JP4927319B2

JP4927319B2 - 高密度カーボンナノチューブフィルムまたはパターンを用いたバイオチップの製造方法

Info

Publication number: JP4927319B2
Application number: JP2004056210A
Authority: JP
Inventors: 鄭喜台; 李相▲華▼; 鄭大煥; 金炳勳; 高永觀
Original assignee: 韓国科学技術園
Priority date: 2003-07-24
Filing date: 2004-03-01
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2024-03-01
Also published as: JP2005040938A; US8067341B2; US20050019791A1

Description

本発明は、化学的な作用基が露出された高密度のカーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅ：ＣＮＴ）フィルム、またはパターンに標的バイオ物質と結合するバイオリセプターが化学的または物理化学的に結合されているバイオチップ、およびその製造方法に関する。

ＣＮＴとは、地球上に多量に存在する炭素からなる炭素同素体であり、一つの炭素が他の炭素原子と六角形の蜂の巣柄に結合されてチューブ形状になっている物質であって、チューブの直径がナノメートル（ｎｍ＝１０億分の１メートル）水準の極めて小さな領域の物質である。ＣＮＴは、優秀な機械的特性、電気的選択性、優れた電界放出特性、高効率の水素貯蔵媒体特性などを有しながら、現存する物質の中で欠陷がほとんどない完璧な新素材として知られている。

ＣＮＴは、力学的強固性と化学的安全性に優れ、理想的な一次元（１Ｄ）の半導体または金属の性質を持つ“クワァントムワイアー”と大きい外見上の比率を持ち、平板表示素子、トランジスター、エネルギー貯蔵体などの素材とナノサイズの各種センサーへの応用性が非常に高い。

前記特性をより多様に応用するために、単一壁ＣＮＴは強酸を用いてナノチューブを欠片に切りとった。このように切られたＣＮＴは、オープンにされたチューブ末端、及び側壁の一部に、主に−ＣＯＯＨ化学的な作用基を有する。このような化学的な作用基を用いて、多様な物質を化学的に結合してＣＮＴの性質を改質することもあった。さらに化学的機作によって、ＣＮＴの作用基を−ＳＨ基に置き換えた後、金の表面にパターン化した報告（Ｎａｎ，Ｘ．ｅｔａｌ．，Ｊ．ＣｏｌｌｏｉｄＩｎｔｅｒｆａｃｅＳｃｉ．，２４５：３１１−８，２００２）と、静電気的方法を利用してＣＮＴを基質に固着させた報告とがある（Ｒｏｕｓｅ，Ｊ．Ｈ．ｅｔａｌ．，ＮａｎｏＬｅｔｔ．，３：５９−６２，２００３）。しかし、前者はＣＮＴの表面密度が低く結合力が弱いという短所を持ち、後者は選択的に表面に固定するパターニング方法を適用することができないという致命的な短所を持っている。したがって、高い密度を持つ新しい形状の表面固定方法の開発が切実に要求されている。

最近、ＣＮＴにバイオ物質を固定した上で、ＣＮＴの電気化学的な変化を利用して蛋白質−蛋白質及び蛋白質−リガンドの間の反応を検出する研究が進められている（Ｄａｉ，Ｈ．ｅｔａｌ．，ＡＣＣ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３５：１０３５−４４，２００２；Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３７５：１０３−５，２００３；Ｅｒｌａｎｇｅｒ，Ｂ．Ｆ．ｅｔａｌ．，ＮａｎｏＬｅｔｔ．，１：４６５−７，２００１；Ａｚａｍｉａｎ，Ｂ．Ｒ．ｅｔａｌ．，ＪＡＣＳ，１２４：１２６６４−５，２００２）。蛋白質−リガンド反応として代表的な例としては、アビジン−ビオチン反応が挙げられるが、Ｓｔａｒなどは、高分子に処理された基質上にＣＮＴを用いてチャンネルを形成した後、電気化学的な方法でストレブトアビジンの結合を測定した（Ｓｔａｒ，Ａ．ｅｔａｌ．，ＮａｎｏＬｅｔｔ．，３：４５９−６３，２００３）。

バイオチップとしてＣＮＴが注目される理由は、第一、ラベリングが不要であり、第二、信号の変化に非常に敏感であり、第三、蛋白質の変形なしに水溶液上で反応を行うことができるからである。新しいナノ物質と生物学的システムの結合により、疾病診断（遺伝病）、プロテオミクス、ナノバイオ技術分野で重要なヒューザン技術が創出されるであろう。

