JP4892686B2 - Enzyme sensor, analysis method and kit using the enzyme sensor - Google Patents
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Description
本発明は、生体サンプルに含まれる微量タンパク質などの生化学物質、特にホルモン例えばコルチゾールの高感度・迅速分析を可能とするバイオセンサ特に酵素センサ、該センサを使用した分析方法並びにキットに関するものである。 The present invention relates to a biosensor capable of high-sensitivity and rapid analysis of biochemical substances such as trace proteins contained in a biological sample, particularly a hormone such as cortisol, particularly an enzyme sensor, an analysis method using the sensor, and a kit. .
生体サンプルに含まれる微量タンパク質を分析する技術としては、免疫測定法が用いられており、競合法とサンドイッチ法がある。それらの改良としては、主に感度向上に主眼がおかれており、酵素標識の改良に関するものが中心である （特許文献１及び２）。
また、３電極構成のセンサは知られており（特許文献３）、コルチゾール等の微量タンパク質やホルモンを分析対象とした分析装置も公知である（特許文献４）。
コルチゾール測定のためには、競合法を用いた酵素標識免疫測定法 (ELISA) キットが販売されている。しかし、サンドイッチ法を使用したキットは販売されていない。ELISAキットでは、抗原抗体反応 (インキュベーション) を行わせるのに何時間も必要であり、即時分析は不可能である。
また、コルチゾール分析のために、ロッシェダイアグノステイックス社のElecsysのような装置もある。これはポリクローナル抗体を使った競合免疫測定法でマグネテイック分離を使って測定時間の短縮を図っている（非特許文献１）。また、マグネテイックビーズを利用して測定時間の短縮をはかる技術も多くある（非特許文献２〜５）。
加えて、被測定物質がハプテンである場合には、通常１個のエピトープしか持たない単価抗原であって２個の抗体（１次、２次抗体）が同時に結合できず、高感度で特異性の高いサンドイッチ測定系を組むことができない。しかし、このようなハプテンの高感度測定に関するいくつかの方法が報告されている（非特許文献６、７）。
また、生理活性物質によっては、生体内で他の生化学物質と結合して存在するものもある。例えば、コルチゾールの分子量は362.5と小さいが、血液中でグロブリンやアルブミンと結合して存在し、その割合は場合によっては90-95%に達することが知られている。生化学検査では、このような複合体も含めて総コルチゾールとして測定されている。
In addition, a sensor having a three-electrode configuration is known (Patent Document 3), and an analyzer for analyzing a trace protein such as cortisol or a hormone is also known (Patent Document 4).
For the measurement of cortisol, enzyme-linked immunoassay (ELISA) kits using competitive methods are on the market. However, kits using the sandwich method are not sold. ELISA kits require hours for the antigen-antibody reaction (incubation) to take place, and immediate analysis is not possible.
There is also a device for the analysis of cortisol, such as Elecsys from Roche Diagnostics. This is a competitive immunoassay using a polyclonal antibody, and uses magnetic separation to shorten the measurement time (Non-patent Document 1). There are also many techniques for reducing the measurement time using magnetic beads (Non-Patent Documents 2 to 5).
In addition, when the substance to be measured is a hapten, it is a unitary antigen that usually has only one epitope, and two antibodies (primary and secondary antibodies) cannot bind simultaneously, and is highly sensitive and specific. High sandwich measurement system cannot be built. However, several methods relating to such high-sensitivity measurement of haptens have been reported (Non-Patent Documents 6 and 7).
Some physiologically active substances exist in combination with other biochemical substances in the living body. For example, although the molecular weight of cortisol is as small as 362.5, it is known to be present in the blood in combination with globulin and albumin, and the proportion may reach 90-95% in some cases. In biochemical tests, total cortisol, including such complexes, is measured.
本発明は、生体サンプルに含まれる微量タンパク質などの生化学物質、特にホルモン例えばコルチゾールの高感度、迅速分析を可能とする酵素センサの提供である。 The present invention provides an enzyme sensor that enables highly sensitive and rapid analysis of biochemical substances such as trace proteins contained in a biological sample, particularly hormones such as cortisol.
本発明の基礎となる免疫測定法 (サンドイッチ法) は公知であるが、この基本技術だけでは、生体サンプルに含まれる生化学物質の高感度測定、迅速分析を可能とすることは困難である。
本発明は、既存技術の改良に関る周辺技術であり、分析系に新たな機構を設けることによって完成した。
具体的には、サンドイッチ法を用い、２次抗体に酵素好適にはペルオキシダーゼ（HRP） 標識し、１次抗体を第１電極である作用極に固定した。そして、作用極と該作用極と対向して配置されている第３電極である対向極間の電気泳動によってサンプル中の被測定物質及び酵素標識２次抗体と１次抗体との凝集手段並びに被測定物質以外の生体サンプル、被測定物質に結合しなかった標識２次抗体の作用極の近傍からの除去手段を酵素センサに導入することによって本発明を完成した。
Although the immunoassay (sandwich method) that forms the basis of the present invention is known, it is difficult to enable high-sensitivity measurement and rapid analysis of biochemical substances contained in a biological sample only with this basic technique.
The present invention is a peripheral technology related to the improvement of the existing technology, and has been completed by providing a new mechanism in the analysis system.
Specifically, using a sandwich method, the secondary antibody was labeled with an enzyme, preferably peroxidase (HRP), and the primary antibody was immobilized on the working electrode as the first electrode. Then, by means of electrophoresis between the working electrode and the counter electrode, which is the third electrode arranged to face the working electrode, the substance to be measured, the means for agglutinating the enzyme-labeled secondary antibody and the primary antibody, and the target The present invention was completed by introducing, into the enzyme sensor, a biological sample other than the measurement substance and a means for removing the labeled secondary antibody that did not bind to the measurement substance from the vicinity of the working electrode.
つまり本発明は以下よりなる；
「１．少なくとも第１電極（作用極）、第２電極（対極）と前記第１電極と対向して配置されている第３電極（対向極）及び反応槽を備える酵素センサであって、以下の要素を含む酵素センサ；
１）前記作用極が基板上で実質的に水平方向に配置され、前記対向極が前記作用極の実質的に上方に配置されており、前記作用極と前記対向極間では電気泳動を垂直に展開可能であり、
２）作用極に被測定物質に対する抗体（１次抗体）が固定化されており、
３）前記作用極に固定化された前記抗体には、前記抗体に結合する生体サンプルに含まれる被測定物質（抗原）を介して酵素によって標識化された酵素標識２次抗体が結合可能であり、
４）前記作用極と前記対向極間に電圧を印加することによる電気泳動により、被測定物質、酵素標識２次抗体と１次抗体との凝集が可能であり、
５）前記４）とは逆方向の電圧を印加すること（電気泳動極性を反転させること）による電気泳動により、被測定物質以外の生体サンプル成分、酵素標識２次抗体が前記作用極の近傍から除去可能であり、
６）前記反応槽に十分量の電子メディエーター及び酸化還元物質が存在し、前記酵素標識２次抗体の前記酵素が酸化還元物質を触媒するとともに電子メディエーターを還元することで電子の授受が発生し、前記作用極と前記対極間の電気化学反応として、被測定物質の濃度に応じた電流が検出される。
２．さらに、以下の要素を含む前項１に記載の酵素センサ；
７）前記反応槽に有極性分子が存在し、前記被測定物質が前記有極性分子と結合して電気泳動性を生じる。
３．前記対向極は、前記基板を被うカバーの裏面に配置されている前項１又は２に記載の酵素センサ。
４．前記被測定物質はキャリアー化合物が結合しており、前記２次抗体は該キャリアー化合物と結合する前項１〜３のいずれか１に記載の酵素センサ。
５．参照極が前記基板に付加された前項１〜４のいずれか１に記載の酵素センサ。
６．前記酵素標識２次抗体が前記作用極上に予め乾燥配置されている又は追加添加される前項１〜５のいずれか１に記載の酵素センサ。
７．前記有極性分子が、ドライ状態又はウェット状態で前記反応槽に添加されている前項１〜６のいずれか１に記載の酵素センサ。
８．前記電子メディエーターが、還元することで電子の授受が発生する化合物である前項１〜７のいずれか１に記載の酵素センサ。
９．前記電子メディエーターが、ヨウ素イオン又はヘキサシアノ鉄イオンである前項８に記載の酵素センサ。
１０．前記酸化還元物質が、過酸化水素水である前項１〜９のいずれか１に記載の酵素センサ。
１１．前記被測定物質が、ホルモンである前項１〜１０の何れか一に記載の酵素センサ。
１２．前記ホルモンが、ステロイドホルモンである前項１１に記載の酵素センサ。
１３．前記ステロイドホルモンが、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド、性コルチコイドのいずれか１以上から選ばれる前項１２に記載の酵素センサ。
１４．前記ステロイドホルモンが、コルチゾールである前項１３に記載の酵素センサ。
１５．前記生体サンプルが、血液、唾液、尿、喀痰、体液、涙、汗、精液、間質液のいずれか１以上から選ばれる前項１〜１４の何れか一に記載の酵素センサ。
１６．前記作用極にグルコースオキシダーゼをさらに固定化し、グルコースが反応槽に添加され、グルコースオキシダーゼの作用で過酸化水素が生成される前項１〜９のいずれか１に記載の酵素センサ。
１７．前記標識酵素が、ペルオキシダーゼである前項１〜１６のいずれか１に記載の酵素センサ。
１８．前記１次抗体及び／又は前記２次抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である前項１〜１７のいずれか１に記載の酵素センサ。
１９．以下から選ばれる複数の試薬が組み合わされた生体サンプル測定用酵素センサキット。
１）前項１〜１８のいずれか１に記載の酵素センサ
２）酵素標識２次抗体又は酵素・２次抗体
３）電子メディエーター
４）酸化還元物質
５）有極性分子
２０．前項１９に記載の生体サンプル測定用酵素センサキットを使用した生体成分の分析方法。
２１．以下の（１）〜（４）の工程を少なくとも有する前項２０に記載の生体成分の分析方法。
（１）作用極に固定化された被測定物質に対する１次抗体と生体サンプル中の被測定物質及び酵素標識２次抗体を反応させる、
（２）作用極と対向極間での垂直方向に展開する電気泳動を行い、サンプル中の被測定物質及び酵素標識２次抗体を前記作用極に固定化した１次抗体と凝集させる、
（３）電気泳動の極性を反転することによって、被測定物質以外の生体サンプル成分、酵素標識２次抗体が前記作用極の近傍から除去させる、
（４）前記作用極と前記対極間の電気化学反応として、被測定物質の濃度に応じた電流を検出する。」
That is, the present invention comprises:
“1. An enzyme sensor comprising at least a first electrode (working electrode), a second electrode (counter electrode), a third electrode (counter electrode) disposed opposite to the first electrode, and a reaction tank, An enzyme sensor comprising:
1) The working electrode is disposed substantially horizontally on the substrate, the counter electrode is disposed substantially above the working electrode, and electrophoresis is performed vertically between the working electrode and the counter electrode. Can be deployed,
2) An antibody against the substance to be measured (primary antibody) is immobilized on the working electrode,
3) An enzyme-labeled secondary antibody that is labeled with an enzyme can be bound to the antibody immobilized on the working electrode via a substance to be measured (antigen) contained in a biological sample that binds to the antibody. ,
4) The substance to be measured, the enzyme-labeled secondary antibody and the primary antibody can be aggregated by electrophoresis by applying a voltage between the working electrode and the counter electrode,
5) Biological sample components other than the substance to be measured and the enzyme-labeled secondary antibody are separated from the vicinity of the working electrode by electrophoresis by applying a voltage in the opposite direction to 4) (reversing the electrophoresis polarity). Is removable,
6) A sufficient amount of electron mediator and redox substance are present in the reaction tank, and the enzyme of the enzyme-labeled secondary antibody catalyzes the redox substance and reduces the electron mediator, thereby transferring electrons. As an electrochemical reaction between the working electrode and the counter electrode, a current corresponding to the concentration of the substance to be measured is detected.
2. The enzyme sensor according to item 1, further comprising the following elements:
7) Polar molecules are present in the reaction vessel, and the substance to be measured is combined with the polar molecules to cause electrophoretic properties.
3. 3. The enzyme sensor according to item 1 or 2, wherein the counter electrode is disposed on a back surface of a cover that covers the substrate.
4). 4. The enzyme sensor according to any one of items 1 to 3, wherein the substance to be measured is bound to a carrier compound, and the secondary antibody is bound to the carrier compound.
5. 5. The enzyme sensor according to any one of items 1 to 4, wherein a reference electrode is added to the substrate.
6). 6. The enzyme sensor according to any one of 1 to 5 above, wherein the enzyme-labeled secondary antibody is previously placed on the working electrode in a dry manner or additionally added.
7). 7. The enzyme sensor according to any one of the preceding items 1 to 6, wherein the polar molecule is added to the reaction vessel in a dry state or a wet state.
8). 8. The enzyme sensor according to any one of 1 to 7 above, wherein the electron mediator is a compound that generates electrons when reduced.
9. 9. The enzyme sensor according to item 8, wherein the electron mediator is iodine ion or hexacyanoiron ion.
10. 10. The enzyme sensor according to any one of 1 to 9 above, wherein the redox substance is hydrogen peroxide.
11. 11. The enzyme sensor according to any one of items 1 to 10, wherein the substance to be measured is a hormone.
12 12. The enzyme sensor according to 11 above, wherein the hormone is a steroid hormone.
13. 13. The enzyme sensor according to item 12, wherein the steroid hormone is selected from one or more of glucocorticoid, mineralocorticoid, and sex corticoid.
14 14. The enzyme sensor according to 13 above, wherein the steroid hormone is cortisol.
15. 15. The enzyme sensor according to any one of items 1 to 14, wherein the biological sample is selected from one or more of blood, saliva, urine, sputum, body fluid, tears, sweat, semen, and interstitial fluid.
16. 10. The enzyme sensor according to any one of 1 to 9 above, wherein glucose oxidase is further immobilized on the working electrode, glucose is added to the reaction vessel, and hydrogen peroxide is generated by the action of glucose oxidase.
17. 17. The enzyme sensor according to any one of 1 to 16 above, wherein the labeling enzyme is peroxidase.
18. 18. The enzyme sensor according to any one of items 1 to 17, wherein the primary antibody and / or the secondary antibody is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
19. An enzyme sensor kit for biological sample measurement in which a plurality of reagents selected from the following are combined.
1) Enzyme sensor according to any one of 1 to 18 above 2) Enzyme-labeled secondary antibody or enzyme / secondary antibody 3) Electron mediator 4) Redox substance 5) Polar molecule 20 20. A method for analyzing a biological component using the enzyme sensor kit for biological sample measurement described in 19 above.
21. 21. The biological component analysis method according to item 20 above, comprising at least the following steps (1) to (4).
(1) reacting a primary antibody against a substance to be measured immobilized on the working electrode, a substance to be measured in a biological sample, and an enzyme-labeled secondary antibody;
(2) performing electrophoresis in a vertical direction between the working electrode and the counter electrode, and aggregating the substance to be measured and the enzyme-labeled secondary antibody in the sample with the primary antibody immobilized on the working electrode;
(3) By reversing the polarity of electrophoresis, biological sample components other than the substance to be measured and the enzyme-labeled secondary antibody are removed from the vicinity of the working electrode.
(4) As an electrochemical reaction between the working electrode and the counter electrode, a current corresponding to the concentration of the substance to be measured is detected. "
従来の分析方法では、生体サンプルに含まれる微量タンパク質の分析時間は6 〜8 時間ほど要していた。本発明の酵素センサの分析では、分オーダー (10分程度) に短縮し、コルチゾールだけでなく他のホルモンの迅速分析に適用可能である。 In the conventional analysis method, the analysis time of a trace amount protein contained in a biological sample requires about 6 to 8 hours. In the analysis of the enzyme sensor of the present invention, it is shortened to the order of minutes (about 10 minutes) and can be applied to the rapid analysis of not only cortisol but also other hormones.
本発明は、サンドイッチ法 (免疫測定法の一手法) を用い、２次抗体を酵素 (ペルオキシダーゼ：HRP)で標識し、１次抗体を少なくとも第１電極である作用極に固定する。さらに、電気泳動用の対向極を設置する。加えて、作用極と対向極の位置関係は、作用極と対向極間での電気泳動を実質的に垂直に展開できる構造である。詳しくは、作用極が基板上で実質的に水平方向に配置され、対向極が前記作用極の実質的に上方に配置されている構造である。 In the present invention, a sandwich method (one method of immunoassay) is used, the secondary antibody is labeled with an enzyme (peroxidase: HRP), and the primary antibody is fixed to at least the working electrode as the first electrode. Furthermore, a counter electrode for electrophoresis is installed. In addition, the positional relationship between the working electrode and the counter electrode is a structure in which electrophoresis between the working electrode and the counter electrode can be developed substantially vertically. Specifically, the working electrode is disposed substantially horizontally on the substrate, and the counter electrode is disposed substantially above the working electrode.
本発明の酵素センサは、少なくとも以上の構成とすることによって、以下の目的を達成することができる。
１）電気泳動のセルボリュームを微小 (マイクロ) 化可能であり、さらにマイクロ電気泳動の垂直展開を実現し、微量サンプルでの分析が可能である。
２）作用極が電気泳動の１つの電極を兼ねているので、電気泳動によってサンプル中の被測定物質（抗原）、酵素標識２次抗体を作用極に固定した１次抗体抗の近傍へ凝集し、反応を迅速に行うことができる。
３） 電気泳動の極性を反転することによって、被測定物質以外のサンプル成分、被測定物質に結合しなかった酵素標識２次抗体、もしくは酵素、２次抗体を作用極の近傍から除去（すなわち、対向極の近傍に凝集させ）することができる。
The enzyme sensor of the present invention can achieve the following objects by having at least the above-described configuration.
1) Electrophoretic cell volume can be miniaturized, and microelectrophoretic vertical development can be realized, enabling analysis with trace samples.
2) Since the working electrode also serves as one electrode for electrophoresis, the substance to be measured (antigen) in the sample and the enzyme-labeled secondary antibody are aggregated in the vicinity of the primary antibody antibody immobilized on the working electrode by electrophoresis. The reaction can be performed quickly.
3) By reversing the polarity of electrophoresis, sample components other than the substance to be measured, enzyme-labeled secondary antibody that did not bind to the substance to be measured, or enzyme and secondary antibody are removed from the vicinity of the working electrode (ie, Agglomeration in the vicinity of the counter electrode).
本発明の酵素センサの構成について説明する。しかし、下記構成は、一例であり、作用極と対向極間での電気泳動が実質的に垂直展開できる酵素センサであれば特に限定されない。 The configuration of the enzyme sensor of the present invention will be described. However, the following configuration is an example, and is not particularly limited as long as it is an enzyme sensor capable of substantially vertically developing electrophoresis between the working electrode and the counter electrode.
（酵素センサの構成）
酵素センサ１０は、図１に示すように基板１１及びカバー１５を備えている。基板１１及びカバー１５は、ガラス、樹脂、セラミックス等の絶縁体から構成されている。基板１１には、第１電極である作用極１２、第２電極である対極１３、好ましくは参照極１４が配置されている。作用極１２、対極１３、参照極１４は、図１（Ｂ）に示すように基板１１に埋め込んでもよいし、又は積層してもよい。
(Configuration of enzyme sensor)
The enzyme sensor 10 includes a substrate 11 and a cover 15 as shown in FIG. The board | substrate 11 and the cover 15 are comprised from insulators, such as glass, resin, ceramics. On the substrate 11, a working electrode 12 as a first electrode, a counter electrode 13 as a second electrode, preferably a reference electrode 14 are arranged. The working electrode 12, the counter electrode 13, and the reference electrode 14 may be embedded in the substrate 11 as shown in FIG.
各極は、白金、金、銀、銅または銀／塩化銀（Ag/AgCl）などの導電性の金属から形成してもよいし、金属薄膜を蒸着して形成しても良い。
図２に示すように作用極１２は、一方の端部に抗体固定部１２１を有している。抗体固定部１２１の表面に１次抗体２０が固定化されている。
参照極１４は、作用極１２及び対極１３と並列に配置されている基準電極である。
作用極１２は、抗体固定部１２１とは反対側の端部にパッド１２２を有している。同様に、対極１３は端部にパッド１３２、参照極１４は端部にパッド１４２を有している。さらに、各パットでは、外部に連結している配線が接続されている。
Each electrode may be formed from a conductive metal such as platinum, gold, silver, copper, silver / silver chloride (Ag / AgCl), or may be formed by vapor deposition of a metal thin film.
As shown in FIG. 2, the working electrode 12 has an antibody fixing part 121 at one end. The primary antibody 20 is immobilized on the surface of the antibody immobilization part 121.
The reference electrode 14 is a reference electrode disposed in parallel with the working electrode 12 and the counter electrode 13.
The working electrode 12 has a pad 122 at the end opposite to the antibody fixing portion 121. Similarly, the counter electrode 13 has a pad 132 at the end, and the reference electrode 14 has a pad 142 at the end. Furthermore, wiring connected to the outside is connected to each pad.
カバー１５の裏面には、電気泳動用電極である対向極１７が配置されている（図１（Ｂ）参照）。なお、図１（Ｂ）に示すように、対向極１７は、作用極１２の実質的に上方好ましくは真上上方に位置するようにカバー１５の裏面に配置する。
また、カバー１５は、基板１１に配置している作用極１２、対極１３を覆っている。これにより、カバー１５は、基板１１との間に反応槽１６を形成する。
A counter electrode 17 that is an electrode for electrophoresis is disposed on the back surface of the cover 15 (see FIG. 1B). As shown in FIG. 1B, the counter electrode 17 is disposed on the back surface of the cover 15 so as to be positioned substantially above, preferably directly above, the working electrode 12.
The cover 15 covers the working electrode 12 and the counter electrode 13 disposed on the substrate 11. Thereby, the reaction tank 16 is formed between the cover 15 and the substrate 11.
（酵素センサの作製方法）
（１）基板の作成
ガラス等の絶縁性材料から形成された基板１１に、作用極１２、対極１３、参照極１４を蒸着により形成する。蒸着する金属は、白金、金、銀、銅、銀／塩化銀（Ag/Cl）等である。
（２）カバーの作成
ガラス等の絶縁性材料から形成されたカバー１５の裏面に、対向極１７を蒸着により形成する。蒸着する金属は、白金、金、銀、銅、銀／塩化銀（Ag/AgCl）等である。
（３）酵素センサの作製
上記（１）の各極が配置された基板１１に、上記（２）のカバー１５を自体公知の接着剤等を使用して被せる。さらに、各極のパッドに配線を連結する。
また、カバー１５の側面には、図１（Ｂ）に示すようにサンプル供給口１８を予め形成してもよい。しかしながら、サンプル供給口１８は、図１（Ｂ）に示されるように位置に限定される必要はない。
(Production method of enzyme sensor)
(1) Preparation of substrate A working electrode 12, a counter electrode 13, and a reference electrode 14 are formed by vapor deposition on a substrate 11 made of an insulating material such as glass. The metal to be deposited is platinum, gold, silver, copper, silver / silver chloride (Ag / Cl) or the like.
(2) Creation of cover The counter electrode 17 is formed by vapor deposition on the back surface of the cover 15 made of an insulating material such as glass. The metal to be deposited is platinum, gold, silver, copper, silver / silver chloride (Ag / AgCl), or the like.
(3) Production of enzyme sensor The substrate 15 on which the respective electrodes in (1) are arranged is covered with the cover 15 in (2) using a known adhesive or the like. Furthermore, the wiring is connected to the pads of each pole.
Further, a sample supply port 18 may be formed in advance on the side surface of the cover 15 as shown in FIG. However, the sample supply port 18 does not have to be limited to a position as shown in FIG.
（被測定物質）
本発明の被測定物質は生体由来のサンプルである。サンプルは、血液、唾液、尿、喀痰、体液、涙、汗、精液、間質液等が例示される。また、本発明の酵素センサは、特にサンプル中の微量含有物であっても好適に測定可能である。特に最適な被測定物質はホルモン、例えばステロイドホルモンである。ステロイドホルモンとしては、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド、性コルチコイド等が例示され。具体的なステロイドホルモンとしてはコルチゾールが好適な測定対象であるが、これに限定されるものではない。
(Substance to be measured)
The substance to be measured of the present invention is a biological sample. Examples of the sample include blood, saliva, urine, sputum, body fluid, tears, sweat, semen, and interstitial fluid. In addition, the enzyme sensor of the present invention can be preferably measured even if it is a trace amount in a sample. Particularly suitable substances to be measured are hormones such as steroid hormones. Examples of steroid hormones include glucocorticoids, mineralocorticoids, and sex corticoids. As a specific steroid hormone, cortisol is a suitable measurement target, but is not limited thereto.
（キャリアー化合物の結合）
本発明の被測定物質がハプテンである場合、それが生体内でどのような状態であるかを予め調べておく。高分子と結合している場合には、後述する２次抗体は該高分子を特異的に認識すれば良い。また、高分子と結合していない場合には、好適には被測定物質にキャリアー化合物を結合させる。
該キャリアー化合物として用いられる高分子化合物は、１万以上の分子量であることが望ましく、例えばグロブリン、ヘモシアニン、卵白アルブミン、牛血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン等のタンパク質、ＭＡＰレジン、ポリアミド、ポリアクロレイン等の合成高分子、デキストラン、アガロース等の多糖、不活化した細菌等が挙げられる。
また、被測定物質とキャリアー化合物との結合は、被測定物質のカルボキシル基と高分子の反応性官能基とを反応させればよく、方法は特に限定されないが、公知の方法として混合酸無水物法や活性エステル法等が挙げられる。
(Binding of carrier compound)
When the substance to be measured of the present invention is a hapten, it is examined in advance what state it is in vivo. In the case of binding to a polymer, the secondary antibody described later only needs to specifically recognize the polymer. In the case where it is not bound to a polymer, a carrier compound is preferably bound to the substance to be measured.
The polymer compound used as the carrier compound preferably has a molecular weight of 10,000 or more, such as proteins such as globulin, hemocyanin, ovalbumin, bovine serum albumin, rabbit serum albumin, MAP resin, polyamide, polyacrolein and the like. Examples thereof include synthetic polymers, polysaccharides such as dextran and agarose, inactivated bacteria, and the like.
In addition, the bond between the substance to be measured and the carrier compound may be a reaction between the carboxyl group of the substance to be measured and the reactive functional group of the polymer, and the method is not particularly limited. And the active ester method.
（１次抗体）
本発明で使用する１次抗体は、被測定物質に対する抗体である。例えば、被測定物質がコルチゾールであれば抗コルチゾール抗体が使用される。１次抗体は、広く市販のものが利用できる。１次抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のどちらも利用できる。抗体作製動物としてウサギ、ヒツジ、ヤギについていずれも利用でき特に限定されない。１次抗体と以下で述べる２次抗体は同一抗原の異なる抗原認識部位に対する抗体である必要があるので、例えば１次抗体にモノクローナル抗体を使えば、２次抗体はポリクローナル抗体を用いることが好ましい。
(Primary antibody)
The primary antibody used in the present invention is an antibody against a substance to be measured. For example, if the substance to be measured is cortisol, an anti-cortisol antibody is used. A wide range of commercially available primary antibodies can be used. As the primary antibody, both a polyclonal antibody and a monoclonal antibody can be used. Rabbits, sheep, and goats can be used as antibody-producing animals, and are not particularly limited. Since the primary antibody and the secondary antibody described below need to be antibodies against different antigen recognition sites of the same antigen, for example, if a monoclonal antibody is used as the primary antibody, it is preferable to use a polyclonal antibody as the secondary antibody.
（２次抗体）
本発明の酵素標識２次抗体における２次抗体は、上記のように１次抗体と抗原認識部位が異なることが必要であり、前記のとおり、１次抗体にモノクローナル抗体を使えばポリクローナル抗体を使うことが必要である。さらに、この抗体に酵素標識が行われる。標識酵素は市販のものを利用してもよい。標識酵素は、化学反応により、電気的変化を起こしうるものであれば特に限定されない。好適な例示としては、ペルオキシダーゼ（HRP）等がある。
なお、酵素標識２次抗体は作用極上に予め乾燥配置されている又は追加添加してもよい。
加えて、被測定物質にキャリアー化合物が結合している場合には、好適には２次抗体は該キャリアー化合物を特異的に認識すれば良い。
(Secondary antibody)
As described above, the secondary antibody in the enzyme-labeled secondary antibody of the present invention needs to have a different antigen recognition site from the primary antibody. As described above, if a monoclonal antibody is used as the primary antibody, a polyclonal antibody is used. It is necessary. In addition, the antibody is labeled with an enzyme. A commercially available labeling enzyme may be used. The labeling enzyme is not particularly limited as long as it can cause an electrical change by a chemical reaction. Suitable examples include peroxidase (HRP).
Note that the enzyme-labeled secondary antibody may be preliminarily dried on the working electrode or may be additionally added.
In addition, when the carrier compound is bound to the substance to be measured, the secondary antibody preferably recognizes the carrier compound specifically.
（１次抗体の固定化）
適当な緩衝液例えばリン酸緩衝液中にBSA（ウシ血清アルブミン）１％（w／v）を含む溶液を調製する。調製した溶液に固定化する１次抗体２０を溶解する。１次抗体２０を溶解した溶液は、上記（２）のカバー１５を被せる前の基板１１上の作用極１２の表面に滴下する。次に、１次抗体２０を含む溶液が自然乾燥することにより、作用極１２の表面には図３に示すように１次抗体２０が固定化される。なお、BSAは、自然乾燥により作用極１２の表面に水不溶性の膜を形成する。
また、１次抗体２０を溶解した溶液は、上記（２）のカバー１５を被せた後の基板１１上の作用極１２の表面にサンプル供給口１８を介して注入することができる。
また、具体的な条件は、以下の通りであるが特に限定されない。
例えば、１次抗体が0.25〜10μg／mlの終濃度となるように調製したpH9.6の緩衝液を作用極に滴下し、１〜１０℃、特に好ましくは２〜６℃で、１０〜３０時間、特に好ましくは１５〜２５時間静置し、固定化させる。
(Immobilization of primary antibody)
Prepare a solution containing 1% (w / v) BSA (bovine serum albumin) in a suitable buffer such as phosphate buffer. The primary antibody 20 to be immobilized is dissolved in the prepared solution. The solution in which the primary antibody 20 is dissolved is dropped on the surface of the working electrode 12 on the substrate 11 before the cover 15 of (2) is covered. Next, the solution containing the primary antibody 20 is naturally dried, whereby the primary antibody 20 is immobilized on the surface of the working electrode 12 as shown in FIG. BSA forms a water-insoluble film on the surface of the working electrode 12 by natural drying.
The solution in which the primary antibody 20 is dissolved can be injected through the sample supply port 18 into the surface of the working electrode 12 on the substrate 11 after the cover 15 of (2) is covered.
Specific conditions are as follows, but are not particularly limited.
For example, a pH 9.6 buffer solution prepared so that the primary antibody has a final concentration of 0.25 to 10 μg / ml is dropped onto the working electrode, and 1 to 10 ° C., particularly preferably 2 to 6 ° C., 10 to 30 Let stand for 15 hours, particularly preferably 15 to 25 hours, and fix.
（酵素センサ検出原理）
本発明の酵素センサでは、免疫測定法の一手法であるサンドイッチ法を用い、サンプルに含まれている微量な被測定物質（抗原）の測定を行う。以下、図３及び図４を用いて説明する。
固定化されている１次抗体２０に被測定物質である抗原２１が結合しているとき、さらに酵素標識２次抗体２２を供給すると、固定化されている１次抗体２０には、抗原２１を介してさらに酵素標識２次抗体２２が結合する。その結果、固定化されている１次抗体２０に結合している抗原２１には、さらに酵素２３で標識化された酵素標識化抗体２２が結合する。
なお、図４に示すように、被測定物質にキャリアー化合物が結合している場合には、酵素標識２次抗体は該キャリアー化合物に結合する。
(Enzyme sensor detection principle)
In the enzyme sensor of the present invention, a very small amount of a substance to be measured (antigen) contained in a sample is measured using a sandwich method which is one method of immunoassay. Hereinafter, a description will be given with reference to FIGS. 3 and 4.
When the antigen 21 as the substance to be measured is bound to the immobilized primary antibody 20, when the enzyme-labeled secondary antibody 22 is further supplied, the immobilized primary antibody 20 is loaded with the antigen 21. Further, the enzyme-labeled secondary antibody 22 is further bound thereto. As a result, the enzyme-labeled antibody 22 labeled with the enzyme 23 is further bound to the antigen 21 bound to the immobilized primary antibody 20.
As shown in FIG. 4, when the carrier compound is bound to the substance to be measured, the enzyme-labeled secondary antibody binds to the carrier compound.
本発明の酵素センサでは、作用極１２と対向極１７間に電圧を印加することによる電気泳動により、抗原２１（キャリアー化合物が結合している抗原も含む）及び酵素標識２次抗体２２を１次抗体２０に凝集させることができる。これにより、生体サンプル中の僅かな量の被測定物質である抗原２１を効率良く及び迅速に１次抗体２０に結合させることができる（図３及び図４の(b)参照）。
さらに、本発明では、上記とは逆方向の電圧を印加すること（電気泳動極性を反転させること）による電気泳動により、被測定物質である抗原２１以外の生体サンプル成分、抗原２１に結合しなかった酵素標識抗体２２を作用極１２の近傍から除去することができる（図３及び図４の(c)参照）。なお、近傍とは、作用極１２と対極１３間での電流の流れる周辺を意味し、図３の(d)で示されるように、被測定物質である抗原２１以外の生体サンプル成分、抗原２１に結合しなかった酵素標識２次抗体２２は、対向極１７の近傍に移動する。
なお、抗原２１及び該抗原２１に結合した酵素標識２次抗体以外の物質が、作用極１２と対極１３間に存在すると、被測定物質の濃度に応じた電流が高感度に検出することができない。
本発明の酵素センサでの電流測定段階では、抗原２１及び該抗原２１に結合した酵素標識２次抗体以外の物質が作用極１２と対極１３間に実質的に存在しない。よって、被測定物質を高感度に検出することができる。
In the enzyme sensor of the present invention, the antigen 21 (including the antigen to which the carrier compound is bound) and the enzyme-labeled secondary antibody 22 are primary treated by electrophoresis by applying a voltage between the working electrode 12 and the counter electrode 17. The antibody 20 can be aggregated. As a result, a small amount of the antigen 21 to be measured in the biological sample can be efficiently and quickly bound to the primary antibody 20 (see FIGS. 3 and 4B).
Furthermore, in the present invention, it does not bind to a biological sample component other than the antigen 21 that is the substance to be measured, the antigen 21 by electrophoresis by applying a voltage in the opposite direction (reversing the electrophoresis polarity). The enzyme-labeled antibody 22 can be removed from the vicinity of the working electrode 12 (see (c) of FIG. 3 and FIG. 4). The vicinity means the vicinity of the current flow between the working electrode 12 and the counter electrode 13, and as shown in FIG. 3D, a biological sample component other than the antigen 21 that is the substance to be measured, the antigen 21 The enzyme-labeled secondary antibody 22 that has not been bound to moves to the vicinity of the counter electrode 17.
If a substance other than the antigen 21 and the enzyme-labeled secondary antibody bound to the antigen 21 is present between the working electrode 12 and the counter electrode 13, the current corresponding to the concentration of the substance to be measured cannot be detected with high sensitivity. .
In the current measurement stage of the enzyme sensor of the present invention, substances other than the antigen 21 and the enzyme-labeled secondary antibody bound to the antigen 21 are substantially absent between the working electrode 12 and the counter electrode 13. Therefore, the substance to be measured can be detected with high sensitivity.
なお、上記本発明の電気泳動を実行することを可能にするには、作用極１２と対向極１７間に電気泳動を実質的に垂直展開する必要がある。この電気泳動の実質的な垂直展開により、上記凝集及び上記除去を高効率かつ迅速に行うことができる。 In order to enable the electrophoresis of the present invention to be performed, it is necessary to develop the electrophoresis substantially vertically between the working electrode 12 and the counter electrode 17. By the substantially vertical development of the electrophoresis, the aggregation and the removal can be performed with high efficiency and speed.
固定化されている１次抗体２０と結合している抗原２１（キャリアー化合物が結合している抗原も含む）に酵素標識２次抗体２２がさらに結合しているとき、ここにHRPの基質として過酸化水素（H2O2）および十分量の電子メディエーターである（ヨウ素又はヨウ化カリウム）を含む緩衝溶液を供給する又は存在すると、下記の式（１）に示すようにHRPはH2O2を介してヨウ素イオンI−をI３−へ酸化する。酸化されたヨウ素イオンI３−は、作用極１２から電子を受け取り、下記の式（２）に示すようにI−へ還元される。その結果、作用極１２と対極１３との間には電流が流れる。
なお、下記の式（１）および式（２）によるヨウ素イオンの酸化還元反応に限らず、式（３）および式（４）に示すようにヨウ素イオンに代えてフェリシアン化イオンの酸化還元反応を用いてもよい。この場合、HRPの基質としてフェリシアン化イオンを含む緩衝溶液を供給すると、式（３）に示すようにH2O2はH2Oに酸化される。これとともに、式（４）に示すようにフェリシアン化イオンは、フェロシアン化イオンに還元される。その結果、作用極１２と対極１３との間には電流が流れる（図５参照）。
When the enzyme-labeled secondary antibody 22 is further bound to the antigen 21 (including the antigen to which the carrier compound is bound) bound to the immobilized primary antibody 20, it is used as a substrate for HRP. When a buffer solution containing hydrogen oxide (H 2 O 2 ) and a sufficient amount of electron mediator (iodine or potassium iodide) is supplied or present, HRP becomes H 2 O 2 as shown in the following formula (1). The iodine ion I − is oxidized to I 3− via Oxidized iodine ion I 3− receives electrons from working electrode 12 and is reduced to I − as shown in the following formula (2). As a result, a current flows between the working electrode 12 and the counter electrode 13.
Not only the redox reaction of iodine ion by the following formulas (1) and (2) but also the redox reaction of ferricyanide ion instead of iodine ions as shown in formula (3) and formula (4) May be used. In this case, when a buffer solution containing ferricyanide ions is supplied as a substrate for HRP, H 2 O 2 is oxidized to H 2 O as shown in Formula (3). At the same time, ferricyanide ions are reduced to ferrocyanide ions as shown in equation (4). As a result, a current flows between the working electrode 12 and the counter electrode 13 (see FIG. 5).
さらに、グルコースオキシダーゼを作用極１２に固定して酵素センサとし、過酸化水素水の代わりにグルコースをサンプルに加えても良い。過酸化水素は溶液中で不安定なので、グルコースを用いることによって特性がより安定する。 Furthermore, glucose oxidase may be fixed to the working electrode 12 to form an enzyme sensor, and glucose may be added to the sample instead of the hydrogen peroxide solution. Since hydrogen peroxide is unstable in solution, the properties are more stable by using glucose.
本発明で使用できる電子メディエーターは、還元することで電子の授受が発生する化合物である。好適な電子メディエーターは、ヨウ素イオン又はヘキサシアノ鉄イオンが例示される。
また、本発明で使用できる酸化還元物質は特に限定されるものではないが、好適には過酸化水素水が例示される。この場合、反応槽１６に過酸化水素水が加えられ、標識酵素であるペロキシダーゼ作用でイオン変化がおこる。過酸化水素水及びヨウ素イオンの添加量は、ペロキシダーゼと反応性に基づく自体公知の量である。また、反応槽１６では、ヨウ素イオン無しで、過酸化水素に対するペロキシダーゼ作用のみであってもよい。
The electron mediator that can be used in the present invention is a compound that generates and receives electrons when reduced. Suitable electron mediators are exemplified by iodine ions or hexacyanoiron ions.
Moreover, the oxidation-reduction substance that can be used in the present invention is not particularly limited, but a hydrogen peroxide solution is preferably exemplified. In this case, hydrogen peroxide is added to the reaction tank 16, and ion changes occur due to the action of peroxidase, which is a labeling enzyme. The amount of hydrogen peroxide solution and iodine ion added is a known amount based on reactivity with peroxidase. Moreover, in the reaction tank 16, only the peroxidase action with respect to hydrogen peroxide may be sufficient, without an iodine ion.
加えて、過酸化水素の不安定性を補うために、作用極にグルコースオキシダーゼをあらかじめ固定化しておき、過酸化水素を添加する代わりにグルコースが反応槽に添加され、グルコースオキシダーゼの作用で過酸化水素が生成されてもよい。この場合でも、無論、ヨウ素イオン添加或いは無添加でイオン変化をおこすことは上記と同様に可能である。グルコースオキシダーゼの固定化量、グルコースの添加量は、自体公知である。 In addition, in order to compensate for the instability of hydrogen peroxide, glucose oxidase was previously immobilized on the working electrode, and instead of adding hydrogen peroxide, glucose was added to the reaction vessel, and the action of glucose oxidase produced hydrogen peroxide. May be generated. Even in this case, as a matter of course, it is possible to change the ion with or without the addition of iodine ions as described above. The amount of glucose oxidase immobilized and the amount of glucose added are known per se.
また、本発明の有極性分子とは、被測定物質に電気泳動性を生じさせる性質を有する分子を意味する。例えば、公知の電気泳動に使用される陰イオン系界面活性剤特にドデシル硫酸ナトリウム（SDS）等又はampholine等の両性担体 (pH3.5-10)等が挙げられるが、特に限定されない。なお、被測定物質は有極性分子と結合して電気泳動性を生じる。
ここで、電気泳動性とは、被測定物質が電圧の印加により陽極又は陰極に向かって泳動する性質を意味する。被測定物質自身がプラス又はマイナスに電荷を帯びているなら、反応槽中に有極性分子がなくても電気泳動を行うことができる。しかし、被測定物質が電気的に中性であれば、反応槽に有極性分子を追加することにより、被測定物質の電気泳動を可能にする。
Moreover, the polar molecule of the present invention means a molecule having a property of causing electrophoretic properties in a substance to be measured. For example, anionic surfactants used in known electrophoresis, particularly sodium dodecyl sulfate (SDS), or amphoteric carriers (pH 3.5-10) such as ampholine, are not particularly limited. The substance to be measured binds to a polar molecule and produces electrophoretic properties.
Here, the electrophoretic property means a property that a substance to be measured migrates toward an anode or a cathode by applying a voltage. If the substance to be measured is charged positively or negatively, electrophoresis can be performed even if there are no polar molecules in the reaction vessel. However, if the substance to be measured is electrically neutral, the substance to be measured can be electrophoresed by adding a polar molecule to the reaction vessel.
本発明の酵素センサで使用する２電極式センサ又は３電極式センサは公知である。作用極と対極、及び所望により参照極を加えて構成され、酵素標識２次抗体の酵素が酸化還元物質を触媒するとともに電子メディエーターを還元することで電子の授受が発生し、作用極と対極間の電気化学反応として、被測定物質の濃度に応じた電流が検出される原理であれば特に限定されない。 A two-electrode sensor or a three-electrode sensor used in the enzyme sensor of the present invention is known. Constructed by adding a working electrode and a counter electrode and, if desired, a reference electrode, the enzyme of the enzyme-labeled secondary antibody catalyzes a redox substance and reduces the electron mediator, giving and receiving electrons. The electrochemical reaction is not particularly limited as long as it is a principle that a current corresponding to the concentration of the substance to be measured is detected.
（本発明の酵素センサを用いての被測定物質の測定方法）
本発明の酵素センサを用いての被測定物質（生体成分）の分析方法の一例を以下に示す。
被測定物質を含むサンプルを適当な希釈液にて希釈するか、又は原液のままサンプル供給口１８から反応槽１６に供給する。
なお、希釈液は、通常用いられる緩衝液等を使用することができる。
次に、酵素を標識化した酵素標識２次抗体を含む溶液をサンプル供給口１８から反応槽１６に供給する。なお、酵素標識２次抗体を含む溶液は、適当な希釈液にて希釈されていても良い。
また、好適には、酵素センサの温度は、酵素反応が好適な温度である１０度〜３０度、好ましくは１５度〜２８度にしておく。
また、予め十分量の電子メディエーター及び酸化還元物質を反応槽１６に添加しておく。さらに、被測定物質が電気的に中性である又は十分に荷電していないと考えられる場合には、有極性分子も反応槽１６に添加しておく。
(Measurement method of a substance to be measured using the enzyme sensor of the present invention)
An example of a method for analyzing a substance to be measured (biological component) using the enzyme sensor of the present invention is shown below.
A sample containing the substance to be measured is diluted with an appropriate diluent, or is supplied as a stock solution from the sample supply port 18 to the reaction vessel 16.
As the diluent, a commonly used buffer or the like can be used.
Next, a solution containing an enzyme-labeled secondary antibody labeled with an enzyme is supplied from the sample supply port 18 to the reaction tank 16. The solution containing the enzyme-labeled secondary antibody may be diluted with an appropriate diluent.
Preferably, the temperature of the enzyme sensor is 10 to 30 degrees, preferably 15 to 28 degrees, which is a suitable temperature for the enzyme reaction.
In addition, a sufficient amount of electron mediator and redox substance are added to the reaction tank 16 in advance. Furthermore, when it is considered that the substance to be measured is electrically neutral or not sufficiently charged, polar molecules are also added to the reaction vessel 16.
被測定物質を含む生体サンプル及び酵素標識２次抗体が反応槽１６に供給された後に、上記示したように、電気泳動を行う。
なお、被測定物質であるタンパク質の荷電はタンパク質の種類によって異なるため、電気泳動条件は分析する被測定物質の性質に依存する。しかし、一般的には、有極性分子であるドデシル硫酸ナトリウム（SDS：陰イオン系界面活性剤）存在下では、被測定物質であるタンパク質はSDS分子に付着するため、該被測定分子は電圧の印加により陽極に向かって泳動する。また、有極性分子は、あらかじめウェット状態で反応槽に添加されてもよいが、ドライ状態で添加されていてもよい。
After the biological sample containing the substance to be measured and the enzyme-labeled secondary antibody are supplied to the reaction tank 16, electrophoresis is performed as described above.
Since the charge of the protein to be measured varies depending on the type of protein, the electrophoresis conditions depend on the nature of the substance to be analyzed. However, in general, in the presence of a polar molecule, sodium dodecyl sulfate (SDS: anionic surfactant), the protein to be measured adheres to the SDS molecule, so When applied, it migrates toward the anode. The polar molecule may be added in advance to the reaction vessel in a wet state, or may be added in a dry state.
（生体サンプル測定用酵素センサキット）
また、本発明では、以下から選ばれる複数の試薬が組み合わされた生体サンプル測定用酵素センサキットも対象とする。
１）上記に記載の酵素センサ
２）酵素標識２次抗体又は酵素・２次抗体
３）電子メディエーター
４）酸化還元物質
５）有極性分子
(Enzyme sensor kit for biological sample measurement)
In addition, the present invention also covers an enzyme sensor kit for biological sample measurement in which a plurality of reagents selected from the following are combined.
1) Enzyme sensor as described above 2) Enzyme-labeled secondary antibody or enzyme / secondary antibody 3) Electron mediator 4) Redox substance 5) Polar molecule
（生体成分の分析方法）
さらに、本発明では、上記生体サンプル測定用酵素センサキットを使用した生体成分の分析方法も対象とする。
詳しい生体成分の分析方法は、以下の通りである。
（１）作用極に固定化された被測定物質に対する１次抗体と生体サンプル中の被測定物質及び酵素標識２次抗体を反応させる、
（２）作用極と対向極間での垂直方向に展開する電気泳動を行い、サンプル中の被測定物質及び酵素標識２次抗体を前記作用極に固定化した１次抗体と凝集させる、
（３）電気泳動の極性を反転することによって、被測定物質以外の生体サンプル成分、酵素標識２次抗体が前記作用極の近傍から除去させる、
（４）前記作用極と前記対極間の電気化学反応として、被測定物質の濃度に応じた電流を検出する。
(Biological component analysis method)
Furthermore, the present invention is also directed to a biological component analysis method using the enzyme sensor kit for biological sample measurement.
The detailed biological component analysis method is as follows.
(1) reacting a primary antibody against a substance to be measured immobilized on the working electrode, a substance to be measured in a biological sample, and an enzyme-labeled secondary antibody;
(2) performing electrophoresis in a vertical direction between the working electrode and the counter electrode, and aggregating the substance to be measured and the enzyme-labeled secondary antibody in the sample with the primary antibody immobilized on the working electrode;
(3) By reversing the polarity of electrophoresis, biological sample components other than the substance to be measured and the enzyme-labeled secondary antibody are removed from the vicinity of the working electrode.
(4) As an electrochemical reaction between the working electrode and the counter electrode, a current corresponding to the concentration of the substance to be measured is detected.
以下に、本発明の実施例について説明する。しかしながら、本発明の請求項は、下記実施例の範囲に限定されない。 Examples of the present invention will be described below. However, the claims of the present invention are not limited to the scope of the following examples.
（１次抗体が作用極に固定化されている酵素センサの作製）
ガラス基材（10 × 7 × 1 mm3）を基板とした。該基板に、作用極、対極、参照極の３電極を蒸着により形成した。作用極と対極には白金 (Pt)、参照極に銀/塩化銀 (AgCl) を用いた。
また、ガラス基材をカバーとした。さらに、該カバーの裏面に、対向極を蒸着により形成した。蒸着に使用した金属は、白金 (Pt)であった。
(Preparation of enzyme sensor with primary antibody immobilized on working electrode)
A glass substrate (10 × 7 × 1 mm 3 ) was used as a substrate. Three electrodes, a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode, were formed on the substrate by vapor deposition. Platinum (Pt) was used for the working electrode and counter electrode, and silver / silver chloride (AgCl) was used for the reference electrode.
Moreover, the glass base material was used as the cover. Furthermore, a counter electrode was formed on the back surface of the cover by vapor deposition. The metal used for vapor deposition was platinum (Pt).
作用極には、BSA溶液に溶解した「抗コルチゾール抗体（モノクローナル抗体，mouse, 2330-4839, Former Biogenesis Ltd.）」を塗布し、自然乾燥させた。これにより、抗コルチゾール抗体は作用極に固定化された。
次に、基板にカバーを被せて酵素センサとした。このとき、カバーの裏面の対向極は、基板上の作用極の上方にくるように設定した。
The working electrode was coated with “anti-cortisol antibody (monoclonal antibody, mouse, 2330-4839, Former Biogenesis Ltd.)” dissolved in a BSA solution and allowed to dry naturally. As a result, the anti-cortisol antibody was immobilized on the working electrode.
Next, the substrate was covered and used as an enzyme sensor. At this time, the counter electrode on the back surface of the cover was set to be above the working electrode on the substrate.
（キャリアー化合物が結合している被測定物質（抗原）の作製）
被測定物質であるコルチゾールの分子量は362.5と小さい。よって、１次抗体及び２次抗体を使用したサンドイッチ法で高感度に測定できない場合を考慮して、コルチゾールにキャリアー化合物であるアルブミンを結合させ、結合率を100%とした。これにより、作用極に固体化している１次抗体はコルチゾール部分に結合し、酵素標識２次抗体はキャリアー化合物であるアルブミンに結合する。
(Preparation of analyte (antigen) to which carrier compound is bound)
Cortisol, the substance to be measured, has a low molecular weight of 362.5. Therefore, in consideration of the case where high sensitivity cannot be measured by the sandwich method using the primary antibody and the secondary antibody, albumin as a carrier compound was bound to cortisol, and the binding rate was set to 100%. As a result, the primary antibody solidified at the working electrode binds to the cortisol moiety, and the enzyme-labeled secondary antibody binds to albumin, which is a carrier compound.
２次抗体の酵素標識
本発明の酵素センサで利用する２次抗体のHRP標識を行い、次にHPLC (D-7500, (株)日立製作所) により２次抗体のHRP標識を確認した。
また、使用する１次抗体と２次抗体は抗原上で異なるエピトープを認識しなければならない。よって、１次抗体にモノクローナル抗体、２次抗体にポリクローナル抗体を使用した。
２次抗体 Anti Albumin (No.02200404, コスモバイオ) のHRP標識を、Peroxidase Labeling Kit - SH (LK09, (株)同仁化学研究所) を用いて行った。下記に使用したHPLCの測定条件を示した。HPLCでの分析は、分子量の高い成分から検出されるサイズ排除モードで行った。
Enzyme labeling of the secondary antibody The HRP labeling of the secondary antibody used in the enzyme sensor of the present invention was performed, and then the HRP labeling of the secondary antibody was confirmed by HPLC (D-7500, Hitachi, Ltd.).
Also, the primary and secondary antibodies used must recognize different epitopes on the antigen. Therefore, a monoclonal antibody was used as the primary antibody and a polyclonal antibody was used as the secondary antibody.
HRP labeling of the secondary antibody Anti Albumin (No. 02200404, Cosmo Bio) was performed using Peroxidase Labeling Kit-SH (LK09, Dojindo Laboratories). The HPLC measurement conditions used are shown below. The analysis by HPLC was performed in a size exclusion mode in which components having a high molecular weight were detected.
HPLC分析条件
カラム ：Shodex KW-804
測定波長：280 nm
移動相 ：蒸留水
流量 ：0.5 ml/min
注入量 ：50μl
HPLC analysis conditions Column: Shodex KW-804
Measurement wavelength: 280 nm
Mobile phase: Distilled water Flow rate: 0.5 ml / min
Injection volume: 50 μl
図６は、HPLCを用いて２次抗体にHRPが標識されていることを確認した結果を示した。図６（a）で示されるように、HRPだけをHPLC分析すると、12.40分のみにピークが確認された。該ピークは、HRPであると考えられる。
次に、Peroxidase Labeling Kit - SHを用いて２次抗体のHRP標識した溶液を分析すると、図６（ｂ）で示されるように、10.60分と12.89分にピークを確認することができた。12.89分のピークはHRPだけを分析したときのピークと時間的にほとんど差がないため、HRPであると考えられる。HRP標識した２次抗体は、HRP単体のときよりも分子量は大きくなるので、10.60分のピークはHRP標識された２次抗体であると考えられた。
以上により、本発明で使用する酵素標識２次抗体が作成できた。
FIG. 6 shows the result of confirming that HRP is labeled on the secondary antibody using HPLC. As shown in FIG. 6 (a), when only HRP was analyzed by HPLC, a peak was confirmed only at 12.40 minutes. The peak is considered to be HRP.
Next, when the HRP-labeled solution of the secondary antibody was analyzed using Peroxidase Labeling Kit-SH, peaks could be confirmed at 10.60 minutes and 12.89 minutes as shown in FIG. 6 (b). The peak at 12.89 minutes is considered to be HRP because there is almost no difference in time from the peak when only HRP is analyzed. Since the HRP-labeled secondary antibody has a higher molecular weight than that of HRP alone, the peak at 10.60 minutes was considered to be the HRP-labeled secondary antibody.
As described above, the enzyme-labeled secondary antibody used in the present invention was prepared.
コルチゾールは、血液中の基準値が10 〜15μg/dl と比較的高いので、免疫測定法など高感度な分析法を用いれば唾液から分析できるので、ストレス研究においてゴールド・スタンダードとして多用されてきた。本発明の酵素センサでは、コルチゾールの高感度、迅速分析が実現され、ストレス研究にも有用である。また、本技術は、コルチゾールだけでなく他のホルモンの迅速分析にも適用可能である。 Since cortisol has a relatively high standard value in blood of 10 to 15 μg / dl, it can be analyzed from saliva using a highly sensitive analytical method such as an immunoassay, and thus has been frequently used as a gold standard in stress studies. The enzyme sensor of the present invention realizes high-sensitivity and rapid analysis of cortisol and is useful for stress studies. Further, the present technology can be applied not only to cortisol but also to rapid analysis of other hormones.
１０：酵素センサ、１１：基板、１２：作用極、１３：対極、１４：参照極、１５：カバー、１６：反応槽、１７：対向極、１８：サンプル供給口
２０：１次抗体、２１：抗原（被測定物質）、２２：酵素標識２次抗体、２３：酵素、２４：キャリアー化合物
１２１：抗体固定部、１２２、１３２、１４２：パッド
10: enzyme sensor, 11: substrate, 12: working electrode, 13: counter electrode, 14: reference electrode, 15: cover, 16: reaction vessel, 17: counter electrode, 18: sample supply port 20: primary antibody, 21: Antigen (substance to be measured), 22: enzyme-labeled secondary antibody, 23: enzyme, 24: carrier compound 121: antibody fixing part, 122, 132, 142: pad
Claims (18)
１）前記作用極が基板上で実質的に水平方向に配置され、前記対向極が前記作用極の実質的に上方に配置されており、前記作用極と前記対向極間では電気泳動を垂直に展開可能であり；
２）作用極に被測定物質に対する１次抗体が固定化されており；
３）前記作用極に固定化された前記抗体には、前記抗体に結合する生体サンプルに含まれる抗原である被測定物質を介して酵素によって標識化された酵素標識２次抗体が結合可能であり；
４）前記作用極と前記対向極間に電圧を印加することによる電気泳動により、被測定物質、酵素標識２次抗体と１次抗体が凝集し；
５）前記４）とは逆方向の電圧を印加すること（電気泳動極性を反転させること）による電気泳動により、被測定物質以外の生体サンプル成分、酵素標識２次抗体を前記作用極の近傍から除去し、
６）前記反応槽に十分量の電子メディエーター及び酸化還元物質が存在し、前記酵素標識２次抗体の前記酵素が酸化還元物質を触媒するとともに電子メディエーターを還元することで電子の授受が発生し、前記作用極と前記対極間の電気化学反応として、被測定物質の濃度に応じた電流が検出される。
Measurement of a substance to be measured using an enzyme sensor comprising at least a first electrode as a working electrode, a second electrode as a counter electrode, a third electrode as a counter electrode disposed opposite to the first electrode, and a reaction tank a method, measurement method comprising the following elements:
1) The working electrode is disposed substantially horizontally on the substrate, the counter electrode is disposed substantially above the working electrode, and electrophoresis is performed vertically between the working electrode and the counter electrode. Expandable;
2) The primary antibody against the substance to be measured is immobilized on the working electrode;
3) An enzyme-labeled secondary antibody labeled with an enzyme can be bound to the antibody immobilized on the working electrode via a substance to be measured that is an antigen contained in a biological sample that binds to the antibody. ;
4) The substance to be measured, the enzyme-labeled secondary antibody and the primary antibody are aggregated by electrophoresis by applying a voltage between the working electrode and the counter electrode;
5) From the vicinity of the working electrode, the biological sample components other than the substance to be measured and the enzyme-labeled secondary antibody are electrophoresed by applying a voltage in the opposite direction to 4) (reversing the electrophoresis polarity). Remove ,
6) A sufficient amount of electron mediator and redox substance are present in the reaction tank, and the enzyme of the enzyme-labeled secondary antibody catalyzes the redox substance and reduces the electron mediator, thereby transferring electrons. As an electrochemical reaction between the working electrode and the counter electrode, a current corresponding to the concentration of the substance to be measured is detected.
７）前記反応槽に有極性分子が存在し、前記被測定物質が前記有極性分子と結合して電気泳動性を生じる。
The measurement method according to claim 1, further comprising:
7) Polar molecules are present in the reaction vessel, and the substance to be measured is combined with the polar molecules to cause electrophoretic properties.
The measuring method according to claim 1, wherein the counter electrode is disposed on a back surface of a cover that covers the substrate.
The measurement method according to claim 1, wherein a carrier compound is bound to the substance to be measured, and the secondary antibody is bound to the carrier compound.
The measurement method according to claim 1, wherein a reference electrode is added to the substrate.
The measurement method according to any one of claims 1 to 5, wherein the enzyme-labeled secondary antibody is preliminarily dried or additionally added on the working electrode .
The measuring method according to claim 1, wherein the polar molecule is added to the reaction vessel in a dry state or a wet state.
The measurement method according to claim 1, wherein the electron mediator is a compound that generates electrons when reduced.
The measurement method according to claim 8, wherein the electron mediator is iodine ion or hexacyanoiron ion.
The measurement method according to claim 1, wherein the oxidation-reduction substance is a hydrogen peroxide solution.
The measurement method according to claim 1, wherein the substance to be measured is a hormone.
The measurement method according to claim 11, wherein the hormone is a steroid hormone.
The measurement method according to claim 12, wherein the steroid hormone is selected from one or more of glucocorticoid, mineralocorticoid, and sex corticoid.
The measurement method according to claim 13, wherein the steroid hormone is cortisol.
The measurement method according to any one of claims 1 to 14, wherein the biological sample is selected from one or more of blood, saliva, urine, sputum, body fluid, tears, sweat, semen, and interstitial fluid.
The measurement method according to claim 1, wherein glucose oxidase is further immobilized on the working electrode, glucose is added to the reaction tank, and hydrogen peroxide is generated by the action of glucose oxidase.
The measurement method according to claim 1, wherein the labeling enzyme is peroxidase.
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