JP4885600B2 - Primer set and method for detecting Escherichia coli causing porcine digestive system diseases - Google Patents
Primer set and method for detecting Escherichia coli causing porcine digestive system diseases Download PDFInfo
- Publication number
- JP4885600B2 JP4885600B2 JP2006116564A JP2006116564A JP4885600B2 JP 4885600 B2 JP4885600 B2 JP 4885600B2 JP 2006116564 A JP2006116564 A JP 2006116564A JP 2006116564 A JP2006116564 A JP 2006116564A JP 4885600 B2 JP4885600 B2 JP 4885600B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- base sequence
- sequence shown
- primer consisting
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 59
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 title claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 38
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 9
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 5
- 239000002585 base Substances 0.000 description 109
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 39
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 4
- 241000589893 Brachyspira hyodysenteriae Species 0.000 description 4
- 241000510930 Brachyspira pilosicoli Species 0.000 description 4
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 4
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 4
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 4
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 3
- 108010017898 Shiga Toxins Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101100378273 Brachyspira hyodysenteriae acpP gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000025053 Escherichia coli DSM 30083 = JCM 1649 = ATCC 11775 Species 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 101100500479 Hafnia alvei eaeA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100098690 Listeria monocytogenes serovar 1/2a (strain ATCC BAA-679 / EGD-e) hly gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 108010015046 cell aggregation factors Proteins 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 101150107911 eae gene Proteins 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 101150021605 hlyA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000004260 plant-type cell wall biogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 210000004916 vomit Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はブタ消化器系疾患を惹起する大腸菌の検出用プライマー及び当該プライマーを用いる大腸菌の検出方法に関する。より詳細には、ブタ消化器系疾患を惹起する複数の型の大腸菌を同時に検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット及び当該プライマーセットを用いる大腸菌の型別の検出方法に関する。 The present invention relates to a detection primer for Escherichia coli that causes a porcine digestive system disease and a method for detecting Escherichia coli using the primer. More specifically, the present invention relates to a multiplex PCR primer set for simultaneously detecting a plurality of types of E. coli causing a porcine digestive system disease, and a detection method for each type of E. coli using the primer set.
ブタに下痢、嘔吐、浮腫病などの消化器系疾患を惹起する原因の一つとして大腸菌がある。ブタの大腸菌消化器系疾患は、例えば2002年の死亡淘汰発生率が約5%であったように、大きな経済的損失を生じる。
授乳期及び離乳後（1ヶ月齢程度以降）のブタの大腸菌消化器系疾患はエンテロトキシン産生性大腸菌（ETEC）及び／又はベロ毒素産生性大腸菌（VTEC）により起こる。ETECは易熱性エンテロトキシン(以下、LT)、メタノール可溶性の耐熱性エンテロトキシン（以下、STp）及び／又はメタノール不溶性の耐熱性エンテロトキシン（以下、ST II）を産生し、ブタに消化器系疾患を惹起する。VTECはブタ型ベロ毒素（以下、VTe）を産生し、ブタに消化器系疾患を惹起する。なお、ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌は、上記毒素の単独又は複数を産生する。
上記の大腸菌はブタ小腸上皮細胞付着因子として機能する線毛（Ｆ4、Ｆ5、Ｆ6、Ｆ18、Ｆ41など）を有している。なお、ブタがＦ18のレセプターを発現するのは3週齢以降なので、3週齢以前のブタはＦ18型線毛を有する大腸菌による消化器系疾患は発症しない。
LT、STp、ST IIはETEC菌体内ではシグナルペプチドの付いた前駆体として産生され、菌体外に分泌される際にシグナルペプチドが外されブタ細胞毒性を発現するので、ETECに細胞壁合成阻害型の抗生物質を作用させ、LT、STp及び／又はST IIの前駆体を菌体外に放出させた場合でも、LT、STp及び／又はST II自体のブタ細胞毒性を発現せず、消化器系疾患の症状を悪化させる事はない。一方、VTeはVTEC菌体内でベロ毒素活性を有する物質として産生されるので、細胞壁合成阻害型等の抗生物質を作用させるとVTeの菌体外放出を促進しブタの病状を悪化させる。従って、VTECによる消化器系疾患の治療に当該抗生物質を使用してはならない。このように、原因大腸菌型により治療用薬剤を適切に選択する必要がある。
E. coli is one of the causes of digestive diseases such as diarrhea, vomiting and edema disease in pigs. Porcine Escherichia coli digestive system diseases cause significant economic losses, for example, the incidence of death in 2002 was about 5%.
Pig E. coli digestive disorders in lactation and after weaning (after about 1 month of age) are caused by enterotoxin-producing E. coli (ETEC) and / or verotoxin-producing E. coli (VTEC). ETEC produces heat-labile enterotoxin (LT), methanol-soluble thermostable enterotoxin (STp) and / or methanol-insoluble thermostable enterotoxin (ST II), causing digestive disorders in pigs . VTEC produces porcine verotoxin (hereinafter referred to as VTe) and causes digestive disorders in pigs. Note that Escherichia coli that causes digestive diseases in pigs produces one or more of the above toxins.
The above Escherichia coli has pili (F4, F5, F6, F18, F41, etc.) that function as porcine small intestinal epithelial cell adhesion factors. Since pigs express F18 receptors after 3 weeks of age, pigs before 3 weeks of age do not develop digestive diseases due to E. coli having F18 pili.
LT, STp, and ST II are produced as precursors with a signal peptide in the ETEC cell, and when secreted outside the cell, the signal peptide is removed and expresses swine cytotoxicity. Even when LT, STp, and / or ST II precursors are released outside the cells, the LT, STp and / or ST II itself does not develop porcine cytotoxicity, and the digestive system It does not worsen the symptoms of the disease. On the other hand, since VTe is produced as a substance having verotoxin activity in the VTEC cell, the action of an antibiotic such as a cell wall synthesis inhibiting type promotes the extracellular release of VTe and worsens the condition of the pig. Therefore, the antibiotic should not be used to treat digestive disorders with VTEC. Thus, it is necessary to appropriately select a therapeutic drug depending on the causative E. coli type.