より速くて安価なバイオチップを開発するために、最近ＤＮＡ混成化感知技術について多くの研究が行われている。ＤＮＡの混成化を感知するための多様なラベリング技術が開発された。ＤＮＡチップでＤＮＡ混成化を効率的に検出するためには、混成化効率を高めると共に非特異的結合による背景を除去し得る効果的な表面処理が必要である。よって、表面処理されたＤＮＡチッププラットフォームを作るために多くの研究が行われて来た（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｙ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６６：２３−３０，１９９９；Ｈｕ，Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２９：１０６−１０，２００１）。また、ＤＮＡ混成化検出のための多様な方法が模索されたが、その方法としてはスキャン分析方法、比色分析方法、ナノ粒子を用いた方法、電気化学を用いた方法などが挙げられる（Ｔａｔｏｎ，T．A．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９：１７５７−６０，２０００；Ａｌｅｘａｎｄｒｅ，I．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９５：１−８，２００１；Ｃａｉ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ．，１２７：８０３−８，２００２；Ｃａｉ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３７５：２８７−９３，２００３）。

一方、ＣＮＴを生命工学分野で応用する事例が最近多く登場している。グルコースセンサー、蛋白質の検出、特定ＤＮＡ配列の検出（Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３７５：１０３−５，２００３；Ｃｈｅｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：４９８４−９，２００３；Ｃａｉ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３７５：２８７−９３，２００３）などのバイオチップに対するＣＮＴの応用可能性が提示されている。ＣＮＴを基盤とした多層からの生物分子検索は、表面積が広くて電気伝導度に優れていて、ＤＮＡのような生物分子が固定される量が増え、生物分子に対する検出敏感度が増大できる。

現在、バイオチップから反応結果を検出する最も普遍的な方法としては、既存の蛍光物質と同位元素を利用する方法であるが（Ｔｏｒｉｂａ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＢＭＣ．，１７：１２６−３２，２００３；Ｓｙｒｚｙｃｋａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，４８４：１−１４，２００３；Ｇｒｏｗ，Ａ．Ｅ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｍｅｔｈ．，５３：２２１−３３，２００３）、より容易で正確に、電気的または電気化学的信号を測定し得る新しい方法が試され、これによりＣＮＴという新素材の必要性がさらに高まっている。

高密度のＣＮＴマルチレイヤを作ってその上にＤＮＡを固定した後、相補的に結合するＤＮＡを検出する方法は、ゲノム分析、突然変異検索、病原性菌診断などに有用である。ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ：ＤＮＡ類似体）を単一壁ＣＮＴに位置特異的に固定し、プローブＤＮＡと相補的に結合することを検出した報告がある（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｋ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２０：７６１，２００１）。また、化学的な方法を用いてオリゴヌクレオチドをＣＮＴアレーに固定し、グアニン酸化方法を用いてＤＮＡを検出した例もある（Ｌｉ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＮａｎｏＬｅｔｔ．，３：５９７−６０２，２００３）。しかし、これらはＣＮＴをバイオチップの作製及び開発に適用したものではない。

最近、ＣＮＴを用いた高用量のバイオ分子検出センサー（ＷＯ０３／０１６９０１Ａ１）が知られている。基質上に化学的連結体を使用して複数のＣＮＴを配列し、様々な種類のリセプターを結合させて得られるマルチチャンネル型バイオチップに関するものであるが、比較的周辺環境の変化に弱いという欠点がある。

よって、本発明者らはアミン基が露出された基質上に化学的結合を用いてＣＮＴを反複的に積層して、化学的な作用基が露出された高密度のＣＮＴフィルムまたはパターンを形成した後、前記ＣＮＴフィルムまたはパターンにバイオリセプターを化学的に結合させるか、または非特異性結合を防止するための化学物質を物理的に吸着してＣＮＴ表面を処理した後、バイオリセプターを化学的に結合させてＣＮＴ−バイオチップを製造する方法を着眼して本発明を完成するようになった。
ＷＯ０３／０１６９０１Ａ１Ｎａｎ，Ｘ．ｅｔａｌ．，Ｊ．ＣｏｌｌｏｉｄＩｎｔｅｒｆａｃｅＳｃｉ．，２４５：３１１−８，２００２Ｒｏｕｓｅ，Ｊ．Ｈ．ｅｔａｌ．，ＮａｎｏＬｅｔｔ．，３：５９−６２，２００３Ｄａｉ，Ｈ．ｅｔａｌ．，ＡＣＣ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３５：１０３５−４４，２００２Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３７５：１０３−５，２００３Ｅｒｌａｎｇｅｒ，Ｂ．Ｆ．ｅｔａｌ．，ＮａｎｏＬｅｔｔ．，１：４６５−７，２００１Ａｚａｍｉａｎ，Ｂ．Ｒ．ｅｔａｌ．，ＪＡＣＳ，１２４：１２６６４−５，２００２Ｓｔａｒ，Ａ．ｅｔａｌ．，ＮａｎｏＬｅｔｔ．，３：４５９−６３，２００３Ｒｏｇｅｒｓ，Ｙ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６６：２３−３０，１９９９；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６６：２３−３０，１９９９Ｈｕ，Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２９：１０６−１０，２００１Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９：１７５７−６０，２０００Ａｌｅｘａｎｄｒｅ，Ｉ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９５：１−８，２００１Ｃａｉ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ．，１２７：８０３−８，２００２Ｃａｉ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３７５：２８７−９３，２００３Ｃｈｅｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：４９８４−９，２００３Ｔｏｒｉｂａ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＢＭＣ．，１７：１２６−３２，２００３；，２００３Ｓｙｒｚｙｃｋａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，４８４：１−１４，２００３Ｇｒｏｗ，Ａ．Ｅ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｍｅｔｈ．，５３：２２１−３３，２００３Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｋ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２０：７６１，２００１Ｌｉ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＮａｎｏＬｅｔｔ．，３：５９７−６０２，２００３Ｋｏｕｗｅｎｈｏｖｅｎ，Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１８９６−９７，１９９７

