JP4884231B2 - コネキシン２６阻害活性を有する多量体型オレアミド誘導体と、その癌治療等への利用 - Google Patents
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Description
本発明は、コネキシン２６阻害活性を有する多量体型オレアミド誘導体とその利用に関する。これらの新規オレアミド誘導体は、研究用試薬として利用できるほか、癌の転移抑制・増殖抑制など有用な生理活性を示すことから、癌の予防薬・治療薬をはじめとして、医薬、サプリメント、機能性食品などの各種用途を有し、産業上広く利用できるものである。
コネキシンは、ギャップ結合を構成する膜結合タンパク質ファミリーの総称である。コネキシンは、その分子量の違いによって、１２を超えるサブタイプが発見されている。分子量が２６ｋＤａのものはコネキシン２６、４３ｋＤａのものはコネキシン４３と称されている。
コネキシンの６量体は、コネクソンと呼ばれ、導管状構造を形成して細胞膜を貫通する。コネクソンが隣接細胞間で連結したものがギャップ結合であり、この連結によって形成された導管内をイオンや低分子量タンパク質が細胞から細胞へと受け渡される。この機構は、上皮性細胞の増殖の恒常性維持などのために必須であると考えられている。
本発明者らは以前、癌の転移機序を遺伝子レベルで解明する基礎研究を行っている中で、コネキシン２６が癌転移に密接に関わっていること、より具体的には、コネキシン２６の機能を抑制することにより癌の転移が抑制されることを見出している（下記の特許文献１および非特許文献１）。
また、ギャップ結合を阻害する物質として、オレイン酸のアミド誘導体であるオレアミドおよびその誘導体が知られている（下記の非特許文献２）。本発明者らは、オレアミド誘導体のうち、コネキシン２６を特異的に阻害し、良好な癌転移抑制活性を示すものを同定し、その１つについて「ＭＩ−１８」と命名した（下記の特許文献２）。
なお、下記の特許文献３・４には、イミダゾリジンの原料として、２量体型オレアミド誘導体を使用する例が記載されている。また、生成物であるイミダゾリジンは、in vitroでバクテリア、酵母等の成長阻害活性を有することが記載されている。
現在の癌治療では、抗癌剤の投与、癌細胞および癌組織の摘出、放射線治療など、直接癌細胞に対する治療が行われている。しかし、癌細胞は転移が非常に早いため、癌治療を行っている途中に、別の組織に転移する場合が多い。その結果、治療が長期化し、あるいは、転移が広がり死に至る事態が生じ得る。
したがって、癌治療の治療効果を上昇させるためには、抗癌剤投与や癌組織摘出などによる直接的な癌治療のほかに、癌の転移を抑制することが重要となる。しかしながら、癌転移抑制剤の研究開発は難航しており、臨床的に確立された癌転移抑制剤は未だ開発されていない。
前述のように、本発明者らは、コネキシン２６を特異的に阻害し、良好な癌転移抑制活性を示すＭＩ−１８等のオレアミド誘導体を同定している。医薬開発などに産業利用するためには、さらに良好な物質の探索を行い、高いコネキシン２６阻害活性を示し、取扱いの容易性、安定性、非毒性などの点でも優れたオレアミド誘導体を同定することが求められている。こうして得られたオレアミド誘導体は、癌転移抑制剤としても非常に有用と考えられる。
本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであって、コネキシン２６阻害活性を有する新規オレアミド誘導体の開発をその課題とする。本発明はさらに、得られた新規オレアミド誘導体を用いた医薬、サプリメント、機能性食品、および研究用試薬の提供をその課題とする。
本発明者らは、構造上安定な多量体型オレアミド誘導体を種々合成し、この中から色素−トランスファーアッセイによってコネキシン２６阻害活性を示す物質を探索した結果、コネキシン２６を特異的に阻害する複数の新規オレアミド誘導体を見出した。このうち良好なコネキシン２６阻害活性を示した後述のＭＩ−２２は、癌自然転移を顕著に抑制し、細胞毒性も殆どなく生体に安全な物質であり、油状物で取扱いにも優れ、さらに、癌の増殖抑制能（抗腫瘍効果）も認められた。これらの知見等から、今回得られた新規オレアミド誘導体は、抗癌自然転移薬、抗癌増殖薬などとして医薬開発に利用可能であり、その他、サプリメント、機能性食品、研究用試薬などとしても有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、医療及び産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｌ）の発明を包含するものである。
Ａ） 下記の式（１）により表される二量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
（ただし、ｎは３，５又は８の整数である。炭素、水素は慣用表記にしたがって省略した。数字は炭化水素の繰り返し個数である。「Ｅｔ2」はジエチル基を表す。他の式の表記も同様である。）
上記式（１）中、ｎ＝３のものを以下「ＭＩ−２２」と称する。同様に、上記式（１）中、ｎ＝５、ｎ＝８のものを、それぞれ、以下「ＭＩ−３９」、「ＭＩ−４０」と称する。
Ｂ） 下記の式（２）により表される二量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
（ただし、ｎは３又は５の整数である。）
上記式（２）中、ｎ＝３、ｎ＝５のものを、それぞれ、以下「ＭＩ−４５」、「ＭＩ−４６」と称する。
Ｃ） 下記の式（３）により表される二量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
（ただし、ｎは５又は８の整数である。）
上記式（３）中、ｎ＝５、ｎ＝８のものを、それぞれ、以下「ＭＩ−４１」、「ＭＩ−４２」と称する。
Ｄ） 下記の式（４）により表される二量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
（ただし、ｎは３又は５の整数である。）
上記式（４）中、ｎ＝３、ｎ＝５のものを、それぞれ、以下「ＭＩ−４７」、「ＭＩ−４８」と称する。
Ｅ） 下記の式（５）により表される三量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
上記式（５）により表されるオレアミド誘導体を、以下「ＭＩ−５０」と称する。
Ｆ） 下記の式（６）により表される四量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
上記式（６）により表されるオレアミド誘導体を、以下「ＭＩ−５２」と称する。
Ｇ） 下記の式（７）により表される三量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
上記式（７）により表されるオレアミド誘導体を、以下「ＭＩ−５１」と称する。
Ｈ） 下記の式（８）により表される四量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
上記式（８）により表されるオレアミド誘導体を、以下「ＭＩ−５３」と称する。
Ｉ） 上記の式（１）〜（８）のいずれかにより表される多量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする癌の転移抑制剤。
Ｊ） 上記の式（１）〜（８）のいずれかにより表される多量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする癌の増殖抑制剤。
Ｋ） 上記の式（１）〜（８）のいずれかにより表される多量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を含有する食用組成物。
Ｌ） 上記の式（１）〜（８）のいずれかにより表される多量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を含有するコネキシン２６阻害剤。
Ａ） 下記の式（１）により表される二量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
（ただし、ｎは３，５又は８の整数である。炭素、水素は慣用表記にしたがって省略した。数字は炭化水素の繰り返し個数である。「Ｅｔ2」はジエチル基を表す。他の式の表記も同様である。）
上記式（１）中、ｎ＝３のものを以下「ＭＩ−２２」と称する。同様に、上記式（１）中、ｎ＝５、ｎ＝８のものを、それぞれ、以下「ＭＩ−３９」、「ＭＩ−４０」と称する。
Ｂ） 下記の式（２）により表される二量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
（ただし、ｎは３又は５の整数である。）
上記式（２）中、ｎ＝３、ｎ＝５のものを、それぞれ、以下「ＭＩ−４５」、「ＭＩ−４６」と称する。
Ｃ） 下記の式（３）により表される二量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
（ただし、ｎは５又は８の整数である。）
上記式（３）中、ｎ＝５、ｎ＝８のものを、それぞれ、以下「ＭＩ−４１」、「ＭＩ−４２」と称する。
Ｄ） 下記の式（４）により表される二量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
（ただし、ｎは３又は５の整数である。）
上記式（４）中、ｎ＝３、ｎ＝５のものを、それぞれ、以下「ＭＩ−４７」、「ＭＩ−４８」と称する。
Ｅ） 下記の式（５）により表される三量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
上記式（５）により表されるオレアミド誘導体を、以下「ＭＩ−５０」と称する。
Ｆ） 下記の式（６）により表される四量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
上記式（６）により表されるオレアミド誘導体を、以下「ＭＩ−５２」と称する。
Ｇ） 下記の式（７）により表される三量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