ところで、ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌の血清型やその出現頻度は、ブタが飼養されている地域や、同一の地域であっても時期によって異なる（非特許文献１）。例えば、VTe非産生菌とVTe産生菌の出現頻度は、オーストラリアではそれぞれ100% (126/126)と0％ (0/126)（非特許文献２）、中国ではそれぞれ97％ (200/206)と3%
(6/206)（非特許文献３）であったが、日本国内の一例では後記表６が示すように、それぞれ35%
(20/56)と65%(36/56)であった。このように農地面積が狭く畜産立地としての適性に恵まれない日本では、ブタの大腸菌消化器系疾患はVTe非産生菌とVTe産生菌の両方が高率に発生している。このようなことから、特に日本では、ブタの消化器系疾患を惹起する大腸菌を正確・迅速・簡便に検査し、薬剤を適切に選択し、生産コストの上昇防止と薬剤耐性菌の発生防止を図ることが必要である。
(6/206) (Non-Patent Document 3) However, as shown in Table 6 below, in each case in Japan, 35%
(20/56) and 65% (36/56). In Japan, where the farmland area is small and not suitable for livestock production, both E.coli-producing bacteria and VTe-producing bacteria occur at high rates in porcine Escherichia coli digestive diseases. For this reason, especially in Japan, E. coli that causes digestive system diseases in pigs is accurately, quickly, and easily tested, and drugs are selected appropriately to prevent an increase in production costs and the generation of drug-resistant bacteria. It is necessary to plan.
大腸菌の検査結果は、一般的には、選択培地等による分離培養、生化学性状試験、血清学的試験、毒素産生試験、薬剤耐性試験等を経て得られるが、検査結果を得るまでに数日間を要する。そこで、近年ではＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を主とする遺伝子検査が行われている。ＰＣＲ法では、培養試験に比べて短時間で検査結果を得ることができる。また、複数のプライマーセットを使用するマルチプレックスＰＣＲを適用することにより、複数の標的遺伝子を同時に検査することができる。
マルチプレックスＰＣＲを用いた大腸菌の検出に関し、Botteldoornらは、VTECについてvt1、vt2、eaeAとhlyA遺伝子を検出するマルチプレックスＰＣＲと、ETECについてLT I、ST IaとST II遺伝子を検出するマルチプレックスＰＣＲを行ったが、VTECとETECの両方を単一のＰＣＲチューブ内で同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲは行っていない。また、供試菌株によっては、当該菌株が保有する遺伝子のマルチプレックス検出に成功しなかった（非特許文献４）。
一方、ChenらはVTECとETECを検出するマルチプレックスＰＣＲを行ったが、線毛型別は血清学的試験で行った（非特許文献５）。
更に、ＰＣＲ増幅反応の温度サイクル条件を一定とする複数の微生物を検出する方法及びプライマーセットが提案されている（特許文献１）が、遺伝子の増幅反応を単一のＰＣＲチューブ内で行うのではなく、検出対象微生物毎に複数のＰＣＲチューブを用いた。
このように、ブタの消化器系疾患を惹起するVTECとETECの両方を同時に検出すると共に、それらの線毛型別を行うことを目的に、複数の標的遺伝子群を単一のＰＣＲチューブ内で増幅させるマルチプレックスＰＣＲは行われていなかった。
Regarding detection of E. coli using multiplex PCR, Botteldoorn et al. Multiplex PCR that detects vt1, vt2, eaeA and hlyA genes for VTEC, and multiplex PCR that detects LT I, ST Ia and ST II genes for ETEC. However, multiplex PCR in which both VTEC and ETEC are simultaneously amplified in a single PCR tube is not performed. In addition, depending on the test strain, multiplex detection of the gene possessed by the strain was not successful (Non-patent Document 4).
On the other hand, Chen et al. Performed multiplex PCR to detect VTEC and ETEC, but the pilus type was determined by serological test (Non-patent Document 5).
Furthermore, a method and a primer set for detecting a plurality of microorganisms with a constant temperature cycle condition of a PCR amplification reaction have been proposed (Patent Document 1), but a gene amplification reaction is not performed in a single PCR tube. Instead, a plurality of PCR tubes were used for each detection target microorganism.
In this way, in order to detect both VTEC and ETEC causing digestive system diseases in pigs simultaneously, and to perform pilus typing of them, multiple target gene groups can be contained in a single PCR tube. Multiplex PCR to be amplified was not performed.
マルチプレックスＰＣＲを行う場合、複数のプライマーセットを単純に混合しただけでは、満足のいく特異的な遺伝子増幅産物が得られるとは限らない。一般に、ＰＣＲにより2つ以上の遺伝子を単一のＰＣＲチューブ内で増幅させようとする場合、目的以外の遺伝子が非特異的に増幅されたり、目的の遺伝子が増幅されなかったりするので、標的遺伝子のみを特異的に増幅させると共に、プライマー間の干渉の生じないプライマーを設計する必要がある（非特許文献６）。しかし、これらを十分考慮してプライマーを設計した場合でも反応効率が低下することもあるので、特異的なマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットの設計は容易でなかった。
上述のように、マルチプレックスＰＣＲ法では、複数のプライマーセットを単純に混合しただけでは、それぞれの特異的な遺伝子増幅産物が得られるとは限らなかった。また、ブタの消化器系疾患を惹起するVTECとETECの両方を同時に検出すると共に、それらの線毛型別を行うことを目的に、複数の標的遺伝子群を単一のＰＣＲチューブ内で増幅させるマルチプレックスＰＣＲは行われていなかった。
本発明者らは係る問題点を解消するために鋭意検討したところ、大腸菌のLT、STp、ST II及びVTe並びに線毛抗原F4及びF18の遺伝子を単一のＰＣＲチューブ内で特異的に増幅させると共に干渉反応を生じさせないで増幅させ、ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動する際に、同一レーン上で標的遺伝子群に対応する増幅産物を肉眼的に識別可能なバンドとして検出できるマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを見出した。
本発明は係る知見に基づくもので、ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌のLT、STp、ST II及びVTe並びに線毛抗原F4及びF18をコードする６種類の遺伝子を同時に正確、迅速、簡便に検出するマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット及び当該プライマーセットを用いる大腸菌のLT、STp、ST II及びVTe並びに線毛抗原F4及びF18の遺伝子を正確、迅速、簡便に検出する方法を提供する。
As described above, in the multiplex PCR method, simply mixing a plurality of primer sets did not always yield specific gene amplification products. In addition, simultaneously detect both VTEC and ETEC causing porcine gastrointestinal diseases, and amplify multiple target genes in a single PCR tube for the purpose of pilus typing. Multiplex PCR was not performed.