本発明の目的は、基質上に化学的結合によって高密度に固定され、表面に化学的な作用基が露出されたＣＮＴフィルム、前記ＣＮＴフィルム表面にバイオリセプターが付着されているＣＮＴ−バイオチップ、及びその製造方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、望まれる位置に化学的結合によって反複的に積層された高密度のＣＮＴパターンに、バイオリセプターが結合されているＣＮＴ−バイオチップ及びその製造方法を提供することにある。

本発明のまた他の目的は、前記ＣＮＴ−バイオチップを用いて、バイオリセプターに結合するか反応する多様な標的バイオ物質を検出する方法を提供することにある。

前記目的を達成するため、本発明は、（ａ）表面にアミン基が露出された基質またはアミン基がパターン状に露出された基質とカルボキシル基が露出されたＣＮＴを反応させ、前記アミン基と前記カルボキシル基間のアミド化反応によって基質表面にＣＮＴ単層または単層パターンを形成する段階と；（ｂ）前記ＣＮＴ単層または単層パターンとジアミン系有機化合物を反応させて前記ＣＮＴ単層上に有機アミン基を形成し、前記有機アミンとカルボキシル基が露出されたＣＮＴとを反応させてＣＮＴを積層する段階と；（ｃ）前記（ｂ）段階をｎ回繰り返してＣＮＴ層と有機アミン基とをｎ回交互に積層して、カルボキシル基が露出された高密度のＣＮＴフィルムまたはパターンを形成する段階と；（ｄ）前記カルボキシル基が露出された高密度ＣＮＴフィルムまたはパターンを前記カルボキシル基と結合する作用基と、アミン基、アルデヒド基、水酸基、チオール基及びハロゲンからなる群から選ばれた化学的な作用基を同時に有する化学物質で改質する段階と；を含む、表面にアミン基、アルデヒド基、水酸基、チオール基及びハロゲンからなる群から選ばれた化学的な作用基が露出された高密度ＣＮＴフィルムまたはパターンの製造方法を提供する。

本発明はまた、前記方法によって製造され、表面にアミン基、アルデヒド基、水酸基、チオール基およびハロゲンからなる群から選ばれた化学的な作用基が露出している高密度ＣＮＴフィルムまたはパターンを提供する。

本発明はまた、前記ＣＮＴフィルムまたはパターンの表面に露出されたアミン基、アルデヒド基、水酸基、チオール基及びハロゲンからなる群から選ばれた化学的な作用基に、前記化学的な作用基と結合する作用基を有するバイオリセプターが化学的なまたは物理化学的結合によって固定されていることを特徴とするＣＮＴ−バイオチップ及びその製造方法を提供する。

本発明において、表面にアミノ作用基が露出された基質は、基質をアミノアルキルオキシランで処理して得ることができ、前記アミン基がパターン状に露出された基質は、アミン基が露出された基質にフォトレジストまたは有機超分子パターンを形成して得ることができる。このようなパターンにＣＮＴを垂直または水平方向に積層または固定することができ、有機超分子のナノパターンである場合には、ＣＮＴを垂直方向に固定するのが望ましい。前記アミン基がパターン状に露出された基質は、半導体工程で慣用的に用いられるフォトリソグラフィ方法を利用して、アミン基が露出された基質にフォトレジストパターンを形成して得ることもでき、基質上にフォトレジストパターンまたは有機超分子パターンを形成した上で、アミノアルキルオキシランで処理して得ることもできる。

