓの活性状況を電気的な信号として検出するように構成されている。また、この活性センサ１９は、信号伝達パターン２３を介してコネクタ２１と電気的に接続されており、試料Ｓから得られた電気信号をコネクタ１８から出力するように構成されている。
信号伝達パターン２３は、導電パターン１８と同様にパターニングによって底部１１と一体的に形成されている。

上記シャーレ１には、図１に示すように、振動子１７を駆動する駆動手段３１に接続される。そして、シャーレ１と駆動手段３１とによって培養用ユニット３２が構成される。
この駆動手段３１は、コネクタ２１に接続可能なコネクタ３３と、導電パターン１８に流す電流量を制御する制御手段３４とを備えている。そして、このコネクタ３３とコネクタ２１とを接続することによって、導電パターン１８に電流を流すように構成されており、導電パターン１８に電流を流すことによって、振動子１７が圧電変換により振動する。また、この駆動手段３１は、各振動子１７に対してそれぞれ独立して接続され、各振動子１７で異なる強度の振動刺激を発生させることができるように構成されている。

次に、このシャーレ１の製造方法について、図を参照しながら説明する。
まず、ガラス基板４１（図３（ａ）参照）の上面に、圧電材料であって振動電極膜となるＰＺＴ膜４２をスパッタ成膜する（図３（ｂ）参照）。そして、ＰＺＴ膜４２の上面に、レジストを塗布してレジスト膜４３を形成し（図３（ｃ）参照）、フォトリソグラフィ技術を用いてパターニングする（図３（ｄ）参照）。その後、このレジスト膜４３をマスクとしてＰＺＴ膜４２のエッチングを行い、パターニングすることで、図２に示す振動子１７を形成する（図４（ａ）参照）。なお、レジスト膜４３として用いられるレジストは、ポジでもネガでもよい。その後、マスクとしたレジスト膜４３を除去する。

続いて、ガラス基板４１及びＰＺＴ膜４２の上面にレジストを塗布してレジスト膜４４を形成し（図４（ｂ）参照）、フォトリソグラフィ技術を用いてパターニングすることで、レジスト膜４４にガラス基板４１またはＰＺＴ膜４２に至る貫通孔４４ａを形成する（図４（ｃ）参照）。そして、貫通孔４４ａを充填するように、レジスト膜４４の上面に、導電性材料であるＩＴＯ膜４５をスパッタ成膜する（図４（ｄ）参照）。その後、リフトオフを行うことによって、レジスト膜４４及びレジスト膜４４の上面に形成されたＩＴＯ膜４５を除去し、図２に示す導電パターン１８及び信号伝達パターン２３と、図１に示すコネクタ２１に電気的に接続される取り出し電極とを形成する（図５（ａ）参照）。なお、ＩＴＯ膜４５を、蒸着によって形成してもよい。また、レジスト膜４４として用いられるレジストは、上述と同様に、ポジでもネガでもよい。

次に、ガラス基板４１、ＰＺＴ膜４２及びＩＴＯ膜４５の上面に、絶縁材料である二酸化シリコン（ＳｉＯ_２）膜４６をスパッタ成膜する（図５（ｂ）参照）。さらに、ＳｉＯ_２膜４６の上面にレジストを塗布してレジスト膜４７を形成し（図５（ｃ）参照）、フォトリソグラフィ技術を用いてパターニングする（図５（ｄ）参照）。そして、このレジスト膜４７マスクとしてＳｉＯ_２膜４６のエッチングを行い、パターニングすることで、図２に示す絶縁層２２を形成する（図６（ａ）参照）。なお、ＳｉＯ_２膜４６を、蒸着やＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition：化学蒸着）法によって形成してもよい。また、レジスト膜４７として用いられるレジストは、上述と同様に、ポジでもネガでもよい。その後、レジスト膜４７を除去する（図６（ｂ）参照）。