The present inventors have intensively studied to solve such problems, and specifically amplify LT, STp, ST II and VTe of E. coli and genes of pilus antigens F4 and F18 in a single PCR tube. A set of primers for multiplex PCR that can be amplified without causing an interference reaction and amplify the PCR amplification product on the same lane as a band that can be visually distinguished on the same lane. I found.
The present invention is based on such findings, and simultaneously, accurately, rapidly and simply, six genes encoding LT, STp, ST II and VTe of E. coli that cause digestive system diseases in pigs and ciliary antigens F4 and F18. The present invention provides a primer set for multiplex PCR to be detected at the same time, and a method for accurately, rapidly and simply detecting LT, STp, ST II and VTe genes of E. coli and fimbriae antigens F4 and F18 using the primer set.
上記の課題を解決するためになされた本発明は、ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌のLT、STp、ST II、VTe、F4及びF18をコードする遺伝子を検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットであって、上記遺伝子を同時に検出でき且つＰＣＲ産物の全てが肉眼的に識別可能なバンドを形成することを可能とするマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットである。特に、上記のプライマーセットは、各ＰＣＲ増幅産物の塩基長が１０塩基以上の差が生じるように各プライマーセットを選択するのが好ましい。
更に、好ましいプライマーセットは、下記(1)〜(4)のプライマーセットの組合せの何れか、又は当該プライマーセットの組合せの各オリゴヌクレオチドに相補的配列の組合せで構成されるプライマーセットからなるマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットである。
(1)配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(2)配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(3)配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(4)配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３１に示される塩基配列からなるプライマー。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３〜７、９〜１１、１３，１４、１６、１７、１９，２０、２２〜２９及び３１に示される塩基配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドである。
更に、本発明の大腸菌の検出方法は、(a)ブタ由来検体からＤＮＡを抽出する工程、(b)当該ＤＮＡを鋳型として、上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、(c)ＤＮＡの増幅の有無を検出する工程を含み、大腸菌のLT、STp、ST II、VTe、F4及びF18をコードする遺伝子を同時且つ肉眼的に識別可能なバンドで検出することからなるブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌を検出する方法である。
The present invention made to solve the above problems is for multiplex PCR for detecting genes encoding LT, STp, STII, VTe, F4 and F18 of Escherichia coli that cause digestive system diseases in pigs. The primer set is a multiplex PCR primer set that can simultaneously detect the above genes and form a band that can be visually discerned by all of the PCR products. In particular, it is preferable to select each primer set so that a difference of 10 bases or more in the base length of each PCR amplification product is generated.
Furthermore, a preferable primer set is a multiplex consisting of a primer set composed of a combination of complementary sequences to any of the following primer set combinations (1) to (4) or to each oligonucleotide of the primer set combination: It is a primer set for PCR.
(1) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24; a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26; and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 .
(2) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25; a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26; and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 .
(3) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24; a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27; and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 .
(4) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 20;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24; a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28; and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 .
Moreover, the oligonucleotide of the present invention consists of the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1, 3 to 7, 9 to 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22 to 29, and 31 or a complementary sequence thereof. It is an oligonucleotide.
Furthermore, the method for detecting Escherichia coli of the present invention includes (a) a step of extracting DNA from a pig-derived specimen, (b) a step of performing PCR using the primer set using the DNA as a template, and (c) a DNA Digestive system disease in pigs, including the step of detecting the presence or absence of amplification and detecting the genes encoding LT, STp, ST II, VTe, F4 and F18 of Escherichia coli simultaneously and in a visually distinguishable band This is a method for detecting E. coli that induces E. coli.
本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを用いてブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌を検査することにより、VTe非産生菌とVTe産生菌の型別などを正確・迅速・簡便に行うことができ、ブタの治療用の薬剤を適切に選択し、生産コストの上昇防止と薬剤耐性菌の発生防止を図ることが可能になる。 By using the multiplex PCR primer set of the present invention to examine Escherichia coli that causes digestive system diseases in pigs, it is possible to accurately, quickly, and easily classify VTe non-producing bacteria and VTe producing bacteria. Therefore, it is possible to appropriately select a drug for treating pigs, and to prevent an increase in production cost and generation of drug-resistant bacteria.
本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットは、ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌が保有するLT、STp、ST II及びVTe並びに線毛抗原F4及びF18をコードする遺伝子のそれぞれと特異的に結合する複数のプライマーセットからなり、上記遺伝子を同時に検出でき且つＰＣＲ産物の全てが肉眼的に識別可能なバンドを形成することを可能とするマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットである。
ここで、上記の「同時に検出でき且つＰＣＲ産物の全てが肉眼的に識別可能なバンドを形成することを可能とする」とは、(1)１本のＰＣＲチューブ内で、熱変性、アニーリング、伸長反応を単一のＰＣＲ条件で行い、ＰＣＲ増幅産物を調製し、(2)当該ＰＣＲ増幅産物を単一のレーン上で電気泳動して、LT、STp、ST II及びVTe並びに線毛抗原F4及びF18をコードする遺伝子を正確に検出でき、(3)供試プライマー特異的な６種のＰＣＲ増幅産物の全てが、肉眼的に識別可能なバンドを形成することをいう。
肉眼的に識別可能なバンドを形成させるためには、近接する増幅産物のサイズの差が10〜400bp、好ましくは20〜300bpであるのが望ましい。
また、正確に検出できるとは、擬陰性又は擬陽性の出現頻度がそれぞれ10％未満であることをいう。
また、上記の消化器系疾患としては、例えば、下痢、嘔吐、浮腫病などが例示される。
また、本発明のプライマーセットは、後記の実施例が示すように、ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌とのみ反応し、ブタに消化器系疾患を惹起しない大腸菌、ブタに消化器系疾患を惹起するClostridium perfringens、Salmonella属細菌、Brachyspira hyodysenteriae及びBrachyspira pilosicoli、並びにブタ糞便中に常在し消化器系疾患には関与しない腸内細菌（Bacteroide など）とは、交差反応しないという特徴を有する。
The primer set for multiplex PCR of the present invention specifically binds to each of LT, STp, ST II and VTe and genes encoding pilus antigens F4 and F18 possessed by Escherichia coli that causes digestive system diseases in pigs. It is a primer set for multiplex PCR that can detect the above genes at the same time and that all PCR products can form a visually distinguishable band.