本発明において、カルボキシル基と結合する化学的な作用基はアミン基または水酸基であることが好ましい。また、バイオリセプターは、カルボキシル基、アミン基、水酸基、アルデヒド基、またはチオール基を有する酵素基質、リガンド、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＡＮ、ＰＮＡ、地質、コパクターまたは炭水化物であることを特徴とする。標的バイオ物質は、バイオリセプターと反応するか結合して検出される標的役目を果たす物質であって、好ましくは蛋白質、核酸、抗体、酵素、炭水化物、地質またはその他生体由来の生物分子であり、さらに好ましくはＤＮＡまたは蛋白質である。

本発明において、カルボキシル基と結合する作用基と、アミン基、アルデヒド基、水酸基、チオール基及びハロゲンからなる群から選ばれた化学的な作用基とを同時に有する化学物質は、Ｈ_２Ｎ−Ｒ_１−ＮＨ_２、Ｈ_２Ｎ−Ｒ_２−ＣＨＯ、Ｈ_２Ｎ−Ｒ_３−ＯＨ，Ｈ_２Ｎ−Ｒ_４−ＳＨまたはＨ_２Ｎ−Ｒ_５−Ｘであることを特徴とする。ここで、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３Ｒ_４及びＲ_５は独立的にＣ_１−２０である飽和炭化水素類、不飽和炭化水素類または芳香族有機基であって、Ｘはハロゲン元素である。

本発明はまた、前記ＣＮＴ−バイオチップを用いることを特徴とするバイオリセプターと結合するか相互反応する標的バイオ物質の検出方法を提供する。

本発明はまた、バイオリセプターがＤＮＡであることを特徴とするＣＮＴ−ＤＮＡチップ及び、前記ＣＮＴ−ＤＮＡチップを用いることを特徴とするＤＮＡ混成化反応の検出方法を提供する。

本発明の「ＣＮＴ−バイオチップ」という用語は、ＣＮＴパターンにバイオリセプターが化学的または物理化学的に結合されているものを包括する概念で、高密度ＣＮＴパターンまたはフィルムにバイオリセプターが化学的または物理化学的に結合（特に、アミド結合）されているバイオチップを含むと定義される。

本発明では、ＣＮＴを、化学的な作用基（アミン基）がコートされた固体基質上に化学的結合によって反復的に積層して、高い表面密度を有する、カルボキシル基が露出されたＣＮＴパターンまたはフィルムを作製した後、これに、前記カルボキシル基と化学的に反応する作用基（アミン基、水酸基など）を有するバイオリセプターを付着させて多様な種類の標的バイオ物質を直接検出するか、電気化学的なまたは電気的な信号を利用して検出することができるＣＮＴ−バイオチップを作製した。

一方、前記カルボキシル基と結合する作用基を有しないバイオリセプターを結合させるためには、前記カルボキシル基が露出されたＣＮＴフィルムまたはパターンを、前記カルボキシル基と結合する化学的な作用基（アミン基、水酸基など）と、目的バイオリセプターにある作用基（アミン基、水酸基、チオール基、アルデヒド基など）と結合する化学的な作用基とを同時に有する化学物質を使用して改質することができる。よって、ほとんどすべてのバイオリセプターを前記高密度ＣＮＴフィルムまたはパターンに化学的または物理化学的に結合させることができる。

例えば、チオール基を有するバイオリセプターを付着させるためには、カルボキシル基と結合する化学的な作用基とチオール作用基とを同時に有する化学物質（例：ＮＮ２−Ｒ２−ＳＨ）で改質し、チオール作用基をＣＮＴフィルムまたはパターンの表面に露出させた後、Ｓ−Ｓ結合によって前記チオール基を有するバイオリセプターを付着させることができる。

本発明によれば、ＣＮＴを、一定の位置に置かれていた触媒から成長させて完成した従来技術の限界を脱して、所望の位置に所望の模様のパターンを形成することができる。本発明は化学的な方法の長所を最大限利用できるように、高分子や有機超分子を用いて基板のパターンを形成することで前記従来技術の短所を改善した。

本発明によれば、ＣＮＴまたはＣＮＴチップ上に置かれた標的バイオ物質を含む液相にそれぞれ電荷を印加できるように、少なくとも一つの伝導性ナノワイヤを介して電源に接続することができる。この際、伝導性ナノワイヤは従来技術を利用して単一原子で形成することができ（Ｋｏｕｗｅｎｈｏｖｅｎ，Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１８９６−９７，１９９７）、伝導性金属で一定のパターンを形成した上でイオン注入やスパッタリングを利用して電流が流れる導線を取り付けることができる。

本発明は、アミン基の露出された基質上にカルボキシル基の露出されたＣＮＴをアミド結合によって反復的に固定して得られた高密度ＣＮＴフィルム及び、前記ＣＮＴフィルム表面に存在する化学的な作用基とバイオリセプターとを化学的または物理化学的に結合させたバイオチップを提供するという効果がある。また、本発明は、基質上の所望位置にカルボキシル基の露出されたＣＮＴを積層して得られた高密度ＣＮＴパターンに、バイオリセプターを化学的に結合させたバイオチップを提供するという効果がある。

