JP4951773B2 - マスクメロンＣｕｃｕｍｉｓＭｅｌｏヒドロペルオキシドリアーゼ及びその使用 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、９−ヒドロペルオキシド基質に対する活性を有し、かつマスクメロン（Cucumis melo）中に存在する脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子に関する。また本発明はヒドロペルオキシドリアーゼを発現するための措置及び有機合成の分野においてリアーゼを使用する方法に関する。
【０００２】
背景技術
植物は特定の植物の特徴的なフレーバー及び臭いをもたらす種々の揮発性化合物を産生する。リノール酸及びリノレン酸のような不飽和脂肪酸はフレーバー化合物、例えばｎ−ヘキサナール、ヘキサン−１−オール、２（Ｅ）−ヘキセン−１−アール、２（Ｅ）−ヘキセン−１−オール、３（Ｚ）−ヘキセン−１−アール、３（Ｚ）−ヘキセン−１−オール（ピポールとしても知られる）、３−（Ｚ）−ノネナール、（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナール、３−（Ｚ）−ノネノール、（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエノール、２−（Ｅ）−ノネナール、（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエナール、２−（Ｅ）−ノネノール及び（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエノールの前駆体である。これらの化合物はフレーバー、特に果実フレーバーにおいて広範に使用され、かつ果実香気に関する香気工場によって使用される。これらのフレーバー化合物に対する需要は伝統的な起源からのそれらの供給を超えて成長しており、従ってこれらの材料を得るための代替の天然の経路を見いだす調査に努力が注がれている。
【０００３】
これらのフレーバー化合物の合成は遊離の（多不飽和）脂肪酸、例えばリノール酸（９（Ｚ），１２（Ｚ）−オクタデカジエン酸）及びα−リノレン酸（９（Ｚ），１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカトリエン酸）から出発する。天然では、これらの酸は細胞障害後に脂肪分解性酵素によって細胞膜から放出される。脂肪酸ヒドロペルオキシドはリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）の作用によって形成され、引き続きヒドロペルオキシドリアーゼによって分解されて、ω−オキソ酸と一緒にＣ６〜９−揮発性フレーバー化合物が得られる。１３−ヒドロペルオキシドの分解によってヘキサナール及び（３Ｚ）−ヘキサナールを含むＣ６−化合物が得られ、かつ９−ヒドロペルオキシドの分解によってＣ９−化合物、（３Ｚ）−ノネナール及び（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナールが得られる。イソメラーゼの存在下に、これらのアルデヒドは（２Ｅ）−エナールに異性体化される。更にアルコールデヒドロゲナーゼは該アルデヒドをそれらの相応のアルコールに変換することができる。
【０００４】
ＨＰＬ酵素は研究が難しいことが判明している。それというのも該酵素は膜に結合し、かつ植物組織中に少量のみ存在するからである。ＨＰＬ酵素はその基質特異性によって１３−ＨＰＬ又は９−ＨＰＬとして特徴付けられている。１３−ＨＰＬ酵素は最初はバナナ果実中で同定され（Tressl and Drawert, 1973）、かつ引き続きスイカ幼植物（Vick and Zimmerman, 1976）、リンゴ及びトマト果実（Schreier and Lorenz, 1982）、トマト葉（Fauconnier et al., 1997）、キュウリ幼植物（Matsui, et al, 1989）及びダイズ幼植物（Olias et al., 1990）を含む種々の多くの植物マテリアルにおいて研究された。１３−ＨＰＬ酵素は茶葉（Matsui et al., 1991）及び、より最近では青ピーマン果実（Shibata et al., 1995）、トマト葉（Fauconnier et al., 1997）、ヒマワリ（Itoh and Vick,1999）、グァバ（ＰＣＴ出願、国際公開第９９５８６４８号明細書）及びバナナ（欧州特許出願、文献番号ＥＰ０８０１１３３Ａ２）から精製されている。９−ヒドロペルオキシド特異的ＨＰＬは洋ナシ（Kim and Grosch, 1981）中に同定されている。９−ヒドロペルオキシド及び１３−ヒドロペルオキシドの両方を分解する第３のタイプのＨＰＬの存在を示唆する研究がなされている（Matsui et al. 1989; Hornostaj and Robinson, 1998）。
【０００５】
リアーゼの粗製ソースは現在ではフレーバー及び香気の製造のための工業的方法で使用されている（例えば米国特許第５４６４７６１号明細書を参照のこと）。このプロセスにおいて、必要とされる基質の溶液は新鮮に製造されたダイズ粉をＬＯＸのソースとして使用してリノール酸又はリノレン酸（ヒマワリ及びアマニ油からそれぞれ得られる）から製造される。この溶液を次いで新鮮に製造された果実全体のピューレをＨＰＬの粗製ソースとして混合する。次いでアルデヒド生成物を蒸留によって単離する。アルコールが必要な場合には、新鮮なパン酵母をヒドロペルオキシド溶液に添加して、その後に果実ピューレと混合する。この酵母はＨＰＬによって形成されるようなアルデヒドを還元する活性なアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を有する。
【０００６】
この工業的プロセスには幾つかの欠点がある。第１の欠点は大量の新鮮な果実を必要とすることである。かかる必要量は、前記プロセスを新鮮な果実が廉価にかつ無料で手に入る国で行う必要があることを意味する。かかる場所が見つかったとしても、その利用は果実の成長時期に限定される。
【０００７】
第２の欠点は所望の酵素活性は使用されるソース中ではかなり希薄であるということである。このことは、比較的大量のダイズ粉、果実ピューレ及び酵母を該プロセスにおいて必要とすることを意味する。工業的生産のために必要な大量のこれらの粗製材料は達成できるフレーバー及び香気化合物の収率において物理的な制約がある。
【０００８】
第３の欠点は大量のバッチ工程であり、これはその性質によってＨＰＬの触媒活性が最大限に使用できず、比較的、研究所よりであり、かつ大量の残留有機物質をもたらす。残留有機物質は引き続きコンポストに輸送するか、又はさもなくば廃棄せねばならない。
【０００９】
本発明はマスクメロン９−ＨＰＬの起源に関連する制限及び欠点を、精製された及び組み換えのマスクメロン９−ＨＰＬタンパク質、核酸、発現系及びその使用方法を提供することによって克服している。
【００１０】
発明の要約
本発明は脂肪酸リアーゼ及び該リアーゼをコードする核酸を提供する。特に単離された脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼを開示しており、その際、９−ヒドロペルオキシド基質に対するリアーゼの活性は１３−ヒドロペルオキシド基質に対する活性よりも大きく、かつ９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＫｍ及びＶｍａｘは９−ヒドロペルオキシリノール酸に関するリアーゼのＫｍ及びＶｍａｘよりも大きい。より特に、本発明はメロン（Cucumis melo）中に存在するリアーゼ及び該リアーゼをコードする核酸を提供する。また本発明は本発明の核酸を有するベクター並びに組み換えリアーゼを得ることができる発現系を提供する。
【００１１】
また本発明は、（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸をＣ９−アルデヒド及びＣ９−オキソノナン酸に分解する方法並びに（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸又は（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸をＣ６−アルデヒド及びＣ１２−オキソカルボン酸に分解する方法を含む本発明のリアーゼを使用する方法を提供している。また、本発明は３−（Ｚ）−ノネナール、（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナール、２−（Ｅ）−ノネナール、（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエナール又はそれらの相応のアルコールを、（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸から製造する方法を提供する。
【００１２】
図面の簡単な説明
図１は、グァバ−ＨＰＬ、バナナ−ＨＰＬ、トウガラシ−ＨＰＬ、アラブ−ＡＯＳ、アマ−ＡＯＳ、グアユール−ＡＯＳ、メロンＡＯＳ、及びメロン９−ＨＰＬのための全長のアミノ酸配列を示しており、高い度合いの同一性を有する領域は暗色のボックスに示し、コンセンサス配列は“majority”としてラベルした。
【００１３】
図２ＡはメロンｃＤＮＡ及び他のＨＰＬ及びＡＯＳに基づく縮重プライマーが結合して、１５０ｂｐ及び７０ｂｐのメロンからクローニングされた生成物を生成する領域を示す図である。
【００１４】
図２Ｂはグァバ−ＨＰＬ、バナナ−ＨＰＬ、トウガラシ−ＨＰＬ、アラブ−ＡＯＳ、アマ−ＡＯＳ、グアユール−ＡＯＳからの部分アミノ酸配列のアラインメントを示している。ボックスで示した領域はＨＰＬ及びＡＯＳ間の高いホモロジーの領域を表している。
【００１５】
図３はメロンＨＰＬ及びＡＯＳの１５０ｂｐ及び７０ｂｐを得るために使用される縮重プライマーの配列を示している。
【００１６】
図４はメロンＨＰＬ及びＡＯＳの３つの異なる１５０ｂｐのクローンのアミノ酸配列のアラインメントを示している。クローンＡ及びクローンＢは６５％の同一性を有するが、一方でクローンＡ及びクローンＣは５７％の同一性を有し、かつクローンＢ及びクローンＣは７２％の同一性をアミノ酸配列において有する。
【００１７】
図５はメロンからのクローンＡ、クローンＢ及びクローンＣの３′末端によってコードされる部分アミノ酸配列及びグァバ、トウガラシ及びバナナからの１３−ＨＰＬ及びアマ、グアユール及びアラビドプシスからのＡＯＳのＣ末端配列の間の同一性を比較している。クローンＡ及びクローンＢによってコードされるＣ末端配列は４２％の同一性を有するが、クローンＡ及びクローンＣは４０％の同一性を有し、かつクローンＢ及びクローンＣは４９％の同一性を有する。
【００１８】
図６はメロン９−ＨＰＬの存在下での９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸の２つの一次酵素生成物：９−オキソノナン酸及び３Ｚ−ノネナールの図を示している。また示されているのは、３Ｚ−ノネナールの２Ｅ−ノネナールへのマイナーな異性体化反応であり、これは精製酵素又は粗製の細菌分解物のいずれかを使用して低い程度で観察されるものである。また示されているのは、粗製の細菌分解物によって惹起される酸化反応であり、それによって３Ｚ−ノネナールは酸化されて３種のアルデヒド、４−ヒドロキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＮＥ）及び４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＰＮＥ）及び９−オキソノナン酸及び４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナールの間で形成されるヘミアセタール誘導体（ヘミアセタール）の混合物にされる。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は以下の本発明の有利な態様の詳細な記載及びそこに含まれる実施例を参照してより容易に理解できる。
【００２０】
本発明を開示及び記載する前に、本発明は特定の方法又は特定の配合物に制限されるものではなく、勿論それ自体変化してよいものと解される。また本願で使用される述語は記載の特定の態様の目的のためのものであり、制限を意図するものではない。
【００２１】
本明細書及び請求の範囲で使用されるように、数量はそこで使用される内容に依存して１つ以上を意味することもある。
【００２２】
Ａ．タンパク質及び核酸
本発明は脂肪酸リアーゼ及び該リアーゼをコードする核酸を提供する。特に単離された脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼを開示しており、その際、９−ヒドロペルオキシド基質についてのリアーゼの活性は１３−ヒドロペルオキシド基質についての活性よりも大きく、かつリアーゼの９−ヒドロペルオキシリノレン酸についてのＫｍ及びＶｍａｘは９−ヒドロペルオキシリノール酸についてのリアーゼのＫｍ及びＶｍａｘよりも大きい。より特に、本発明はキュウリ（Cucumis sativus）ではなくメロン（Cucumis melo）中に存在するリアーゼ及びかかるポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸を提供する。このようにリアーゼはCucumis meloから単離されるタンパク質中に存在するアミノ酸配列を有するが、キュウリ（Cucumis sativus）から単離されたタンパク質中のアミノ酸配列を有さない。
【００２３】
用語“タンパク質”はアミノ酸のポリマーを示し、かつ全長のタンパク質及びポリペプチド及びその断片を含んでよい。本発明においては、“リアーゼ”は少なくとも１つのリアーゼ機能を有するタンパク質を意味する。
【００２４】
特に用語“９−ヒドロペルオキシドリアーゼ”、“９−ＨＰＬ”及び“機能的な９−ヒドロペルオキシドリアーゼ”は天然の９−ヒドロペルオキシドリアーゼによって展開される少なくとも１つの機能を有するリアーゼタンパク質を意味する。例えば、９−ＨＰＬ機能は脂肪酸９−ヒドロペルオキシドをＣ９−アルデヒド及びＣ９−オキソノナン酸に分解する触媒活性を含んでよい。更に、開示されたリアーゼは天然の９−ＨＰＬの以下の特性：抗原決定基、結合部位などを有してよい。
【００２５】
開示される９−ＨＰＬは１３−ヒドロペルオキシド基質よりもむしろ９−ヒドロペルオキシド基質に有利であるが、９−ＨＰＬ及び１３−ＨＰＬの両方の機能を有する。用語“１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ”、“１３−ＨＰＬ”及び“機能的な１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ”は天然の１３−ヒドロペルオキシドリアーゼによって展開される少なくとも１つの機能を有するリアーゼタンパク質を示している。例えば１３−ＨＰＬ機能は脂肪酸９−ヒドロペルオキシドをＣ６−アルデヒド及びＣ１２−ω−オキソ酸部に分解する触媒活性を含むことがある。更に開示されるリアーゼは天然の１３−ＨＰＬの以下の特性：抗原決定基、結合部位などを有してよい。
【００２６】
本願のリアーゼは、得られるタンパク質又はペプチドがリアーゼ機能、例えば有利なリアーゼ機能を保持する限りは、付加的なアミノ酸、例えばＮ−末端に結合されるアミノ酸又はＣ−末端に結合されるアミノ酸又はリアーゼ配列内に挿入されるアミノ酸を含む。更にリアーゼは、少なくとも１つのリアーゼ機能が保持される限りは、天然のリアーゼのアミノ酸配列に対してアミノ酸配列中に種々の突然変異を有してよい。より特に開示されるリアーゼは９−ヒドロペルオキシリノール酸基質（例えば（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸）、９−ヒドロペルオキシリノレン酸基質（例えば（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸）、１３−ヒドロキシリノール酸基質（例えば（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸）及び１３−ヒドロペルオキシリノレン酸基質（例えば（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸）を分解する。９−ヒドロペルオキシリノレン酸に関するリアーゼのＫｍ及びＶｍａｘは９−ヒドロペルオキシリノール酸に関するリアーゼのＫｍ及びＶｍａｘよりも大きい。
【００２７】
該リアーゼは種々の基質に対して特徴的な親和性を有する。該リアーゼは１３−ヒドロペルオキシド基質に対するより大きな親和性を有し、かつ９−ヒドロペルオキシド基質に対するリアーゼのＫｍは１３−ヒドロペルオキシド基質に対するよりも大きい。コンピュータ演算されたＫｍは以下の通りである：９−ヒドロペルオキシリノレン酸＞９−ヒドロペルオキシリノール酸＞１３−ヒドロペルオキシリノール酸。１３−ヒドロペルオキシリノール酸に対するリアーゼのＫｍは１３−ヒドロペルオキシリノレン酸に対する親和性とほぼ同一である。より特にコンピュータ演算された９−ヒドロペルオキシリノール酸に対するＫｍは１４２〜２４２としての９５％の信頼限界でほぼ１９２μＭであり、かつ約４５〜６０％、有利には約５４％の９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＫｍである。コンピュータ演算された１３−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するＫｍは４１〜５９としての９５％の信頼限界で５０μＭであり、かつ約１５〜３５％、有利には約２６％の９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＫｍである。コンピュータ演算された１３−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するＫｍは３７〜６５としての９５％の信頼限界で約５１μＭであり、かつ約１５〜３５％、有利には約２７％の９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＫｍである。
【００２８】
開示されたリアーゼは、おのおのの型の基質を特徴的な速度で分解する。該リアーゼは９−ヒドロペルオキシド基質とより迅速に反応し、かつ９−ヒドロペルオキシド基質の対するリアーゼのＶｍａｘは１３−ヒドロペルオキシド基質に対するＶｍａｘよりも大きい。本発明のリアーゼによる種々の基質の、Ｖｍａｘによって示される速度は以下の通りである：９−ヒドロペルオキシリノレン酸＞９−ヒドロペルオキシリノール酸＞１３−ヒドロペルオキシリノール酸。１３−ヒドロペルオキシリノール酸に対する分解速度は１３−ヒドロペルオキシリノレン酸に対する速度とほぼ同一である。より特に、９−ヒドロペルオキシリノール酸に対するリアーゼのＶｍａｘは９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＶｍａｘの約４５〜６０％、有利には約５５％である。１３−ヒドロペルオキシリノール酸に対するリアーゼのＶｍａｘは９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＶｍａｘの約２５〜３５％、有利には約３０％である。１３−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＶｍａｘは９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＶｍａｘの２０〜３０％、有利には約２２％である。“ほぼ同一”な速度又は親和性とは、１つの基質、例えば１３−ヒドロペルオキシリノレン酸に対する、９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対する速度又は親和性のパーセントとして表現される速度又は親和性を意味し、かつ第２の基質、例えば１３−ヒドロペルオキシリノール酸の、９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対する速度又は親和性のパーセンテージとして表現される１０％未満、有利には５％未満である。
【００２９】
開示されたリアーゼは約４５〜６５ｋＤａ、有利には約５０〜６０ｋＤａ、かつより有利には約５５ｋＤａの分子量を有する。開示されるリアーゼのために最適なｐＨは６より高い、有利には約６．５〜８．５、より有利には７．０〜８．０、より特に有利には７．２〜７．６である。該酵素は、ｐＨ５．０で最大活性の約２５％を有し、かつｐＨ９．０で最大活性の約１５％を有する。
【００３０】
開示されたリアーゼを単離する。リアーゼの単離は種々の方法で行うことができる。例えば該リアーゼは、起源、例えばCucumis meloから、標準的な生化学的手法を使用して精製でき、又は部分的に精製できる。例えばHornostaj and Robnson (1998)を参照のこと。選択的に、該リアーゼは当業者に公知のタンパク質合成法を使用して合成でき、又は組み換えＤＮＡ技術によってかつ遺伝子操作された発現系を使用して組み換え的に作成できる。合成された又は組み換え的に作成されたリアーゼはヒスチジンタグによって単離を促進できる。このように、組み換え的に作成されるリアーゼのための有利な単離方法はヒスチジン残基を結合するニッケルカラムの使用である。ヒスチジン残基を開示されたリアーゼのアミノ末端に付加して、タンパク質のためのタグとして作用させてよい。ヒスチジンタグ又は他のタグの使用は当業者によく知られている。
【００３１】
１つの態様において、開示されるリアーゼは図１に記載されるようなCucumis meloに独特なアミノ酸を有し、これらは１３−ヒドロペルオキシド基質よりも大きい活性で９−ヒドロペルオキシド基質を分解する活性を提供し、かつ９−ヒドロペルオキシリノレン酸よりも１．６倍未満の活性で９−ヒドロペルオキシリノール酸を分解する活性を提供する。
【００３２】
また本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質を提供する。配列番号１５のアミノ酸配列はアクセッション番号ＡＦ０８１９５５としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されている。
【００３３】