Here, the above-mentioned “it is possible to form a band that can be detected at the same time and all of the PCR products are visually discernable” means (1) heat denaturation, annealing, The extension reaction is performed under a single PCR condition to prepare a PCR amplification product, (2) the PCR amplification product is electrophoresed on a single lane, and LT, STp, ST II and VTe and the pilus antigen F4 And the gene encoding F18 can be accurately detected, and (3) all six PCR amplification products specific to the test primer form a visually distinguishable band.
In order to form a visually distinguishable band, it is desirable that the difference in size between adjacent amplification products is 10 to 400 bp, preferably 20 to 300 bp.
Moreover, being able to detect correctly means that the appearance frequency of false negative or false positive is less than 10%, respectively.
Examples of the digestive system diseases include diarrhea, vomiting, and edema disease.
The primer set of the present invention reacts only with Escherichia coli that causes digestive system diseases in pigs, as shown in the examples described later, and does not cause digestive system diseases in pigs. Clostridium perfringens , Salmonella genus bacteria, Brachyspira hyodysenteriae and Brachyspira pilosicoli , and intestinal bacteria (such as Bacteroide ) that are resident in pig feces and are not involved in digestive system diseases.
本発明でプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、選択性や検出感度及び再現性から考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然のどちらでもよく、プライマーが標識されているか否かは問わない。また、プライマーとしての機能を果たす限り、プライマー（オリゴヌクレオチド）の５’末端側に１又は２以上の塩基が付加していてもよく、また１又は２以上の塩基が置換、欠失していてもよい。 The oligonucleotide used as a primer in the present invention is a nucleotide fragment having a length of 10 bases or more, preferably 15 bases or more in consideration of selectivity, detection sensitivity and reproducibility, and may be either chemically synthesized or natural. It does not matter whether or not the primer is labeled. In addition, as long as it functions as a primer, one or more bases may be added to the 5 ′ end side of the primer (oligonucleotide), and one or more bases are substituted or deleted. Also good.
ＰＣＲ増幅産物の塩基長は選択したプライマーセットにより規定されるが、検出対象遺伝子の増幅領域は、５０塩基から２,０００塩基、望ましくは、１００塩基から１,０００塩基となるように選択する。 The base length of the PCR amplification product is defined by the selected primer set, and the amplification region of the detection target gene is selected so as to be from 50 bases to 2,000 bases, and preferably from 100 bases to 1,000 bases.
本発明では複数の標的遺伝子群を単一のＰＣＲチューブ内で特異的に増幅させると共に、干渉反応を生じさせないで増幅させる必要があるので、アニーリング温度が一定になるようにプライマーを設計する必要があり、各プライマーの融解温度（Tm）を一定にする必要がある。Tm値は正確には実験により求められるが、プライマーの塩基配列から換算することができる。例えば、Ａ又はＴを２℃、Ｇ又はＣを４℃として合計する方法が一般に用いられている。 In the present invention, it is necessary to specifically amplify a plurality of target gene groups in a single PCR tube and amplify without causing an interference reaction, so it is necessary to design primers so that the annealing temperature is constant. Yes, the melting temperature (Tm) of each primer must be constant. Although the Tm value can be accurately determined by experiments, it can be converted from the base sequence of the primer. For example, a method of adding A or T at 2 ° C. and G or C at 4 ° C. is generally used.
本発明の好ましいプライマーセットの例としては、下記(1)〜(4)のプライマーセットの組合せの何れか、又は当該プライマーセットの組合せの各オリゴヌクレオチドに相補的配列の組合せで構成されるプライマーセットからなるマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットが挙げられる。なお、プライマーセットの各オリゴヌクレオチドに相補的配列の組合せの構成もプライマーセットとして機能することは当業者にとって自明である。
(1)配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(2)配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(3)配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(4)配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３１に示される塩基配列からなるプライマー。
As an example of a preferable primer set of the present invention, any one of the following primer set combinations (1) to (4), or a primer set composed of a combination of complementary sequences to each oligonucleotide of the primer set combination A primer set for multiplex PCR consisting of It is obvious to those skilled in the art that the combination of complementary sequences for each oligonucleotide in the primer set also functions as a primer set.
(1) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24; a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26; and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 .
(2) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25; a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26; and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 .
(3) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24; a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27; and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 .
(4) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 20;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24; a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28; and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 .