本発明によれば、カルボキシル基の露出されたＣＮＴパターン（またはフィルム）または前記カルボキシル基を多様な化学的な作用基で改質したＣＮＴパターン（またはフィルム）に、多様なバイオリセプターを化学的または物理化学的に結合させることで、様々な種類のＣＮＴ−バイオチップを作製することができる。また、ＣＮＴフィルムの表面に化学的な作用基が豊富で均一に存在していて、ＣＮＴフィルム表面に高密度で均一にバイオリセプターを結合させたＣＮＴ−バイオチップを作製することができ、ＣＮＴ表面の化学的な作用基は化学的機作によって望まれる多様な作用基により改質することができる。

特に、本発明に係るＣＮＴ−ＤＮＡチップを用いたＤＮＡ混成化反応の蛍光を測定するとき、不必要な信号を除去することで、極めて優れた結果を得ることができる。このようなＣＮＴ−ＤＮＡチップはゲノム分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）、突然変異検索（ｍｕｔａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）、病原性菌診断（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などに有用である。

以下に実施例を用いて本発明について詳細に説明する。これら実施例はただ本発明をより詳しく説明するためで、本発明の範囲がこれら実施例に制限されないということは当業界では通常の知識を有している者において明らかである。

カルボキシル基が露出されたＣＮＴの製造
本発明で用いられるＣＮＴは特に限定するのではなく、市販の製品を購入して用いることはもとより、通常の方法によって製造して用いることもできる。純粋なＣＮＴを本発明に用いるためにはＣＮＴの表面及び／または両末端をカルボキシル化する必要がある。

ＣＮＴを硝酸に浸して９０℃で４５時間還流させた上で遠心分離した。残余物を蒸留水で洗浄した後０．２μｍフィルターで濾過した。精製されたＣＮＴは酸溶液（硝酸と硫酸の混合溶液）が入っているソニケイターで１６時間還流させ、切断された。切断されたカルボキシル基が露出されたＣＮＴは０．１μｍフィルターで濾過して一定の大きさのＣＮＴを選別した。

アミン基が露出された基質の準備
本発明では、シリコーン、ガラス、溶融シリカ、プラスチック、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などの基質表面上にアミンアルキルオキシランで変形してアミン基を基質表面に露出させて使用したが、市販の、アミンで表面処理された基質を購入して使用することも可能である。

表面にカルボキシル基が露出された高密度ＣＮＴフィルムの製造
実施例１で準備したカルボキシル基が露出されたＣＮＴを、実施例２で準備したアミン基が露出された基質と反応させ、前記カルボキシル基と前記アミン基間のアミド結合によって基質上にＣＮＴ単層を形成した（図１（ａ））。

次に、基質にアミド結合で結合されたＣＮＴと、二重アミン作用基を有するジアミン系有機化合物とを反応させ、カルボキシル基が露出されたＣＮＴを、前記ジアミン系有機化合物の一側のアミン基と反応させて、アミド結合の形成によってＣＮＴを積層した（図１（ｂ））。

その次に、カルボキシル基が露出されたＣＮＴとジアミン係有機化合物との化学反応を反復的に行い、ＣＮＴ層と有機ジアミン層がｎ回交互に積層され、表面にカルボキシル基が露出された高密度ＣＮＴフィルムを製造した（図１（ｃ））。

本発明において、ジアミン系有機化合物としてはＨＮ_２−Ｒ_１−ＮＨ_２の化学式を有する物質を使用することができる。ここで、Ｒ_１はＣ_１−２０である飽和炭化水素類、不飽和炭化水素類または芳香族有機基である。

前記アミド結合を促進するために、カップリング剤としてＨＡＭＤＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，３−ジメチル−１，３−ジメチレンウロニウムヘキサフルオルリン酸），ＤＣＣ（１,３−ジシクロヘキシルカルボジミド），ＨＡＰＹＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１：３，３−ビス（テトラメチレン）ウロニウムヘキサフルオルリン酸）、ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１：３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオルリン酸），ＨＢＭＤＵ（Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，３−ジメチル−１，３−ジメチレンウロニウムヘキサフルオルリン酸）、ＨＢＴＵ（Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）などを使用することが好ましく、ベースとしてＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、ＴＭＰ（２，４，６−トリメチルピリジン）、ＮＭＩ（Ｎ−メチルイミダゾール）などを使用することが好ましい。

また、水を溶媒として使用する場合は、カップリング剤としてＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミン−プロピル）アルボジイミド塩酸塩）を使用し、カップリング剤の補助制としてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシイミド）、ＮＨＳＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）などを使用することが望ましい。