続いて、ガラス基板４１、ＩＴＯ膜４５及びＳｉＯ_２膜４６の上面に、レジストを塗布してレジスト膜４８を形成し（図６（ｃ）参照）、フォトリソグラフィ技術を用いてパターニングすることで、レジスト膜４８にガラス基板４１またはＩＴＯ膜４５に至る貫通孔４８ａを形成する（図６（ｄ）参照）。そして、貫通孔４８ａを充填するように、レジスト膜４８の上面に、導電性材料であるＰｔ（プラチナ）膜４９をスパッタ成膜し（図７（ａ）参照）、リフトオフを行うことによって、レジスト膜４８及びレジスト膜４８の上面に形成されたＰｔ膜４９を除去し、図２に示す活性センサ１９と、図１に示すコネクタ２１に電気的に接続される取り出し電極とを形成する（図７（ｂ）参照）。なお、Ｐｔ膜４９を、蒸着によって形成してもよい。また、レジスト膜４８として用いられるレジストは、上述と同様に、ポジでもネガでもよい。

次に、ガラス基板４１、ＳｉＯ_２膜４６及びＰｔ膜４９の上面に、ポリイミドなどのレジストを塗布することによって形成された保護層５０を設け（図７（ｃ）参照）、フォトリソグラフィ技術を用いてパターニングすることで、図１及び図２に示す凹部１６を形成する（図７（ｄ）参照）。以上のようにしてシャーレ１を製造する。

以上のように構成されたシャーレ１及び培養用ユニット３２を用いた試料Ｓの培養方法について説明する。
まず、試料載置部１５上に細胞を配置して培液中で活性状態を保つ。そして、コネクタ２１を駆動手段３１のコネクタ３３に接続した状態で、制御手段３４で振動子１７に電流を流すことによって試料Ｓに対して所望の強度を有する振動刺激を与える。このとき、活性センサ１９で試料Ｓの活性状況を確認しながら与える振動刺激の強度を調節したり、衰弱している試料Ｓに対する振動刺激の印加を中止したりする。
シャーレ１による培養後に培養した試料Ｓの観察を行うときには、シャーレ１を周知の光学顕微鏡のステージ上に載置して観察を行う。ここで、試料Ｓに対して振動刺激を与えながら光学顕微鏡による観察を行ってもよい。

以上のように構成されたシャーレ１及び培養用ユニット３２によれば、試料Ｓの裏面から試料Ｓに対して直接振動刺激を与えることができ、試料Ｓの培養後に試料Ｓを他の容器に移し換えることなく観察を行うことができる。したがって、物理的な負荷や環境変化による負荷を試料Ｓに与えずに自然な環境で培養後の観察を行うことができる。

また、複数の試料Ｓがそれぞれ異なる振動子１７の上に載置されるので、各試料Ｓに対してそれぞれ異なる強度の振動刺激を印加することや、所望の試料Ｓのみに振動刺激を印加することができる。ここで、各試料Ｓが同じ培液である同一環境内に載置された状態で異なる振動刺激を与えることができるので、振動刺激の強度のみによって各試料Ｓの培養状態が変化するので、誤差要因が小さくなり、より効率のよい培養試験を行うことができる。

次に、本発明にかかる測定用容器の第２の実施形態について説明する。なお、以下の説明において、上記実施形態で説明した構成要素には同一符号を付し、その説明を省略する。
第２の実施形態と第１の実施形態との異なる点は、第１の実施形態では、試料載置部１５が底部１１に設けられているのに対して、第２の実施形態のシャーレ５１では、試料載置部１５が底部５２に着脱自在に設けられた試料載置板（試料載置部材）５３に設けられている点である。

すなわち、本実施形態のシャーレ５１は、図８及び図９に示すように、底部５２と周縁部からほぼ垂直上方に向かって設けられた周壁部５４とを有するシャーレ本体５５と、シャーレ本体５５の内部に着脱自在に設けられた試料載置板５３とを備えている。
試料載置板５３には、上述した第１の実施形態と同様に、各振動子１７と導電パターン１８を介して接続される配線ケーブル５６が外部に露出して設けられている。そして、この配線ケーブル５６の先端は、上述したコネクタ３３に接続可能となっている。