本発明の大腸菌の検出方法は、(a)ブタ由来検体からＤＮＡを抽出する工程、(b)当該ＤＮＡを鋳型として、請求項１に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、(c)ＤＮＡの増幅の有無を検出する工程を含み、大腸菌のLT、STp、ST II、VTe、F4及びF18をコードする遺伝子を同時且つ肉眼的に識別可能なバンドで検出することからなるブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌を検出（型別）する方法である。
Method for detecting E. coli of the present invention, the step of extracting DNA from (a) Porcine analyte, (b) the DNA as a template, a step of performing PCR using the primer set according to
上記のブタ由来検体としては、糞便、嘔吐物、スワブ、腸内容物、臓器などが例示されるが、糞便が代表的な例である。係る材料をＰＣＲの試料として用いるには、材料中に存在する菌体からＤＮＡ成分を遊離させる操作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハイブリダイズできるＤＮＡが数分子から数十分子以上存在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行させるに十分なＤＮＡ量を持った試料液が調製できる。なお、必要に応じて、検査材料を適当な培地中で培養して大腸菌を増殖させてからＤＮＡ試料を調製してもよい。しかし、大腸菌感染により下痢症を発症したブタから採取した糞便（下痢便）中には、原因大腸菌が優勢的かつ純培養的に存在するので、前培養または増菌培養を要さないことは当業者には自明である。 Examples of the pig-derived specimen include stool, vomit, swab, intestinal contents, organ, and the like, but stool is a typical example. In order to use such a material as a PCR sample, an operation for releasing a DNA component from bacterial cells present in the material is required as a pretreatment. However, PCR progresses if there are several to several tens of centimeters of DNA that can be hybridized with the primer, so that it is sufficient to proceed with PCR simply by treating the test material with lytic enzyme, surfactant, alkali, etc. A sample solution having a DNA amount can be prepared. If necessary, the DNA sample may be prepared after growing the E. coli by culturing the test material in an appropriate medium. However, in the stool collected from pigs that developed diarrhea due to E. coli infection (diarrhea stool), the causative Escherichia coli is predominantly present in pure culture, so it is not necessary to preculture or enrichment culture. It is obvious to the contractor.
次いで、上記で調製した試料中のＤＮＡを鋳型として、本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを用いてＰＣＲを行う。
係るＰＣＲ工程は常法に準じて行うことができ、既に市販されているＰＣＲ装置などを用いて行うことができる。
より詳細には、例えば、ＰＣＲ反応に使用される反応液は、市販のＰＣＲ測定キットなどに添付されている反応液を使用すればよい。
また、ＰＣＲ反応に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは９０〜９５℃の温度で活性を保持していれば、何れの生物種由来でもよい。使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばGene Taq、TaKaRa Taq、ExTaq HSなどが例示できる。
ＰＣＲ条件としては、熱変性の温度は９０〜９５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５℃、伸長反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４５サイクル行って増幅させる。特に本発明は一回のＰＣＲ反応で複数の大腸菌の遺伝子の同時検出を可能にするために、熱変性の温度は９４℃、全てのプライマーのTm値を５０から６０℃の範囲内となるように設計した。
プライマーセットの使用量は、特に制限されないが、一般的に各プライマーが最終濃度0.5μＭ程度になるように使用することが好ましい。
Next, PCR is performed using the DNA in the sample prepared above as a template and the multiplex PCR primer set of the present invention.
Such a PCR step can be performed according to a conventional method, and can be performed using a commercially available PCR apparatus or the like.
More specifically, for example, as a reaction solution used for the PCR reaction, a reaction solution attached to a commercially available PCR measurement kit or the like may be used.
Moreover, the thermostable DNA polymerase used in the PCR reaction may be derived from any species as long as the activity is maintained at a temperature of 90 to 95 ° C. Examples of the thermostable DNA polymerase used include Gene Taq, TaKaRa Taq, ExTaq HS and the like.
As PCR conditions, the temperature of heat denaturation is 90 to 95 ° C., the temperature of the annealing operation for hybridizing the primers is 37 to 65 ° C., the extension reaction is 50 to 75 ° C., and PCR using this as one cycle is 20 to 45 ° C. Amplify by cycling. In particular, the present invention enables simultaneous detection of a plurality of E. coli genes in a single PCR reaction, so that the temperature of heat denaturation is 94 ° C. and the Tm values of all primers are in the range of 50 to 60 ° C. Designed.
The amount of the primer set used is not particularly limited, but generally it is preferable to use each primer so that the final concentration is about 0.5 μM.
ＰＣＲを終えた反応液をアガロースゲル電気泳動に供することによって、ＰＣＲ増幅産物の存在及びその増幅産物がプライマー特異的なものであるか否かを確認することができる。便宜的には増幅産物の移動度と既知のマーカーの移動度を比較することによって目的の増幅産物であるか否かを判定できる。更には、アガロースゲルから抽出したＤＮＡについてシーケンスする方法、ネスティッドＰＣＲに供する方法、サザンブロッティングに供する方法などによって標的遺伝子の増幅産物であることを確認することができる。
増幅されたヌクレオチド断片の検出には、アガロースゲル以外の支持体を使用する電気泳動法やクロマトグラフィーを適用することもできる。
係る方法によれば、ブタ由来検体中に存在する可能性のある、大腸菌のLT、STp、ST II、VTe、F4及び／又はF18をコードする遺伝子を同時且つ肉眼的に識別可能なバンドで検出することができる。
By subjecting the reaction solution after PCR to agarose gel electrophoresis, it is possible to confirm the presence of the PCR amplification product and whether the amplification product is primer-specific. For convenience, it can be determined whether or not the amplification product is the target by comparing the mobility of the amplification product with the mobility of a known marker. Furthermore, it can be confirmed that the product is an amplification product of the target gene by a method for sequencing DNA extracted from an agarose gel, a method for nested PCR, a method for Southern blotting, or the like.
For detection of the amplified nucleotide fragment, electrophoresis method or chromatography using a support other than agarose gel can be applied.
According to such a method, genes encoding LT, STp, ST II, VTe, F4 and / or F18 of E. coli that may be present in swine-derived specimens are detected at the same time and in a visually distinguishable band. can do.
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited to the example which concerns.
実施例１〜４及び比較例１〜８
(1)プライマーの調製
表１に示す配列からなるオリゴヌクレオチドを、バルブブロック集合体装置を用いるホスホアミダイト法により合成し、オリゴプリフィキ逆相カートリッジで精製した。
(2)プライマーセット
実施例１〜４として、表２に示される６種類のプライマーセットを混合してブタ消化器系疾患を惹起する大腸菌を検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットとして使用した。
また、比較例１〜８として、表３に示される６種類のプライマーセットを混合してマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットとして使用した。
Examples 1-4 and Comparative Examples 1-8
(1) Preparation of primers Oligonucleotides having the sequences shown in Table 1 were synthesized by the phosphoramidite method using a valve block assembly apparatus and purified with an oligo-prefix reverse phase cartridge.