本実施例では、カップリング剤としてＨＡＴＵを使用し、ベースとしてＤＩＥＡを使用した。前記カップリング剤は、−ＣＯＯＨ作用基と−ＮＨ_２作用基とのアミド結合（−ＣＯＮＨ−）を促進する役目をし、前記ベースは、カップリング剤のアミド結合を形成する時にその効率を高める役割を果たす。

アミン基がパターン状に露出された基質及びそれを用いた高密度ＣＮＴパターンの形成
基質上にパターン状のアミン基を露出させるために２つの方法を使用することができる。第１方法は、シリコーン、ガラス、溶融シリカ、プラスチック、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などの基質上に高分子、フォトレジストまたは有機超分子パターンを形成した後、前記パターンをマスクとしてアミノアルキルオキシランを表面に固定してアミン基を基質表面にパターン状に露出させる方法であり、第２方法は、基質表面をアミノアルキルオキシランで処理した後、高分子、フォトレジストまたは有機超分子パターンを形成してアミン基を基質表面にパターン状に露出させる方法である。前記アミノアルキルオキシランとしてはアミノプロピルトリエトキシシランを使用することが好ましい。

前記アミン基がパターン状に露出された基質を利用して、前記実施例３と同様の方法を繰り返して、表面にカルボキシル基が露出された高密度ＣＮＴパターンを形成した。

前記カルボキシル基が露出されたＣＮＴパターンは、前記カルボキシル基と応じる化学的な作用基（アミン基、水酸基など）および、目的バイオリセプターが持つ作用基と結合する化学的な作用基（アミン基、水酸基、チオール期、アルテヒドギなど）を同時に有する化学物質を用いて改質することができる。前記改質に用いられる化学物質としては、Ｈ_２Ｎ−Ｒ_１−ＮＨ_２、Ｈ_２Ｎ−Ｒ_２−ＣＨＯ、Ｈ_２Ｎ−Ｒ_３−ＯＨ，Ｈ_２Ｎ−Ｒ_４−ＳＨまたはＨ_２Ｎ−Ｒ_５−Ｘであることを特徴とする。ここで、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４及びＲ_５は独立的にＣ_１−２０である飽和炭化水素類、不飽和炭化水素類または芳香族有機基であって、Ｘはハロゲン元素である。

ＣＮＴフィルムにＤＮＡを固定したＤＮＡチップの作製
実施例３で作製されたカルボキシル基が露出されたＣＮＴフィルムにＤＮＡのアミン基を結合させてＣＮＴ−ＤＮＡチップを作製した（図２）。本実施例では、前記カルボキシル基とアミン基とのアミド結合のためにカップリング剤としてＥＤＣを使用し、ベースとしてＮＨＳを使用した。また、本実施例では、末端にアミン基を有する下記配列１のオリゴヌクレオチドを使用してＣＮＴ−ＤＮＡチップを作製した。

配列１：５’−ＴＧＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧ−３’

ＣＮＴフィルム上のＤＮＡの存在は、すべてのＤＮＡがリン酸基を含有している点を利用して、リン原子に対するＸＰＳ（Ｘ‐ｒａｙｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｅ）スペクトラムによって確認された（図４）。図４に示すように、ＸＰＳ表面分析からリンが検出され、これからＣＮＴ表面にＤＮＡが結合されていることが確認された。

本実施例ではまた、実施例３で作製された、アミン基が露出されたＣＮＴフィルムにＤＮＡのカルボキシル基を結合してＣＮＴ−ＤＮＡチップを作製した（図３）。本実施例では、前記カルボキシル基とアミン基のアミド結合のためにカップリング剤としてＥＤＣを使用し、カップリング剤の補助制としてＮＨＳを使用した。また、本実施例では、末端にカルボキシル基を持つ前記配列１のオリゴヌクレオチドを使用してＣＮＴ−ＤＮＡチップを作製した。

ＣＮＴパターンにＤＮＡを固定したＤＮＡチップの作製
本実施例では、実施例４で作製されたカルボキシル基が露出されたＣＮＴパターンにＤＮＡのアミン基を結合させてＤＮＡチップを作製した（図２）。他の方法として、実施例４で作製されたカルボキシル基が露出されたＣＮＴパターンを、両側にアミノ作用基を有するジアミン系有機化合物で改質してアミノ作用基を露出させた後、前記アミン基にＤＮＡのカルボキシル基を結合させてＤＮＡチップを作製することもできる（図３）。