上記式（７）により表されるオレアミド誘導体を、以下「ＭＩ−５１」と称する。
Ｈ） 下記の式（８）により表される四量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
上記式（８）により表されるオレアミド誘導体を、以下「ＭＩ−５３」と称する。
Ｉ） 上記の式（１）〜（８）のいずれかにより表される多量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする癌の転移抑制剤。
Ｊ） 上記の式（１）〜（８）のいずれかにより表される多量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする癌の増殖抑制剤。
Ｋ） 上記の式（１）〜（８）のいずれかにより表される多量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を含有する食用組成物。
Ｌ） 上記の式（１）〜（８）のいずれかにより表される多量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を含有するコネキシン２６阻害剤。
なお、本明細書において「多量体型」とは、脂肪酸の炭素鎖を複数有する意味で用いており、例えば「二量体型」とは、脂肪酸の炭素鎖を２つ有するものを意味する。同様に、「三量体型」「四量体型」とは、それぞれ脂肪酸の炭素鎖を３つと４つ有するものを意味する。
本発明のオレアミド誘導体、即ち、上記の式（１）〜（８）により表される多量体型オレアミド誘導体は、コネキシン２６の機能を阻害することによって癌の自然転移を抑制・阻害し、癌の予防薬・治療薬として有用である。また、医薬のほか、サプリメント、機能性食品として利用可能であり、さらに、コネキシン２６阻害剤として、研究用試薬（生化学試薬）などに利用することができる。
以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。
［１］本発明のオレアミド誘導体の生理活性とその特徴
本発明者らは、上記の式（１）〜（８）により表される多量体型オレアミド誘導体を後述の実施例に示す方法により合成し、各誘導体についてコネキシン２６阻害活性の有無を検討した。その結果、上記誘導体のすべてにコネキシン２６阻害活性が認められた（図３参照）。
［１］本発明のオレアミド誘導体の生理活性とその特徴
本発明者らは、上記の式（１）〜（８）により表される多量体型オレアミド誘導体を後述の実施例に示す方法により合成し、各誘導体についてコネキシン２６阻害活性の有無を検討した。その結果、上記誘導体のすべてにコネキシン２６阻害活性が認められた（図３参照）。
このうち、強いコネキシン２６阻害活性が認められた３つの二量体型オレアミド誘導体（ＭＩ−２２・ＭＩ−３９・ＭＩ−４５）について、更にコネキシン４３阻害活性の有無を検討したところ、図３に示すように、これらの誘導体はコネキシン４３の機能を殆ど阻害しなかった。
コネキシン４３は、コネキシンファミリーの中で、中枢神経や心筋細胞に多く存在し、その機能が阻害されると、不整脈などの悪影響を及ぼすと考えられている。それゆえ、医薬開発に利用する場合は、コネキシン４３の機能を阻害することなく、コネキシン２６を特異的に阻害する特性が望ましい。この点で、上記３つのオレアミド誘導体のうちＭＩ−２２が最も望ましい結果を示したため、このＭＩ−２２の抗癌自然転移薬、抗癌増殖薬としての利用可能性について検討を行った。
その結果、上記ＭＩ−２２は、癌の自然転移を顕著に抑制し（図４・５）、癌の増殖抑制能（抗腫瘍効果）も認められた（図７）。なお、詳細は後述の実施例において説明する。
また、上記ＭＩ−２２は、以下の特徴を有し、抗癌自然転移薬、抗癌増殖薬などの医薬開発に好適な物質である。
（１）油状物で、有機溶媒に良溶であり、取扱いに優れている。
（２）後述の色素−トランスファーアッセイによってコネキシン２６を介したＧＪＩＣスコアが「２」以下という低い値を示し、コネキシン２６の機能を強力に阻害する一方、コネキシン４３を介したＧＪＩＣスコアはコントロールと殆ど変わらず、コネキシン４３の阻害作用は認められなかった（図３）。したがって、不整脈などの副作用の少ない安全な薬剤開発が期待できる。
（３）細胞毒性も認められず（図６）、生体に安全な物質と考えられる。ＭＩ−２２による癌の自然転移阻害を調べた実験（実施例３）において、ＭＩ−２２をマウスに連日投与しても、ＭＩ−２２投与が原因で死亡したマウスは皆無であり、この結果からも安全性が極めて高い物質と考えられる。
（４）一般に酸、塩基、熱、光、求核反応等の種々の条件で容易に分解するようなエポキシド構造を有しておらず、比較的安定である。また、核酸等の塩基と反応して、ＤＮＡに損傷を与える可能性もない。
（５）ＭＩ−２２の二量体構造は、炭素鎖によって形成されているため、分解してモノマー体のオレアミドとなることはない。同様に、本発明の他のオレアミド誘導体についても、その多量体構造は炭素鎖によって形成されているため、容易に分解しがたく変化しにくいため、種々の処理を行いやすい。
（１）油状物で、有機溶媒に良溶であり、取扱いに優れている。
（２）後述の色素−トランスファーアッセイによってコネキシン２６を介したＧＪＩＣスコアが「２」以下という低い値を示し、コネキシン２６の機能を強力に阻害する一方、コネキシン４３を介したＧＪＩＣスコアはコントロールと殆ど変わらず、コネキシン４３の阻害作用は認められなかった（図３）。したがって、不整脈などの副作用の少ない安全な薬剤開発が期待できる。
（３）細胞毒性も認められず（図６）、生体に安全な物質と考えられる。ＭＩ−２２による癌の自然転移阻害を調べた実験（実施例３）において、ＭＩ−２２をマウスに連日投与しても、ＭＩ−２２投与が原因で死亡したマウスは皆無であり、この結果からも安全性が極めて高い物質と考えられる。
（４）一般に酸、塩基、熱、光、求核反応等の種々の条件で容易に分解するようなエポキシド構造を有しておらず、比較的安定である。また、核酸等の塩基と反応して、ＤＮＡに損傷を与える可能性もない。
（５）ＭＩ−２２の二量体構造は、炭素鎖によって形成されているため、分解してモノマー体のオレアミドとなることはない。同様に、本発明の他のオレアミド誘導体についても、その多量体構造は炭素鎖によって形成されているため、容易に分解しがたく変化しにくいため、種々の処理を行いやすい。
なお、注目すべきは、上記ＭＩ−２２が実験転移ではなく、癌の自然転移を抑制（阻害）することである。従来の薬効評価（癌転移抑制活性の評価）は、癌細胞を移植するのではなく、実験的に癌を転移させる実験転移により行っていた。すなわち、癌細胞を静注し、候補薬剤の投与２週間後の肺への癌の転移から、有効性を評価していた。これに対し、後述の実施例では、癌細胞を移植して、移植後の癌の転移から、薬効評価を行っている。これにより、実際の癌に近い状態での、有効性の評価が可能となる。すなわち、上記ＭＩ−２２、そのほか本発明のオレアミド誘導体は、生体における癌転移を直接反映する癌の自然転移を抑制（阻害）するものとして、実効性ある癌治療薬の開発に利用できる可能性が極めて高い。
本発明のオレアミド誘導体は、後述の実施例記載の方法により製造することができるが、製造方法はもちろん当該方法に限定されるものではなく、種々の改変が可能である。また、もし天然に存在することがわかれば、本発明のオレアミド誘導体を天然物から単離・精製してもよいし、あるいは、天然物から得られた物質を原材料として反応等の処理を施し、製造してもよい。必要であれば、微生物などの生物材料を使用して生産したものであってもよい。
図１に示される工程で製造する場合、炭素鎖に２重結合（アルケン）を有する７個のオレアミド誘導体（ＭＩ−２２・ＭＩ−３９・ＭＩ−４０・ＭＩ−４５・ＭＩ−４６・ＭＩ−５０・ＭＩ−５２）は、２重結合をオキシランに変換する反応を省略できる分、より少ない工程で製造可能である。
本発明のオレアミド誘導体は、コネキシン２６阻害活性を有するが、ここで「コネキシン２６阻害活性」は、本発明のオレアミド誘導体を投与することにより、コネキシン２６を介した細胞間物質移動が抑制されることを意味する。このことは、後述の色素−トランスファーアッセイによりコネキシン２６を介したＧＪＩＣスコアの変化を調べることによって容易に確認することができる。
［２］本発明のオレアミド誘導体の用途
上記のように、本発明のオレアミド誘導体はコネキシン２６阻害活性を示すことから、コネキシン２６阻害剤として研究用試薬に利用することができる。また、このようにギャップ結合を構成するコネキシン２６を特異的に阻害するという生理活性を有することから、この特性を利用した医薬開発も期待できる。
上記のように、本発明のオレアミド誘導体はコネキシン２６阻害活性を示すことから、コネキシン２６阻害剤として研究用試薬に利用することができる。また、このようにギャップ結合を構成するコネキシン２６を特異的に阻害するという生理活性を有することから、この特性を利用した医薬開発も期待できる。
さらに上記ＭＩ−２２等のオレアミド誘導体には、強い癌の転移抑制活性、抗腫瘍活性が認められるので、抗癌剤（制癌剤）などの医薬、さらには抗癌作用または癌予防効果をもつサプリメント、機能性食品（食用組成物）の原材料などに利用可能である。
なお、本発明には上記オレアミド誘導体のほかに、これら誘導体の薬理上許容される塩も含まれる。このような薬理上許容される塩としては、フッ化水素酸塩、塩酸塩などのハロゲン化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、スルホン酸塩、および、有機酸塩を例示することができる。
本発明のオレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩（以下、単に「オレアミド誘導体」という。）を医薬開発に利用する場合、その一態様として、本発明のオレアミド誘導体を医薬品開発過程におけるリード化合物として利用するものであってもよい。
本発明のオレアミド誘導体を医薬品（医薬用組成物）に用いる場合の一例について説明する。本発明のオレアミド誘導体は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、ヒト（または動物）に投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤、塗布剤等の非経口剤が挙げられる。