(2) Primer Set As Examples 1 to 4, the six types of primer sets shown in Table 2 were mixed and used as primer sets for multiplex PCR for detecting E. coli that causes porcine digestive system diseases.
Moreover, as Comparative Examples 1-8, 6 types of primer sets shown in Table 3 were mixed and used as primer sets for multiplex PCR.
(3)試験例１(ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌のマルチプレックスＰＣＲによる検出)
検体の調製
毒素遺伝子LT,
STp, ST II及び／又はVTe並びにF4及び／又はF18を保有する大腸菌株を増菌培地に混合接種し、３７℃で一晩培養した。これをブタ糞便（Bacteroides などのブタ糞便中に常在する腸内細菌が大量に存在する）と混合し、該糞便０．１ｇに滅菌蒸留水１．２ｍｌを加え、十分に攪拌し、１５分間放置した。その後、２００×ｇで遠心分離し、その上清を更に１５，０００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。沈渣ペレットを細胞溶解液（50mM Tris-HCl pH 8.4, 1mM EDTA, 0.5% Tween 20）４００μｌに浮遊させ、沸騰水中で１０分間加熱した。その後、再度１５，０００×ｇで２分間遠心分離した後、上清を別のチューブに移し、その上清にフェノール-クロロホルム４００μｌを添加し、よく攪拌した。その後、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清をエタノール沈殿し、得られた沈殿物をＴＥ緩衝液４０μｌで溶解しＰＣＲに供した。
(3) Test Example 1 (Detection of Escherichia coli causing digestive system diseases in pigs by multiplex PCR)
Specimen preparation toxin gene LT,
E. coli strains carrying STp, ST II and / or VTe and F4 and / or F18 were mixed and inoculated into an enrichment medium and cultured overnight at 37 ° C. This is mixed with swine feces (a large amount of intestinal bacteria present in swine feces such as Bacteroides ), 1.2 ml of sterilized distilled water is added to 0.1 g of the feces, and the mixture is sufficiently stirred for 15 minutes. I left it alone. Thereafter, the mixture was centrifuged at 200 × g, and the supernatant was further centrifuged at 15,000 × g for 5 minutes to remove the supernatant. The pellet pellet was suspended in 400 μl of cell lysate (50 mM Tris-HCl pH 8.4, 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20) and heated in boiling water for 10 minutes. Then, after centrifuging again at 15,000 × g for 2 minutes, the supernatant was transferred to another tube, and 400 μl of phenol-chloroform was added to the supernatant and stirred well. Thereafter, it was centrifuged at 15,000 × g for 10 minutes. The supernatant was ethanol precipitated, and the resulting precipitate was dissolved in 40 μl of TE buffer and subjected to PCR.
ＰＣＲ
検体液２μｌ、１０×反応緩衝液（500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH8.3, 30
mM MgCl2）５μｌ、ｄＮＴＰ溶液（dATP, dCTP, dGTP, dTTPの混合溶液で各2.5 mM）５μｌ、実施例１から４、又は比較例１から８に示すマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットの何れかの１２μｌ及び耐熱性ポリメラーゼ（Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ, 5 unit/μl, Roche社製）０．５μｌを加え、更に滅菌蒸留水を加えて全量５０μｌの反応液を調製した。この反応液を０．２ｍｌ容ＰＣＲ用チューブに入れ、ＤＮＡサーマルサイクラー(Bio-Rad社製iCycler）を用いてＰＣＲを行った（熱変性；９４℃、１分間：アニーリング；５５℃、１分間：伸長反応；６８℃、１分間：熱変性からアニーリングを経て伸長反応に至る過程を１サイクルとし、このサイクルを３５回繰り返した）
PCR
5 μl of mM MgCl 2 ), 5 μl of dNTP solution (2.5 mM each in a mixed solution of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP), any of the primer sets for multiplex PCR shown in Examples 1 to 4 or Comparative Examples 1 to 8 12 μl and thermostable polymerase (Taq
0.5 μl of DNA polymerase (5 unit / μl, manufactured by Roche) was added, and sterile distilled water was further added to prepare a total volume of 50 μl of reaction solution. This reaction solution was placed in a 0.2 ml PCR tube, and PCR was performed using a DNA thermal cycler (iCycler manufactured by Bio-Rad) (thermal denaturation; 94 ° C., 1 minute: annealing; 55 ° C., 1 minute: Elongation reaction: 68 ° C., 1 minute: The process from heat denaturation through annealing to the elongation reaction was defined as one cycle, and this cycle was repeated 35 times)
検出
反応液からＰＣＲによる増幅産物を検出するため、アガロースゲル電気泳動を行った。アガロースゲルはゲル濃度２％（W/V）とし、臭化エチジウム（100ng/ml）を含むものを用いた。ＴＡＥ溶液の入った泳動槽にゲルを浸し、１３５Ｖの定電圧で電気泳動を行なった。電気泳動後のゲルはＵＶランプを照射して増幅産物の鎖長を相対的に計測した。
In order to detect the amplification product by PCR from the detection reaction solution, agarose gel electrophoresis was performed. An agarose gel having a gel concentration of 2% (W / V) and containing ethidium bromide (100 ng / ml) was used. The gel was immersed in an electrophoresis tank containing a TAE solution, and electrophoresis was performed at a constant voltage of 135V. The gel after electrophoresis was irradiated with a UV lamp to relatively measure the chain length of the amplified product.