本実施形態のシャーレ５１を用いて試料Ｓを培養する際には、まずシャーレ本体５５に試料載置板５３を沈降させる。その後、配線ケーブル５６の先端を培養用ユニット３２のコネクタ３３に接続し、上述した第１の実施形態と同様にして試料Ｓの培養を行う。そして、培養後に観察を行うときも上述と同様にすることで行う。

以上のように構成されたシャーレ５１によれば、上述した第１の実施形態と同様の作用、効果を有するが、試料載置板５３をシャーレ本体５５に対して着脱自在とすることによってシャーレ本体５５をディスポーザブルとすることができる。

なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、種々の変更を加えることが可能である。
例えば、上記実施形態において、図１０に示すように、振動子６１の上面の面積が試料Ｓに対して小さくなるように形成されると共に複数の振動子６１上に試料Ｓが載置されるように構成したシャーレ６２であってもよい。このようにすると、例えば複数の振動子６１のうちの一部から振動刺激を与えることによって、試料Ｓに対して部分的に振動刺激を印加することができる。これにより、試料Ｓの培養促進のための局所的な振動刺激を与えることができる。また、振動子６１のそれぞれで所望の強度の振動刺激を試料Ｓに対して印加することで、試料Ｓに対して所望の強度分布を有する振動刺激を与えることができる。

また、試料載置部において所望の位置に試料を載置させるために、試料を載置させる所望の位置に例えば金薄膜による地台を設けてもよい。このようにすることで、試料と地台との間で金−チオール反応によって試料のＳＨ基と地台との結合を促進させて地台を設けた所望位置に試料が載置されやすくなる。また、試料を載置させる所望の位置を除いて、試料と結合しにくい疎液膜を形成してもよい。このようにすることで、試料載置部の所望の位置以外に試料が載置されることを抑制する。

本発明の第１の実施形態にかかる観測用ユニットを示す概略平面図である。図１のシャーレを示す概略断面図である。図１のシャーレの製造工程を説明する概略断面図である。図３に続く、図１のシャーレの製造工程を説明する概略断面図である。図４に続く、図１のシャーレの製造工程を説明する概略断面図である。図５に続く、図１のシャーレの製造工程を説明する概略断面図である。図６に続く、図１のシャーレの製造工程を説明する概略断面図である。本発明の第２の実施形態にかかる観測用ユニットを示す概略平面図である。図８のシャーレを示す概略部分断面図である本発明の実施形態以外の、本発明を適用可能なシャーレを示す部分拡大平面図である。

符号の説明

１、５１、６２シャーレ（培養用容器）
１１、５２底部
１２、５４周壁部
１５試料載置部
１７、６１振動子（刺激印加部）
１９活性センサ
３１駆動手段
３２培養用ユニット
５３試料載置板（試料載置部材）
Ｓ試料

Claims

上面に培養対象となる試料を載置する試料載置部を備える培養用容器において、
前記試料載置部の複数箇所に前記試料を載置可能な凹部が形成され、前記凹部ごとに前記試料に対して独立して振動刺激を与えることが可能な振動刺激印加部が設けられていることを特徴とする培養用容器。
底部と該底部の周縁部からほぼ垂直上方に向かって設けられた周壁部とを備え、
前記底部の上面に前記試料載置部が一体的に形成されていることを特徴とする請求項１に記載の培養用容器。
底部と、該底部の周縁部からほぼ垂直上方に向かって設けられた周壁部と、上面に前記試料載置部が設けられた試料載置部材とを備え、
該試料載置部材が、前記底部に対して着脱自在に設けられていることを特徴とする請求項１に記載の培養用容器。
前記振動刺激印加部が、前記試料載置部に互いが異なる２方向に等間隔で行列状となるように配置されていることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の培養用容器。
前記振動刺激印加部が、上面に載置された前記試料の生体情報を取得する活性センサを備えることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の培養用容器。
請求項１から５のいずれか１項に記載の培養用容器と、前記振動刺激印加部を駆動させて前記試料に対して振動刺激を与える駆動手段とを備えることを特徴とする培養用ユニット。