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、トレハロース、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明のオレアミド誘導体の配合量は特に限定されるものではなく適宜設定できる。この種の製剤には、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
非経口剤の場合、患者の年齢、体重、疾患の程度などに応じて用量を調節し、例えば、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射などによって投与する。この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら製剤中の本発明のオレアミド誘導体の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。
なお、公知のＤＤＳ（ドラッグ・デリバリー・システム）を利用し、例えば、本発明のオレアミド誘導体をリポソームなどの運搬体に封入して体内投与してもよい。このとき標的部位（癌細胞等）を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位に本発明のオレアミド誘導体を効率よく運ぶことができ効果的である。
また前述したように、本発明のオレアミド誘導体は、サプリメント、機能性食品などの食品（食用組成物）に利用することができる。すなわち、各種飲料や各種加工食品の原材料として本発明のオレアミド誘導体を飲食品に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や保健食品等として利用できる。
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明は下記実施例によって何ら限定されるものではない。
〔実施例１：本発明に係る多量体型オレアミド誘導体の合成〕
まず、ＭＩ−２２をはじめとする本発明の多量体型オレアミド誘導体の合成方法について説明する。図１（ａ）は、二量体型オレアミド誘導体の化学合成を概略的に示したもの、同図（ｂ）は、三量体型・四量体型オレアミド誘導体の化学合成を概略的に示したもの、である。
まず、ＭＩ−２２をはじめとする本発明の多量体型オレアミド誘導体の合成方法について説明する。図１（ａ）は、二量体型オレアミド誘導体の化学合成を概略的に示したもの、同図（ｂ）は、三量体型・四量体型オレアミド誘導体の化学合成を概略的に示したもの、である。
なお、以下の実施例では、核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルは、２０−２５℃でテトラメチルシランを内部標準物質として３００ＭＨｚにて測定した。赤外線（ＩＲ）吸収スペクトルは、ＫＢｒを希釈剤とした拡散反射法により測定した。カラムクロマトグラフィの吸着剤にはE. Merck silica gel 60を使用し、薄層クロマトグラフィにはE. Merck pre-coated TLC platesおよびsilica gel F254を使用した。
［1. 1］ＭＩ−２２の合成
ＭＩ−２２、即ち、Ｎ1,Ｎ1,Ｎ7,Ｎ7−テトラエチル−２,６−ジ［（Ｚ）−７−ヘキサデセニル］ヘプタンジアミド（N1,N1,N7,N7-Tetraethyl-2,6-di[(Z)-7-hexadecenyl]heptanediamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−２２、即ち、Ｎ1,Ｎ1,Ｎ7,Ｎ7−テトラエチル−２,６−ジ［（Ｚ）−７−ヘキサデセニル］ヘプタンジアミド（N1,N1,N7,N7-Tetraethyl-2,6-di[(Z)-7-hexadecenyl]heptanediamide）を以下の方法により合成した。
窒素雰囲気下、オレイン酸（５０３ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）の無水メチレンクロリド溶液（８．５ｍＬ）に氷冷下、オキザリルクロリド（０．４６ｍＬ，５．４ｍｍｏｌ）を滴下して、室温で４時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた残渣にジエチルアミン（１．０ｍＬ，９．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で０．５時間攪拌した後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）を用いて精製し、無色油状物として、（Ｚ）−Ｎ,Ｎ−ジエチル−９−オクタデセンアミド（(Z)-N,N-diethyl-9-octadecenamide）（４９５ｍｇ，８２％）を得た。
上記無色油状物の核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (3H, t, J = 6.6 Hz), 1.11 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.17 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.25-1.39 (20H, m), 1.50-1.75 (2H, m), 1.95-2.10 (4H, m), 2.28 (2H, t, J = 7.4 Hz), 3.30 (2H, q, J = 6.6 Hz), 3.37 (2H, q, J = 6.6 Hz), 5.32-5.36 (2H, m).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (3H, t, J = 6.6 Hz), 1.11 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.17 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.25-1.39 (20H, m), 1.50-1.75 (2H, m), 1.95-2.10 (4H, m), 2.28 (2H, t, J = 7.4 Hz), 3.30 (2H, q, J = 6.6 Hz), 3.37 (2H, q, J = 6.6 Hz), 5.32-5.36 (2H, m).
上記無色油状物（１５３ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１２ｍＬ）を−４０℃に冷却し、ＬＤＡ（０．７ｍＬ，１．４ｍｍｏｌ）を加え、−４０℃で０．５時間攪拌した。その後、ジヨードプロパン（1,3-diiodopropane）（０．２６ｍＬ，２．３ｍｍｏｌ）を加え、−４０℃で３時間攪拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた。次に、有機層を分別し、水層を酢酸エチルで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）を用いて精製し、無色油状物として、ＭＩ−２２（２２ｍｇ，２１％）を得た。
上記ＭＩ−２２の赤外線（ＩＲ）吸収スペクトル、核磁気共鳴（1Ｈ，13Ｃ−ＮＭＲ）スペクトル、質量分析法（ＦＡＢ）の各データを以下に示す。
IR (KBr) 3416, 2855, 1614 cm-1;
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.09 (6H, t, J = 7.2 Hz), 1.14 (6H, t, J = 7.2 Hz), 1.20-1.38 (48H, m), 1.50-1.62 (2H, m), 1.98-2.03 (8H, m), 2.42-2.52 (2H, m), 3.31 (4H, q, J = 7.2 Hz), 3.36 (4H, q, J = 7.2 Hz), 5.32-5.35 (4H, m);
13C NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 12.9, 13.9, 14.8, 22.5 (2C), 27.0 (2C), 27.4, 29.0 (3C), 29.3, 29.6 (2C), 31.7 (2C), 33.3, 33.5, 40.2, 41.0, 41.6, 129.5, 129.7, 175.1.
LRMS (FAB) m/z 716 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C47H91N2O2, 715.7081; found, 715.7078.
IR (KBr) 3416, 2855, 1614 cm-1;
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.09 (6H, t, J = 7.2 Hz), 1.14 (6H, t, J = 7.2 Hz), 1.20-1.38 (48H, m), 1.50-1.62 (2H, m), 1.98-2.03 (8H, m), 2.42-2.52 (2H, m), 3.31 (4H, q, J = 7.2 Hz), 3.36 (4H, q, J = 7.2 Hz), 5.32-5.35 (4H, m);
13C NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 12.9, 13.9, 14.8, 22.5 (2C), 27.0 (2C), 27.4, 29.0 (3C), 29.3, 29.6 (2C), 31.7 (2C), 33.3, 33.5, 40.2, 41.0, 41.6, 129.5, 129.7, 175.1.
LRMS (FAB) m/z 716 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C47H91N2O2, 715.7081; found, 715.7078.