結果
ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌のマルチプレックスＰＣＲによる検出結果を表４及び図１に示す。表４及び図１が示すように、本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットは、ブタの糞便（Bacteroides などのブタ糞便中に常在する腸内細菌が大量に存在する）が共存する条件下でもLT、STp、ST II、VTe、F4及びF18をコードする遺伝子のそれぞれを増幅し、アガロース電気泳動ゲルの単一のレーン上に、それぞれ肉眼的に識別可能なバンドが観察された。
一方、比較例のプライマーセットを用いた場合には、LT、STp、ST II、VTe、F4又はF18の何れかの増幅バンドが観察されない、又は非特異的な増幅バンドが観察された。
Results Table 4 and FIG. 1 show the results of detection of E. coli causing digestive system diseases in pigs by multiplex PCR. As shown in Table 4 and FIG. 1, the primer set for multiplex PCR of the present invention can be used even under conditions in which pig stool (a large amount of intestinal bacteria present in pig stool such as Bacteroides ) coexist. Each of the genes encoding LT, STp, STII, VTe, F4 and F18 was amplified, and macroscopically distinguishable bands were observed on a single lane of the agarose electrophoresis gel.
On the other hand, when the primer set of the comparative example was used, any amplification band of LT, STp, ST II, VTe, F4 or F18 was not observed, or a non-specific amplification band was observed.
(4)試験例２（本発明のマルチプレックスＰＣＲプライマーとブタ消化器系疾患を惹起する大腸菌以外の細菌との交差反応）
実施例１、２、３及び４、並びに比較例１及び５のマルチプレックスＰＣＲプライマーがブタ消化器系疾患を惹起する大腸菌以外の病原性細菌と交差反応するか否かを調べた。
(4) Test Example 2 (Cross-reaction between the multiplex PCR primer of the present invention and bacteria other than E. coli causing porcine digestive system diseases)
It was investigated whether the multiplex PCR primers of Examples 1, 2, 3 and 4 and Comparative Examples 1 and 5 cross-react with pathogenic bacteria other than E. coli causing porcine digestive system diseases.
検体の調製
試験例１の大腸菌に代えて、ブタに消化器系疾患を惹起しない大腸菌(Esherichia coli ATCC11775, O157:H2)、ブタに消化器系疾患を惹起するClostridium perfringens、Salmonella属細菌、Brachyspira hyodysenteriae及びBrachyspira pilosicoliをそれぞれ至適な条件下で培養した。ＰＣＲ及び検出は試験例１と同様に操作した。
Specimen preparation In place of Escherichia coli in Test Example 1, Escherichia coli ATCC11775, O157: H2 that does not cause digestive system diseases in pigs, Clostridium perfringens , Salmonella genus bacteria that cause digestive system diseases in pigs, Brachyspira hyodysenteriae And Brachyspira pilosicoli were cultured under optimal conditions. PCR and detection were performed in the same manner as in Test Example 1.
結果
ブタに消化器系疾患を惹起しない大腸菌、ブタに消化器系疾患を惹起するClostridium perfringens、Salmonella属細菌、Brachyspira hyodysenteriae及びBrachyspira pilosicoliの本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット（及び比較例のプライマーセット）を用いた検査結果を表５に示す。表５が示すように、本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットは、ブタの糞便（Bacteroides などのブタ糞便中に常在する腸内細菌が大量に存在する）が共存する条件下でも、ブタに消化器系疾患を惹起しない大腸菌、ブタに消化器系疾患を惹起するClostridium perfringens、Salmonella属細菌、Brachyspira hyodysenteriae及びBrachyspira pilosicoliと交差反応しないことが示された。
Results Primer set for multiplex PCR of the present invention of Escherichia coli which does not cause digestive system diseases in pigs, Clostridium perfringens , Salmonella genus bacteria, Brachyspira hyodysenteriae and Brachyspira pilosicoli which cause digestive system diseases in pigs (and primer sets of comparative examples) Table 5 shows the test results using). As shown in Table 5, the primer set for multiplex PCR of the present invention can be used in pigs even under conditions where pig feces (the presence of large amounts of intestinal bacteria present in pig feces such as Bacteroides ) coexist. It was shown that E. coli that does not cause digestive diseases, Clostridium perfringens , Salmonella bacteria, Brachyspira hyodysenteriae and Brachyspira pilosicoli that cause digestive diseases in pigs do not cross-react.
(5)試験例３（ブタに消化器系疾患を惹起した大腸菌のマルチプレックスＰＣＲ法による同定）
下痢を発症したブタの便から分離された大腸菌株を実施例１のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーを用いて型別した。ＰＣＲ及び検出は試験例１と同様に操作した。
(5) Test Example 3 (Identification of Escherichia coli causing digestive system diseases in pigs by multiplex PCR method)
The E. coli strain isolated from the stool of pigs that developed diarrhea was typed using the multiplex PCR primers of Example 1. PCR and detection were performed in the same manner as in Test Example 1.
結果
結果を表６に示す。標的遺伝子の増幅産物を検出できた場合は「○」、検出できなかった場合は「×」と示した。表６が示すように、農場分離で分離され従来法（生化学性状試験、血清学的診断など）で型別された大腸菌株を本発明のマルチプレックスＰＣＲ法で検査したところ、供試５６株中５１株が毒素遺伝子(LT、STp、ST II、VTe)並びに線毛抗原遺伝子(F4及びF18)を単独あるいは複数保有していることが確認された。即ち、本発明で使用したプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行えば、ブタに消化器系疾患を惹起した大腸菌の９０％以上を型別でき、従来法とほぼ同様の型別ができ、養豚飼養現場で実質的に必要とされている迅速、正確な型別を可能にすることが分かった。また、大腸菌感染により下痢症を発症したブタから採取した糞便（下痢便）中には、原因大腸菌が優勢的かつ純培養的に存在するので、糞便から直接抽出したＤＮＡを対象として本発明で使用したプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行えば、養豚飼養現場で実質的に必要とされている迅速、正確な型別を可能にすることが分かった。
また上述のように、VTe非産生菌とVTe産生菌の出現頻度は、それぞれ35% (20/56)と65%(36/56)であり、農地面積が狭く畜産立地としての適性に恵まれない日本では、ブタの大腸菌消化器系疾患はVTe非産生菌とVTe産生菌の両方が高率に発生しており、至適薬剤の迅速な選別に寄与することが確認された。
The results are shown in Table 6. When the amplification product of the target gene was detected, “◯” was indicated, and when it was not detected, “X” was indicated. As shown in Table 6, when E. coli strains separated by farm separation and typed by conventional methods (biochemical property test, serological diagnosis, etc.) were examined by the multiplex PCR method of the present invention, 56 strains were tested. It was confirmed that 51 of them possessed one or more toxin genes (LT, STp, ST II, VTe) and pilus antigen genes (F4 and F18). That is, if multiplex PCR is performed using the primer set used in the present invention, 90% or more of E. coli that caused digestive system diseases in pigs can be typed, and the type classification can be made almost the same as the conventional method. It has been found that it allows for quick and accurate typing that is practically needed at the breeding site. Also, in feces collected from pigs that have developed diarrhea due to E. coli infection (causing diarrhea), the causative Escherichia coli is predominantly present in pure culture, so DNA directly extracted from feces is used in the present invention as a target. It has been found that multiplex PCR using the primer set made enables rapid and accurate typing that is substantially required in the pig farming field.