ＣＮＴ−ＤＮＡチップを用いた混成化反応分析
実施例６で作製されたＤＮＡチップを混成化チェンバー（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｃｈａｍｂｅｒ）の中に置いた後、ＣＮＴが固定された部位に混成化溶液を落とし、その上部をカバースライドで覆った。この時、混成化溶液は、３２μｌの相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチドを有する溶液に入れ、最終濃度３ＸＳＳＣ（０．４５ＭＮａＣｌ、０．０４５Ｍクエン酸ナトリウム）及び０．３％のＳＤＳ（ドデジル硫酸ナトリウム）になるように作って、総容積を４０μｌとした。前記相補的なオリゴヌクレオチド塩基配列は、末端にＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）が付着された下記配列２を使用した。

配列２：５’‐ＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＡＧＧＴＧＧＣＡＣＡ‐３’

二つのオリゴヌクレオチド筋の非特異的結合を除去するために、この溶液を１００℃で２分間放置した後、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。混成化用チェンバー内での混成化溶液の乾燥を防止するために、チェンバー両側の凹んでいるところに３ＸＳＳＣ（０．４５ＭＮａＣｌ、０．０４５Ｍクエン酸ナトリウム）を３０μｌずつ入れた後、チェンバー蓋を閉じ５５℃恒温槽で１０時間混成化した。

混成化反応は、配列２のオリゴヌクレオチド末端にラベリングされているＦＩＴＣを用いた蛍光イメージを用いて検出した。蛍光イメージは、スキャンアレイ５０００（ＳｃａｎＡｒｒａｙ５０００ＰａｃｋａｒｄＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，ＢｉｏＣｈｉｐＴｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓＬＬＣ）共焦点微細顕微鏡とクォントアレイ・マイクロアレイ分析プログラム（ＱｕａｎｔＡｒｒａｙＭｉｃｒｏａｒｒａｙＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅ）を利用して得た（図５）。図５の、（ａ）はＤＮＡを結合させる前の、カルボキシル基が露出されたＣＮＴが高密度に固定された基質の蛍光イメージを示す図であり、（ｂ）は相補的なＤＮＡで混成化した場合の蛍光検出結果を示す図であり、（ｃ）は相補的ではないＤＮＡで混成化した場合の蛍光検出結果を示す図である。前記ＣＮＴ−ＤＮＡチップに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを混成化反応させた時の蛍光が鮮やかで均一に示されるのが確認された。｛図５（ｂ）｝。しかし、オリゴヌクレオチドが固定されてないＣＮＴパターンである場合｛図５（ａ）｝と、前記ＣＮＴ−ＤＮＡチップに、相補的ではない塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを混成化した場合｛図５（ｃ）｝とには、全く蛍光が示されなかった。この結果から非特異的な反応がほとんど起こらないことが確認された。

また、実施例５で作製されたＣＮＴ−ＤＮＡチップを用いて前記と同様の混成化反応を行った（図６）。図６（ａ）はＤＮＡを結合させる前の高密度ＣＮＴフィルムの蛍光イメージを示す図であり、図６（ｂ）の（１）は相補的なＤＮＡで混成化した場合の蛍光検出結果であり、（２）は相補的ではないＤＮＡで混成化した場合の蛍光検出結果を示す図である。ＣＮＴフィルムに結合されたオリゴヌクレオチドに、相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを混成化反応させた場合には、蛍光が鮮やかで均一に示されることが確認された｛図６（ｂ）の（１）｝。しかし、オリゴヌクレオチドが固定されていないＣＮＴフィルムである場合｛図６（ａ）｝と、ＣＮＴフィルムに結合されたオリゴヌクレオチドに、相補的ではない塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを混成化した場合｛図６（ｂ）の（２）｝とには、全く蛍光が示されないことが確認された。この結果から非特異的反応がほとんど起らないことが確認された。

本実施例ではまた、実施例５で作製されたＣＮＴ−ＤＮＡチップを用いて上記のように同一の混成化反応を行った（図７）。図７の（ａ）は相補的なＤＮＡで混成化した場合の蛍光検出結果を示す図であり、（ｂ）は相補的ではないＤＮＡで混成化した場合の蛍光検出結果を示す図である。図７に示すように、混成化されたものと混成化されてないものとを確実に区別することができた。

アミン基が露出された基質上に、カルボキシル基が露出されたＣＮＴをアミド化反応で積層して高密度ＣＮＴフィルムを製造することを示す概略図である。カルボキシル基が露出されたＣＮＴパターン、またはフィルムにアミン基を有するＤＮＡを結合させて作製したＣＮＴ−ＤＮＡチップに、相補的なＤＮＡが加水分解されることを示す図である。カルボキシル基が露出されたＣＮＴパターン、またはフィルムをアミン基で改質した後、カルボキシル末端基を有するＤＮＡを結合させて作製したＣＮＴ−ＤＮＡチップに、相補的なＤＮＡが加水分解されることを示す図である。ＤＮＡが化学的に結合されたＣＮＴパターン、またはフィルム表面のリンに対するＸＰＳスペクトラムである。高密度ＣＮＴパターンにＤＮＡを固定したＤＮＡチップを用いた混成化反応結果を示す図であって、（ａ）はＤＮＡを結合する前の、カルボキシル基が露出されたＣＮＴが高密度に固定された基質の蛍光イメージを示す図であり、（ｂ）は相補的なＤＮＡで混成化した場合の蛍光検出結果を示す図であり、（ｃ）は相補的ではないＤＮＡで混成化した場合の蛍光検出結果を示す図である。高密度ＣＮＴフィルムにＤＮＡを固定したＤＮＡチップを用いた混成化反応結果を示す図であって、（ａ）はＤＮＡを結合する前の高密度ＣＮＴフィルムに対する蛍光イメージを示す図であり、（ｂ）は混成化したものに対する蛍光検出結果を示す図であり、（１）は相補的なＤＮＡで混成化した場合を示し、（２）は相補的ではないＤＮＡで混成化反応した場合を示す。アミン基で改質された高密度ＣＮＴフィルムに、ＤＮＡを固定したＤＮＡチップを用いた混成化反応結果を示す図であって、（ａ）は相補的なＤＮＡを混成化した場合の蛍光検出結果を示す図であり、（ｂ）は相補的ではないＤＮＡを混成化した場合の蛍光検出結果を示す図である。

Claims

表面にアミン基、アルデヒド基、水酸基、チオール基及びハロゲンからなる群から選ばれた化学的な作用基が露出された高密度ＣＮＴフィルムまたはパターンに前記化学的な作用基と結合する作用基を有するバイオリセプターを化学的または物理化学的に結合させることを特徴とするCNT−バイオチップの製造方法であって、
（ａ）〈１〉基質をアミノアルキルオキシシランで処理して得られる表面にアミン基が露出された基質；〈２〉基質をアミノアルキルオキシシランで処理して得られる表面にアミン基が露出された基質にフォトレジストパターンまたは有機超分子パターンを形成して得られる、アミン基がパターン状に露出された基質；または〈３〉基質上にフォトレジストパターンまたは有機超分子パターンを形成した上で、アミノアルキルオキシシランで処理して得られる、アミン基がパターン状に露出された基質と、
カルボキシル基が露出されたＣＮＴを反応させ、前記アミン基と前記カルボキシル基間のアミド化反応によって基質表面にＣＮＴ単層または単層パターンを形成する段階、
（ｂ）前記ＣＮＴ単層または単層パターンと両末端にアミン基を有する有機化合物を反応させて前記ＣＮＴ単層上に有機アミン基を形成し、前記有機アミンとカルボキシル基が露出されたＣＮＴとを反応させてＣＮＴを積層する段階、
（ｃ）前記（ｂ）段階をｎ回繰り返してＣＮＴ層と有機アミン基とをｎ回交互に積層して、カルボキシル基が露出された、反複的に積層して高い表面密度を有する高密度のＣＮＴフィルムまたはパターンを形成する段階および、
（ｄ）前記カルボキシル基が露出された高密度ＣＮＴフィルムまたはパターンをH₂N-R₁-NH₂、H₂N-R₂-CHO、H₂N-R₃-OH、H₂N-R₄-SH及びH₂N-R₅-X（ここで、R₁、R₂、R₃、R₄及びR₅は独立的にC_1-20である飽和炭化水素類、不飽和炭化水素類または芳香族有機基であって、Xはハロゲン元素である）からなる群より選ばれる化学物質で改質する段階、及び
（ｅ）前記アミン基、アルデヒド基、水酸基、チオール基、及びハロゲンからなる群から選ばれた化学的な作用基が露出された高密度ＣＮＴフィルムまたはパターンに前記化学的な作用基と結合する作用基を有するバイオリセプターを化学的または物理化学的に結合させる段階を含み；
基質はシリコン、ガラス、溶融シリカ、プラスチックおよびポリジメチルシロキサンからなる群から選択された材質であることを特徴とする製造方法。
請求項１に記載の方法によって製造され、アミン基、アルデヒド基、水酸基、チオール基及びハロゲンからなる群から選ばれた化学的な作用基が露出された高密度ＣＮＴフィルムまたはパターンに前記化学的な作用基と結合する作用基を有するバイオリセプターを化学的または物理化学的な結合によって付着させることを特徴とするＣＮＴ−バイオチップ。
バイオリセプターは酵素基質、リガンド、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＡＮ、ＰＮＡ、脂質、または炭水化物であることを特徴とする請求項２に記載の製造ＣＮＴ−バイオチップ。
バイオリセプターはＤＮＡであることを特徴とする請求項３に記載の製造ＣＮＴ−バイオチップ。
請求項４に記載のＣＮＴ−バイオチップを用いることを特徴とするＤＮＡ混成化反応の検出方法。