［1. 2］ＭＩ−３９の合成
ＭＩ−３９、即ち、Ｎ1,Ｎ1,Ｎ9,Ｎ9−テトラエチル−２,８−ジ［（Ｚ）−７−ヘキサデセニル］ノナンジアミド（N1,N1,N9,N9-Tetraethyl-2,8-di[(Z)-7-hexadecenyl]nonanediamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−３９、即ち、Ｎ1,Ｎ1,Ｎ9,Ｎ9−テトラエチル−２,８−ジ［（Ｚ）−７−ヘキサデセニル］ノナンジアミド（N1,N1,N9,N9-Tetraethyl-2,8-di[(Z)-7-hexadecenyl]nonanediamide）を以下の方法により合成した。
上記ＭＩ−２２の合成と同様に、(Z)-N,N-diethyl-9-octadecenamide（７０ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液にＬＤＡ（０．３４ｍＬ，０．６６ｍｍｏｌ）を加え、−４０℃で０．５時間攪拌した。その後、ジヨードペンタン（1,5-diiodopentane）（３．０ｍＬ，０．１７ｍｍｏｌ）を加え、−４０℃で３時間攪拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた。次に、有機層を分別し、水層を酢酸エチルで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝８：１）を用いて精製し、無色油状物として、ＭＩ−３９（５０ｍｇ，３０％）を得た。
上記ＭＩ−３９の核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル、質量分析法（ＦＡＢ）の各データを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.07-1.29 (64H, m), 1.50-1.62 (2H, m), 1.99-2.01 (8H, m), 2.28 (2H, m), 3.35 (8H, q, J = 5.4 Hz), 5.33 (4H, m).
LRMS (FAB) m/z 744 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C49H95N2O2, 743.7394; found, 743.7415.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.07-1.29 (64H, m), 1.50-1.62 (2H, m), 1.99-2.01 (8H, m), 2.28 (2H, m), 3.35 (8H, q, J = 5.4 Hz), 5.33 (4H, m).
LRMS (FAB) m/z 744 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C49H95N2O2, 743.7394; found, 743.7415.
［1. 3］ＭＩ−４０の合成
ＭＩ−４０、即ち、Ｎ1,Ｎ1,Ｎ12,Ｎ12−テトラエチル−２,１１−ジ［（Ｚ）−９−ヘキサデセニル］ドデカンジアミド（N1,N1,N12,N12-Tetraethyl-2,11-di[(Z)-9-hexadecenyl]dodecanediamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−４０、即ち、Ｎ1,Ｎ1,Ｎ12,Ｎ12−テトラエチル−２,１１−ジ［（Ｚ）−９−ヘキサデセニル］ドデカンジアミド（N1,N1,N12,N12-Tetraethyl-2,11-di[(Z)-9-hexadecenyl]dodecanediamide）を以下の方法により合成した。
上記ＭＩ−２２の合成と同様に、(Z)-N,N-diethyl-9-octadecenamide（５２ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液にＬＤＡ（０．２５ｍＬ，０．５１ｍｍｏｌ）を加え、−４０℃で０．５時間攪拌した。その後、ジヨードオクタン（1,5-diiodooctane）（０．１７ｍＬ，０．８５ｍｍｏｌ）を加え、−４０℃で３時間攪拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた。次に、有機層を分別し、水層を酢酸エチルで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝８：１）を用いて精製し、無色油状物として、ＭＩ−４０（２１ｍｇ，１６％）を得た。
上記ＭＩ−４０の核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル、質量分析法（ＦＡＢ）の各データを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.08-1.59 (72H, m), 1.99-2.04 (8H, m), 2.50 (2H, m), 3.35 (8H, q, J = 5.4 Hz), 5.33 (4H, m).
LRMS (FAB) m/z 786 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C52H101N2O2, 785.7863; found, 785.7897.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.08-1.59 (72H, m), 1.99-2.04 (8H, m), 2.50 (2H, m), 3.35 (8H, q, J = 5.4 Hz), 5.33 (4H, m).
LRMS (FAB) m/z 786 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C52H101N2O2, 785.7863; found, 785.7897.
［1. 4］ＭＩ−４５の合成
ＭＩ−４５、即ち、Ｎ1−［（Ｚ）−３−オクタデック−９−エノイルアミノプロピル］−（Ｚ）−９−オクタデセンアミド（N1-[(Z)-3-Octadec-9-enoylaminopropyl]-(Z)-9-octadecenamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−４５、即ち、Ｎ1−［（Ｚ）−３−オクタデック−９−エノイルアミノプロピル］−（Ｚ）−９−オクタデセンアミド（N1-[(Z)-3-Octadec-9-enoylaminopropyl]-(Z)-9-octadecenamide）を以下の方法により合成した。
窒素雰囲気下、オレイン酸（１００ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）の無水メチレンクロリド溶液（３．０ｍＬ）に氷冷下、オキザリルクロリド（０．１１ｍＬ，１．２ｍｍｏｌ）を滴下して、室温で４時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた残渣にプロパン−１，３−ジアミン（０．０１５ｍＬ，０．１８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：４）を用いて精製し、無色油状物として、ＭＩ−４５（８９ｍｇ，８４％）を得た。
上記ＭＩ−４５の核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル、質量分析法（ＦＡＢ）の各データを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.6 Hz), 1.27-1.31 (40H, m), 1.57-1.61 (6H, m), 1.98-2.05 (8H, m), 2.20 (4H, dd, J = 7.4 Hz), 3.27 (4H, dd, J = 12.4, 5.9 Hz), 5.34 (4H, m), 6.19 (2H, brs).
LRMS (FAB) m/z 604 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C39H75N2O2, 603.5829; found, 603.5813.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.6 Hz), 1.27-1.31 (40H, m), 1.57-1.61 (6H, m), 1.98-2.05 (8H, m), 2.20 (4H, dd, J = 7.4 Hz), 3.27 (4H, dd, J = 12.4, 5.9 Hz), 5.34 (4H, m), 6.19 (2H, brs).
LRMS (FAB) m/z 604 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C39H75N2O2, 603.5829; found, 603.5813.
［1. 5］ＭＩ−４６の合成
ＭＩ−４６、即ち、Ｎ1−［（Ｚ）−５−オクタデック−９−エノイルアミノペンチル］−（Ｚ）−９−オクタデセンアミド（N1-[(Z)-5-Octadec-9-enoylaminopentyl]-(Z)-9-octadecenamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−４６、即ち、Ｎ1−［（Ｚ）−５−オクタデック−９−エノイルアミノペンチル］−（Ｚ）−９−オクタデセンアミド（N1-[(Z)-5-Octadec-9-enoylaminopentyl]-(Z)-9-octadecenamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−４５の合成と同様に、オレイン酸（１２７ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）の無水メチレンクロリド溶液に氷冷下、オキザリルクロリド（０．１４ｍＬ，１．５８ｍｍｏｌ）を滴下して、室温で４時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた残渣にペンタン−１，５−ジアミン（０．０２６ｍＬ，０．２２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）を用いて精製し、無色油状物として、ＭＩ−４６（１２７ｍｇ，４５％）を得た。
上記ＭＩ−４６の核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル、質量分析法（ＦＡＢ）の各データを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.85 (6H, t, J = 6.5Hz), 1.25-1.64 (42H, m), 1.97-2.01 (8H, m), 2.13-2.19 (4H, dd, J = 7.2 Hz), 3.23 (4H, dd, J = 12.4, 5.9 Hz), 5.27-5.40 (4H, m), 5.88 (2H, brs).
LRMS (FAB) m/z 631 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C41H78N2O2, 631.6142; found, 631.6130.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.85 (6H, t, J = 6.5Hz), 1.25-1.64 (42H, m), 1.97-2.01 (8H, m), 2.13-2.19 (4H, dd, J = 7.2 Hz), 3.23 (4H, dd, J = 12.4, 5.9 Hz), 5.27-5.40 (4H, m), 5.88 (2H, brs).
LRMS (FAB) m/z 631 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C41H78N2O2, 631.6142; found, 631.6130.
［1. 6］ＭＩ−５０の合成
ＭＩ−５０、即ち、Ｎ1−｛（Ｚ）−３−オクタデック−９−エノイル−Ｎ−［（Ｚ）−４−オクタデック−９−エノイルアミノブチル］−アミノプロピル｝−（Ｚ）−９−オクタデセンアミド（N1-{(Z)-3-Octadec-9-enoyl-N-[(Z)-4-octadec-9-enoylaminobutyl]-aminopropyl}-(Z)-9-octadecenamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−５０、即ち、Ｎ1−｛（Ｚ）−３−オクタデック−９−エノイル−Ｎ−［（Ｚ）−４−オクタデック−９−エノイルアミノブチル］−アミノプロピル｝−（Ｚ）−９−オクタデセンアミド（N1-{(Z)-3-Octadec-9-enoyl-N-[(Z)-4-octadec-9-enoylaminobutyl]-aminopropyl}-(Z)-9-octadecenamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−４５の合成と同様に、オレイン酸（１００ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）の無水メチレンクロリド溶液に氷冷下、オキザリルクロリド（０．１１ｍＬ，１．２ｍｍｏｌ）を滴下して、室温で４時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた残渣にスペルミジン（０．０２０ｍＬ，０．１２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）を用いて精製し、無色油状物として、ＭＩ−５０（７５ｍｇ，２３％）を得た。
上記ＭＩ−５０の核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル、質量分析法（ＦＡＢ）の各データを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (9H, t, J = 6.5Hz), 1.27-1.80 (72H, m), 1.99-2.01 (12H, m), 2.14-2.36 (6H, m), 3.11-3.42 (8H, m), 5.28-5.40 (6H, m).
LRMS (FAB) m/z 939 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C61H116N3O3, 938.9017; found, 938.9005.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (9H, t, J = 6.5Hz), 1.27-1.80 (72H, m), 1.99-2.01 (12H, m), 2.14-2.36 (6H, m), 3.11-3.42 (8H, m), 5.28-5.40 (6H, m).
LRMS (FAB) m/z 939 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C61H116N3O3, 938.9017; found, 938.9005.
［1. 7］ＭＩ−５２の合成
ＭＩ−５２、即ち、Ｎ1−｛（Ｚ）−３−オクタデック−９−エノイル−Ｎ−［（Ｚ）−４−オクタデック−９−エノイル−Ｎ−｛（Ｚ）−３−オクタデック−９−エノイルアミノプロピル｝−アミノブチル］−アミノプロピル｝−（Ｚ）−９−オクタデセンアミド（N1-{(Z)-3-Octadec-9-enoyl-N-[(Z)-4-octadec-9-enoyl-N-{(Z)-3-octadec-9-enoylaminopropyl}-aminobutyl]-aminopropyl}-(Z)-9-octadecenamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−５２、即ち、Ｎ1−｛（Ｚ）−３−オクタデック−９−エノイル−Ｎ−［（Ｚ）−４−オクタデック−９−エノイル−Ｎ−｛（Ｚ）−３−オクタデック−９−エノイルアミノプロピル｝−アミノブチル］−アミノプロピル｝−（Ｚ）−９−オクタデセンアミド（N1-{(Z)-3-Octadec-9-enoyl-N-[(Z)-4-octadec-9-enoyl-N-{(Z)-3-octadec-9-enoylaminopropyl}-aminobutyl]-aminopropyl}-(Z)-9-octadecenamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−４５の合成と同様に、オレイン酸（１００ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）の無水メチレンクロリド溶液に氷冷下、オキザリルクロリド（０．１１ｍＬ，１．２ｍｍｏｌ）を滴下して、室温で４時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた残渣にＮ，Ｎ1−ビス（３−アミノプロピル）−１，４−ブタンジアミン（１８．２ｍｇ，０．０８６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）を用いて精製し、無色油状物として、ＭＩ−５２（７１ｍｇ，１６％）を得た。
上記ＭＩ−５２の核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル、質量分析法（ＦＡＢ）の各データを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (12H, t, J = 6.5Hz), 1.27-1.77 (96H, m), 1.99-2.02 (16H, m), 2.16-2.37 (8H, m), 3.14-3.41 (12H, m), 5.28-5.30 (8H, m).
LRMS (FAB) m/z 1260 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C68H155N4O4, 1260.2048; found, 1260.2062.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (12H, t, J = 6.5Hz), 1.27-1.77 (96H, m), 1.99-2.02 (16H, m), 2.16-2.37 (8H, m), 3.14-3.41 (12H, m), 5.28-5.30 (8H, m).
LRMS (FAB) m/z 1260 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C68H155N4O4, 1260.2048; found, 1260.2062.
［1. 8］ＭＩ−４１の合成
ＭＩ−４１、即ち、Ｎ1,Ｎ1,Ｎ9,Ｎ9−テトラエチル−２,８−ジ［８−｛（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝−オクチル］ノナンジアミド（N1,N1,N9,N9-Tetraethyl-2,8-di[8-{(2S*, 3R*)-3-octyl-oxiranyl}-octyl]nonanediamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−４１、即ち、Ｎ1,Ｎ1,Ｎ9,Ｎ9−テトラエチル−２,８−ジ［８−｛（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝−オクチル］ノナンジアミド（N1,N1,N9,N9-Tetraethyl-2,8-di[8-{(2S*, 3R*)-3-octyl-oxiranyl}-octyl]nonanediamide）を以下の方法により合成した。
前記ＭＩ−３９（５０ｍｇ，０．０６４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３ｍＬ）に、氷冷下、ｍ−クロロ過安息香酸（２８ｍｇ，０．１３ｍｍоｌ）を加えて、室温で３時間撹拌した。次に、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて、有機層を分別し、水層をジクロロメタンで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）を用いて精製し、白色固体として、ＭＩ−４１（３９ｍｇ，７６％）を得た。
上記ＭＩ−４１の核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル、質量分析法（ＦＡＢ）の各データを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.08-1.64 (78H, m), 2.44-2.53 (2H, m), 2.89 (4H, brs), 3.36 (8H, q, J = 7.2 Hz).
LRMS (FAB) m/z 776 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C49H95N2O4, 775.7292; found, 775.7323.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.08-1.64 (78H, m), 2.44-2.53 (2H, m), 2.89 (4H, brs), 3.36 (8H, q, J = 7.2 Hz).
LRMS (FAB) m/z 776 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C49H95N2O4, 775.7292; found, 775.7323.
［1. 9］ＭＩ−４２の合成
ＭＩ−４２、即ち、Ｎ1,Ｎ1,Ｎ12,Ｎ12−テトラエチル−２,１１−ジ［８−｛（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝−オクチル］ドデカンジアミド（N1,N1,N12,N12-Tetraethyl-2,11-di[8-{(2S*, 3R*)-3-octyl-oxiranyl)-octyl]dodecanediamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−４２、即ち、Ｎ1,Ｎ1,Ｎ12,Ｎ12−テトラエチル−２,１１−ジ［８−｛（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝−オクチル］ドデカンジアミド（N1,N1,N12,N12-Tetraethyl-2,11-di[8-{(2S*, 3R*)-3-octyl-oxiranyl)-octyl]dodecanediamide）を以下の方法により合成した。
前記ＭＩ−４０（３０ｍｇ，０．０３８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液に、氷冷下、ｍ−クロロ過安息香酸（２１ｍｇ，０．０９５ｍｍоｌ）を加えて、室温で３時間撹拌した。次に、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて、有機層を分別し、水層をジクロロメタンで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）を用いて精製し、無色油状物として、ＭＩ−４２（２５ｍｇ，８１％）を得た。
上記ＭＩ−４２の核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル、質量分析法（ＦＡＢ）の各データを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.08-1.64 (80H, m), 2.45-2.53 (2H, m), 2.89 (4H, brs), 3.36 (8H, q, J = 7.2 Hz).
LRMS (FAB) m/z 818 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C52H101N2O4, 817.7761; found, 817.7729.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.08-1.64 (80H, m), 2.45-2.53 (2H, m), 2.89 (4H, brs), 3.36 (8H, q, J = 7.2 Hz).
LRMS (FAB) m/z 818 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C52H101N2O4, 817.7761; found, 817.7729.
［1. 10］ＭＩ−４７の合成
ＭＩ−４７、即ち、Ｎ1−［３−｛８−［（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル］−オクタノイルアミノ｝−プロピル］―｛８−（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝オクタンアミド（N1-[3-{8-[(2S*, 3R*)-3-Octyl-oxiranyl]-octanoylamino}-propyl]-{8-(2S*, 3R*) -3-octyl-oxiranyl}octanamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−４７、即ち、Ｎ1−［３−｛８−［（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル］−オクタノイルアミノ｝−プロピル］―｛８−（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝オクタンアミド（N1-[3-{8-[(2S*, 3R*)-3-Octyl-oxiranyl]-octanoylamino}-propyl]-{8-(2S*, 3R*) -3-octyl-oxiranyl}octanamide）を以下の方法により合成した。
前記ＭＩ−４５（６０ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液に、氷冷下、ｍ−クロロ過安息香酸（１００ｍｇ，０．４５ｍｍоｌ）を加えて、室温で３時間撹拌した。次に、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて、有機層を分別し、水層をジクロロメタンで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル）を用いて精製し、無色油状物として、ＭＩ−４７（６０ｍｇ，９４％）を得た。
上記ＭＩ−４７の核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル、質量分析法（ＦＡＢ）の各データを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.5Hz), 1.25-1.76 (54H, m), 2.20 (4H, t, J = 7.5Hz), 3.01 (4H, brs), 3.27 (4H, q, J = 6.4Hz), 6.49 (2H, brs).
LRMS (FAB) m/z 636 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C39H75N2O4, 635.5727; found, 635.5726.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.5Hz), 1.25-1.76 (54H, m), 2.20 (4H, t, J = 7.5Hz), 3.01 (4H, brs), 3.27 (4H, q, J = 6.4Hz), 6.49 (2H, brs).
LRMS (FAB) m/z 636 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C39H75N2O4, 635.5727; found, 635.5726.
［1. 11］ＭＩ−４８の合成
ＭＩ−４８、即ち、Ｎ1−［５−｛８−［（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル］−オクタノイルアミノ｝−ペンチル］―｛８−（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝オクタンアミド（N1-[5-{8-[(2S*, 3R*)-3-Octyl-oxiranyl]-octanoylamino}-pentyl]-{8-(2S*, 3R*) -3-octyl-oxiranyl}octanamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−４８、即ち、Ｎ1−［５−｛８−［（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル］−オクタノイルアミノ｝−ペンチル］―｛８−（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝オクタンアミド（N1-[5-{8-[(2S*, 3R*)-3-Octyl-oxiranyl]-octanoylamino}-pentyl]-{8-(2S*, 3R*) -3-octyl-oxiranyl}octanamide）を以下の方法により合成した。
前記ＭＩ−４６（６３ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液に、氷冷下、ｍ−クロロ過安息香酸（７８ｍｇ，０．３５ｍｍоｌ）を加えて、室温で３時間撹拌した。次に、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて、有機層を分別し、水層をジクロロメタンで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）を用いて精製し、無色油状物として、ＭＩ−４８（６６ｍｇ，９９％）を得た。
上記ＭＩ−４８の核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル、質量分析法（ＦＡＢ）の各データを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.5Hz), 1.25-1.73 (58H, m), 2.17 (4H, t, J = 7.5Hz), 2.90 (4H, brs), 3.24 (4H, q, J = 6.4Hz), 5.70 (2H, brs).
LRMS (FAB) m/z 664 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C41H79N2O4, 663.6040; found, 660.6050.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.5Hz), 1.25-1.73 (58H, m), 2.17 (4H, t, J = 7.5Hz), 2.90 (4H, brs), 3.24 (4H, q, J = 6.4Hz), 5.70 (2H, brs).
LRMS (FAB) m/z 664 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C41H79N2O4, 663.6040; found, 660.6050.
［1. 12］ＭＩ−５１の合成
ＭＩ−５１、即ち、Ｎ1−｛３−［８−｛（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝−オクタノイル］−Ｎ−［４−｛８−［（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル］―オクタノイルアミノ｝−ブチル］−アミノプロピル｝−｛８−（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝オクタンアミド（N1-{3-[8-{(2S*, 3R*)-3-Octyl-oxiranyl}-octanoyl]-N-[4-{8-[(2S*, 3R*)-3-octyl-oxiranyl]-octanoylamino}-butyl]-aminopropyl}-{8-(2S*, 3R*) -3-octyl-oxiranyl}octanamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−５１、即ち、Ｎ1−｛３−［８−｛（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝−オクタノイル］−Ｎ−［４−｛８−［（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル］―オクタノイルアミノ｝−ブチル］−アミノプロピル｝−｛８−（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝オクタンアミド（N1-{3-[8-{(2S*, 3R*)-3-Octyl-oxiranyl}-octanoyl]-N-[4-{8-[(2S*, 3R*)-3-octyl-oxiranyl]-octanoylamino}-butyl]-aminopropyl}-{8-(2S*, 3R*) -3-octyl-oxiranyl}octanamide）を以下の方法により合成した。
前記ＭＩ−５０（３６ｍｇ，０．０３８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液に、氷冷下、ｍ−クロロ過安息香酸（３０ｍｇ，０．１９ｍｍоｌ）を加えて、室温で３時間撹拌した。次に、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて、有機層を分別し、水層をジクロロメタンで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）を用いて精製し、無色油状物として、ＭＩ−５１（３８ｍｇ，１００％）を得た。
上記ＭＩ−５１の核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル、質量分析法（ＦＡＢ）の各データを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (9H, t, J = 6.5Hz), 1.26-1.77 (84H, m), 2.14-2.36 (6H, m), 2.89-2.91 (6H, m), 3.07-3.42 (8H, m), 5.31 (1H, brs), 6.88 (1H, brs).
LRMS (FAB) m/z 987 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C61H116N3O6, 986.8864; found, 986.8820.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (9H, t, J = 6.5Hz), 1.26-1.77 (84H, m), 2.14-2.36 (6H, m), 2.89-2.91 (6H, m), 3.07-3.42 (8H, m), 5.31 (1H, brs), 6.88 (1H, brs).
LRMS (FAB) m/z 987 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C61H116N3O6, 986.8864; found, 986.8820.
［1. 13］ＭＩ−５３の合成
ＭＩ−５３、即ち、Ｎ1−（３−｛［８−｛（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝−オクタノイル］−［４−（｛８−［（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル］―オクタノイル｝−Ｎ−｛３−［８−｛（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝−オクタノイルアミノ］−プロピル｝−アミノ）−ブチル］−アミノ｝−プロピル）−８−｛（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝オクタンアミド（N1-(3-{[8-{(2S*, 3R*)-3-Octyl-oxiranyl}-octanoyl]-[4-({8-[(2S*, 3R*)-3-octyl-oxiranyl]-octanoyl}-N-{3-[8-{(2S*, 3R*)-3-octyl-oxiranyl}-octanoylamino]-propyl}-amino)-butyl]-amino}-propyl)- 8-{(2S*, 3R*) -3-octyl-oxiranyl}octanamide）を以下の方法により合成した。
ＭＩ−５３、即ち、Ｎ1−（３−｛［８−｛（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝−オクタノイル］−［４−（｛８−［（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル］―オクタノイル｝−Ｎ−｛３−［８−｛（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝−オクタノイルアミノ］−プロピル｝−アミノ）−ブチル］−アミノ｝−プロピル）−８−｛（２Ｓ*，３Ｒ*）−３−オクチル−オキシラニル｝オクタンアミド（N1-(3-{[8-{(2S*, 3R*)-3-Octyl-oxiranyl}-octanoyl]-[4-({8-[(2S*, 3R*)-3-octyl-oxiranyl]-octanoyl}-N-{3-[8-{(2S*, 3R*)-3-octyl-oxiranyl}-octanoylamino]-propyl}-amino)-butyl]-amino}-propyl)- 8-{(2S*, 3R*) -3-octyl-oxiranyl}octanamide）を以下の方法により合成した。
前記ＭＩ−５２（３６ｍｇ，０．０２９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液に、氷冷下、ｍ−クロロ過安息香酸（３２ｍｇ，０．１４ｍｍоｌ）を加えて、室温で３時間撹拌した。次に、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて、有機層を分別し、水層をジクロロメタンで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）を用いて精製し、無色油状物として、ＭＩ−５３（３６ｍｇ，９４％）を得た。
上記ＭＩ−５３の核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル、質量分析法（ＦＡＢ）の各データを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (12H, t, J = 6.5Hz), 1.11-1.77 (112H, m), 2.15-2.66 (8H, m), 3.01-3.02 (8H, m), 3.09-3.41 (12H, m), 6.81 (1H, brs), 6.93 (1H, brs).
LRMS (FAB) m/z 1324 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C82H155N4O8, 1324.1845; found, 1324.1849.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.88 (12H, t, J = 6.5Hz), 1.11-1.77 (112H, m), 2.15-2.66 (8H, m), 3.01-3.02 (8H, m), 3.09-3.41 (12H, m), 6.81 (1H, brs), 6.93 (1H, brs).
LRMS (FAB) m/z 1324 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C82H155N4O8, 1324.1845; found, 1324.1849.
〔実施例２：上記多量体型オレアミド誘導体のコネキシン２６特異的阻害〕
次に、上記方法により合成した各オレアミド誘導体について、各誘導体によるコネキシン２６阻害の有無（換言すれば、コネキシン２６によって構成されるギャップ結合を介した細胞間物質輸送の阻害の有無）を検討した。実験方法は、国際公開ＷＯ２００４／０６０３９８号公報に記載の方法と同様であり、色素−トランスファーアッセイにより各被検物質のＧＪＩＣスコア（ギャップ結合細胞間コミュニケーション値）を評価した。
次に、上記方法により合成した各オレアミド誘導体について、各誘導体によるコネキシン２６阻害の有無（換言すれば、コネキシン２６によって構成されるギャップ結合を介した細胞間物質輸送の阻害の有無）を検討した。実験方法は、国際公開ＷＯ２００４／０６０３９８号公報に記載の方法と同様であり、色素−トランスファーアッセイにより各被検物質のＧＪＩＣスコア（ギャップ結合細胞間コミュニケーション値）を評価した。
［2. 1］細胞株と細胞培養
上記公報に記載の方法と同様に、実験にはヒト子宮頸部偏平上皮癌細胞（ＨｅＬａ細胞）を使用した。より具体的には、ラットコネキシン２６（Ｃｘ２６）を安定して発現するＨｅＬａ細胞サブクローン（ＨｅＬａ−Ｃｘ２６）、および、ラットコネキシン４３（Ｃｘ４３）を安定して発現するＨｅＬａ細胞サブクローン（ＨｅＬａ−Ｃｘ４３）を使用した。すべての細胞（後述の実施例で使用した細胞を含む）は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加えて培養した。
上記公報に記載の方法と同様に、実験にはヒト子宮頸部偏平上皮癌細胞（ＨｅＬａ細胞）を使用した。より具体的には、ラットコネキシン２６（Ｃｘ２６）を安定して発現するＨｅＬａ細胞サブクローン（ＨｅＬａ−Ｃｘ２６）、および、ラットコネキシン４３（Ｃｘ４３）を安定して発現するＨｅＬａ細胞サブクローン（ＨｅＬａ−Ｃｘ４３）を使用した。すべての細胞（後述の実施例で使用した細胞を含む）は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加えて培養した。
［2. 2］色素−トランスファーアッセイ
アッセイの前日、ＨｅＬａ−Ｃｘ２６細胞およびＨｅＬａ−Ｃｘ４３細胞をそれぞれ別個に、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中に懸濁させた。そして、いずれの細胞もドナー細胞用と、レシピエント細胞用とに分けて培養した。レシピエント細胞は、直径３ｃｍの培養皿で培養し、アッセイ時にほぼコンフルエントな単層を形成するように、調節された。
アッセイの前日、ＨｅＬａ−Ｃｘ２６細胞およびＨｅＬａ−Ｃｘ４３細胞をそれぞれ別個に、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中に懸濁させた。そして、いずれの細胞もドナー細胞用と、レシピエント細胞用とに分けて培養した。レシピエント細胞は、直径３ｃｍの培養皿で培養し、アッセイ時にほぼコンフルエントな単層を形成するように、調節された。
アッセイにおいてはまず、ドナー細胞の培養液にカルセイン（ギャップ結合透過性）およびＤｉＩ（ギャップ結合非透過性）の両色素をそれぞれ１０μＭ、２μＭ添加し、１時間インキュベートした。２重標識ドナー細胞は、トリプシン処理し、リン酸緩衝溶液で３回洗浄した。その後、各単一のドナー細胞を、標識化されていないレシピエント細胞上に静かに載置した。ドナー細胞が単層に定着するには１時間を要した。そして、約１．５時間で色素−カップリングを示し始め、ギャップ結合を介したドナー細胞から隣接レシピエント細胞への色素移動が観察された。
色素−カップリングに対する各被検物質の阻害活性を評価するために、ドナー細胞培養１時間後、オレアミドおよび上記多量体型オレアミド誘導体をそれぞれエタノールに溶解し、各培養皿に対して１０μＬ、終濃度２０μＭとなるよう添加した。また、コントロールとして、エタノールを１０００倍希釈して培養皿に添加した。それから１時間後、各培養皿を共焦点走査顕微鏡（ＬＳＭ５１０）により観察した。図２は、こうして観察された顕微鏡写真の一例を示す。
図中、＊印で示されるドナー細胞は、カルセイン（緑色蛍光）およびＤｉＩ（赤色蛍光）を両方含むため、原図では黄色に表示される。また、色素−カップリングにより、ギャップ結合透過性のカルセインがギャップ結合を介してレシピエント細胞に色素移動すると、当該細胞は緑色に表示される。このようなアッセイにより、各被検物質のＧＪＩＣスコアは、次のように評価される。
すなわち、ドナー細胞が色素−カップリングしなければ「０」、ドナー細胞から隣接レシピエント細胞に色素−カップリングすれば「１」、このレシピエント細胞に移動したカルセインが、上記ドナー細胞から離れる方向の次の隣接細胞に移動すれば「２」、さらに上記ドナー細胞から離れた３番目の隣接細胞に移動すれば「３」、・・・というように評価する。また、中間レベルとして、図中矢印に示すように、細胞染色の程度を０．２５、０．５、０．７５、１．０の４段階に評価した。
このようなアッセイを３回繰り返し行い、各被検物質について、少なくとも３０個のドナー細胞を使用して評価を行った。そして、各被検物質のＧＪＩＣスコアの平均値、標準偏差を算出した。図３は、このアッセイ結果を示すグラフであり、各オレアミド誘導体のＧＪＩＣスコアが示される。グラフ中、黒色のバーはコネキシン２６を介したＧＪＩＣスコア、灰色のバーはコネキシン４３を介したＧＪＩＣスコア、である。コネキシン２６を介したＧＪＩＣスコアについて、実験に供された二量体型オレアミド誘導体はすべて、オレアミドと同程度またはそれより低い値を示し、コネキシン２６阻害活性を有することが認められた。
３量体型オレアミド誘導体（ＭＩ−５０・ＭＩ−５１）、および、４量体型オレアミド誘導体（ＭＩ−５２・ＭＩ−５３）についても、コントロールと比較してコネキシン２６阻害活性を有することが、上記アッセイ時に目視で観察された。
上記アッセイにより、強いコネキシン２６阻害活性が認められた３つの二量体型オレアミド誘導体（ＭＩ−２２・ＭＩ−３９・ＭＩ−４５）は、図に示すように、コネキシン４３阻害活性を示さなかった。すなわち、これらのオレアミド誘導体は、コネキシン２６を特異的に阻害し、コネキシン４３は阻害しなかった。このように、コネキシン４３は阻害せずに、コネキシン２６を特異的に阻害するという性質の点で、上記３つのオレアミド誘導体のうちＭＩ−２２が最も良好な結果を示したため、以下ではこのＭＩ−２２を使用して解析を行った。
〔実施例３：上記ＭＩ−２２による癌の自然転移阻害〕
上記のようにコネキシン２６阻害活性を有するＭＩ−２２が、実際に動物個体において癌の自然転移を抑制するかどうかを以下の実験により検討した。
上記のようにコネキシン２６阻害活性を有するＭＩ−２２が、実際に動物個体において癌の自然転移を抑制するかどうかを以下の実験により検討した。
［3. 1］方法
実験は、国際公開ＷＯ２００４／０６０３９８号公報に記載の方法と同様に行った。すなわち、１×１０5個のＢＬ６細胞（Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の亜株）を４週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの足底部皮下に接種した後、マウスを次の２群に分けた。
１）ＭＩ−２２投与群：ＭＩ−２２（１０ｍｇ）をオリーブ油（１０ｍＬ）に溶解したものをマウスの体重１ｇあたり０.０１ｍLとなるよう１日１回（約０.２ｍLずつ）、連日腹腔内注射したマウス群。
２）無処置（Ｎｔ）群：注射による薬剤投与・処置を何も行わなかったマウス群。
実験は、国際公開ＷＯ２００４／０６０３９８号公報に記載の方法と同様に行った。すなわち、１×１０5個のＢＬ６細胞（Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の亜株）を４週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの足底部皮下に接種した後、マウスを次の２群に分けた。
１）ＭＩ−２２投与群：ＭＩ−２２（１０ｍｇ）をオリーブ油（１０ｍＬ）に溶解したものをマウスの体重１ｇあたり０.０１ｍLとなるよう１日１回（約０.２ｍLずつ）、連日腹腔内注射したマウス群。
２）無処置（Ｎｔ）群：注射による薬剤投与・処置を何も行わなかったマウス群。
上記の処置をＢＬ６細胞接種の翌日より連日行い、接種部に形成された腫瘤が径約７ｍｍに成長した時点で、膝関節切断により足を切除した。この２日後まで上記の処置を行い、その後は無処置でマウスを飼育する。膝関節切断後４週間でマウスを安楽死させ、左右両肺の胸膜表面に形成された転移結節（肺への転移巣の数）を肉眼的に数えた。なお、各群マウス１５匹で評価を行った。
［3. 2］結果
上記実験結果を、図４および図５に示す。図４のグラフ縦軸は肺への転移巣の数を示し、ＭＩ−２２投与群は、無処置（Ｎｔ）群と比較して、転移巣の数が８０％減少し、ＭＩ−２２が癌の自然転移を顕著に阻害・抑制することが示された。
上記実験結果を、図４および図５に示す。図４のグラフ縦軸は肺への転移巣の数を示し、ＭＩ−２２投与群は、無処置（Ｎｔ）群と比較して、転移巣の数が８０％減少し、ＭＩ−２２が癌の自然転移を顕著に阻害・抑制することが示された。
図５には、ＭＩ−２２投与群および無処置（Ｎｔ）群の各マウスから摘出された肺の写真などが示される。すなわち、パネル上段は癌の自然転移が生じていない肺とそのマウスの数を、パネル中段はやや自然転移が見られた肺とそのマウスの数を、パネル下段は自然転移が多く見られた肺とそのマウスの数を、それぞれ示す。無処置（Ｎｔ）群では、癌の自然転移が生じていない肺、やや自然転移が見られた肺、自然転移が多く見られた肺の数がそれぞれ２，８，５匹であるのに対して、ＭＩ−２２投与群では７，６，２匹である。この結果からも、ＭＩ−２２は癌の自然転移を強力に阻害・抑制することが認められた。
また、上記実験において、ＭＩ−２２を毎日投与しても、癌の自然転移以外の原因で死亡したマウスは皆無であり、ＭＩ−２２は、安全性が極めて高い物質である。したがって、ＭＩ−２２は、副作用の少ない癌転移抑制剤（抗癌転移薬）として利用可能と考えられる。
［3. 3］細胞毒性実験
ＭＩ−２２の細胞毒性（細胞増殖阻害能）を調べるため、直径３．５ｃｍのシャーレに、ヒト胃がん細胞であるＡｚ５２１細胞を約１×１０5個撒き、ＭＩ−２２存在下または非存在下（control）で培養を行った。培養を開始して６，１２，２４，３６，４８時間経過した後、おのおのトリプシン−ＥＤＴＡで細胞をはがし、遠心後１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに細胞を溶解させ、この細胞溶解液１０μＬに、トリパンブルーを１０μＬ加え、計算板で細胞数をカウントした。その結果を図６のグラフに示す。縦軸は細胞数、横軸は時間である。３回の実験の平均を示す。
ＭＩ−２２の細胞毒性（細胞増殖阻害能）を調べるため、直径３．５ｃｍのシャーレに、ヒト胃がん細胞であるＡｚ５２１細胞を約１×１０5個撒き、ＭＩ−２２存在下または非存在下（control）で培養を行った。培養を開始して６，１２，２４，３６，４８時間経過した後、おのおのトリプシン−ＥＤＴＡで細胞をはがし、遠心後１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに細胞を溶解させ、この細胞溶解液１０μＬに、トリパンブルーを１０μＬ加え、計算板で細胞数をカウントした。その結果を図６のグラフに示す。縦軸は細胞数、横軸は時間である。３回の実験の平均を示す。
同図に示すように、ＭＩ−２２とコントロールとの間に有意差はなく、ＭＩ−２２の細胞毒性（細胞増殖阻害能）は認められなかった。
〔実施例４：上記ＭＩ−２２による癌の増殖抑制〕
ヌードマウスの背中皮下にヒト胃がん細胞であるＡｚ５２１細胞を移植し、ＭＩ−２２腹腔投与による癌増殖抑制効果（抗腫瘍効果）について検討を行った。より具体的には、４週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）の背中に、１−２×１０5個のＡｚ５２１細胞を皮下注射した。この皮下移植３日前に、ＭＩ−２２（１０ｍｇ）をオリーブ油（１０ｍＬ）に溶解したものをヌードマウスに０．１ｍＬ腹腔内注射した。皮下移植後は、週２回の割合でＭＩ−２２を同様に腹腔内投与した。コントロールのマウス群には、注射による薬剤投与・処置を何も行わなかった。
ヌードマウスの背中皮下にヒト胃がん細胞であるＡｚ５２１細胞を移植し、ＭＩ−２２腹腔投与による癌増殖抑制効果（抗腫瘍効果）について検討を行った。より具体的には、４週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）の背中に、１−２×１０5個のＡｚ５２１細胞を皮下注射した。この皮下移植３日前に、ＭＩ−２２（１０ｍｇ）をオリーブ油（１０ｍＬ）に溶解したものをヌードマウスに０．１ｍＬ腹腔内注射した。皮下移植後は、週２回の割合でＭＩ−２２を同様に腹腔内投与した。コントロールのマウス群には、注射による薬剤投与・処置を何も行わなかった。
皮下移植後に形成される腫瘍の大きさを観察し、ＭＩ−２２の抗腫瘍効果は、腫瘍重量を経時的に測定することで評価した。その結果を図７のグラフに示す。縦軸は腫瘍重量（ｍｇ）、横軸は皮下移植後の日数である。３匹のヌードマウスについて６つの腫瘍の平均値を示す。
同図に示すように、ＭＩ−２２を投与したマウスでは、コントロールのマウス群と比較して腫瘍の増大が顕著に抑制され、ＭＩ−２２による抗腫瘍効果が認められた。
図８は、上記と同様の実験方法で、ヒト胃がん細胞であるＡｚ５２１細胞が皮下移植されたヌードマウスに対してＭＩ−２２を腹腔内投与し、その抗腫瘍効果を検討した結果である。同図に示すように、ＭＩ−２２を投与したマウスでは、無処置のマウス群（ＮＴ）と比較して腫瘍体積の肥大化が顕著に抑制され、ＭＩ−２２による抗腫瘍効果が認められた。
これらの結果は、ＭＩ−２２が従来の抗癌剤には無い際立って優れた特徴を有することを示している。すなわち、従来開発されてきた抗癌剤の殆どは「正常細胞より増殖能力の高い癌細胞の増殖を優先的に阻害する」特徴を利用したものである。これらは正常細胞に対しても増殖阻害を示すため必然的に細胞毒性を持ち、これが抗癌剤の副作用の原因となるという欠点は免れなかった。これに対して、ＭＩ−２２はシャーレで培養した正常細胞および癌細胞に対しては細胞毒性（細胞増殖阻害能）を全く示さないにもかかわらず、生体内（ここでは野生マウスおよびヌードマウス）に移植した癌細胞には細胞増殖阻害作用を示したのである。この特徴は、ＭＩ−２２が極めて高い新規性を持つこれまでに前例の無い新しいタイプの抗癌剤であることを示している。
以上のように、本発明は、コネキシン２６阻害活性を有する多量体型オレアミド誘導体に関するものであり、これらの新規オレアミド誘導体は、研究用試薬として利用できるほか、癌の転移抑制・増殖抑制など有用な生理活性を示すことから、癌の予防薬・治療薬をはじめとして、医薬、サプリメント、機能性食品などの各種用途を有し、産業上広く利用できるものである。
Claims (5)
- 下記の式（１）により表される二量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。
- 請求項１に記載の二量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする癌の転移抑制剤。
- 請求項１に記載の二量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする癌の増殖抑制剤。
- 請求項１に記載の二量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を含有する食用組成物。
- 請求項１に記載の二量体型オレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を含有するコネキシン２６阻害剤。
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