In addition, as mentioned above, the frequency of occurrence of non-VTe-producing bacteria and VTe-producing bacteria is 35% (20/56) and 65% (36/56), respectively, and the farmland area is small and not suitable for livestock production. In Japan, porcine Escherichia coli digestive system diseases are highly likely to occur in both non-VTe-producing bacteria and VTe-producing bacteria, which has been confirmed to contribute to the rapid selection of optimal drugs.
Claims (3)
(1)配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(2)配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(3)配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(4)配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３１に示される塩基配列からなるプライマー。 A primer set for multiplex PCR for detecting genes encoding LT, STp, ST II, VTe, F4 and F18 of Escherichia coli causing digestive system diseases in pigs, the primer set being (1) A multiplex comprising a primer set composed of any combination of the primer sets of (4), capable of simultaneously detecting the above genes and forming a band that can be visually discerned by all of the PCR products. PCR primer set.
(1) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24; and
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29.
(2) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25; and
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29.
(3) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24; and
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29.
(4) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 20;
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24; and
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 31.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006116564A JP4885600B2 (en) | 2006-04-20 | 2006-04-20 | Primer set and method for detecting Escherichia coli causing porcine digestive system diseases |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006116564A JP4885600B2 (en) | 2006-04-20 | 2006-04-20 | Primer set and method for detecting Escherichia coli causing porcine digestive system diseases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007282608A JP2007282608A (en) | 2007-11-01 |
| JP4885600B2 true JP4885600B2 (en) | 2012-02-29 |
Family
ID=38754932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006116564A Expired - Fee Related JP4885600B2 (en) | 2006-04-20 | 2006-04-20 | Primer set and method for detecting Escherichia coli causing porcine digestive system diseases |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4885600B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6565147B2 (en) * | 2014-08-29 | 2019-08-28 | 東洋紡株式会社 | Multiplex PCR method |
-
2006
- 2006-04-20 JP JP2006116564A patent/JP4885600B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2007282608A (en) | 2007-11-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| García et al. | Evaluation and comparison of various PCR methods for detection of Mycoplasma gallisepticum infection in chickens | |
| Wang et al. | Development and application of an oligonucleotide microarray for the detection of food-borne bacterial pathogens | |
| CN101113475B (en) | Primer for detecting pathogenic microorganism and multiple PCR using the same | |
| Kim et al. | Development of 16S rRNA targeted PCR methods for the detection and differentiation of Vibrio vulnificus in marine environments | |
| US6867021B2 (en) | Multiplex RT-PCR/PCR for simultaneous detection of bovine coronavirus, bovine rotavirus, Cryptosporidium parvum, and Escherichia coli | |
| CN103898108B (en) | The nucleotide special to vibrio fluvialis O2, O4, O13, O15 and O18 and application thereof | |
| Lew et al. | Detection of Pseudomonas pseudomallei by PCR and hybridization | |
| WO2010062897A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
| CN102281893A (en) | Vaccine strains of brachyspira hyodysenteriae | |
| JP4885600B2 (en) | Primer set and method for detecting Escherichia coli causing porcine digestive system diseases | |
| JP2001095576A (en) | Detection of enterohemorrhagic Escherichia coli | |
| CN105200044B (en) | The nucleotides special to vibrio fluvialis O1, O6, O7, O8 and O9 and its application | |
| CZ298165B6 (en) | Oligonucleotide and method for detecting Pectinatus frisingensis and Pectinatus cerevisiiphilu by making use of such oligonucleotide | |
| CN105200045B (en) | The nucleotides special to vibrio fluvialis O11, O14, O16 and O17 and its application | |
| CN105256041B (en) | The nucleotide special to aeromonas hydrophila O44, O24, O25 and O28 and application | |
| JP2007274934A (en) | Primer set and method for detecting food poisoning bacterium | |
| Kim et al. | Development of Multiplex PCR assays to identify Escherichia Coli pathogenic genes in food | |
| CN111850145A (en) | A detection method for molecular typing of serotype O antigens of hydrophilic Aeromonas O7, O16, O19, O24 and the like | |
| CN105154438B (en) | To Hafnia alvei G5907, G5908, G5913, nucleotide special G5916 and its application | |
| CN105112406B (en) | To Hafnia alvei G5897, G5898, G5900 special nucleotide and its application | |
| CN105256042B (en) | The nucleotide special to aeromonas hydrophila O13, O36, O16 and O19 and application | |
| KR100293571B1 (en) | Multiplex polymerase chain reaction-based method for fast detecting of pathological Escherichia Coil and PCR primers used for this method | |
| CN100510104C (en) | Polymerase chain reaction method for detecting salmonella choleraesuis | |
| CN105154439A (en) | Nucleotide specific to hafinia alvei G5902, G5903, G5904 and G5906, and application of nucleotide | |
| CN105087569B (en) | To vibrio cholerae O 18, O19, O23 and the special nucleotides of O12 and its application |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090416 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110912 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111111 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111202 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20111208 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141216 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4885600 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |