JP4923066B2

JP4923066B2 - 免疫測定装置、免疫測定装置に用いられる光ファイバ及び免疫測定を行う方法

Info

Publication number: JP4923066B2
Application number: JP2008558236A
Authority: JP
Inventors: ウィーチャンジン，; ルーディイラワン，
Original assignee: ナンヤンテクノロジカルユニヴァーシティー
Priority date: 2006-03-07
Filing date: 2006-03-07
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2026-03-07
Also published as: JP2009529137A; EP2002240A1; AU2006339611A1; US8158363B2; WO2007102783A1; US20090194707A1

Description

発明の分野

本発明は、免疫測定装置に関し、特にマイクロ流体蛍光免疫測定装置に関する。

発明の背景

健康管理の質を向上させるためには、免疫測定などの診断テストが、家庭或いは病院のベッドのそばなどでの介護に際して迅速且つ安価に行なわれることが望ましい。そのためには、マイクロ流体装置が理想的である。これは、マイクロ流体装置が非常に僅かな量のサンプルおよび試薬しか必要とせず、それにより、コストおよびスペースが減少されるからである。

マイクロ流体免疫測定装置における蛍光方法は、現在、大型の光検出システムを伴う。この光検出システムは、典型的に励起光源からの励起光をマイクロチャンネル内のサンプルに合焦させるとともに、複雑なレンズ、ミラーおよび光学フィルタのセットを用いて発せられる任意の蛍光を集める。蛍光発光は等方性を有しているため、効率は一般に低く、通常は５％未満である。効率を高めることは、通常、より複雑で大型の更に高価な光学システムを必要とすることを意味する。サンプルおよび検出システムと励起光とのアライメントは、マイクロ流体装置の狭いチャンネルに与えられるもう１つの課題である。これは、チャンネル内で発せられる全ての蛍光を得るために励起および収集がチャンネルの長さに沿って行なわれるべき場合に悪化される。また、等方性蛍光発光および散乱励起光は、マイクロ流体基板を通じて伝搬し、マルチチャンネル装置における隣接するチャンネルでクロストークを生じる場合がある。マイクロ流体基板からの蛍光バックグラウンドノイズは、サンプルによって引き起こされる発光よりも高い場合さえある。

第１の好ましい態様によれば、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルを有する免疫測定装置において用いられる光ファイバであって、励起光を上記マイクロ流体チャンネルへ伝送するとともに、発せられた蛍光を光検出器へ伝送するための光ファイバが提供される。

光ファイバは、検体流の方向と平行な方向で光を光検出器に伝送するためのものであってもよい。

第２の好ましい態様によれば、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルを有する免疫測定装置において用いられる光ファイバであって、上記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネル内での検体流の方向と略平行な方向で光を光検出器に伝送するための光ファイバが提供される。

第３の好ましい態様によれば、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルを有する免疫測定装置において用いられる光ファイバであって、上記マイクロ流体チャンネルの壁の少なくとも一部を形成する光ファイバが提供される。

第４の好ましい態様によれば、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルを有する免疫測定装置において用いられる光ファイバであって、少なくとも１つのキャビティを備え、各キャビティが検体を保持するとともに反応チャンバとしての機能を果たす光ファイバが提供される。

第５の好ましい態様によれば、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルと、少なくとも１つの光ファイバとを有する免疫測定装置であって、光ファイバが、上記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネル内での検体流の方向と略平行な方向で光を光検出器に伝送する、免疫測定装置が提供される。

第６の好ましい態様によれば、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルと、少なくとも１つの光ファイバとを有する免疫測定装置であって、光ファイバが、上記マイクロ流体チャンネルの壁の少なくとも一部を形成する、免疫測定装置が提供される。

第７の好ましい態様によれば、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルと、少なくとも１つの光ファイバとを有する免疫測定装置であって、光ファイバが少なくとも１つのキャビティを備え、各キャビティが検体を保持するとともに反応チャンバとしての機能を果たす、免疫測定装置が提供される。

第８の好ましい態様によれば、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルと、少なくとも１つの光ファイバとを有する免疫測定装置であって、上記光ファイバが、励起光を上記マイクロ流体チャンネルへ伝送するとともに、発せられた蛍光を光検出器へ伝送する、免疫測定装置が提供される。

第１、第２、第５および第６の態様においては、光ファイバが上記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルの壁の少なくとも一部を形成してもよい。

第１、第２、第３、第５、第６および第７の態様によれば、光ファイバが少なくとも１つのキャビティを備え、各キャビティが検体を保持するとともに反応チャンバとしての機能を果たしてもよい。

全ての関連する態様において、上記キャビティは、光ファイバ内をキャビティに伝送される励起光がキャビティ内のフルオロフォアを励起できるようになっていてもよい。上記キャビティは、フルオロフォアによって発せられる蛍光が光ファイバ内をキャビティから光ファイバの出射端に伝送されるようになっていてもよい。上記キャビティが上記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルの一部を形成してもよい。上記キャビティは、光ファイバのシースを貫いて光ファイバのコアに向かう溝であってもよい。光ファイバは、上記キャビティが上記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネル内にある状態で上記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネル内へ突出してもよい。上記フルオロフォアがフルオレセインであってもよい。

上記態様の全てにおいて、光ファイバが上記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルのベースの少なくとも一部を形成してもよい。光ファイバ内で伝送される励起光は、フルオロフォアの励起波長に基づいて選択される波長を有していてもよい。

第９の好ましい態様によれば、蛍光を使用して免疫測定を行なう方法であって、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルを有する免疫測定装置内に光ファイバを設けるステップであって、上記光ファイバが、検体を保持するとともに反応チャンバとして機能する少なくとも１つのキャビティを備えるステップと、上記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルに沿って複数の検体を通過させるステップであって、上記複数の検体のうちの少なくとも１つがフルオロフォアを含むステップと、上記少なくとも１つのキャビティ内で上記複数の検体を反応させるステップと、上記フルオロフォアが蛍光を発するように上記キャビティ内の上記フルオロフォアを励起するために、上記少なくとも１つのキャビティに前記光ファイバ内の励起光を伝送するステップと、発せられた蛍光を光ファイバに沿ってキャビティから光ファイバの出射端に伝送するステップと、上記蛍光を検出するステップとを備える方法が提供される。

励起光は、発せられた蛍光を残すように検出でフィルタリングされてもよい。励起光および発せられた蛍光は、上記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネル内での検体流の方向と略平行な方向で伝送されてもよい。励起光の波長がフルオロフォアの励起波長に基づいて選択されてもよい。上記光ファイバが上記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルの壁の少なくとも一部を形成してもよい。上記キャビティが上記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルの一部を形成してもよい。上記キャビティが光ファイバの溝であってもよい。上記フルオロフォアがフルオレセインであってもよい。

本発明を十分に理解するとともに実用的効果を容易に得るため、次に、単なる非限定的な例として、添付図面を参照して、本発明の好ましい実施形態について説明する。

好ましい実施形態の詳細な説明

１つの態様によれば、図１、図２および図３に示される蛍光免疫測定装置１０において用いられる光ファイバ８が提供される。装置１０は、一般にポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）シートまたはポリエステルフィルム、例えばマイラーなどのプラスチック材料から形成されるマイクロ流体基板１２を備えている。光ファイバも、一般にＰＭＭＡから形成され、約５００μｍのコア直径および約１０μｍのクラッド厚さを有している。ＰＭＭＡは、他のタイプの高分子ファイバと比べてその蛍光バックグラウンドノイズが低いため、光ファイバ８にとって好ましい。

装置１０は少なくとも１つのマイクロ流体チャンネル１４を含んでおり、このマイクロ流体チャンネルを通じて検体が流れることができる。光ファイバ８は、当該光ファイバ８がマイクロ流体チャンネル１４の壁１６の少なくとも一部を形成するように装置１０内に組み込まれる。図示のように、光ファイバ８は、マイクロ流体チャンネル１４のベースを形成する。光ファイバはベースの全部または一部のみを形成してもよい。光ファイバ８の長さに沿って、光ファイバ８には少なくとも１つのキャビティが形成される。好ましくは、複数のキャビティ１８が存在する。キャビティ１８は、マイクロ流体チャンネル１４内へ開放しており、マイクロ流体チャンネル１４の一部を形成してもよい。また、キャビティ１８は、ＣＯ_２レーザ直接描画機またはエキシマレーザを使用して光ファイバ８のシースを貫いて光ファイバ８のコアに切り込まれる溝である。各溝は、幅約１００×１００μｍおよび深さ約１００μｍであることが好ましい。隣り合う溝は、約１．５ｍｍ離間されている。光ファイバ８がマイクロ流体チャンネル１４のベースを形成し、それにより、流体が重力下でキャビティ１８内に定着することが好ましい。

免疫測定装置１０の典型的な使用例では、第１の抗体を含む第１の検体が、矢印２０で示される方向でマイクロ流体チャンネル１４を沿って通過する。キャビティ１８は、第１の検体の一部を捕らえて保持する。その後、第１の抗体と結合できる対象の抗原を含む第２の検体がマイクロ流体チャンネル１４に沿って通される。抗原の一部は、キャビティ１８内に保持された第１の抗体に結合する。その後、第２の抗体を含む第３の検体がマイクロ流体チャンネル１４に沿って通される。第２の抗体は、既にフルオロフォアで標識化されており、抗原と結合できるようにその能力が選択される。第３の検体がマイクロ流体チャンネル１４に沿って通過すると、第２の抗体の一部がキャビティ１８内に保持された抗原と結合する。このように、キャビティ１８は、様々な検体が相互作用するための反応チャンバであって、最終的に抗原の存在を示すことができる任意のフルオロフォアを保持するための反応チャンバとしての役目を果たす。

「サンドイッチ免疫測定」として知られる典型的なプロセスで３つの異なる検体が順次に流されることについて説明してきたが、装置１０は、マイクロ流体チャンネル１４に沿って通過した対象物質の存在を示すために、結果としてフルオロフォアがキャビティ１８内に保持されている限り、任意の他の免疫測定プロセスと共に使用できる。

光ファイバ８は、広帯域光源からのＵＶ光または可視光などの励起光（矢印３０で示される）をキャビティ１８へ伝送する。図４から分かるように、光伝送の方向（矢印３２）は、マイクロ流体チャンネル１４内の検体流の方向（矢印２０）と略平行である。

例えば光学帯域通過フィルタおよび光ファイバプローブを使用することによって励起光の波長を適切に調整することにより、キャビティ１８内に保持されたフルオロフォアが励起光によって励起されて蛍光を発する。例えば、使用されるフルオロフォアが約４９０ｎｍのピーク励起波長を有するフルオレセインである場合には、４７０ｎｍ±１０ｎｍ帯域通過干渉フィルタが適している。発せられる蛍光は、典型的に等方性を有している。発せられる蛍光の一部はマイクロ流体チャンネル１４へ入り込み、また、一部（矢印３４で示される）は、光ファイバ８に入り込んで光ファイバ８の出射端部にあるフォトダイオードなどの光検出器へ伝送される。

フルオロフォアの励起は、光ファイバ８自体のキャビティ１８内で行なわれるため、レンズおよびミラーを伴う外部光検出システムと比べて非常に効率的に蛍光発光を光ファイバ８によって集めることができる。光ファイバを使用して励起光を伝送するとともに発せされた蛍光を集めると、チャンネル内で発せられる蛍光全体を捕らえるためにチャンネルの長さに沿って走査するという複雑なプロセスも回避される。また、基板の蛍光に起因する「ノイズ」もない。キャビティ１８から蛍光を集めるためには、光源励起光３２のフィルタリングが必要である。残りの信号が蛍光３４である。

検出された蛍光の強度を測定することにより、比例して蛍光ブローブの濃度を決定できる。フルオロフォアの濃度はキャビティ１８内に保持される対象物質の量に比例しているため、対象物質の濃度もまた決定できる。

図５は、装置１０の実験検証においてキャビティ１８内の７．４のｐＨを有するＰＢＳ緩衝液中の１ｍｇ／ｌのフルオレセインがＬＥＤ光源からの４３０ｎｍの波長を有する青色光によって励起されたときに光検出器によって検出される蛍光強度を示している。

広帯域光源からの励起光がキャビティ１８内のフルオレセインによって発せられる蛍光と共に検出されるため、励起光を蛍光発光と明確に区別するために、光検出器の前の光ファイバの端部に光学フィルタを有することが好ましい。

光ファイバ８内で伝送される光は、キャビティ１８内のフルオロフォアによってのみならず、装置１０のマイクロベンドなどの他の要因によっても影響される。したがって、そのような他の要因から生じる場合がある光源変動および損失並びに任意の他の干渉を補償するために、特別に選択された波長を有する基準光が対照として使用されることが好ましい。基準光の波長は、使用されるフルオロフォアの励起・蛍光発光スペクトルの範囲外にあってもよい。赤色領域または赤外線領域の波長が一般に適している。なぜなら、殆どのフルオロフォアは、これらの波長の光に晒されると、蛍光を発しないからである。蛍光強度は励起光の強度に正比例するため、基準光の強度を比べることにより、光検出器によって測定される蛍光強度を補正することができる。

図６は、低い濃度で蛍光強度がフルオレセインの濃度に正比例していることを示している。これは、装置１０が検体中の対象物質の存在だけでなく濃度も検出するのに適していることを示している。

実験検証により、光ファイバ８に沿うキャビティ１８の数は図７に示されるように免疫測定の感度に影響を与えることが分かった。検出される蛍光の強度は、３０個未満のキャビティでは、キャビティ１８の数によってかなり影響されることが分かった。キャビティが３０個を越えると、検出される蛍光の強度に著しい変化はない。更に多くの数のキャビティ１８を有することにより、第２の検体中に含まれる抗原などの対象物質の大部分をキャビティ１８によって捕らえて保持することができると考えられる。したがって、フルオレセインなどのフルオロフォアを使用する免疫測定中に装置の感度を最大にするためには、少なくとも３０個のキャビティ１８を有することが好ましい。他のフルオロフォアにおいては、それに応じてキャビティ１８の数を最適化することにより、装置の感度を最適化することができる。

本発明は、以下の表１のフルオロフォアを含むがこれらに限定されない広い範囲のフルオロフォアにおいて有効である。

以上の説明では本発明の好ましい実施形態について説明してきたが、当業者であれば分かるように、本発明から逸脱することなく、設計または構造の詳細において多くの変形または改良を成してもよい。例えば、免疫測定装置が複数のマイクロ流体チャンネルを備え、それぞれのチャンネルがチャンネル壁を形成する組み込み光ファイバを有していてもよい。これにより、各チャンネルのための励起光の大部分をそれ自体の光ファイバに閉じ込めるため、クロストーク問題を最小限に抑えつつ、異なるフルオロフォアを使用して異なる対象物質を検査することができる。

本発明の１つの実施形態に係る免疫測定装置の概略側面図である。図１の免疫測定装置のＡ−Ａ線に沿う断面図である。図１の免疫測定装置の平面図である。図１の免疫測定装置のキャビティの拡大概略側面図である。図１の免疫測定装置が使用されるときに光検出器によって検出される波長に対する蛍光強度のグラフである。フルオレセイン濃度に対する蛍光強度のグラフである。キャビティの数に対する蛍光強度のグラフである。

Claims

少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルを有する免疫測定装置において用いられる光ファイバであって、
励起光を前記マイクロ流体チャンネルへ伝送するとともに、発せられた蛍光を光検出器へ伝送するための光ファイバであり、
当該光ファイバは、
（ａ）少なくとも１つのキャビティであって、各キャビティが検体を保持するとともに反応チャンバとしての機能を果たすキャビティを備え、
前記キャビティは、前記マイクロ流体チャンネル内へ開放しており該マイクロ流体チャンネルの一部を形成し、前記キャビティは、当該光ファイバのシースを貫いて当該光ファイバのコアの中に設けられた溝である、光ファイバ。
検体流の方向と平行な方向で光を光検出器に伝送する請求項１に記載の光ファイバ。
前記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルの壁の少なくとも一部を形成する請求項１および２のいずれか一項に記載の光ファイバ。
当該光ファイバ内を前記キャビティに伝送される励起光が前記キャビティ内のフルオロフォアを励起できる請求項１に記載の光ファイバ。
前記フルオロフォアによって発せられる蛍光が前記キャビティから当該光ファイバの出射端に当該光ファイバ内を伝送される請求項４に記載の光ファイバ。
前記フルオロフォアがフルオレセインである請求項４または５に記載の光ファイバ。
前記キャビティが前記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネル内にある状態で、当該光ファイバが前記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネル内へ突出する請求項１〜６のいずれか一項に記載の光ファイバ。
前記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルのベースの少なくとも一部を形成する請求項１〜７のいずれか一項に記載の光ファイバ。
当該光ファイバ内で伝送される励起光が、前記フルオロフォアの励起波長に基づいて選択される波長を有している請求項４〜８のいずれか一項に記載の光ファイバ。
蛍光を使用して免疫測定を行なう方法であって、
ａ）少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルを有する免疫測定装置内に光ファイバを設けるステップであって、前記光ファイバが、少なくとも１つのキャビティを備え、各キャビティが検体を保持するとともに反応チャンバとして機能し、前記キャビティは、前記マイクロ流体チャンネル内へ開放しており該マイクロ流体チャンネルの一部を形成し、前記キャビティは、前記光ファイバのシースを貫いて前記光ファイバのコアの中に設けられた溝である、ステップと、
ｂ）前記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルに沿って複数の検体を通過させるステップであって、前記複数の検体のうちの少なくとも１つがフルオロフォアを含むステップと、
ｃ）前記少なくとも１つのキャビティ内で前記複数の検体を反応させるステップと、
ｄ）前記フルオロフォアが蛍光を発するように前記キャビティ内の前記フルオロフォアを励起するために、前記少なくとも１つのキャビティに前記光ファイバ内の励起光を伝送するステップと、
ｅ）前記発せられた蛍光を光ファイバに沿って前記キャビティから前記光ファイバの出射端に伝送するステップと、
ｆ）前記蛍光を検出するステップと、
を備える方法。
前記励起光が、前記発せられた蛍光を残すように前記検出でフィルタリングされる請求項１０に記載の方法。
前記励起光および前記発せられた蛍光が、前記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネル内での検体流の方向と略平行な方向で伝送される請求項１０または１１に記載の方法。
前記光ファイバが前記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルの壁の少なくとも一部を形成する請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
前記フルオロフォアがフルオレセインである請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
前記励起光の波長が前記フルオロフォアの励起波長に基づいて選択される請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルと、少なくとも１つの光ファイバとを有する免疫測定装置であって、
前記光ファイバが、励起光を前記マイクロ流体チャンネルへ伝送するとともに、発せられた蛍光を光検出器へ伝送し
前記光ファイバは、
（ａ）少なくとも１つのキャビティであって、各キャビティが検体を保持するとともに反応チャンバとしての機能を果たすキャビティを備え、
前記キャビティは、前記マイクロ流体チャンネル内へ開放しており該マイクロ流体チャンネルの一部を形成し、前記キャビティが、前記光ファイバのシースを貫いて前記光ファイバのコアの中に設けられた溝である、免疫測定装置。
前記光ファイバが検体流の方向と平行な方向で光を光検出器に伝送する請求項１６に記載の免疫測定装置。
前記光ファイバが前記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルの壁の少なくとも一部を形成する請求項１６および１７のいずれか一項に記載の免疫測定装置。
前記光ファイバ内を前記キャビティに伝送される励起光が前記キャビティ内のフルオロフォアを励起できる請求項１６に記載の免疫測定装置。
前記フルオロフォアによって発せられる蛍光が前記キャビティから前記光ファイバの出射端に前記光ファイバ内を伝送される請求項１９に記載の免疫測定装置。
前記フルオロフォアがフルオレセインである請求項１９または２０に記載の免疫測定装置。
前記キャビティが前記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネル内にある状態で、前記光ファイバが前記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネル内へ突出する請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の免疫測定装置。
前記光ファイバが前記少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルのベースの少なくとも一部を形成する請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の免疫測定装置。
前記光ファイバ内で伝送される励起光が、前記フルオロフォアの励起波長に基づいて選択される波長を有している請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の免疫測定装置。
請求項１〜９のいずれか一項に記載の光ファイバを備える免疫測定装置。