本発明は開示されるリアーゼをコードする単離された核酸を提供する。Cucumis meloからの９−ＨＰＬのｃＤＮＡはクローニングされ、かつ配列決定された（配列番号８）。Cucumis meloのｃＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列はまた開示されている（配列番号７）。１つの態様においては、該核酸は配列番号８に記載される核酸配列を有する。他の態様においては、該核酸は配列番号５６に記載される核酸配列を有する。配列番号５６の核酸配列はアクセッション番号ＡＦ０８１９５５としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されている。
【００３４】
更に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする単離された核酸が提供されている。組み換え系は原核細胞及び真核細胞の両方の発現系を含み、かつ天然のタンパク質配列を有するリアーゼ又は同様に天然配列から改変されたタンパク質配列を有するリアーゼの発現を含む。メロンの９−ＨＰＬのｃＤＮＡはクローニングされ、かつ配列決定され、かつ全長のｃＤＮＡに関するヌクレオチド配列は１４４６塩基対であると規定され（配列番号８）、これは停止コドンを含む。翻訳された配列は全体で４８１個のアミノ酸残基（配列番号７）をコードし、計算される約５５０００ダルトンの分子量を有するタンパク質に相当する。
【００３５】
図１に示されるように、誘導される全長のアミノ酸配列は幾つかのＨＰＬ及びアレン酸化物シンターゼ（ＡＯＳ）にある程度のホモロジー（同一性及び類似性）を示す。例えば開示されたアミノ酸配列及びグァバ、バナナ及びトウガラシの１３−ＨＰＬの間にある程度のホモロジーが存在する。また開示されたＨＰＬ及びＡＯＳ−アマ、ＡＯＳ−グアユール、ＡＯＳアラビ及びＡＯＳ−メロンの間にホモロジーが存在する。しかしながら、図１は、他のＨＰＬ及びＡＯＳと比較して独特な開示されたリアーゼのための領域が存在することを明確に示している。特にこれらの領域は９−ＨＰＬにとって独特であり、かつ更にこれらの領域はCucumis meloにとって独特である。
【００３６】
欠失及び挿入を考慮して、図１及び第１表におけるアラインメントはLasergene（Dnastar, Madison, Wisconsin）のMegAlignサブプログラムを通して利用できるＰＡＭ２５０残基質量チャートを用いるＣｌｕｓｔａｌ法を使用して、メロンの９−ＨＰＬアミノ酸配列がＡＯＳ−アマと約４５．７％の類似性を有し、ＡＯＳ−グアユールと約４６％の類似性を有し、ＡＯＳ−アラビと約４８．０％の類似性を有し、ＡＯＳ−メロンと約４７％の類似性を有し、ＨＰＬ−グァバと約６０％の類似性を有し、ＨＰＬ−バナナと約５８％の類似性を有し、かつＨＰＬ−トウガラシと約６０％の類似性を有することが判明した。
【００３７】
“類似性”は同一又は類似のいずれかのアミノ酸残基を含んでよい。類似のアミノ酸は第２表に示す。これらの類似性にもかかわらず、開示されたリアーゼの独特の領域が存在する。有利な独特な領域は配列番号１（ＭＡＴＰＳＳＳＳＰＥ）、配列番号２（ＩＬＦＤＴＡＫＶＥＫＲＮＩＬＤ）、配列番号３（ＲＬＦＬＳＦＬＡ）、配列番号４（ＳＩＳＤＳＭＳ）、配列番号５（ＬＬＳＤＧＴＰＤ）及び配列番号６（ＩＦＳＶＦＥＤＬＶＩ）に示される。これらの領域及び開示されたリアーゼとしての機能を有するタンパク質を提供する。特に有利な態様は、９−ＨＰＬ機能を保持する配列番号１〜６に示される前記の定義の領域の少なくとも１つを有するタンパク質である。より有利な態様は存在する配列番号１〜６に示される前記の定義の領域の少なくとも２つを有し、かつ９−ＨＰＬ機能を保持するタンパク質である。より有利な態様は存在する配列番号１〜６に示される前記の定義の領域の少なくとも３つを有し、かつ９−ＨＰＬ機能を保持するタンパク質である。より有利な態様は存在する配列番号１〜６に示される前記の定義の領域の少なくとも４つを有し、かつ９−ＨＰＬ機能を保持するタンパク質である。更により有利な態様は存在する配列番号１〜６に示される前記の定義の領域の少なくとも５つを有し、かつ９−ＨＰＬ機能を保持するタンパク質である。最も有利な態様は存在する配列番号１〜６に示される前記の定義の領域の少なくとも６つを有し、かつ９−ＨＰＬ機能を保持するタンパク質である。
【００３８】
【表１】
【００３９】
開示されるリアーゼは機能的変異体を含む。これらの変異体はアミノ酸置換、欠失及び挿入並びに翻訳後修飾をもたらすことによって作成される。かかる変異体はアレル変異体（例えば遺伝子多型のため）として天然に生じてよく、又はヒトの関与（例えばクローニングされたＤＮＡの突然変異誘発によって）、例えば誘発された欠失、挿入および置換の点突然変異によって作成されてよい。これらの改変はアミノ酸配列に変化をもたらし、サイレント突然変異をもたらし、制限部位を変更し、又はほかの特異的突然変異をもたらす。
【００４０】
アミノ酸配列の改変は３つのクラス：置換変異体、挿入変異体又は欠失変異体の１つ以上をもたらす。挿入はアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は通常、アミノ末端又はカルボキシル末端の融合のそれよりもより少ない、１〜４残基のオーダーである。欠失はタンパク質配列から１つ以上のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。典型的に約２〜６残基以下の残基がタンパク質分子内の任意の部位で欠失する。これらの変異体は通常、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発によって作成され、それによって変異体をコードするＤＮＡが作成され、かつ次いで組み換え細胞培養においてＤＮＡが発現される。公知の配列を有するＤＮＡ中の予め規定された部位において置換変異を作成するための技術はよく知られており、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発である。アミノ酸置換は典型的に単一の残基であるが、種々の部位に複数の置換を含んでよく；挿入は通常約１〜１０アミノ酸残基のオーダーであるが、それ以上であってもよく；かつ欠失は約１〜３０残基の範囲であるが、それ以上であってもよい。欠失又は挿入は有利には隣接のペア、すなわち２残基の欠失又は２残基の挿入でなされる。置換、欠失、挿入又は任意のそれらの組み合わせを最終構築物に到達するように組み合わせてよい。突然変異は読み枠の他の配列に位置してはならず、有利には二次的なｍＲＮＡ構造を生じうる相補的領域を作成しない。置換変異体は少なくとも１つの残基が除去され、かつ種々の残基がその場所に挿入された変異体である。かかる置換は一般に第２表に関連してなされ、かつ保存的置換と呼称される。
【００４１】
【表２】
【００４２】
【表３】
【００４３】
機能又は免疫学的同一性における置換変化は第２表での置換よりも保存性に乏しい置換を選択する、すなわち（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格、例えばシート又はヘリックスのコンホーメーションの構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性又は（ｃ）側鎖の嵩の保持におけるその効果がより大きく異なる残基を選択することによってなされる。一般にタンパク質特性に非常に大きな変化をもたらすと期待される置換は（ａ）親水性残基、例えばセリル又はトレオニルが疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル又はアラニルの代わりに（又はによって）置換され；（ｂ）システイン又はプロリンが任意の他の残基の代わりに（又はによって）置換され；（ｃ）正電荷の側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニル又はヒスチジルが負電荷の残基、例えばグルタミル又はアスパラギルの代わりに（又はによって）置換され；又は（ｄ）嵩高い側鎖、例えばフェニルアラニンが側鎖を有さない残基、例えばグリシンの代わりに（又はによって）、この場合に（ｅ）硫酸化及び／又はグリコシル化のための部位の数を増大させて置換される置換である。置換又は欠失の突然変異誘発を使用してＮ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）又はＯ−グリコシル化（Ｓｅｒ又はＴｈｒ）のための部位を挿入してよい。システイン又は他の反応性の残基の欠失も所望であってよい。潜在的なタンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失又は置換は、例えば塩基性残基の１つの欠失又は１つの残基のグルタミニル又はヒスチジル残基による置換によって達成される。
【００４４】
一定の翻訳後誘導体化は発現されたポリペプチドにおける組み換えホスト細胞の作用の結果である。グルタミニル及びアルパラギニル残基はしばしば翻訳後脱アミド化されて、相応のグルタミル及びアスパリル残基になる。選択的に、これらの残基は緩慢な酸性条件下に脱アミド化される。他の翻訳後修飾はプロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジンの側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Creighton,1983）、Ｎ−末端アミンのアセチル化及び幾つかの例においては、Ｃ−末端カルボキシルのアミド化を含む。
【００４５】
全ての突然変異現象において、突然変異の制御範囲は引き続いてのタンパク質が有する機能であると解される。最も有利な突然変異は変化を検出できないほど９−ＨＰＬ機能を変化させる突然変異である。例えば前記のように開示されたリアーゼが非常に特異的な動力学特性を有し、かつ有利な突然変異が９−ヒドロペルオキシド基質を有利に分解する突然変異された９−ＨＰＬをもたらす突然変異である。
【００４６】
開示されたリアーゼの相対的な機能を測定するための、ＨＰＬＣ分析、分光分析、ガスクロマトグラフィー分析、質量分光分析とのガスクロマトグラフィーを含む多くのアッセイが存在する。
【００４７】
また突然変異現象は、そのときに定義された方法で、例えば９−ヒドロペルオキシド基質の分解のＶｍａｘを増大させることによって活性を変更する突然変異を含んでよいと解される。これらの種類の突然変異が望まれるべき場合には、反応速度及び突然変異されたタンパク質の機能の緻密な分析は、天然のリアーゼより良好又は粗悪のいずれかで機能する突然変異リアーゼの単離を可能にする。有利な突然変異は９−ヒドロペルオキシド基質の分解に関するリアーゼの活性を増大させる突然変異である。
【００４８】
また与えられたタンパク質配列のための複数の核酸コドンが存在しうるように、核酸及びタンパク質の間の関係において縮重が存在すると解される。このようにCucumis meloから単離されたＤＮＡと同一の配列を有さないメロンのｃＤＮＡがCucumis meloから単離されたリアーゼの同一のアミノ酸配列をコードする。更にCucumis meloのｃＤＮＡの配列を変更することが望まれるが、Cucumis meloのタンパク質の独特のコーディングを維持する多くの理由が存在する。例えばｃＤＮＡ中に含まれ又は望まれる特異的な核酸制限酵素部位を挿入又は除去することが望まれることがある。
【００４９】
特に有利な態様は配列番号１から配列番号６に示される独特の領域と組み合わせて前記の非保存的アミノ酸を組み込む機能的変異体の両者を織り込んでいる。最も有利には配列番号７に示される配列を有するCucumis meloから単離される機能的な９−ＨＰＬである。
【００５０】
また本願に開示されるタンパク質をコードする核酸配列が開示される。これらの核酸は配列番号１から配列番号６に開示される独特のアミノ酸配列の少なくとも１つを有するタンパク質をコードする核酸配列を含む。これは残基で議論されたように、これらのタンパク質をコードする核酸に対する全ての縮重配列を含む。１つの態様は配列番号８に示されるCucumis meloから単離されたｃＤＮＡを表す核酸である。
【００５１】
また配列番号８の核酸とハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件下に特異的にハイブリダイズする単離された核酸が開示される。有利には配列番号８の核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸はストリンジェントな条件下にCucumis sativus中に存在するリアーゼをコードする核酸とハイブリダイズしない。最も有利には単離された核酸は９−ＨＰＬ機能を有するタンパク質をコードする。
【００５２】
“ストリンジェントな条件”はハイブリダイゼーション手順又はＰＣＲ反応におけるプライマー／鋳型ハイブリダイゼーションにおいて使用される洗浄条件を呼称する。一般にこれらの条件は、変性温度が調査されるハイブリッドの計算されたＴｍ（溶融温度／変性温度）より低い約５〜２０℃であるように選択された洗浄のための温度及び塩濃度の組み合わせであるべきである。該温度及び塩条件は、参照核酸を関連のプライマー核酸にハイブリダイズし、かつ異なる厳密性の条件下に増幅させる予備試験において経験的に容易に規定される。厳密条件は容易に試験され、かつ変更されたパラメータは当業者に容易に明らかにされる。例えばＰＣＲバッファー中で使用されるＭｇＣｌ２濃度を変更して、プライマーが鋳型に結合する特異性が増大するが、ハイブリダイゼーション反応で使用される該化合物の濃度範囲は狭く、従って適当な厳密性レベルは容易に規定される。例えば１８ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは６×ＳＳＰＥ中で推定されるＴｍの５〜１０℃未満で実施され、次いで２×ＳＳＰＥ中で同一の温度で洗浄される。かかるオリゴヌクレオチドのＴｍは各Ａ又はＴのヌクレオチドに関しては２℃を可能にし、かつ各Ｇ又はＣに関しては４℃を可能にすることによって見積もることができる。５０％のＧ＋Ｃの１８ヌクレオチドプローブは、従って約５４℃のＴｍを有する。同様に１８ヌクレオチドプライマー又はプローブの出発塩濃度は約１００〜２００ｍＭである。このようにかかる１８ヌクレオチドプライマー又はプローブのためのストリンジェントな条件は約５４℃のＴｍ及び約１５０ｍＭの出発塩濃度であり、かつ従って予備試験によって変更される。Ｔｍ値はまた市販されるコンピュータソフトウェア（例えばＯＬＩＧＯ（Ｒ））を使用して種々の条件に関して計算することができる。
【００５３】
更に本発明は配列番号７に記載されるメロンの９−ＨＰＬのアミノ酸配列をコードする核酸とハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件下に特異的にハイブリダイズする単離された核酸を提供する。有利には単離された核酸はストリンジェントな条件においてCucumis sativus中に存在するリアーゼをコードする核酸セットにハイブリダイズしない。最も有利には単離された核酸は９−ＨＰＬ機能を有するタンパク質をコードする。
【００５４】
有利には本発明の単離された核酸は、ハイブリダイズする配列と少なくとも９９、９８、９７、９５、９０、８５、８０、７５又は７０％の相補性を有する。より有利な態様は、ハイブリダイズする配列と少なくとも９０％の相補性を有する単離された核酸である。より有利な態様は、ハイブリダイズする配列と少なくとも８０％の相補性を有する単離された核酸である。より有利な態様は、ハイブリダイズする配列と少なくとも７０％の相補性を有する単離された核酸である。パーセントの相補性は、有利には２つのストランドのヌクレオチドとヌクレオチドとの比較に基づくものであってよい。相補性の測定のための特定の方法は当業者に公知である（例えばClustal, Jotun Hein, WilburLipman, Martinez Needleman-Wunsch, Lipman-Pearson, and Dotplot methods）。従って当業者はその用語の意味を理解し、２つの配列間の相補性を測定する方法を知っている。
【００５５】
また核酸は、例えばターゲット核酸を検出又は増幅するためのプローブ又はプライマーであってよい。典型的に、プライマー又はプローブとして有用な独特の核酸は配列の特定のヌクレオチド含量に依存して長さが少なくとも約２０ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドである。更に断片は、例えば約３０、４０、５０、７５、１００、２００、４００又はヌクレオチド長の間の任意の数であってよい。選択的に全長の配列又は全長の配列より長い配列を使用してよい。
【００５６】
Ｂ．ベクター
本発明は本発明の核酸を有するベクターを提供する。また本発明は、例えばCucumis meloから単離されたタンパク質中に存在するアミノ酸配列を有するリアーゼを含む９−ヒドロペルオキシドリアーゼをコードする核酸を有するベクターを提供する。より特に該ベクターはプラスミドであってよい。更により特にベクターは本発明の核酸の１つに機能的に結合したプロモーターを有してよい。
【００５７】
“ベクター”は外来ＤＮＡを有する任意の担体を意味する。従って、ベクターは外来核酸を分解せずに細胞中に輸送する原因物質であり、かつ移送される細胞中の核酸の発現をもたらすプロモーターを含む。“ベクター”は、しかしながらプラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミド及び人工染色体に制限されない。本発明の機能的なリアーゼの発現のために適当な原核性及び真核性の多様な発現ベクターを作成することができる。かかる発現ベクターは、例えばｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣ及び酵母ベクターを含む。該ベクターは、例えば多様なインビトロ及びインビボの状況において前記のリアーゼを発現することができる。
【００５８】
ウイルスベクターはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、ニューロン栄養ウイルス、シンドビスウイルス及び、ＨＩＶ骨格を有する前記のウイルスを含む他のＲＮＡウイルスを含む。またベクターとしての使用に適当にする前記のウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーが有利である。Verma（1985)に記載されるレトロウイルスはマウスマロネー白血病ウイルス、ＭＭＬＶ及びベクターとしてのＭＭＬＶの所望の特性を発現するレトロウイルスを含む。典型的にウイルスベクターは非構造的早期遺伝子、構造的後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製及びカプシド形成のために必要な逆反復末端及びウイルスゲノムの転写及び複製をコントロールするプロモーターを含む。ベクターとして加工される場合、ウイルスは典型的に１つ以上の早期遺伝子が除去され、かつ遺伝子又は遺伝子／プロモーターカセットは除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノム中に挿入される。
【００５９】
“プロモーター”は一般に転写開始部位に関して比較的固定された位置の場合に機能するＤＮＡの１つ以上の配列である。“プロモーター”はＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用のために必要なコアエレメントを含み、かつ上流エレメント及び応答エレメントを含んでよい。
【００６０】
“エンハンサー”は一般に転写開始部位から固定されない距離で機能するＤＮＡの配列を呼称し、かつ転写単位に対して５′（Laimins,1981）又は３′（Lusky et al., 1983）のいずれであってよい。更にエンハンサーはイントロン内（Banerji et al., 1983）並びにそのコーディング配列内（Osborne et al., 1984）であってよい。これらは通常は長さ１０〜３００ｂｐであり、かつシスで機能する。エンハンサーは近隣のプロモーターからの転写を増大するように機能する。プロモーターのようなエンハンサーは、またしばしば転写の調節を媒介する応答エレメントを有する。しばしばエンハンサーは発現の調節を規定する。プロモーター及び／又はエンハンサー領域が構成的プロモーター及び／又はエンハンサーとして作用して、転写されるべき転写単位の領域の発現を最大化することが有利である。
【００６１】
真核性の宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト又は有核細胞）中で使用される発現ベクターはまたｍＲＮＡ発現に影響することがある転写の終結のために必要な配列を有する。これらの領域は組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部位でポリアデニル化されたセグメントとして転写される。また３′非翻訳領域は転写終結部位も含む。また転写単位がポリアデニル化領域を有することも有利である。この領域の１つの利点は、転写された単位がｍＲＮＡのようにプロセシングされ、かつ輸送される見込みが増大することである。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの同定及び使用はよく確立されている。同種のポリアデニル化シグナルをトランスジーン構築物中で使用することが有利である。
【００６２】
ベクターはマーカー生成物をコードする核酸配列を含んでよい。このマーカー生成物を使用して、遺伝子が細胞に移送されたかを決定し、かつ移送されれば発現される。有利なマーカー遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ及び緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．ｃｏｌｉのｌａｃＺ遺伝子である。
【００６３】
いくつかの態様において、マーカーは選択可能なマーカーであってよい。かかる選択可能なマーカーを効率的に宿主細胞中に移送する場合に、形質転換された宿主細胞は、選択圧下にある場合には生存できる。選択の様式には２種の広範に使用される別個のカテゴリーが存在する。第１のカテゴリーは細胞の代謝に基づくものであり、かつ供給された培地に独立に増殖する能力を欠損した変異細胞系統の使用である。第２のカテゴリーは任意の細胞型で使用される選択様式と示され、かつ変異細胞系統の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームを使用して、典型的に宿主細胞の増殖を抑止する。新規の遺伝子を有するこれらの細胞は薬剤耐性を与えるタンパク質を発現し、かつ選択から生存する。かかる優性選択の例は薬剤のネオマイシン（Southern and Berg, 1982）、ミコフェノール酸（Mulligan and Berg, 1980）又はハイグロマイシン（Sugden et al., 1985）を使用する。
【００６４】
またリアーゼ又は本発明のタンパク質をコードする核酸を有する外来の核酸を有する細胞が開示される。有里な細胞は原核細胞である。特に有利な原核細胞はエシェリキア コリ細胞、バシラス細胞及びストレプトマイセス細胞である。これらの細菌は組み換えタンパク質を分泌する能力を有し、従ってタンパク質の単離のために細胞の溶解を必要としない。
【００６５】
リアーゼ又は本発明によるタンパク質をコードする核酸を有する外来の核酸を有する別の有利な細胞型は真核細胞である。特に有利な真核細胞は酵母細胞、植物細胞、及び昆虫細胞である。例えばピチア パストリス又はサッカロマイセス セレビシエは発現系として使用できる。ウイルスベクター、化学的なトランスフェクタント又は物理機械的方法、例えばエレクトロポレーション及びＤＮＡの直接的な拡散を含む外来のベクターでの細胞のトランスフェクションのための適当な措置は当業者に公知である。例えばWolff他及びWolff（Wolff et al.(1990) and Wolff(1991)）を参照のこと、これらは引用されることにより内容が記載されたものとする。トランスフェクションされた細胞を本発明のタンパク質及びリアーゼの発現のための方法として使用できる。
【００６６】
多くの異なる戦略を使用して、本発明のタンパク質又はリアーゼの発現を最適化することができる。種々のエンハンサーは宿主細胞型、ベクター及びプロモーターに基づいて選択される。例えばイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）をＰｌａｃプロモーター及びＰｌａｃプロモーターの誘導体を、Ｅ．ｃｏｌｉが宿主の場合にはインデューサーとして使用してよい。ＩＰＴＧのインデューサー濃度は０〜１ｍＭの範囲である。選択的にＬ−アラビノースによって誘導されるプロモーターを有するｐＢＡＤベクターをＥ．ｃｏｌｉにおいて使用できる。宿主細胞型、ベクター、プロモーター、誘導時間、培地組成、温度、コファクター、培養条件及び培養時間を変更して発現を最適化してよい。更にヘム（例えばδ−アミノレブリン酸を含む）のような補欠分子群の前駆体の添加によって発現を最適化することができる。
【００６７】
Ｃ．該組成物の使用方法
（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）−９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸をＣ９−アルデヒド及びＣ９−オキソノナン酸に分解するにあたり、開示されたリアーゼと（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）−９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸と接触させる工程を有する方法が開示される。（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸が基質である場合にはＣ９−アルデヒドは３Ｚ−ノネナールである。（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）−９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸が基質である場合には、Ｃ９−アルデヒドは３Ｚ，６Ｚ−ノナジエナールである。
【００６８】
また（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸又は（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸をＣ６−アルデヒド及びＣ１２−オキソカルボン酸に分解するにあたり、開示されたリアーゼを１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸又は１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸と接触させることを含む方法が開示される。
【００６９】
また３−（Ｚ）−ノネナール、（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナール、２−（Ｅ）−ノネナール、（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエナール又はそれらの相応のアルコールを（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸から製造するにあたり、（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸を開示された９−ＨＰＬと接触させ、それによって（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸を３−（Ｚ）−ノネナールに変換し、又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）−９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸を（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナールに変換し；かつ３−（Ｚ）−ノネナール又は（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナールを回収し；３−（Ｚ）−ノネナールを３−（Ｚ）−ノネノールに還元し、又は（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナールを（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエノールに還元し、かつ３−（Ｚ）−ノネノール又は（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエノールを回収し；又は３−（Ｚ）−ノネナール又は（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナールを、２−（Ｅ）−ノネナール又は（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエナールを得るのに効率的な温度及びｐＨ条件下に異性体化し、かつ形成された２−（Ｅ）−ノネナール又は（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエナールを回収し、又は２−（Ｅ）−ノネナールを２−（Ｅ）−ノネノールに還元し、又は（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエナールを（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエノールに還元し、かつ２−（Ｅ）−ノネノール又は（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエノールを培地から回収することを含む方法が開示されている。還元工程は有利には当業者に公知の技術を使用して酵母によって媒介される酵素触媒による還元（例えばアルコールデヒドロゲナーゼを使用する）を使用して行われる。例えばＥＰ０５９７０６９Ｂ１号を参照のこと、これは引用することにより内容が記載されたものとする。異性体化工程は酵素的な手順を使用して最適化することができる。異性体化はイソメラーゼ又は非酵素的な異性体化因子によって触媒できる。例えばイソメラーゼは３Ｚ：２Ｅ−エナールイソメラーゼであってよい。例えばNoordermeer他（Noordermeer et al）を参照のこと、これは引用することにより内容が記載されたものとする。
【００７０】
またｎ−ヘキサナール、３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アール、２−（Ｅ）−ヘキセン−１−アール又はそれらの相応のアルコールを、（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸又は（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）−１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸から製造するにあたり、（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸又は（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸を開示された９−ＨＰＬと接触させ、それにより（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸をｎ−ヘキサナールに変換し、又は（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸を３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アールに変換し；かつｎ−ヘキサナール又は３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アールを回収し；ｎ−ヘキサナールをｎ−ヘキサノールに還元し、又は３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アールを３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オールに還元し、かつヘキサノール又は３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オールを回収する；又は３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アールを、２−（Ｅ）−ヘキセン−１−アールを得るのに効率的な温度及びｐＨ条件下に異性体化し、かつ形成された２−（Ｅ）−ヘキセン−１−アールを回収し、又は２−（Ｅ）−ヘキセン−１−アールを２−（Ｅ）−ヘキセン−１−オールに還元しかつ２−（Ｅ）−ヘキセン−１−オールを培地から回収する工程を含む方法が開示される。還元工程は有利には前記の酵素触媒による還元を使用して行われ、かつ異性体工程は前記の酵素的な手順を使用して最適化できる。
【００７１】
本発明を以下の実施例でより特に記載し、これらは多くの変法及び変形が当業者に明らかなので説明を意図しているにすぎない。
【００７２】
実施例
例１． ９−ヒドロペルオキシドリアーゼを含むメロンリアーゼの部分的なｃＤＮＡのクローニング
ホモロジーに基づいたクローニング方法を使用してマスクメロン（Cucumis melo）を単離した。一般にメロンのｍＲＮＡを調製し、リバーストランスクリプターゼを使用してメロンのｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。このｃＤＮＡはシトクロムＰ４５０ファミリー７４（ＣＹＰ７４）におけるコンセンサス配列に適合するようにデザインされた縮重プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のための基質であった。このＰＣＲはＣＹＰ７４遺伝子ファミリーと配列ホモロジーを有する部分的なｃＤＮＡクローンを提供する。部分的クローンは３′−ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）及び５′−ＲＡＣＥの反応によって伸長され、これはそれぞれの部分的なクローンのための完全なｃＤＮＡ（すなわちｍＲＮＡの完全体）をもたらす。全長のｃＤＮＡをＰＣＲによってクローニングし、かつＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉが発現する生成物の触媒活性を基質としての９−ヒドロペルオキシ及び１３−ヒドロペルオキシ脂肪酸を使用して特徴付けた。
【００７３】
メロンのＲＮＡの調製
出発材料は様々なカンタループメロン（“マスクメロン”）、Cucumis melo、Caravelle（Asgrow,Texas）であった。TRI REAGENTキット（Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio）を使用して全体のＲＮＡを単離した。全体のＲＮＡを未熟なメロン果実２０ｇから調製した。４００μｇの全体のＲＮＡが得られた。ｍＲＮＡ精製キット（Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey）を使用して全体のＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。該キットはポリアデニル化されたＲＮＡのアフィニティー精製のためのオリゴ（ｄＴ）−セルローススピンカラムを提供する。製造元のプロトコールに従った。３．７μｇのｍＲＮＡが４００μｇの全体のＲＮＡから単離された。
【００７４】
Ｂ． 保存されたＣＹＰ７４配列に基づく縮重プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲクローニング
第１のストランドのｃＤＮＡを全体のＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ＲＮＡからオリゴｄ（Ｔ）−アダプターを使用して合成された。リバーストランスクリプターゼ反応は８０ピコモルのオリゴ−ｄＴアダプター（配列番号４９，Ａ１６７８，５′−ＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３′又は配列番号５０，Ａ１６７７，５′−ＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣ−３′）、１０μｌの５×の第１ストランドバッファー（GibcoBRL, Rockville, Maryland）、１ｍＭのＤＴＴ、各ｄＮＴＰに関して１ｍＭ、５０単位のＲＮＡｓｉｎ、４００ＵのＭＭＶ−ＲＴ及びＨ２Ｏを有し、最終反応容量５０μｌにした。このＲＴ反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。第１ストランドｃＤＮＡをさらなる精製をせずにＰＣＲ反応で直接使用した。ＰＣＲ反応物は２０〜１００ｎｇのメロンのｃＤＮＡ鋳型、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ピコモルの上流プライマー（ＧＧＴＧＡＧＴＴＧＣＴＮＴＧＹＧＧＮＴＡＹＣＡ（配列番号１６）、ＧＧＴＧＡＧＴＴＧＣＴＮＴＧＹＧＧＮＴＡ（配列番号１７）又はＴＡＣＴＧＧＴＣＮＡＡＹＧＧＮＣＣＮＳＡＲＡＣ（配列番号１９））及び２０ピコモルの下流プライマー（ＴＧＧＴＣＮＡＡＹＧＧＮＣＣＲＧＡＧＡＣ（配列番号１８）、ＡＡＹＡＡＲＣＡＲＴＧＹＧＣＮＧＣＴＡＡＧＧＡＣ（配列番号２０）又はＡＡＲＣＡＲＴＧＹＧＣＮＧＣＴＡＡＧＧＡＣ（配列番号２１））（図２及び図３を参照のこと）を含有した。更にＰＣＲ反応物は１．２５単位の酵素及びＨ２Ｏを有し、最終反応容量５０μｌを有した。ｃＤＮＡ鋳型を反応温度が８０℃の時に添加した。反応サイクルパラメーターは９４℃で２分（サイクル１だけ）；５７℃〜６２℃で１分間、７２℃で１分間、９４℃で１分間（典型的に３０サイクル）及び７２℃で１０分間（最終サイクル）であった。反応条件は全ての反応に関して同一であるが、２種の異なるＤＮＡポリメラーゼを使用した：（１）AmpliTaqＤＮＡポリメラーゼ（PE Applied Biosystems, Focter City, CA）及び（２）AdvanTaq（Advantage cDNA Polymerase Mix(Clontech, Palo Alto, CA））。
【００７５】
ｉ．１５０ｂｐのｃＤＮＡ断片の増幅
単一サイクルのＰＣＲを鋳型としてメロンのｃＤＮＡを使用して実施した。上流縮重プライマー（配列番号１６、プライマー１Ａ、図２及び図３）を下流縮重プライマー（配列番号１８、プライマー２、図２及び図３）と一緒に使用したが、第１のＰＣＲではバンドは得られなかった。従って第２のＰＣＲを０．１μｌの第１回のＰＣＲ反応生成物を鋳型として使用して、かつ上流縮重プライマー１Ｂ（配列番号１７、図２及び図３）をネスト型上流プライマーとして使用して実施した。
【００７６】
第２のＰＣＲはアガロースゲル中で唯一のバンド（１５０ｂｐ）として移行する生成物を精製した。１５０ｂｐのＰＣＲ生成物は期待されたＣｙｐ７４遺伝子ファミリー生成物にサイズでは匹敵するものである。
【００７７】
１５０ｂｐ生成物をベクター（pCR2.1 Invitrogen, Carlsbad, CA）中にサブクローニングし、かつ約５０個のクローンの配列決定をした。３種の異なるＰ４５０関連の配列が得られ（図４）、これらを部分的なクローンＡ（配列番号２８）、クローンＢ（配列番号２９）及びクローンＣ（配列番号３０）と呼称した。部分的なクローンＡ及びクローンＢは６５％の同一性ホモロジーを有した；部分的なクローンＡ及びクローンＣは５７％の同一性ホモロジーを有した；かつ部分的なクローンＢ及びクローンＣは７２％の同一性ホモロジーを有した。
【００７８】
ｉｉ．７０ｂｐのｃＤＮＡ断片の増幅
単一サイクルのＰＣＲをメロンｃＤＮＡを鋳型として使用して実施した。上流縮重プライマー（配列番号１８、プライマー２、図２及び図３）を下流縮重プライマー（配列番号２０、プライマー４Ａ、図２及び図３）と一緒に使用した。アガロースゲル中に生成物のバンドは観察されなかった。従って第２のＰＣＲを０．１ｍｌの第１のＰＣＲを鋳型として使用して実施した。下流縮重プライマー、プライマー４Ｂ、（配列番号２１、図２及び図３）をネスト型下流プライマーとして使用した。この第２のＰＣＲはアガロースゲル中で約７０ｂｐの唯一のバンドとして移行する生成物を生成する。これは期待される生成物にサイズにおいて匹敵する。この７０ｂｐのバンドのサイズはアガロースゲル上では厳密に測定するのが困難なので、個々のクローン（４８個のクローン）を１０％のゲル上のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって較正のために１０ｂｐのＤＮＡラダーを使用してサイズを測定した。ＰＡＧＥは生成物（６０〜９０ｂｐ）の複合混合物が増幅されたことを示した。予測されたサイズに近い１２個のクローンの配列決定をした。これらのクローンの１つはＰ４５０の様な配列をコードしていた。この部分的なクローンは１５０ｂｐの部分的なクローンＢの種々の領域を表した。
【００７９】
例２． ３′−ＲＡＣＥ及び５′−ＲＡＣＥにより得られたプライマーを使用する全長クローンの作成
３′−ＲＡＣＥ（３′−ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）法はＰＣＲのための縮重上流プライマー及びｃＤＮＡの逆転写酵素で触媒される合成で使用されるプライマーの５′−末端でのアダプター配列に基づく下流プライマーを使用する。ｃＤＮＡを例１に記載のように調製した。
【００８０】
マラソンｃＤＮＡ増幅キット（Marathon cDNA Amplification Kit）（Clontech）を５′−ＲＡＣＥ（５′−ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）のために使用した。この手順をｍＲＮＡ（１μｇ）を二本鎖ｃＤＮＡに変換し、ｃＤＮＡ末端をアダプター配列カセットでタグするようにデザインした。プロトコールは製造元のプロトコールに従った。
【００８１】
Ａ．３′−ＲＡＣＥ
ｃＤＮＡを前記のように調製した。全体のＲＮＡの３種の調製を使用した：（１）メロンの多汁性の果肉及び固い皮の混合物から、（２）メロンの固い皮から、（３）メロンの多汁性の果肉から。クローンＡの遺伝子特異的上流プライマー（５′−ＧＧＴＴＡＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧ−３′（配列番号３４）又は５′−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＧＴＴＴＡＡＴＣＣＧ−３′（配列番号３５））、クローンＢ（５′−ＡＣＡＧＡＧＣＧＧＡＣＧＡＧＴＴＣＧＴＡＣＣＴ−３′（配列番号３６））又はクローンＣ（５′−ＡＧＧＡＴＴＣＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＧＴＧＧＧＣ−３′（配列番号３７））をオリゴｄＴ−アダプター配列に基づく下流プライマー（配列番号４９及び配列番号５０）と一緒に使用した。
【００８２】
クローンＢ及びクローンＣの全長クローンを単離するために、クローンＢのための遺伝子特異的プライマー（配列番号３６）及びクローンＣのための遺伝子特異的プライマー（配列番号３７）及びオリゴｄＴプライマーのアダプター配列に基づくプライマー（配列番号５０）を使用した。ＰＣＲをメロンの多汁性の果肉及び固い皮の混合物から単離されたＲＮＡから得られたｃＤＮＡ鋳型で開始した。これらのプライマーを使用するＰＣＲ反応は３５０ｂｐ（クローンＢ）の生成物及び５５０ｂｐの生成物（クローンＣ）を生成し、これらはアガロースゲル上で唯一のバンドとして移行する。
【００８３】
これらの３５０ｂｐ及び５５０ｂｐのＰＣＲ生成物はＡＯＳ及び１３−ＨＰＬのｃＤＮＡの３′−末端の増幅からの期待される生成物とサイズにおいて匹敵した。これらの生成物をｐＣＲ２．１中にサブクローニングし、かつ配列決定した。
【００８４】
クローンＡの全長のクローンを単離するために、ＰＣＲを多汁性の果肉又は固い皮のメロンｃＤＮＡ鋳型を用いて開始した。クローンＡのための遺伝子特異的上流プライマー（配列番号３４又は配列番号３５）及びオリゴｄＴアダプター配列に基づく下流プライマー（配列番号５０）を増幅のために使用した。ＰＣＲ反応を固い皮のメロンｃＤＮＡを用いて開始する場合にはアガロースゲル電気泳動で測定されるようにＰＣＲ生成物は得られなかった。ＰＣＲ反応を多汁性の果肉のメロンｃＤＮＡを用いて開始する場合には、しかしながらアガロースゲル上で唯一のバンドとして移行する２つのバンドが得られた。配列番号３４のヌクレオチド配列を有するプライマーで生成された生成物は４５０ｂｐであり、かつ配列番号３５のヌクレオチド配列を有するプライマーで生成された生成物は４００ｂｐであった。これらの２つのＰＣＲ生成物のサイズにおける差異（５０ｂｐ）は配列番号３４及び配列番号３５に相応する２種の上流プライマー間の期待される距離と一致した。
【００８５】
クローンＡから得られるプライマーから生成した４００ｂｐ及び４５０ｂｐのＰＣＲ生成物はＡＯＳ及び１３−ＨＰＬのｃＤＮＡの３′末端からの期待される生成物とサイズにおいて匹敵した。これらの生成物をｐＣＲ２．１中にサブクローニングし、かつ配列決定した。
【００８６】
図５はメロンからのクローンＡ、クローンＢ及びクローンＣによってコードされるアミノ酸配列のＣ−末端及びグァバ、トウガラシ及びバナナからの１３−ＨＰＬのＣ−末端配列及びアマ、グアユール及びアラビドプシスからのＡＯＳのＣ−末端配列の間の同一性を比較している。このアラインメントはクローンＡが１３−ＨＰＬ配列と最も高いホモロジーを有することを示している。クローンＢ及びクローンＣはＡＯＳと１３−ＨＰＬより高いホモロジーを有する。クローンＢはクローンＣよりもＡＯＳと類似しており、かつ従ってクローンＣはＡＯＳ又は１３−ＨＰＬのいずれかとは最も異なる。
【００８７】
Ｂ．５′−ＲＡＣＥ
全体のＲＮＡを前記のように多汁性のメロン果肉から調製した。５′−ＲＡＣＥのためのｃＤＮＡ合成はクロンテックの手順（Clontech procedue）（マラソンｃＤＮＡ増幅キット）を使用して達成された。プロトコールは製造元のプロトコールに従った。未熟なメロン果実からの１μｇのｍＲＮＡを使用した。第１のＰＣＲを、５′及び３′末端でマラソンアダプター配列でタグされたメロンｃＤＮＡを鋳型として使用して実施した。上流プライマーＡＰ１をクローンＡのための遺伝子特異的下流プライマー（５′−ＣＣＧＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＣＣＴＴＣ−３′（配列番号３９））、クローンＢのための遺伝子特異的下流プライマー（５′−ＣＴＧＡＡＣＣＧＡＣＣＧＣＧＡＣＴＧＴＧＴ−３′（配列番号４１））及びクローンＣのための遺伝子特異的下流プライマー（５′−ＴＣＣＧＣＧＴＣＧＧＣＴＣＣＡＣＴＧＴＣ−３′（配列番号４３））と一緒に使用した。アガロースゲル上で拡散した不鮮明なバンドとして移行する生成物は各クローンに関する第１のＰＣＲにおいて得られた。第２のＰＣＲを０．０５μｌの第１のＰＣＲ生成物を鋳型（５０μｌのＰＣＲ反応）として使用して実施した。上流プライマーはアダプターＡＰ２（マラソンｃＤＮＡ増幅キット）であり、かつ下流遺伝子特異的プライマーはクローンＡのためには５′−ＧＡＡＣＡＧＡＴＡＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣ−３′（配列番号４０）、クローンＢのためには５′−ＴＣＧＣＣＣＧＴＧＡＡＣＣＧＡＴＣＡＧＧＴＡ−３′（配列番号４２）又はクローンＣのためには５′−ＴＣＴＣＣＣＡＣＧＡＡＣＣＴＡＴＣＧＣＣＣＡ−３′（配列番号４４）であった。この第２のＰＣＲはクローンＡに関しては１０００ｂｐ生成物を、クローンＢに関しては１４００ｂｐ生成物を、かつクローンＣに関しては１２００ｂｐ生成物を生成した。１０００ｂｐ、１４００ｂｐ及び１２００ｂｐのＰＣＲ生成物はＡＯＳ及び１３−ＨＰＬのｃＤＮＡのサイズに基づく期待される生成物とサイズにおいて匹敵した。これらの生成物をベクター（ｐＣＲ２．１、インビトロゲン）中にサブクローニングし、かつ配列決定した。
【００８８】
クローンＢ及びクローンＣの５′−ＲＡＣＥ及び３′−ＲＡＣＥの生成物の配列決定の後に、遺伝子特異的プライマーをコーディング配列の推定される開始に相応し、かつ停止コドンに相応して合成した。クローンＢに関してはＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位（ユニーク部位）を、以下のプライマー５′−ＧＣＣＡＴ ＧＧＣＣＴＣＣＡＴＴＧＴＣＡＴＴＣＣＴＴＣ−３′（配列番号４５）（ＮｃｏＩ部位に下線及び下線のＡＴＧはＭｅｔをコードする）（５′−ｕｐ）及び５′−ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＡＡＡＣＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＡＧ−３′（配列番号４６）（ＥｃｏＲＩ部位に下線及び下線のＡＧＴコドンは停止コドンを表す）を使用してそれぞれ５′−末端及び３′−末端に組み込んだ。
【００８９】
クローンＣのために、ユニークなＮｄｅＩ及びＣｌａＩ制限部位を５′及び３′末端にそれぞれ、以下のプライマー５′−ＧＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣ−３′（配列番号４７）（ＮｄｅＩ部位に下線及び下線のＡＴＧはＭｅｔをコードする）（５′−ｕｐ）及び５′−ＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＴＡＧＴＣＡＴＴＡＧＣＴＴＴＡＡ−３′（配列番号４８）（ＣｌａＩ部位に下線及びＡＧＴは停止コドンである）（３′−ｄｏｗｎ）を使用して組み込んだ。ＮｃｏＩ部位はコーディング配列中に存在する。
【００９０】
ＰＣＲ反応を１μｇのｍＲＮＡ（前記の）から調製されたメロンｃＤＮＡ及び配列番号４５のヌクレオチド配列を有するプライマー及び配列番号４６のヌクレオチド配列を有するプライマー又は配列番号４７のヌクレオチド配列を有するプライマー及び配列番号４８のヌクレオチド配列を有するプライマーをプライマーとして使用して開始した。これらの反応のためのアニーリング温度は６０℃であり、クロンテックによるAdvantageｃＤＮＡポリメラーゼミックスを使用した。クローンＢに関する１．６ｋｂの生成物及びクローンＣに関する１．４ｋｂの生成物を増幅した。これらの生成物のそれぞれをベクター（ｐＣＲ２．１）中にサブクローニングし、かつ配列決定した。クローンＢのヌクレオチド配列は配列番号５１として提供され、かつクローンＣのヌクレオチド配列は配列番号７として提供される。
【００９１】
クローンＢの１．６ｋｂ生成物（図１において示されるメロンＡＯＳ、アミノ酸配列 配列番号５２を有する）配列番号５１及びクローンＣの１．４ｋｂ生成物（図１において示されるメロンＨＰＬ、配列番号７を有する）によってコードされる推定されるアミノ酸配列をアマ（配列番号５３）、グアユール（配列番号５４）及びアラビドプシス（配列番号５５）からのＡＯＳのアミノ酸配列並びにグァバ（配列番号３８）、バナナ（配列番号３３）及びトウガラシ（配列番号３２）からの１３−ＨＰＬのアミノ酸配列と比較した。配列の開始（５′末端によってコードされる）は長さ及びアミノ酸配列における相当の変化を含み、次いで全ての配列が収束し、かつ緊密な関連性を示すようになる。クローンＢは比較的短い５′末端を有するクローンＣと比較してより長い５′−ＲＡＣＥ生成物の根拠となる非常に長い５′末端を有する。
【００９２】
得られる３′末端の配列比較によって、クローンＡは公知の１３−ＨＰＬ酵素に最も類似している。クローンＢはメロンＡＯＳである。クローンＣは９−ヒドロペルオキシドリアーゼである。
【００９３】
例３．Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現
ｐＣＲ２．１中のクローンＢのｃＤＮＡをＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、かつ発現ベクタープラスミドｐＥＴ３ｄ（これもＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化した）中にサブクローニングした。ｐＣＲ２．１中のクローンＣのｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＣｌａＩで切断し、かつ発現ベクタープラスミドｐＥＴ３ｂ（これもＮｄｅＩ及びＣｌａＩで消化した）中にサブクローニングした。２つの異なる構築物を使用してＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、クローンＢ及びクローンＣの遺伝子産物を発現させる。これらの構築物は付加的なアミノ酸を有さない又は５′−末端の他の改変を有さない天然の植物の配列の細菌による発現をもたらす。
【００９４】
発現のために、形質転換されたＢＬ２１細胞を３７℃及び２８０ｒｐｍでＬＢ培地（３ｍｌ、トリプトン（１０ｇ）、酵母エキス（５ｇ）及びＮａＣｌ（１０ｇ）を１ｌの水に溶解させ、ｐＨを７．０に調整し、かつオートクレーブにかけることによって調製される）中で一晩培養した。抗生物質カナマイシン（３０ｍｇ）をオートクレーブにかけた後に無菌的に添加した。得られた培養の一部（０．２ｍｌ）を次いでテリフィックブロス（ＴＢ，１０ｍｌ、バクトトリプトン（１２ｇ）、バクト酵母エキス（１２ｇ）及びグリセロール（４ｍｌ）を脱イオン水（９００ｍｌ）中に溶解し、オートクレーブにかけ、次いで５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１７ＭのＫＨ２ＰＯ４及び０．７２ＭのＫ２ＨＰＯ４を含有する滅菌溶液（１００ｍｌ）を添加することによって調製される）に移し、かつ２６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ２６０）が０．６に達するまで増殖させた。この培養を使用して５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５０ｍｌのＴＢに接種し、次いで２８℃及び２００ｒｐｍに置き、ヘム前駆体、δ−アミノレブリミン酸（aminolevulimic acid）（１ｍＭ）を添加し、引き続き１時間後にインデューサーのＩＰＴＧ（０．４ｍＭ）を添加した。誘導された培養を更に（４又は１６時間）放置し、かつ細胞を遠心分離（４℃で５０００ｒｐｍで７分間）によって回収した。沈殿した細胞をトリスＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．９）中に再懸濁させ、引き続き前記のように再遠心分離することによって洗浄した。
【００９５】
得られた細胞のペレットを、スクロース（０．５Ｍ）、ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）及びリソザイム（１ｍｇ／ｍｌ）を含有するトリス酢酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ７．６）中に再懸濁した。氷上で３０分後に、該混合物を前記のように遠心分離し、スフェロプラストのペレットを得た。これらを、酢酸マグネシウム（６ｍＭ）、グリセロール（２０％ｖ／ｖ）及びＤＴＴ（０．１ｍＭ）を含有するリン酸カリウムバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ７．６）中に再懸濁し、かつ該混合物を−８０℃で１０分間放置する。これに引き続いてプロテアーゼインヒビターを添加し（ＰＭＳＦ、１ｍＭ）、細胞をソニケーション処理（２×３０秒）した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現生成物の分析はクローンＢ及びクローンＣの両方に関してほとんど検出できるバンドを示さなかった。ｃＤＮＡインサートを有さないベクターから生成するコントロールタンパク質と比較して、より少量のタンパク質が存在するが、それぞれの細菌溶解物は容易に測定可能な触媒活性を与える。脂肪酸ヒドロペルオキシド基質のＵＶ−２３５ｎｍの消失をモニタすることによって、１μｌ（＜１０μｇの粗製タンパク質）の懸濁され、かつ溶解された細菌ペレットが１ｍｌのＵＶキュベット中で反応を観察するために必要であった。
【００９６】
例４．クローンＣから得られた９−ＨＰＬの部分的な精製
９−ＨＰＬ酵素を例３で議論したようにＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１細胞）中で発現させたが、Ｈｉｓ−６タグを、配列番号３１のヌクレオチド配列を使用してタンパク質のカルボキシル末端で発現させた。可溶化されたスフェロプラストの３つの５０ｍｌの細菌培養からの調製物をプールし、かつ製造元の指示に従ってニッケル−ＮＴＡカラム（キアゲンから購入）に適用した。該カラム（床容量１ｍｌ）をアプリケーションバッファー（５０ｍＭのグリシン及び０．１％のエマルホゲン（Emulphogen）を含有する）で洗浄し、次いで該酵素を４０ｍＭのヒスチジン及び０．１％のエマルホゲン界面活性剤を含有するアプリケーションバッファーを使用して溶出させた。プールされたフラクションを引き続き一晩透析し、ヒスチジンを除去した。これによって約５ｍｌの溶液が得られ、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析によって主要なタンパク質成分として期待された５５ｋＤの９−ＨＰＬのバンドを含んでいた。部分的に精製された９−ＨＰＬのＵＶ可視スペクトルは４１６ｎｍで０．３５ＡＵの吸収を有するヘムタンパク質のメジャーなソレー帯を示した。
【００９７】
例５．発現されたメロンのクローンＣの触媒活性
Ａ．室温、ｐＨ７．６での９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸を使用する９−ＨＰＬの代謝回転数
測定は分光分析的アッセイ（２３５ｎｍでの吸光度における減少）及び反応の初期速度を使用して実施した。基質として９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸を使用する精製された９−ＨＰＬ酵素の代謝回転数（酵素１分子あたりに形成される生成物分子の数）を公知の酵素濃度（４１６ｎｍでのソレー極大で測定し、１０００００のモル吸光係数を使用する）及び基質濃度の測定された変化速度（共役ジエンの２３５ｎｍでの２３０００のモル吸光係数を使用する）から算出した。得られた値は最も活性な９−ＨＰＬの調製物に関して１秒間に３０００の代謝回転であった。
【００９８】
この計算は反応の観察される初期速度に関連している。酵素が代謝回転依存性の失活を被るので該速度は時間とともに低下する。
【００９９】
Ｂ．９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸から、精製された９−ＨＰＬ酵素によって形成される生成物の同定
精製された酵素（２μｌ中約０．４μｇ）を１００μｌのバッファー（リン酸カリウム、０．１Ｍ、ｐＨ７．６）中の３μｇの「Ｕ−１４Ｃ］９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸と反応させた。反応が完了する室温での３０秒後に、メタノール（２００μｌ）を添加した。該溶液を混合し、ベンチトップ遠心分離器で簡単に回転させ、かつ上清をＨＰＬＣに注入した。
【０１００】
ＨＰＬＣシステムはＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ５μｍのＯＤＳカラム（２５×０．４６ｃｍ）、メタノール／水／氷酢酸（７５／２５／０．０１、ｖ／ｖ／ｖ）及び流速１．１ｍｌ／分を使用した。該カラムを、ＵＶ吸収化合物の検出のためにヒューレット・パッカード１０４０Ａダイオードアレイ検出器（Hewlett-Packard 1040A diode array detector）に接続し、次いで溶出液を１４Ｃ代謝物のプロフィールの記録のためにパッカードＦｌｏ−Ｏｎｅ放射活性オンライン検出器（Packard Flo-One radioactive on-line detector）に通した。
【０１０１】
不均一に１４Ｃで標識された基質を２つの主要な放射線標識された生成物に変換し、これらは面積において等しかった。初期に溶出する生成物（３．５分の滞留時間で）はＣＧ−ＭＳによって引き続き９−オキソ−ノナン酸（以下参照）として同定され；この生成物は１８個の炭素基質の最初の９個の炭素を表す。９分の滞留時間での第２の主要な生成物は厳密に滞留時間において３Ｚ−ノネナールと一致した。この生成物は基質の炭素１０〜１８を表す。ピークにおける非常に小さい後方の肩、ピーク面積の約５％は基準の２Ｅ−ノネナールと一致した。
【０１０２】
Ｃ．９−オキソ−ノナン酸の同定
９−ＨＰＬと９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸との反応から初期に溶出する生成物（３．５分の滞留時間）はＵＶにおける弱い最終吸収（end absorbance）のみを阻害する。この生成物を前記のＨＰＬＣシステムを使用して精製し、かつジエチルエーテルを有するカラム溶媒から抽出した。アリコートを２０μｌのメタノール中に再溶解させ、かつエーテル性のジアゾメタンで処理して、遊離酸をメチルエステルに変換した。このメチル化された試料の一部をピリジン中の２％メトキシルアミン塩酸（ＭＯＸ）で試料を処理することによってメトキシム誘導体に変換した。
【０１０３】
２つの試料（メチルエステル及びメチルエステルメトキシム誘導体）を電子衝撃モードで、ＳＰＢ−５融解石英キャピラリカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍの内径）を備えたヒューレット・パッカード５８９０ガスクロマトグラフに接続されたＦｉｎｎｉｇａｎ Ｉｃｏｎｓ５０マススペクトロメーターを使用して作動されるＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）によって分析した。これらの試料を５０℃で注入し、かつ温度を引き続き１０℃／分で３００℃にプログラムした。これらの条件下に、９−オキソ−ノナン酸メチルエステルは１３分の滞留時間で溶出した。質量スペクトルはｍ／ｚ１８５（Ｍ+−Ｈ）、１５８（Ｍ+−ＣＯ）、１５５（Ｍ+−ＯＣＨ３）、１４３（Ｍ+−ＣＨ２ＣＨＯ）で特徴的なフラグメントを示し、ｍ／ｚ７４及び８７でメチルエステルマクラファティーフラグメントを示した。メチルエステルのＭＯＸ誘導体化は約１４．５分で一緒に溶出されるｓｙｎ−及びａｎｔｉ−オキシム異性体からなる二重のガスクロマトグラフィーピークをもたらす。これらの質量スペクトルはイオン強度において僅かな差異を有する同一の主要なフラグメントイオンを示す。主要なイオンはｍ／ｚ２１５（Ｍ+）、１８４（Ｍ+−ＮＨ２ＯＣＨ３）、１５２（Ｍ+−ＮＨ２ＯＣＨ３−ＣＨ３ＯＨ）、１２４（１８４−ＣＨ３ＣＯ２Ｈ）及び７３（ＣＨ３−ＣＮＨ−ＯＣＨ３+）で検出された。
【０１０４】
Ｄ．３Ｚ−ノネナールの同定
９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸と精製された９−ＨＰＬとの反応物をヘキサンで抽出し、かつヘキサン抽出物のアリコートを前記のＧＣ−ＭＳシステムに注入した。２つのピークが３Ｚ−ノネナール（約８分）及び２Ｅ−ノネナール（約９分）の基準のスタンダードの滞留時間で留出した。ピーク面積によって判断すれば、２つのアルデヒドは１０：１の３Ｚ対２Ｅの比で形成した。２つのアルデヒドの同定のために、３Ｚ−ノネナールのスタンダードを化学的に合成し（例６参照）かつ２Ｅ−ノネナールをAldrich（Milwakee, WI）から購入した。９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸との９−ＨＰＬの反応によって製造された両方のアルデヒドに関する質量スペクトルは基準のスタンダードと実質的に同一である。３Ｚ−ノネナールはｍ／ｚ１４０（Ｍ+）、１２２（Ｍ+−Ｈ２Ｏ）及び１１１（Ｍ+−ＣＨＯ）において特徴的なフラグメントイオンを示すが、他方で２Ｅ−ノネナールはｍ／ｚ１３９（Ｍ+−Ｈ）、１２２（Ｍ+−Ｈ２Ｏ）及び１１１（Ｍ+−ＣＨＯ）でのイオンを示した。
【０１０５】
例６．３Ｚ−ノネナールの化学合成
３Ｚ−ノネナール合成をCorey及びSuggsの方法（１９７５）及びAndre及びFunkの方法（１９８６）の僅かな変更によって実施した。簡単にＮａＯＡｃ緩衝された、塩化メチレン中のピリジニウムクロロクロメートの溶液に、塩化メチレン中に溶解された３Ｚ−ノネノールを添加した。室温での撹拌の後に、ジエチルエーテルの添加によって反応を終了させ、かつ直ちにシリカゲルのカラムを通して濾過し、塩化メチレンで溶出させ、酸化剤を除去した。ＴＬＣ分析は、３Ｚ−ノネナールへの変換が約５０％完了であることを示した。粗製生成物をオープンベッドクロマトグラフィーによって単離し、かつＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。精製の間の全ての段階において、３Ｚ−ノネナールが４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナールに酸化しないように気をつけた。化学合成された３Ｚ−ノネナールのＧＣ−ＭＳ分析は、化学合成された３Ｚ−ノネナールの質量スペクトルが特徴的なフラグメントイオンを示す基準のスタンダードと実質的に同一であることを示した。
【０１０６】
例７．粗製の細菌溶解物中の９−ＨＰＬ酵素によって９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸から形成される生成物の同定
細菌による発現の粗製溶解物を９−ＨＰＬの起源として使用する場合に、精製された酵素を使用して得られた生成物と比較して異なる生成物プロフィールが得られた。以下に記載される分析調査（特にトラッピング試験）は、最初の酵素による生成物が精製酵素を使用して特徴付けられた生成物と同一であるという結論に導いた。しかしながら粗製の細菌溶解物中で２種の一次酵素生成物の１つ、３Ｚ−ノネナールは容易に酸化されて（恐らく非酵素的に）４−ヒドロキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＮＥ）、４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＰＮＥ）及び９−オキソ−ノナン酸及び４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナールの間に形成されるヘミアセタール誘導体（ヘミアセタール）からなる３種のアルデヒドの混合物になった。３種の極性のアルデヒドの構造及び３Ｚ−ノネナールからのそれらの形成を図６に示す。またこれは３Ｚ−ノネナールの２Ｅ−ノネナールへのマイナーな異性体化を示し、後者は精製酵素又は粗製の細菌溶解物のいずれかを使用しても少量が観察される。粗製の細菌溶解物において、他の一次９−ＨＰＬ生成物、９−オキソ−ノナン酸は主に未変換で回収される。少量のフラクションを図６に示されるようにヘミアセタールに変換する。
【０１０７】
メロン９−ＨＰＬを発現する粗製の細菌溶解物を使用して、９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸との反応を酸素電極（該電極は時間に対する溶液中のＯ２濃度を記録する）を使用してモニタした。酸素電極の閉鎖された２ｍｌのセル中でインキュベーションを実施することによって、９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸と粗製溶解物からの９−ＨＰＬの反応が溶液中でのＯ２濃度の低下と関連があることが観察された。Ｏ２濃度の低下はＯ２と３Ｚ−ノネナールとが反応して、３種の極性アルデヒドが得られることに相当する。定量的に、Ｏ２濃度の低下（消費されたナノモルのＯ２）はＨＰＬＣ分析によって検出された極性アルデヒド誘導体のナノモルにほぼ相当した。粗製の酵素調製物との対比によって、精製された９−ＨＰＬと９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸との反応は、溶液中の不変のＯ２濃度と関連した。
【０１０８】
メロン９−ＨＰＬを発現する粗製の細菌溶解物を使用して９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸との反応をＯ２電極を使用するか、又は前記のような２３５ｎｍでの分光分析によってモニタした。次いで該溶液をＣ１８抽出カートリッジ（Bond-Elut,Varian）を使用して抽出し、かつジエチルエーテルを使用して溶出させた。エーテル抽出物を蒸発させて乾燥させ、かつＨＰＬＣによって分析した。放射線標識された生成物のプロフィールを、［１−１４Ｃ］９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸（炭素−１において１４Ｃ）及び［Ｕ−１４Ｃ］９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸（全ての１８炭素で均一に１４Ｃ）を基質として使用して得た。ＵＶ吸収材料のプロフィールを２０５ｎｍ及び２２０ｎｍでのモニタリングによって検出した。１−１４Ｃ基質を使用する場合、基質の炭素−１を保持する生成物だけが放射線標識され（すなわち９−オキソ−ノナン酸及びヘミアセタール生成物）、かつＵ−１４Ｃ基質からは、全ての生成物が放射線標識された。
【０１０９】
１−１４Ｃ及び均一に標識された１４Ｃ基質の両方から形成される最も高い放射線標識ピークは９−オキソ−ノナン酸として同定された。これは本来の基質の炭素１−９に相当し、かつこの９−ＨＰＬの一次アルデヒド生成物は主にインキュベーションからインタクトに回収される。少量が図６に示されるようにヘミアセタールに変換される。
【０１１０】
３種の生成物は３Ｚ−ノネナールの最初の酸化を介して得られる。３Ｚ−ノネナールを酸化させて、まず４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＰＮＥ）を形成することは、恐らく粗製の細菌溶解物中で簡単に生じる非酵素的反応である。４−ＨＰＮＥは４−ＨＮＥに部分的に還元される。また４−ＨＰＮＥは９−オキソ−ノナン酸と反応して、ヘミアセタール誘導体を形成する（図６）。
【０１１１】
例８．粗製の細菌溶解物中の９−ＨＰＬの一次生成物が９−オキソ−ノナン酸及び３Ｚ−ノネナールであることの証拠
この一連の試験のために、粗製の９−ＨＰＬとの反応の前に、バッファー中の酸素濃度をゼロに減らす。これはナトリウムジチオナイトの溶液の少量のアリコートを添加することによって達成し、他方でＯ２濃度を酸素電極を使用してモニタする。
【０１１２】
酸素が枯渇したバッファーを使用して、９−ＨＰＬと９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸との反応速度はＯ２の不在によって低下しないことが示された。これは分光分析アッセイを使用して証明された（２３５ｎｍでのＵＶ吸収の消失速度）。
【０１１３】
［Ｕ−１４Ｃ］９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸（４０μｇ）と粗製の細菌溶解物からの９−ＨＰＬとの反応をＯ２枯渇したバッファー中で酸素電極の２ｍｌのセル中で実施した。反応がほとんど完了すると期待される１分後に、新たに調製されたＮａＢＨ４の１０ｍｇ／ｍｌ溶液５０μｌを注入し、かつ還元反応を５分間進行させた。この手順はアルデヒドを相応のアルコール（９−ヒドロキシ−ノナン酸及び３Ｚ−ノネノール）として還元（かつそれにより安定化された）。
【０１１４】
２ｍｌの溶液を引き続きＣ１８抽出カートリッジ（Bond-Elut,Varian）を使用して抽出し、かつ生成物をジエチルエーテルでの溶出によって回収した。５０μｇの未標識の基準の３Ｚ−ノネノール及び５０μｇの２Ｅ−ノネノール（Aldrichから入手）を試料のアリコートに添加し、次いで該試料をＨＰＬＣによって分析した。
【０１１５】
１つのクロマトグラムは放射線標識された生成物を示し、かつもう１つのクロマトグラムは２０５ｎｍでのＵＶプロフィールを示した。ＵＶクロマトグラムにおける２つのメインピークは２つの添加されたスタンダードに相当し、従って３Ｚ−ノネノール及び２Ｅ−ノネノールの正確な滞留時間を達成した。ＵＶクロマトグラムにおける後方のピークは使用されない基質（９−ヒドロキシ−リノール酸）及びその１０トランス−１２トランスの異性体の還元生成物に相当し、これらは本来の基質のマイナーな汚染物であることがある。
【０１１６】
１４Ｃクロマトグラムは９−ヒドロキシ−ノナン酸、一次酵素生成物のＮａＢＨ４−還元生成物、９−オキソ−ノナン酸として同定される３分で早くに溶出するピークを示した。８．８分で溶出する第２の放射線標識されたメインピークは３Ｚ−ノネノール、３Ｚ−ノネナールのＮａＢＨ４−還元生成物に相当した。２Ｅ−ノネノールはＮａＢＨ４−トラッピング実験においては検出されなかった。このことは相応のアルデヒド、２Ｅ−ノネナールは一次酵素生成物であるが、むしろ非酵素的な異性体化によって形成されることを暗示している。ＮａＢＨ４−トラッピング実験においては、その形成は３Ｚ−ノネナールのより安定なアルコールへの迅速な変換の故に低減された。
【０１１７】
トラッピング実験の結果は、粗製の細菌溶解物中の９−ＨＰＬの活性が９Ｓ−ヒドロペルオキシ−リノール酸の２つの一次アルデヒド、９−オキソ−ノナン酸及び３Ｚ−ノネナールへの変換に限定されることを示している。粗製の細菌溶解物中の９−ＨＰＬの反応から回収された他のアルデヒドは一次生成物と分子の酸素との引き続いての反応によるか、又は２Ｅ−ノネナールの異性体化によって形成された。
【０１１８】
例９．４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＰＮＥ）及び４−ヒドロキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＮＥ）の同定
例７に記載されたインキュベーションから、４−ＨＰＮＥは逆相ＨＰＬＣによって単離され、かつ１Ｈ−ＮＭＲ分光法（９．５８ｐｐｍ、ｄ，Ｊ＝７．８、Ｈ１；６．９ｐｐｍ、ｄｄ，Ｊ＝１５．９、６．２、Ｈ３；６．２５、ｄｄｄ，Ｊ＝１５．９、７．８、１．２、Ｈ２；４．６ｐｐｍ、ｑ（幾つかの微細構造を有する），Ｊ＞＞６．５、Ｈ４）によって特徴付けられた。４−ヒドロキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＮＥ）の形成はまた、４−ＨＰＮＥの非特異的な還元によって形成され、微生物溶解物中でみられた（例７参照）。酵素インキュベーションから回収された４−ＨＮＥはそのＵＶスペクトル及びＨＰＬＣ滞留時間においてCayman Chemical Co.（Ann Arbor, MI）から得られる４−ＨＮＥの基準の試料と同一であった。
【０１１９】
４−ＨＰＮＥの質量分析法のために、アリコートを、トリフェニルホスフィンを使用して還元して、相応のアルコール、４−ＨＮＥにし、かつＨＰＬＣによって再精製した。前記のＧＣ−ＭＳシステムを使用して４−ＨＮＥを直接及びＢＳＴＦＡでの処理の後に分析し、トリメチルシリルエーテル誘導体を得た。誘導体化されていない４−ＨＮＥに関して得られたフラグメントイオンは文献（Gardner et al., 1992）における報告と一致している。特に、以下のフラグメントイオンが観察された：ｍ／ｚ１３８（Ｍ+−Ｈ２Ｏ）、１２７（Ｍ+−ＣＨＯ）、１０９（Ｍ+−ＣＨＯ−Ｈ２Ｏ）、９９、８６及び８５。トリメチルシリルエーテル誘導体はｍ／ｚ１９９（Ｍ+−ＣＨＯ）、１５７（ＣＨＯ−Ｃ２Ｈ２−ＣＨ−ＯＳｉ（ＣＨ３）３+）及び１２９（ＣＨＯ−Ｃ２Ｈ２−ＣＨ−ＯＳｉ（ＣＨ３）３+−ＣＯ）において診断イオンを示した。
【０１２０】
本明細書を通して、種々の文献を引用している。これらの文献の開示は参照することにより本願にその全体が記載され、その発明の関連する分野の状態をより完全に記載するものとする。
【０１２１】
【外１】
【０１２２】
【外２】
【０１２３】
【外３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、グァバ−ＨＰＬ、バナナ−ＨＰＬ、トウガラシ−ＨＰＬ、アラブ−ＡＯＳ、アマ−ＡＯＳ、グアユール−ＡＯＳ、メロンＡＯＳ、及びメロン９−ＨＰＬのための全長のアミノ酸配列を示している。
【図２】 図２のＡはメロンｃＤＮＡ及び他のＨＰＬ及びＡＯＳに基づく縮重プライマーが結合して、１５０ｂｐ及び７０ｂｐのメロンからクローニングされた生成物を生成する領域を示し、図２のＢはグァバ−ＨＰＬ、バナナ−ＨＰＬ、トウガラシ−ＨＰＬ、アラブ−ＡＯＳ、アマ−ＡＯＳ、グアユール−ＡＯＳ、メロンＡＯＳ、及びメロン９−ＨＰＬからの部分アミノ酸配列のアラインメントを示している。
【図３】 図３はメロンＨＰＬ及びＡＯＳの１５０ｂｐ及び７０ｂｐを得るために使用される縮重プライマーの配列を示している。
【図４】 図４はメロンＨＰＬ及びＡＯＳの３つの異なる１５０ｂｐのクローンのアミノ酸配列のアラインメントを示している。
【図５】 図５はメロンからのクローンＡ、クローンＢ及びクローンＣの３′末端によってコードされる部分アミノ酸配列及びグァバ、トウガラシ及びバナナからの１３−ＨＰＬ及びアマ、グアユール及びアラビドプシスからのＡＯＳのＣ末端配列の間の同一性を比較している。
【図６】 図６はメロン９−ＨＰＬ：９−オキソノナン酸及び３Ｚ−ノネナールの存在下での９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸の２つの一次酵素生成物の図を示している。
【配列表】
発明の背景
発明の分野
本発明は、９−ヒドロペルオキシド基質に対する活性を有し、かつマスクメロン（Cucumis melo）中に存在する脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子に関する。また本発明はヒドロペルオキシドリアーゼを発現するための措置及び有機合成の分野においてリアーゼを使用する方法に関する。
【０００２】
背景技術
植物は特定の植物の特徴的なフレーバー及び臭いをもたらす種々の揮発性化合物を産生する。リノール酸及びリノレン酸のような不飽和脂肪酸はフレーバー化合物、例えばｎ−ヘキサナール、ヘキサン−１−オール、２（Ｅ）−ヘキセン−１−アール、２（Ｅ）−ヘキセン−１−オール、３（Ｚ）−ヘキセン−１−アール、３（Ｚ）−ヘキセン−１−オール（ピポールとしても知られる）、３−（Ｚ）−ノネナール、（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナール、３−（Ｚ）−ノネノール、（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエノール、２−（Ｅ）−ノネナール、（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエナール、２−（Ｅ）−ノネノール及び（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエノールの前駆体である。これらの化合物はフレーバー、特に果実フレーバーにおいて広範に使用され、かつ果実香気に関する香気工場によって使用される。これらのフレーバー化合物に対する需要は伝統的な起源からのそれらの供給を超えて成長しており、従ってこれらの材料を得るための代替の天然の経路を見いだす調査に努力が注がれている。
【０００３】
これらのフレーバー化合物の合成は遊離の（多不飽和）脂肪酸、例えばリノール酸（９（Ｚ），１２（Ｚ）−オクタデカジエン酸）及びα−リノレン酸（９（Ｚ），１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカトリエン酸）から出発する。天然では、これらの酸は細胞障害後に脂肪分解性酵素によって細胞膜から放出される。脂肪酸ヒドロペルオキシドはリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）の作用によって形成され、引き続きヒドロペルオキシドリアーゼによって分解されて、ω−オキソ酸と一緒にＣ６〜９−揮発性フレーバー化合物が得られる。１３−ヒドロペルオキシドの分解によってヘキサナール及び（３Ｚ）−ヘキサナールを含むＣ６−化合物が得られ、かつ９−ヒドロペルオキシドの分解によってＣ９−化合物、（３Ｚ）−ノネナール及び（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナールが得られる。イソメラーゼの存在下に、これらのアルデヒドは（２Ｅ）−エナールに異性体化される。更にアルコールデヒドロゲナーゼは該アルデヒドをそれらの相応のアルコールに変換することができる。
【０００４】
ＨＰＬ酵素は研究が難しいことが判明している。それというのも該酵素は膜に結合し、かつ植物組織中に少量のみ存在するからである。ＨＰＬ酵素はその基質特異性によって１３−ＨＰＬ又は９−ＨＰＬとして特徴付けられている。１３−ＨＰＬ酵素は最初はバナナ果実中で同定され（Tressl and Drawert, 1973）、かつ引き続きスイカ幼植物（Vick and Zimmerman, 1976）、リンゴ及びトマト果実（Schreier and Lorenz, 1982）、トマト葉（Fauconnier et al., 1997）、キュウリ幼植物（Matsui, et al, 1989）及びダイズ幼植物（Olias et al., 1990）を含む種々の多くの植物マテリアルにおいて研究された。１３−ＨＰＬ酵素は茶葉（Matsui et al., 1991）及び、より最近では青ピーマン果実（Shibata et al., 1995）、トマト葉（Fauconnier et al., 1997）、ヒマワリ（Itoh and Vick,1999）、グァバ（ＰＣＴ出願、国際公開第９９５８６４８号明細書）及びバナナ（欧州特許出願、文献番号ＥＰ０８０１１３３Ａ２）から精製されている。９−ヒドロペルオキシド特異的ＨＰＬは洋ナシ（Kim and Grosch, 1981）中に同定されている。９−ヒドロペルオキシド及び１３−ヒドロペルオキシドの両方を分解する第３のタイプのＨＰＬの存在を示唆する研究がなされている（Matsui et al. 1989; Hornostaj and Robinson, 1998）。
【０００５】
リアーゼの粗製ソースは現在ではフレーバー及び香気の製造のための工業的方法で使用されている（例えば米国特許第５４６４７６１号明細書を参照のこと）。このプロセスにおいて、必要とされる基質の溶液は新鮮に製造されたダイズ粉をＬＯＸのソースとして使用してリノール酸又はリノレン酸（ヒマワリ及びアマニ油からそれぞれ得られる）から製造される。この溶液を次いで新鮮に製造された果実全体のピューレをＨＰＬの粗製ソースとして混合する。次いでアルデヒド生成物を蒸留によって単離する。アルコールが必要な場合には、新鮮なパン酵母をヒドロペルオキシド溶液に添加して、その後に果実ピューレと混合する。この酵母はＨＰＬによって形成されるようなアルデヒドを還元する活性なアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を有する。
【０００６】
この工業的プロセスには幾つかの欠点がある。第１の欠点は大量の新鮮な果実を必要とすることである。かかる必要量は、前記プロセスを新鮮な果実が廉価にかつ無料で手に入る国で行う必要があることを意味する。かかる場所が見つかったとしても、その利用は果実の成長時期に限定される。
【０００７】
第２の欠点は所望の酵素活性は使用されるソース中ではかなり希薄であるということである。このことは、比較的大量のダイズ粉、果実ピューレ及び酵母を該プロセスにおいて必要とすることを意味する。工業的生産のために必要な大量のこれらの粗製材料は達成できるフレーバー及び香気化合物の収率において物理的な制約がある。
【０００８】
第３の欠点は大量のバッチ工程であり、これはその性質によってＨＰＬの触媒活性が最大限に使用できず、比較的、研究所よりであり、かつ大量の残留有機物質をもたらす。残留有機物質は引き続きコンポストに輸送するか、又はさもなくば廃棄せねばならない。
【０００９】
本発明はマスクメロン９−ＨＰＬの起源に関連する制限及び欠点を、精製された及び組み換えのマスクメロン９−ＨＰＬタンパク質、核酸、発現系及びその使用方法を提供することによって克服している。
【００１０】
発明の要約
本発明は脂肪酸リアーゼ及び該リアーゼをコードする核酸を提供する。特に単離された脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼを開示しており、その際、９−ヒドロペルオキシド基質に対するリアーゼの活性は１３−ヒドロペルオキシド基質に対する活性よりも大きく、かつ９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＫｍ及びＶｍａｘは９−ヒドロペルオキシリノール酸に関するリアーゼのＫｍ及びＶｍａｘよりも大きい。より特に、本発明はメロン（Cucumis melo）中に存在するリアーゼ及び該リアーゼをコードする核酸を提供する。また本発明は本発明の核酸を有するベクター並びに組み換えリアーゼを得ることができる発現系を提供する。
【００１１】
また本発明は、（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸をＣ９−アルデヒド及びＣ９−オキソノナン酸に分解する方法並びに（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸又は（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸をＣ６−アルデヒド及びＣ１２−オキソカルボン酸に分解する方法を含む本発明のリアーゼを使用する方法を提供している。また、本発明は３−（Ｚ）−ノネナール、（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナール、２−（Ｅ）−ノネナール、（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエナール又はそれらの相応のアルコールを、（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸から製造する方法を提供する。
【００１２】
図面の簡単な説明
図１は、グァバ−ＨＰＬ、バナナ−ＨＰＬ、トウガラシ−ＨＰＬ、アラブ−ＡＯＳ、アマ−ＡＯＳ、グアユール−ＡＯＳ、メロンＡＯＳ、及びメロン９−ＨＰＬのための全長のアミノ酸配列を示しており、高い度合いの同一性を有する領域は暗色のボックスに示し、コンセンサス配列は“majority”としてラベルした。
【００１３】
図２ＡはメロンｃＤＮＡ及び他のＨＰＬ及びＡＯＳに基づく縮重プライマーが結合して、１５０ｂｐ及び７０ｂｐのメロンからクローニングされた生成物を生成する領域を示す図である。
【００１４】
図２Ｂはグァバ−ＨＰＬ、バナナ−ＨＰＬ、トウガラシ−ＨＰＬ、アラブ−ＡＯＳ、アマ−ＡＯＳ、グアユール−ＡＯＳからの部分アミノ酸配列のアラインメントを示している。ボックスで示した領域はＨＰＬ及びＡＯＳ間の高いホモロジーの領域を表している。
【００１５】
図３はメロンＨＰＬ及びＡＯＳの１５０ｂｐ及び７０ｂｐを得るために使用される縮重プライマーの配列を示している。
【００１６】
図４はメロンＨＰＬ及びＡＯＳの３つの異なる１５０ｂｐのクローンのアミノ酸配列のアラインメントを示している。クローンＡ及びクローンＢは６５％の同一性を有するが、一方でクローンＡ及びクローンＣは５７％の同一性を有し、かつクローンＢ及びクローンＣは７２％の同一性をアミノ酸配列において有する。
【００１７】
図５はメロンからのクローンＡ、クローンＢ及びクローンＣの３′末端によってコードされる部分アミノ酸配列及びグァバ、トウガラシ及びバナナからの１３−ＨＰＬ及びアマ、グアユール及びアラビドプシスからのＡＯＳのＣ末端配列の間の同一性を比較している。クローンＡ及びクローンＢによってコードされるＣ末端配列は４２％の同一性を有するが、クローンＡ及びクローンＣは４０％の同一性を有し、かつクローンＢ及びクローンＣは４９％の同一性を有する。
【００１８】
図６はメロン９−ＨＰＬの存在下での９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸の２つの一次酵素生成物：９−オキソノナン酸及び３Ｚ−ノネナールの図を示している。また示されているのは、３Ｚ−ノネナールの２Ｅ−ノネナールへのマイナーな異性体化反応であり、これは精製酵素又は粗製の細菌分解物のいずれかを使用して低い程度で観察されるものである。また示されているのは、粗製の細菌分解物によって惹起される酸化反応であり、それによって３Ｚ−ノネナールは酸化されて３種のアルデヒド、４−ヒドロキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＮＥ）及び４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＰＮＥ）及び９−オキソノナン酸及び４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナールの間で形成されるヘミアセタール誘導体（ヘミアセタール）の混合物にされる。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は以下の本発明の有利な態様の詳細な記載及びそこに含まれる実施例を参照してより容易に理解できる。
【００２０】
本発明を開示及び記載する前に、本発明は特定の方法又は特定の配合物に制限されるものではなく、勿論それ自体変化してよいものと解される。また本願で使用される述語は記載の特定の態様の目的のためのものであり、制限を意図するものではない。
【００２１】
本明細書及び請求の範囲で使用されるように、数量はそこで使用される内容に依存して１つ以上を意味することもある。
【００２２】
Ａ．タンパク質及び核酸
本発明は脂肪酸リアーゼ及び該リアーゼをコードする核酸を提供する。特に単離された脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼを開示しており、その際、９−ヒドロペルオキシド基質についてのリアーゼの活性は１３−ヒドロペルオキシド基質についての活性よりも大きく、かつリアーゼの９−ヒドロペルオキシリノレン酸についてのＫｍ及びＶｍａｘは９−ヒドロペルオキシリノール酸についてのリアーゼのＫｍ及びＶｍａｘよりも大きい。より特に、本発明はキュウリ（Cucumis sativus）ではなくメロン（Cucumis melo）中に存在するリアーゼ及びかかるポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸を提供する。このようにリアーゼはCucumis meloから単離されるタンパク質中に存在するアミノ酸配列を有するが、キュウリ（Cucumis sativus）から単離されたタンパク質中のアミノ酸配列を有さない。
【００２３】
用語“タンパク質”はアミノ酸のポリマーを示し、かつ全長のタンパク質及びポリペプチド及びその断片を含んでよい。本発明においては、“リアーゼ”は少なくとも１つのリアーゼ機能を有するタンパク質を意味する。
【００２４】
特に用語“９−ヒドロペルオキシドリアーゼ”、“９−ＨＰＬ”及び“機能的な９−ヒドロペルオキシドリアーゼ”は天然の９−ヒドロペルオキシドリアーゼによって展開される少なくとも１つの機能を有するリアーゼタンパク質を意味する。例えば、９−ＨＰＬ機能は脂肪酸９−ヒドロペルオキシドをＣ９−アルデヒド及びＣ９−オキソノナン酸に分解する触媒活性を含んでよい。更に、開示されたリアーゼは天然の９−ＨＰＬの以下の特性：抗原決定基、結合部位などを有してよい。
【００２５】
開示される９−ＨＰＬは１３−ヒドロペルオキシド基質よりもむしろ９−ヒドロペルオキシド基質に有利であるが、９−ＨＰＬ及び１３−ＨＰＬの両方の機能を有する。用語“１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ”、“１３−ＨＰＬ”及び“機能的な１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ”は天然の１３−ヒドロペルオキシドリアーゼによって展開される少なくとも１つの機能を有するリアーゼタンパク質を示している。例えば１３−ＨＰＬ機能は脂肪酸９−ヒドロペルオキシドをＣ６−アルデヒド及びＣ１２−ω−オキソ酸部に分解する触媒活性を含むことがある。更に開示されるリアーゼは天然の１３−ＨＰＬの以下の特性：抗原決定基、結合部位などを有してよい。
【００２６】
本願のリアーゼは、得られるタンパク質又はペプチドがリアーゼ機能、例えば有利なリアーゼ機能を保持する限りは、付加的なアミノ酸、例えばＮ−末端に結合されるアミノ酸又はＣ−末端に結合されるアミノ酸又はリアーゼ配列内に挿入されるアミノ酸を含む。更にリアーゼは、少なくとも１つのリアーゼ機能が保持される限りは、天然のリアーゼのアミノ酸配列に対してアミノ酸配列中に種々の突然変異を有してよい。より特に開示されるリアーゼは９−ヒドロペルオキシリノール酸基質（例えば（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸）、９−ヒドロペルオキシリノレン酸基質（例えば（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸）、１３−ヒドロキシリノール酸基質（例えば（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸）及び１３−ヒドロペルオキシリノレン酸基質（例えば（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸）を分解する。９−ヒドロペルオキシリノレン酸に関するリアーゼのＫｍ及びＶｍａｘは９−ヒドロペルオキシリノール酸に関するリアーゼのＫｍ及びＶｍａｘよりも大きい。
【００２７】
該リアーゼは種々の基質に対して特徴的な親和性を有する。該リアーゼは１３−ヒドロペルオキシド基質に対するより大きな親和性を有し、かつ９−ヒドロペルオキシド基質に対するリアーゼのＫｍは１３−ヒドロペルオキシド基質に対するよりも大きい。コンピュータ演算されたＫｍは以下の通りである：９−ヒドロペルオキシリノレン酸＞９−ヒドロペルオキシリノール酸＞１３−ヒドロペルオキシリノール酸。１３−ヒドロペルオキシリノール酸に対するリアーゼのＫｍは１３−ヒドロペルオキシリノレン酸に対する親和性とほぼ同一である。より特にコンピュータ演算された９−ヒドロペルオキシリノール酸に対するＫｍは１４２〜２４２としての９５％の信頼限界でほぼ１９２μＭであり、かつ約４５〜６０％、有利には約５４％の９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＫｍである。コンピュータ演算された１３−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するＫｍは４１〜５９としての９５％の信頼限界で５０μＭであり、かつ約１５〜３５％、有利には約２６％の９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＫｍである。コンピュータ演算された１３−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するＫｍは３７〜６５としての９５％の信頼限界で約５１μＭであり、かつ約１５〜３５％、有利には約２７％の９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＫｍである。
【００２８】
開示されたリアーゼは、おのおのの型の基質を特徴的な速度で分解する。該リアーゼは９−ヒドロペルオキシド基質とより迅速に反応し、かつ９−ヒドロペルオキシド基質の対するリアーゼのＶｍａｘは１３−ヒドロペルオキシド基質に対するＶｍａｘよりも大きい。本発明のリアーゼによる種々の基質の、Ｖｍａｘによって示される速度は以下の通りである：９−ヒドロペルオキシリノレン酸＞９−ヒドロペルオキシリノール酸＞１３−ヒドロペルオキシリノール酸。１３−ヒドロペルオキシリノール酸に対する分解速度は１３−ヒドロペルオキシリノレン酸に対する速度とほぼ同一である。より特に、９−ヒドロペルオキシリノール酸に対するリアーゼのＶｍａｘは９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＶｍａｘの約４５〜６０％、有利には約５５％である。１３−ヒドロペルオキシリノール酸に対するリアーゼのＶｍａｘは９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＶｍａｘの約２５〜３５％、有利には約３０％である。１３−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＶｍａｘは９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対するリアーゼのＶｍａｘの２０〜３０％、有利には約２２％である。“ほぼ同一”な速度又は親和性とは、１つの基質、例えば１３−ヒドロペルオキシリノレン酸に対する、９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対する速度又は親和性のパーセントとして表現される速度又は親和性を意味し、かつ第２の基質、例えば１３−ヒドロペルオキシリノール酸の、９−ヒドロペルオキシリノレン酸に対する速度又は親和性のパーセンテージとして表現される１０％未満、有利には５％未満である。
【００２９】
開示されたリアーゼは約４５〜６５ｋＤａ、有利には約５０〜６０ｋＤａ、かつより有利には約５５ｋＤａの分子量を有する。開示されるリアーゼのために最適なｐＨは６より高い、有利には約６．５〜８．５、より有利には７．０〜８．０、より特に有利には７．２〜７．６である。該酵素は、ｐＨ５．０で最大活性の約２５％を有し、かつｐＨ９．０で最大活性の約１５％を有する。
【００３０】
開示されたリアーゼを単離する。リアーゼの単離は種々の方法で行うことができる。例えば該リアーゼは、起源、例えばCucumis meloから、標準的な生化学的手法を使用して精製でき、又は部分的に精製できる。例えばHornostaj and Robnson (1998)を参照のこと。選択的に、該リアーゼは当業者に公知のタンパク質合成法を使用して合成でき、又は組み換えＤＮＡ技術によってかつ遺伝子操作された発現系を使用して組み換え的に作成できる。合成された又は組み換え的に作成されたリアーゼはヒスチジンタグによって単離を促進できる。このように、組み換え的に作成されるリアーゼのための有利な単離方法はヒスチジン残基を結合するニッケルカラムの使用である。ヒスチジン残基を開示されたリアーゼのアミノ末端に付加して、タンパク質のためのタグとして作用させてよい。ヒスチジンタグ又は他のタグの使用は当業者によく知られている。
【００３１】
１つの態様において、開示されるリアーゼは図１に記載されるようなCucumis meloに独特なアミノ酸を有し、これらは１３−ヒドロペルオキシド基質よりも大きい活性で９−ヒドロペルオキシド基質を分解する活性を提供し、かつ９−ヒドロペルオキシリノレン酸よりも１．６倍未満の活性で９−ヒドロペルオキシリノール酸を分解する活性を提供する。
【００３２】
また本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質を提供する。配列番号１５のアミノ酸配列はアクセッション番号ＡＦ０８１９５５としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されている。
【００３３】
本発明は開示されるリアーゼをコードする単離された核酸を提供する。Cucumis meloからの９−ＨＰＬのｃＤＮＡはクローニングされ、かつ配列決定された（配列番号８）。Cucumis meloのｃＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列はまた開示されている（配列番号７）。１つの態様においては、該核酸は配列番号８に記載される核酸配列を有する。他の態様においては、該核酸は配列番号５６に記載される核酸配列を有する。配列番号５６の核酸配列はアクセッション番号ＡＦ０８１９５５としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されている。
【００３４】
更に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする単離された核酸が提供されている。組み換え系は原核細胞及び真核細胞の両方の発現系を含み、かつ天然のタンパク質配列を有するリアーゼ又は同様に天然配列から改変されたタンパク質配列を有するリアーゼの発現を含む。メロンの９−ＨＰＬのｃＤＮＡはクローニングされ、かつ配列決定され、かつ全長のｃＤＮＡに関するヌクレオチド配列は１４４６塩基対であると規定され（配列番号８）、これは停止コドンを含む。翻訳された配列は全体で４８１個のアミノ酸残基（配列番号７）をコードし、計算される約５５０００ダルトンの分子量を有するタンパク質に相当する。
【００３５】
図１に示されるように、誘導される全長のアミノ酸配列は幾つかのＨＰＬ及びアレン酸化物シンターゼ（ＡＯＳ）にある程度のホモロジー（同一性及び類似性）を示す。例えば開示されたアミノ酸配列及びグァバ、バナナ及びトウガラシの１３−ＨＰＬの間にある程度のホモロジーが存在する。また開示されたＨＰＬ及びＡＯＳ−アマ、ＡＯＳ−グアユール、ＡＯＳアラビ及びＡＯＳ−メロンの間にホモロジーが存在する。しかしながら、図１は、他のＨＰＬ及びＡＯＳと比較して独特な開示されたリアーゼのための領域が存在することを明確に示している。特にこれらの領域は９−ＨＰＬにとって独特であり、かつ更にこれらの領域はCucumis meloにとって独特である。
【００３６】
欠失及び挿入を考慮して、図１及び第１表におけるアラインメントはLasergene（Dnastar, Madison, Wisconsin）のMegAlignサブプログラムを通して利用できるＰＡＭ２５０残基質量チャートを用いるＣｌｕｓｔａｌ法を使用して、メロンの９−ＨＰＬアミノ酸配列がＡＯＳ−アマと約４５．７％の類似性を有し、ＡＯＳ−グアユールと約４６％の類似性を有し、ＡＯＳ−アラビと約４８．０％の類似性を有し、ＡＯＳ−メロンと約４７％の類似性を有し、ＨＰＬ−グァバと約６０％の類似性を有し、ＨＰＬ−バナナと約５８％の類似性を有し、かつＨＰＬ−トウガラシと約６０％の類似性を有することが判明した。
【００３７】
“類似性”は同一又は類似のいずれかのアミノ酸残基を含んでよい。類似のアミノ酸は第２表に示す。これらの類似性にもかかわらず、開示されたリアーゼの独特の領域が存在する。有利な独特な領域は配列番号１（ＭＡＴＰＳＳＳＳＰＥ）、配列番号２（ＩＬＦＤＴＡＫＶＥＫＲＮＩＬＤ）、配列番号３（ＲＬＦＬＳＦＬＡ）、配列番号４（ＳＩＳＤＳＭＳ）、配列番号５（ＬＬＳＤＧＴＰＤ）及び配列番号６（ＩＦＳＶＦＥＤＬＶＩ）に示される。これらの領域及び開示されたリアーゼとしての機能を有するタンパク質を提供する。特に有利な態様は、９−ＨＰＬ機能を保持する配列番号１〜６に示される前記の定義の領域の少なくとも１つを有するタンパク質である。より有利な態様は存在する配列番号１〜６に示される前記の定義の領域の少なくとも２つを有し、かつ９−ＨＰＬ機能を保持するタンパク質である。より有利な態様は存在する配列番号１〜６に示される前記の定義の領域の少なくとも３つを有し、かつ９−ＨＰＬ機能を保持するタンパク質である。より有利な態様は存在する配列番号１〜６に示される前記の定義の領域の少なくとも４つを有し、かつ９−ＨＰＬ機能を保持するタンパク質である。更により有利な態様は存在する配列番号１〜６に示される前記の定義の領域の少なくとも５つを有し、かつ９−ＨＰＬ機能を保持するタンパク質である。最も有利な態様は存在する配列番号１〜６に示される前記の定義の領域の少なくとも６つを有し、かつ９−ＨＰＬ機能を保持するタンパク質である。
【００３８】
【表１】
開示されるリアーゼは機能的変異体を含む。これらの変異体はアミノ酸置換、欠失及び挿入並びに翻訳後修飾をもたらすことによって作成される。かかる変異体はアレル変異体（例えば遺伝子多型のため）として天然に生じてよく、又はヒトの関与（例えばクローニングされたＤＮＡの突然変異誘発によって）、例えば誘発された欠失、挿入および置換の点突然変異によって作成されてよい。これらの改変はアミノ酸配列に変化をもたらし、サイレント突然変異をもたらし、制限部位を変更し、又はほかの特異的突然変異をもたらす。
【００４０】
アミノ酸配列の改変は３つのクラス：置換変異体、挿入変異体又は欠失変異体の１つ以上をもたらす。挿入はアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は通常、アミノ末端又はカルボキシル末端の融合のそれよりもより少ない、１〜４残基のオーダーである。欠失はタンパク質配列から１つ以上のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。典型的に約２〜６残基以下の残基がタンパク質分子内の任意の部位で欠失する。これらの変異体は通常、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発によって作成され、それによって変異体をコードするＤＮＡが作成され、かつ次いで組み換え細胞培養においてＤＮＡが発現される。公知の配列を有するＤＮＡ中の予め規定された部位において置換変異を作成するための技術はよく知られており、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発である。アミノ酸置換は典型的に単一の残基であるが、種々の部位に複数の置換を含んでよく；挿入は通常約１〜１０アミノ酸残基のオーダーであるが、それ以上であってもよく；かつ欠失は約１〜３０残基の範囲であるが、それ以上であってもよい。欠失又は挿入は有利には隣接のペア、すなわち２残基の欠失又は２残基の挿入でなされる。置換、欠失、挿入又は任意のそれらの組み合わせを最終構築物に到達するように組み合わせてよい。突然変異は読み枠の他の配列に位置してはならず、有利には二次的なｍＲＮＡ構造を生じうる相補的領域を作成しない。置換変異体は少なくとも１つの残基が除去され、かつ種々の残基がその場所に挿入された変異体である。かかる置換は一般に第２表に関連してなされ、かつ保存的置換と呼称される。
【００４１】
【表２】
【表３】
機能又は免疫学的同一性における置換変化は第２表での置換よりも保存性に乏しい置換を選択する、すなわち（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格、例えばシート又はヘリックスのコンホーメーションの構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性又は（ｃ）側鎖の嵩の保持におけるその効果がより大きく異なる残基を選択することによってなされる。一般にタンパク質特性に非常に大きな変化をもたらすと期待される置換は（ａ）親水性残基、例えばセリル又はトレオニルが疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル又はアラニルの代わりに（又はによって）置換され；（ｂ）システイン又はプロリンが任意の他の残基の代わりに（又はによって）置換され；（ｃ）正電荷の側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニル又はヒスチジルが負電荷の残基、例えばグルタミル又はアスパラギルの代わりに（又はによって）置換され；又は（ｄ）嵩高い側鎖、例えばフェニルアラニンが側鎖を有さない残基、例えばグリシンの代わりに（又はによって）、この場合に（ｅ）硫酸化及び／又はグリコシル化のための部位の数を増大させて置換される置換である。置換又は欠失の突然変異誘発を使用してＮ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）又はＯ−グリコシル化（Ｓｅｒ又はＴｈｒ）のための部位を挿入してよい。システイン又は他の反応性の残基の欠失も所望であってよい。潜在的なタンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失又は置換は、例えば塩基性残基の１つの欠失又は１つの残基のグルタミニル又はヒスチジル残基による置換によって達成される。
【００４４】
一定の翻訳後誘導体化は発現されたポリペプチドにおける組み換えホスト細胞の作用の結果である。グルタミニル及びアルパラギニル残基はしばしば翻訳後脱アミド化されて、相応のグルタミル及びアスパリル残基になる。選択的に、これらの残基は緩慢な酸性条件下に脱アミド化される。他の翻訳後修飾はプロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジンの側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Creighton,1983）、Ｎ−末端アミンのアセチル化及び幾つかの例においては、Ｃ−末端カルボキシルのアミド化を含む。
【００４５】
全ての突然変異現象において、突然変異の制御範囲は引き続いてのタンパク質が有する機能であると解される。最も有利な突然変異は変化を検出できないほど９−ＨＰＬ機能を変化させる突然変異である。例えば前記のように開示されたリアーゼが非常に特異的な動力学特性を有し、かつ有利な突然変異が９−ヒドロペルオキシド基質を有利に分解する突然変異された９−ＨＰＬをもたらす突然変異である。
【００４６】
開示されたリアーゼの相対的な機能を測定するための、ＨＰＬＣ分析、分光分析、ガスクロマトグラフィー分析、質量分光分析とのガスクロマトグラフィーを含む多くのアッセイが存在する。
【００４７】
また突然変異現象は、そのときに定義された方法で、例えば９−ヒドロペルオキシド基質の分解のＶｍａｘを増大させることによって活性を変更する突然変異を含んでよいと解される。これらの種類の突然変異が望まれるべき場合には、反応速度及び突然変異されたタンパク質の機能の緻密な分析は、天然のリアーゼより良好又は粗悪のいずれかで機能する突然変異リアーゼの単離を可能にする。有利な突然変異は９−ヒドロペルオキシド基質の分解に関するリアーゼの活性を増大させる突然変異である。
【００４８】
また与えられたタンパク質配列のための複数の核酸コドンが存在しうるように、核酸及びタンパク質の間の関係において縮重が存在すると解される。このようにCucumis meloから単離されたＤＮＡと同一の配列を有さないメロンのｃＤＮＡがCucumis meloから単離されたリアーゼの同一のアミノ酸配列をコードする。更にCucumis meloのｃＤＮＡの配列を変更することが望まれるが、Cucumis meloのタンパク質の独特のコーディングを維持する多くの理由が存在する。例えばｃＤＮＡ中に含まれ又は望まれる特異的な核酸制限酵素部位を挿入又は除去することが望まれることがある。
【００４９】
特に有利な態様は配列番号１から配列番号６に示される独特の領域と組み合わせて前記の非保存的アミノ酸を組み込む機能的変異体の両者を織り込んでいる。最も有利には配列番号７に示される配列を有するCucumis meloから単離される機能的な９−ＨＰＬである。
【００５０】
また本願に開示されるタンパク質をコードする核酸配列が開示される。これらの核酸は配列番号１から配列番号６に開示される独特のアミノ酸配列の少なくとも１つを有するタンパク質をコードする核酸配列を含む。これは残基で議論されたように、これらのタンパク質をコードする核酸に対する全ての縮重配列を含む。１つの態様は配列番号８に示されるCucumis meloから単離されたｃＤＮＡを表す核酸である。
【００５１】
また配列番号８の核酸とハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件下に特異的にハイブリダイズする単離された核酸が開示される。有利には配列番号８の核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸はストリンジェントな条件下にCucumis sativus中に存在するリアーゼをコードする核酸とハイブリダイズしない。最も有利には単離された核酸は９−ＨＰＬ機能を有するタンパク質をコードする。
【００５２】
“ストリンジェントな条件”はハイブリダイゼーション手順又はＰＣＲ反応におけるプライマー／鋳型ハイブリダイゼーションにおいて使用される洗浄条件を呼称する。一般にこれらの条件は、変性温度が調査されるハイブリッドの計算されたＴｍ（溶融温度／変性温度）より低い約５〜２０℃であるように選択された洗浄のための温度及び塩濃度の組み合わせであるべきである。該温度及び塩条件は、参照核酸を関連のプライマー核酸にハイブリダイズし、かつ異なる厳密性の条件下に増幅させる予備試験において経験的に容易に規定される。厳密条件は容易に試験され、かつ変更されたパラメータは当業者に容易に明らかにされる。例えばＰＣＲバッファー中で使用されるＭｇＣｌ２濃度を変更して、プライマーが鋳型に結合する特異性が増大するが、ハイブリダイゼーション反応で使用される該化合物の濃度範囲は狭く、従って適当な厳密性レベルは容易に規定される。例えば１８ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは６×ＳＳＰＥ中で推定されるＴｍの５〜１０℃未満で実施され、次いで２×ＳＳＰＥ中で同一の温度で洗浄される。かかるオリゴヌクレオチドのＴｍは各Ａ又はＴのヌクレオチドに関しては２℃を可能にし、かつ各Ｇ又はＣに関しては４℃を可能にすることによって見積もることができる。５０％のＧ＋Ｃの１８ヌクレオチドプローブは、従って約５４℃のＴｍを有する。同様に１８ヌクレオチドプライマー又はプローブの出発塩濃度は約１００〜２００ｍＭである。このようにかかる１８ヌクレオチドプライマー又はプローブのためのストリンジェントな条件は約５４℃のＴｍ及び約１５０ｍＭの出発塩濃度であり、かつ従って予備試験によって変更される。Ｔｍ値はまた市販されるコンピュータソフトウェア（例えばＯＬＩＧＯ（Ｒ））を使用して種々の条件に関して計算することができる。
【００５３】
更に本発明は配列番号７に記載されるメロンの９−ＨＰＬのアミノ酸配列をコードする核酸とハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件下に特異的にハイブリダイズする単離された核酸を提供する。有利には単離された核酸はストリンジェントな条件においてCucumis sativus中に存在するリアーゼをコードする核酸セットにハイブリダイズしない。最も有利には単離された核酸は９−ＨＰＬ機能を有するタンパク質をコードする。
【００５４】
有利には本発明の単離された核酸は、ハイブリダイズする配列と少なくとも９９、９８、９７、９５、９０、８５、８０、７５又は７０％の相補性を有する。より有利な態様は、ハイブリダイズする配列と少なくとも９０％の相補性を有する単離された核酸である。より有利な態様は、ハイブリダイズする配列と少なくとも８０％の相補性を有する単離された核酸である。より有利な態様は、ハイブリダイズする配列と少なくとも７０％の相補性を有する単離された核酸である。パーセントの相補性は、有利には２つのストランドのヌクレオチドとヌクレオチドとの比較に基づくものであってよい。相補性の測定のための特定の方法は当業者に公知である（例えばClustal, Jotun Hein, WilburLipman, Martinez Needleman-Wunsch, Lipman-Pearson, and Dotplot methods）。従って当業者はその用語の意味を理解し、２つの配列間の相補性を測定する方法を知っている。
【００５５】
また核酸は、例えばターゲット核酸を検出又は増幅するためのプローブ又はプライマーであってよい。典型的に、プライマー又はプローブとして有用な独特の核酸は配列の特定のヌクレオチド含量に依存して長さが少なくとも約２０ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドである。更に断片は、例えば約３０、４０、５０、７５、１００、２００、４００又はヌクレオチド長の間の任意の数であってよい。選択的に全長の配列又は全長の配列より長い配列を使用してよい。
【００５６】
Ｂ．ベクター
本発明は本発明の核酸を有するベクターを提供する。また本発明は、例えばCucumis meloから単離されたタンパク質中に存在するアミノ酸配列を有するリアーゼを含む９−ヒドロペルオキシドリアーゼをコードする核酸を有するベクターを提供する。より特に該ベクターはプラスミドであってよい。更により特にベクターは本発明の核酸の１つに機能的に結合したプロモーターを有してよい。
【００５７】
“ベクター”は外来ＤＮＡを有する任意の担体を意味する。従って、ベクターは外来核酸を分解せずに細胞中に輸送する原因物質であり、かつ移送される細胞中の核酸の発現をもたらすプロモーターを含む。“ベクター”は、しかしながらプラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミド及び人工染色体に制限されない。本発明の機能的なリアーゼの発現のために適当な原核性及び真核性の多様な発現ベクターを作成することができる。かかる発現ベクターは、例えばｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣ及び酵母ベクターを含む。該ベクターは、例えば多様なインビトロ及びインビボの状況において前記のリアーゼを発現することができる。
【００５８】
ウイルスベクターはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、ニューロン栄養ウイルス、シンドビスウイルス及び、ＨＩＶ骨格を有する前記のウイルスを含む他のＲＮＡウイルスを含む。またベクターとしての使用に適当にする前記のウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーが有利である。Verma（1985)に記載されるレトロウイルスはマウスマロネー白血病ウイルス、ＭＭＬＶ及びベクターとしてのＭＭＬＶの所望の特性を発現するレトロウイルスを含む。典型的にウイルスベクターは非構造的早期遺伝子、構造的後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製及びカプシド形成のために必要な逆反復末端及びウイルスゲノムの転写及び複製をコントロールするプロモーターを含む。ベクターとして加工される場合、ウイルスは典型的に１つ以上の早期遺伝子が除去され、かつ遺伝子又は遺伝子／プロモーターカセットは除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノム中に挿入される。
【００５９】
“プロモーター”は一般に転写開始部位に関して比較的固定された位置の場合に機能するＤＮＡの１つ以上の配列である。“プロモーター”はＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用のために必要なコアエレメントを含み、かつ上流エレメント及び応答エレメントを含んでよい。
【００６０】
“エンハンサー”は一般に転写開始部位から固定されない距離で機能するＤＮＡの配列を呼称し、かつ転写単位に対して５′（Laimins,1981）又は３′（Lusky et al., 1983）のいずれであってよい。更にエンハンサーはイントロン内（Banerji et al., 1983）並びにそのコーディング配列内（Osborne et al., 1984）であってよい。これらは通常は長さ１０〜３００ｂｐであり、かつシスで機能する。エンハンサーは近隣のプロモーターからの転写を増大するように機能する。プロモーターのようなエンハンサーは、またしばしば転写の調節を媒介する応答エレメントを有する。しばしばエンハンサーは発現の調節を規定する。プロモーター及び／又はエンハンサー領域が構成的プロモーター及び／又はエンハンサーとして作用して、転写されるべき転写単位の領域の発現を最大化することが有利である。
【００６１】
真核性の宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト又は有核細胞）中で使用される発現ベクターはまたｍＲＮＡ発現に影響することがある転写の終結のために必要な配列を有する。これらの領域は組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部位でポリアデニル化されたセグメントとして転写される。また３′非翻訳領域は転写終結部位も含む。また転写単位がポリアデニル化領域を有することも有利である。この領域の１つの利点は、転写された単位がｍＲＮＡのようにプロセシングされ、かつ輸送される見込みが増大することである。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの同定及び使用はよく確立されている。同種のポリアデニル化シグナルをトランスジーン構築物中で使用することが有利である。
【００６２】
ベクターはマーカー生成物をコードする核酸配列を含んでよい。このマーカー生成物を使用して、遺伝子が細胞に移送されたかを決定し、かつ移送されれば発現される。有利なマーカー遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ及び緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．ｃｏｌｉのｌａｃＺ遺伝子である。
【００６３】
いくつかの態様において、マーカーは選択可能なマーカーであってよい。かかる選択可能なマーカーを効率的に宿主細胞中に移送する場合に、形質転換された宿主細胞は、選択圧下にある場合には生存できる。選択の様式には２種の広範に使用される別個のカテゴリーが存在する。第１のカテゴリーは細胞の代謝に基づくものであり、かつ供給された培地に独立に増殖する能力を欠損した変異細胞系統の使用である。第２のカテゴリーは任意の細胞型で使用される選択様式と示され、かつ変異細胞系統の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームを使用して、典型的に宿主細胞の増殖を抑止する。新規の遺伝子を有するこれらの細胞は薬剤耐性を与えるタンパク質を発現し、かつ選択から生存する。かかる優性選択の例は薬剤のネオマイシン（Southern and Berg, 1982）、ミコフェノール酸（Mulligan and Berg, 1980）又はハイグロマイシン（Sugden et al., 1985）を使用する。
【００６４】
またリアーゼ又は本発明のタンパク質をコードする核酸を有する外来の核酸を有する細胞が開示される。有里な細胞は原核細胞である。特に有利な原核細胞はエシェリキア コリ細胞、バシラス細胞及びストレプトマイセス細胞である。これらの細菌は組み換えタンパク質を分泌する能力を有し、従ってタンパク質の単離のために細胞の溶解を必要としない。
【００６５】
リアーゼ又は本発明によるタンパク質をコードする核酸を有する外来の核酸を有する別の有利な細胞型は真核細胞である。特に有利な真核細胞は酵母細胞、植物細胞、及び昆虫細胞である。例えばピチア パストリス又はサッカロマイセス セレビシエは発現系として使用できる。ウイルスベクター、化学的なトランスフェクタント又は物理機械的方法、例えばエレクトロポレーション及びＤＮＡの直接的な拡散を含む外来のベクターでの細胞のトランスフェクションのための適当な措置は当業者に公知である。例えばWolff他及びWolff（Wolff et al.(1990) and Wolff(1991)）を参照のこと、これらは引用されることにより内容が記載されたものとする。トランスフェクションされた細胞を本発明のタンパク質及びリアーゼの発現のための方法として使用できる。
【００６６】
多くの異なる戦略を使用して、本発明のタンパク質又はリアーゼの発現を最適化することができる。種々のエンハンサーは宿主細胞型、ベクター及びプロモーターに基づいて選択される。例えばイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）をＰｌａｃプロモーター及びＰｌａｃプロモーターの誘導体を、Ｅ．ｃｏｌｉが宿主の場合にはインデューサーとして使用してよい。ＩＰＴＧのインデューサー濃度は０〜１ｍＭの範囲である。選択的にＬ−アラビノースによって誘導されるプロモーターを有するｐＢＡＤベクターをＥ．ｃｏｌｉにおいて使用できる。宿主細胞型、ベクター、プロモーター、誘導時間、培地組成、温度、コファクター、培養条件及び培養時間を変更して発現を最適化してよい。更にヘム（例えばδ−アミノレブリン酸を含む）のような補欠分子群の前駆体の添加によって発現を最適化することができる。
【００６７】
Ｃ．該組成物の使用方法
（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）−９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸をＣ９−アルデヒド及びＣ９−オキソノナン酸に分解するにあたり、開示されたリアーゼと（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）−９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸と接触させる工程を有する方法が開示される。（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸が基質である場合にはＣ９−アルデヒドは３Ｚ−ノネナールである。（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）−９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸が基質である場合には、Ｃ９−アルデヒドは３Ｚ，６Ｚ−ノナジエナールである。
【００６８】
また（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸又は（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸をＣ６−アルデヒド及びＣ１２−オキソカルボン酸に分解するにあたり、開示されたリアーゼを１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸又は１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸と接触させることを含む方法が開示される。
【００６９】
また３−（Ｚ）−ノネナール、（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナール、２−（Ｅ）−ノネナール、（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエナール又はそれらの相応のアルコールを（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸から製造するにあたり、（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸を開示された９−ＨＰＬと接触させ、それによって（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２−ジエン酸を３−（Ｚ）−ノネナールに変換し、又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）−９−ヒドロペルオキシオクタデカ−１０，１２，１５−トリエン酸を（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナールに変換し；かつ３−（Ｚ）−ノネナール又は（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナールを回収し；３−（Ｚ）−ノネナールを３−（Ｚ）−ノネノールに還元し、又は（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナールを（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエノールに還元し、かつ３−（Ｚ）−ノネノール又は（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエノールを回収し；又は３−（Ｚ）−ノネナール又は（３Ｚ，６Ｚ）−ノナジエナールを、２−（Ｅ）−ノネナール又は（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエナールを得るのに効率的な温度及びｐＨ条件下に異性体化し、かつ形成された２−（Ｅ）−ノネナール又は（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエナールを回収し、又は２−（Ｅ）−ノネナールを２−（Ｅ）−ノネノールに還元し、又は（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエナールを（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエノールに還元し、かつ２−（Ｅ）−ノネノール又は（２Ｅ，６Ｚ）−ノナジエノールを培地から回収することを含む方法が開示されている。還元工程は有利には当業者に公知の技術を使用して酵母によって媒介される酵素触媒による還元（例えばアルコールデヒドロゲナーゼを使用する）を使用して行われる。例えばＥＰ０５９７０６９Ｂ１号を参照のこと、これは引用することにより内容が記載されたものとする。異性体化工程は酵素的な手順を使用して最適化することができる。異性体化はイソメラーゼ又は非酵素的な異性体化因子によって触媒できる。例えばイソメラーゼは３Ｚ：２Ｅ−エナールイソメラーゼであってよい。例えばNoordermeer他（Noordermeer et al）を参照のこと、これは引用することにより内容が記載されたものとする。
【００７０】
またｎ−ヘキサナール、３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アール、２−（Ｅ）−ヘキセン−１−アール又はそれらの相応のアルコールを、（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸又は（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）−１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸から製造するにあたり、（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸又は（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸を開示された９−ＨＰＬと接触させ、それにより（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸をｎ−ヘキサナールに変換し、又は（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）１３−ヒドロペルオキシオクタデカ−９，１１，１５−トリエン酸を３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アールに変換し；かつｎ−ヘキサナール又は３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アールを回収し；ｎ−ヘキサナールをｎ−ヘキサノールに還元し、又は３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アールを３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オールに還元し、かつヘキサノール又は３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オールを回収する；又は３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アールを、２−（Ｅ）−ヘキセン−１−アールを得るのに効率的な温度及びｐＨ条件下に異性体化し、かつ形成された２−（Ｅ）−ヘキセン−１−アールを回収し、又は２−（Ｅ）−ヘキセン−１−アールを２−（Ｅ）−ヘキセン−１−オールに還元しかつ２−（Ｅ）−ヘキセン−１−オールを培地から回収する工程を含む方法が開示される。還元工程は有利には前記の酵素触媒による還元を使用して行われ、かつ異性体工程は前記の酵素的な手順を使用して最適化できる。
【００７１】
本発明を以下の実施例でより特に記載し、これらは多くの変法及び変形が当業者に明らかなので説明を意図しているにすぎない。
【００７２】
実施例
例１． ９−ヒドロペルオキシドリアーゼを含むメロンリアーゼの部分的なｃＤＮＡのクローニング
ホモロジーに基づいたクローニング方法を使用してマスクメロン（Cucumis melo）を単離した。一般にメロンのｍＲＮＡを調製し、リバーストランスクリプターゼを使用してメロンのｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。このｃＤＮＡはシトクロムＰ４５０ファミリー７４（ＣＹＰ７４）におけるコンセンサス配列に適合するようにデザインされた縮重プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のための基質であった。このＰＣＲはＣＹＰ７４遺伝子ファミリーと配列ホモロジーを有する部分的なｃＤＮＡクローンを提供する。部分的クローンは３′−ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）及び５′−ＲＡＣＥの反応によって伸長され、これはそれぞれの部分的なクローンのための完全なｃＤＮＡ（すなわちｍＲＮＡの完全体）をもたらす。全長のｃＤＮＡをＰＣＲによってクローニングし、かつＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉが発現する生成物の触媒活性を基質としての９−ヒドロペルオキシ及び１３−ヒドロペルオキシ脂肪酸を使用して特徴付けた。
【００７３】
メロンのＲＮＡの調製
出発材料は様々なカンタループメロン（“マスクメロン”）、Cucumis melo、Caravelle（Asgrow,Texas）であった。TRI REAGENTキット（Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio）を使用して全体のＲＮＡを単離した。全体のＲＮＡを未熟なメロン果実２０ｇから調製した。４００μｇの全体のＲＮＡが得られた。ｍＲＮＡ精製キット（Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey）を使用して全体のＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。該キットはポリアデニル化されたＲＮＡのアフィニティー精製のためのオリゴ（ｄＴ）−セルローススピンカラムを提供する。製造元のプロトコールに従った。３．７μｇのｍＲＮＡが４００μｇの全体のＲＮＡから単離された。
【００７４】
Ｂ． 保存されたＣＹＰ７４配列に基づく縮重プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲクローニング
第１のストランドのｃＤＮＡを全体のＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ＲＮＡからオリゴｄ（Ｔ）−アダプターを使用して合成された。リバーストランスクリプターゼ反応は８０ピコモルのオリゴ−ｄＴアダプター（配列番号４９，Ａ１６７８，５′−ＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３′又は配列番号５０，Ａ１６７７，５′−ＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣ−３′）、１０μｌの５×の第１ストランドバッファー（GibcoBRL, Rockville, Maryland）、１ｍＭのＤＴＴ、各ｄＮＴＰに関して１ｍＭ、５０単位のＲＮＡｓｉｎ、４００ＵのＭＭＶ−ＲＴ及びＨ２Ｏを有し、最終反応容量５０μｌにした。このＲＴ反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。第１ストランドｃＤＮＡをさらなる精製をせずにＰＣＲ反応で直接使用した。ＰＣＲ反応物は２０〜１００ｎｇのメロンのｃＤＮＡ鋳型、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ピコモルの上流プライマー（ＧＧＴＧＡＧＴＴＧＣＴＮＴＧＹＧＧＮＴＡＹＣＡ（配列番号１６）、ＧＧＴＧＡＧＴＴＧＣＴＮＴＧＹＧＧＮＴＡ（配列番号１７）又はＴＡＣＴＧＧＴＣＮＡＡＹＧＧＮＣＣＮＳＡＲＡＣ（配列番号１９））及び２０ピコモルの下流プライマー（ＴＧＧＴＣＮＡＡＹＧＧＮＣＣＲＧＡＧＡＣ（配列番号１８）、ＡＡＹＡＡＲＣＡＲＴＧＹＧＣＮＧＣＴＡＡＧＧＡＣ（配列番号２０）又はＡＡＲＣＡＲＴＧＹＧＣＮＧＣＴＡＡＧＧＡＣ（配列番号２１））（図２及び図３を参照のこと）を含有した。更にＰＣＲ反応物は１．２５単位の酵素及びＨ２Ｏを有し、最終反応容量５０μｌを有した。ｃＤＮＡ鋳型を反応温度が８０℃の時に添加した。反応サイクルパラメーターは９４℃で２分（サイクル１だけ）；５７℃〜６２℃で１分間、７２℃で１分間、９４℃で１分間（典型的に３０サイクル）及び７２℃で１０分間（最終サイクル）であった。反応条件は全ての反応に関して同一であるが、２種の異なるＤＮＡポリメラーゼを使用した：（１）AmpliTaqＤＮＡポリメラーゼ（PE Applied Biosystems, Focter City, CA）及び（２）AdvanTaq（Advantage cDNA Polymerase Mix(Clontech, Palo Alto, CA））。
【００７５】
ｉ．１５０ｂｐのｃＤＮＡ断片の増幅
単一サイクルのＰＣＲを鋳型としてメロンのｃＤＮＡを使用して実施した。上流縮重プライマー（配列番号１６、プライマー１Ａ、図２及び図３）を下流縮重プライマー（配列番号１８、プライマー２、図２及び図３）と一緒に使用したが、第１のＰＣＲではバンドは得られなかった。従って第２のＰＣＲを０．１μｌの第１回のＰＣＲ反応生成物を鋳型として使用して、かつ上流縮重プライマー１Ｂ（配列番号１７、図２及び図３）をネスト型上流プライマーとして使用して実施した。
【００７６】
第２のＰＣＲはアガロースゲル中で唯一のバンド（１５０ｂｐ）として移行する生成物を精製した。１５０ｂｐのＰＣＲ生成物は期待されたＣｙｐ７４遺伝子ファミリー生成物にサイズでは匹敵するものである。
【００７７】
１５０ｂｐ生成物をベクター（pCR2.1 Invitrogen, Carlsbad, CA）中にサブクローニングし、かつ約５０個のクローンの配列決定をした。３種の異なるＰ４５０関連の配列が得られ（図４）、これらを部分的なクローンＡ（配列番号２８）、クローンＢ（配列番号２９）及びクローンＣ（配列番号３０）と呼称した。部分的なクローンＡ及びクローンＢは６５％の同一性ホモロジーを有した；部分的なクローンＡ及びクローンＣは５７％の同一性ホモロジーを有した；かつ部分的なクローンＢ及びクローンＣは７２％の同一性ホモロジーを有した。
【００７８】
ｉｉ．７０ｂｐのｃＤＮＡ断片の増幅
単一サイクルのＰＣＲをメロンｃＤＮＡを鋳型として使用して実施した。上流縮重プライマー（配列番号１８、プライマー２、図２及び図３）を下流縮重プライマー（配列番号２０、プライマー４Ａ、図２及び図３）と一緒に使用した。アガロースゲル中に生成物のバンドは観察されなかった。従って第２のＰＣＲを０．１ｍｌの第１のＰＣＲを鋳型として使用して実施した。下流縮重プライマー、プライマー４Ｂ、（配列番号２１、図２及び図３）をネスト型下流プライマーとして使用した。この第２のＰＣＲはアガロースゲル中で約７０ｂｐの唯一のバンドとして移行する生成物を生成する。これは期待される生成物にサイズにおいて匹敵する。この７０ｂｐのバンドのサイズはアガロースゲル上では厳密に測定するのが困難なので、個々のクローン（４８個のクローン）を１０％のゲル上のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって較正のために１０ｂｐのＤＮＡラダーを使用してサイズを測定した。ＰＡＧＥは生成物（６０〜９０ｂｐ）の複合混合物が増幅されたことを示した。予測されたサイズに近い１２個のクローンの配列決定をした。これらのクローンの１つはＰ４５０の様な配列をコードしていた。この部分的なクローンは１５０ｂｐの部分的なクローンＢの種々の領域を表した。
【００７９】
例２． ３′−ＲＡＣＥ及び５′−ＲＡＣＥにより得られたプライマーを使用する全長クローンの作成
３′−ＲＡＣＥ（３′−ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）法はＰＣＲのための縮重上流プライマー及びｃＤＮＡの逆転写酵素で触媒される合成で使用されるプライマーの５′−末端でのアダプター配列に基づく下流プライマーを使用する。ｃＤＮＡを例１に記載のように調製した。
【００８０】
マラソンｃＤＮＡ増幅キット（Marathon cDNA Amplification Kit）（Clontech）を５′−ＲＡＣＥ（５′−ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）のために使用した。この手順をｍＲＮＡ（１μｇ）を二本鎖ｃＤＮＡに変換し、ｃＤＮＡ末端をアダプター配列カセットでタグするようにデザインした。プロトコールは製造元のプロトコールに従った。
【００８１】
Ａ．３′−ＲＡＣＥ
ｃＤＮＡを前記のように調製した。全体のＲＮＡの３種の調製を使用した：（１）メロンの多汁性の果肉及び固い皮の混合物から、（２）メロンの固い皮から、（３）メロンの多汁性の果肉から。クローンＡの遺伝子特異的上流プライマー（５′−ＧＧＴＴＡＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧ−３′（配列番号３４）又は５′−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＧＴＴＴＡＡＴＣＣＧ−３′（配列番号３５））、クローンＢ（５′−ＡＣＡＧＡＧＣＧＧＡＣＧＡＧＴＴＣＧＴＡＣＣＴ−３′（配列番号３６））又はクローンＣ（５′−ＡＧＧＡＴＴＣＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＧＴＧＧＧＣ−３′（配列番号３７））をオリゴｄＴ−アダプター配列に基づく下流プライマー（配列番号４９及び配列番号５０）と一緒に使用した。
【００８２】
クローンＢ及びクローンＣの全長クローンを単離するために、クローンＢのための遺伝子特異的プライマー（配列番号３６）及びクローンＣのための遺伝子特異的プライマー（配列番号３７）及びオリゴｄＴプライマーのアダプター配列に基づくプライマー（配列番号５０）を使用した。ＰＣＲをメロンの多汁性の果肉及び固い皮の混合物から単離されたＲＮＡから得られたｃＤＮＡ鋳型で開始した。これらのプライマーを使用するＰＣＲ反応は３５０ｂｐ（クローンＢ）の生成物及び５５０ｂｐの生成物（クローンＣ）を生成し、これらはアガロースゲル上で唯一のバンドとして移行する。
【００８３】
これらの３５０ｂｐ及び５５０ｂｐのＰＣＲ生成物はＡＯＳ及び１３−ＨＰＬのｃＤＮＡの３′−末端の増幅からの期待される生成物とサイズにおいて匹敵した。これらの生成物をｐＣＲ２．１中にサブクローニングし、かつ配列決定した。
【００８４】
クローンＡの全長のクローンを単離するために、ＰＣＲを多汁性の果肉又は固い皮のメロンｃＤＮＡ鋳型を用いて開始した。クローンＡのための遺伝子特異的上流プライマー（配列番号３４又は配列番号３５）及びオリゴｄＴアダプター配列に基づく下流プライマー（配列番号５０）を増幅のために使用した。ＰＣＲ反応を固い皮のメロンｃＤＮＡを用いて開始する場合にはアガロースゲル電気泳動で測定されるようにＰＣＲ生成物は得られなかった。ＰＣＲ反応を多汁性の果肉のメロンｃＤＮＡを用いて開始する場合には、しかしながらアガロースゲル上で唯一のバンドとして移行する２つのバンドが得られた。配列番号３４のヌクレオチド配列を有するプライマーで生成された生成物は４５０ｂｐであり、かつ配列番号３５のヌクレオチド配列を有するプライマーで生成された生成物は４００ｂｐであった。これらの２つのＰＣＲ生成物のサイズにおける差異（５０ｂｐ）は配列番号３４及び配列番号３５に相応する２種の上流プライマー間の期待される距離と一致した。
【００８５】
クローンＡから得られるプライマーから生成した４００ｂｐ及び４５０ｂｐのＰＣＲ生成物はＡＯＳ及び１３−ＨＰＬのｃＤＮＡの３′末端からの期待される生成物とサイズにおいて匹敵した。これらの生成物をｐＣＲ２．１中にサブクローニングし、かつ配列決定した。
【００８６】
図５はメロンからのクローンＡ、クローンＢ及びクローンＣによってコードされるアミノ酸配列のＣ−末端及びグァバ、トウガラシ及びバナナからの１３−ＨＰＬのＣ−末端配列及びアマ、グアユール及びアラビドプシスからのＡＯＳのＣ−末端配列の間の同一性を比較している。このアラインメントはクローンＡが１３−ＨＰＬ配列と最も高いホモロジーを有することを示している。クローンＢ及びクローンＣはＡＯＳと１３−ＨＰＬより高いホモロジーを有する。クローンＢはクローンＣよりもＡＯＳと類似しており、かつ従ってクローンＣはＡＯＳ又は１３−ＨＰＬのいずれかとは最も異なる。
【００８７】
Ｂ．５′−ＲＡＣＥ
全体のＲＮＡを前記のように多汁性のメロン果肉から調製した。５′−ＲＡＣＥのためのｃＤＮＡ合成はクロンテックの手順（Clontech procedue）（マラソンｃＤＮＡ増幅キット）を使用して達成された。プロトコールは製造元のプロトコールに従った。未熟なメロン果実からの１μｇのｍＲＮＡを使用した。第１のＰＣＲを、５′及び３′末端でマラソンアダプター配列でタグされたメロンｃＤＮＡを鋳型として使用して実施した。上流プライマーＡＰ１をクローンＡのための遺伝子特異的下流プライマー（５′−ＣＣＧＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＣＣＴＴＣ−３′（配列番号３９））、クローンＢのための遺伝子特異的下流プライマー（５′−ＣＴＧＡＡＣＣＧＡＣＣＧＣＧＡＣＴＧＴＧＴ−３′（配列番号４１））及びクローンＣのための遺伝子特異的下流プライマー（５′−ＴＣＣＧＣＧＴＣＧＧＣＴＣＣＡＣＴＧＴＣ−３′（配列番号４３））と一緒に使用した。アガロースゲル上で拡散した不鮮明なバンドとして移行する生成物は各クローンに関する第１のＰＣＲにおいて得られた。第２のＰＣＲを０．０５μｌの第１のＰＣＲ生成物を鋳型（５０μｌのＰＣＲ反応）として使用して実施した。上流プライマーはアダプターＡＰ２（マラソンｃＤＮＡ増幅キット）であり、かつ下流遺伝子特異的プライマーはクローンＡのためには５′−ＧＡＡＣＡＧＡＴＡＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣ−３′（配列番号４０）、クローンＢのためには５′−ＴＣＧＣＣＣＧＴＧＡＡＣＣＧＡＴＣＡＧＧＴＡ−３′（配列番号４２）又はクローンＣのためには５′−ＴＣＴＣＣＣＡＣＧＡＡＣＣＴＡＴＣＧＣＣＣＡ−３′（配列番号４４）であった。この第２のＰＣＲはクローンＡに関しては１０００ｂｐ生成物を、クローンＢに関しては１４００ｂｐ生成物を、かつクローンＣに関しては１２００ｂｐ生成物を生成した。１０００ｂｐ、１４００ｂｐ及び１２００ｂｐのＰＣＲ生成物はＡＯＳ及び１３−ＨＰＬのｃＤＮＡのサイズに基づく期待される生成物とサイズにおいて匹敵した。これらの生成物をベクター（ｐＣＲ２．１、インビトロゲン）中にサブクローニングし、かつ配列決定した。
【００８８】
クローンＢ及びクローンＣの５′−ＲＡＣＥ及び３′−ＲＡＣＥの生成物の配列決定の後に、遺伝子特異的プライマーをコーディング配列の推定される開始に相応し、かつ停止コドンに相応して合成した。クローンＢに関してはＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位（ユニーク部位）を、以下のプライマー５′−ＧＣＣＡＴ ＧＧＣＣＴＣＣＡＴＴＧＴＣＡＴＴＣＣＴＴＣ−３′（配列番号４５）（ＮｃｏＩ部位に下線及び下線のＡＴＧはＭｅｔをコードする）（５′−ｕｐ）及び５′−ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＡＡＡＣＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＡＧ−３′（配列番号４６）（ＥｃｏＲＩ部位に下線及び下線のＡＧＴコドンは停止コドンを表す）を使用してそれぞれ５′−末端及び３′−末端に組み込んだ。
【００８９】
クローンＣのために、ユニークなＮｄｅＩ及びＣｌａＩ制限部位を５′及び３′末端にそれぞれ、以下のプライマー５′−ＧＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣ−３′（配列番号４７）（ＮｄｅＩ部位に下線及び下線のＡＴＧはＭｅｔをコードする）（５′−ｕｐ）及び５′−ＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＴＡＧＴＣＡＴＴＡＧＣＴＴＴＡＡ−３′（配列番号４８）（ＣｌａＩ部位に下線及びＡＧＴは停止コドンである）（３′−ｄｏｗｎ）を使用して組み込んだ。ＮｃｏＩ部位はコーディング配列中に存在する。
【００９０】
ＰＣＲ反応を１μｇのｍＲＮＡ（前記の）から調製されたメロンｃＤＮＡ及び配列番号４５のヌクレオチド配列を有するプライマー及び配列番号４６のヌクレオチド配列を有するプライマー又は配列番号４７のヌクレオチド配列を有するプライマー及び配列番号４８のヌクレオチド配列を有するプライマーをプライマーとして使用して開始した。これらの反応のためのアニーリング温度は６０℃であり、クロンテックによるAdvantageｃＤＮＡポリメラーゼミックスを使用した。クローンＢに関する１．６ｋｂの生成物及びクローンＣに関する１．４ｋｂの生成物を増幅した。これらの生成物のそれぞれをベクター（ｐＣＲ２．１）中にサブクローニングし、かつ配列決定した。クローンＢのヌクレオチド配列は配列番号５１として提供され、かつクローンＣのヌクレオチド配列は配列番号７として提供される。
【００９１】
クローンＢの１．６ｋｂ生成物（図１において示されるメロンＡＯＳ、アミノ酸配列 配列番号５２を有する）配列番号５１及びクローンＣの１．４ｋｂ生成物（図１において示されるメロンＨＰＬ、配列番号７を有する）によってコードされる推定されるアミノ酸配列をアマ（配列番号５３）、グアユール（配列番号５４）及びアラビドプシス（配列番号５５）からのＡＯＳのアミノ酸配列並びにグァバ（配列番号３８）、バナナ（配列番号３３）及びトウガラシ（配列番号３２）からの１３−ＨＰＬのアミノ酸配列と比較した。配列の開始（５′末端によってコードされる）は長さ及びアミノ酸配列における相当の変化を含み、次いで全ての配列が収束し、かつ緊密な関連性を示すようになる。クローンＢは比較的短い５′末端を有するクローンＣと比較してより長い５′−ＲＡＣＥ生成物の根拠となる非常に長い５′末端を有する。
【００９２】
得られる３′末端の配列比較によって、クローンＡは公知の１３−ＨＰＬ酵素に最も類似している。クローンＢはメロンＡＯＳである。クローンＣは９−ヒドロペルオキシドリアーゼである。
【００９３】
例３．Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現
ｐＣＲ２．１中のクローンＢのｃＤＮＡをＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、かつ発現ベクタープラスミドｐＥＴ３ｄ（これもＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化した）中にサブクローニングした。ｐＣＲ２．１中のクローンＣのｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＣｌａＩで切断し、かつ発現ベクタープラスミドｐＥＴ３ｂ（これもＮｄｅＩ及びＣｌａＩで消化した）中にサブクローニングした。２つの異なる構築物を使用してＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、クローンＢ及びクローンＣの遺伝子産物を発現させる。これらの構築物は付加的なアミノ酸を有さない又は５′−末端の他の改変を有さない天然の植物の配列の細菌による発現をもたらす。
【００９４】
発現のために、形質転換されたＢＬ２１細胞を３７℃及び２８０ｒｐｍでＬＢ培地（３ｍｌ、トリプトン（１０ｇ）、酵母エキス（５ｇ）及びＮａＣｌ（１０ｇ）を１ｌの水に溶解させ、ｐＨを７．０に調整し、かつオートクレーブにかけることによって調製される）中で一晩培養した。抗生物質カナマイシン（３０ｍｇ）をオートクレーブにかけた後に無菌的に添加した。得られた培養の一部（０．２ｍｌ）を次いでテリフィックブロス（ＴＢ，１０ｍｌ、バクトトリプトン（１２ｇ）、バクト酵母エキス（１２ｇ）及びグリセロール（４ｍｌ）を脱イオン水（９００ｍｌ）中に溶解し、オートクレーブにかけ、次いで５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１７ＭのＫＨ２ＰＯ４及び０．７２ＭのＫ２ＨＰＯ４を含有する滅菌溶液（１００ｍｌ）を添加することによって調製される）に移し、かつ２６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ２６０）が０．６に達するまで増殖させた。この培養を使用して５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５０ｍｌのＴＢに接種し、次いで２８℃及び２００ｒｐｍに置き、ヘム前駆体、δ−アミノレブリミン酸（aminolevulimic acid）（１ｍＭ）を添加し、引き続き１時間後にインデューサーのＩＰＴＧ（０．４ｍＭ）を添加した。誘導された培養を更に（４又は１６時間）放置し、かつ細胞を遠心分離（４℃で５０００ｒｐｍで７分間）によって回収した。沈殿した細胞をトリスＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．９）中に再懸濁させ、引き続き前記のように再遠心分離することによって洗浄した。
【００９５】
得られた細胞のペレットを、スクロース（０．５Ｍ）、ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）及びリソザイム（１ｍｇ／ｍｌ）を含有するトリス酢酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ７．６）中に再懸濁した。氷上で３０分後に、該混合物を前記のように遠心分離し、スフェロプラストのペレットを得た。これらを、酢酸マグネシウム（６ｍＭ）、グリセロール（２０％ｖ／ｖ）及びＤＴＴ（０．１ｍＭ）を含有するリン酸カリウムバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ７．６）中に再懸濁し、かつ該混合物を−８０℃で１０分間放置する。これに引き続いてプロテアーゼインヒビターを添加し（ＰＭＳＦ、１ｍＭ）、細胞をソニケーション処理（２×３０秒）した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現生成物の分析はクローンＢ及びクローンＣの両方に関してほとんど検出できるバンドを示さなかった。ｃＤＮＡインサートを有さないベクターから生成するコントロールタンパク質と比較して、より少量のタンパク質が存在するが、それぞれの細菌溶解物は容易に測定可能な触媒活性を与える。脂肪酸ヒドロペルオキシド基質のＵＶ−２３５ｎｍの消失をモニタすることによって、１μｌ（＜１０μｇの粗製タンパク質）の懸濁され、かつ溶解された細菌ペレットが１ｍｌのＵＶキュベット中で反応を観察するために必要であった。
【００９６】
例４．クローンＣから得られた９−ＨＰＬの部分的な精製
９−ＨＰＬ酵素を例３で議論したようにＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１細胞）中で発現させたが、Ｈｉｓ−６タグを、配列番号３１のヌクレオチド配列を使用してタンパク質のカルボキシル末端で発現させた。可溶化されたスフェロプラストの３つの５０ｍｌの細菌培養からの調製物をプールし、かつ製造元の指示に従ってニッケル−ＮＴＡカラム（キアゲンから購入）に適用した。該カラム（床容量１ｍｌ）をアプリケーションバッファー（５０ｍＭのグリシン及び０．１％のエマルホゲン（Emulphogen）を含有する）で洗浄し、次いで該酵素を４０ｍＭのヒスチジン及び０．１％のエマルホゲン界面活性剤を含有するアプリケーションバッファーを使用して溶出させた。プールされたフラクションを引き続き一晩透析し、ヒスチジンを除去した。これによって約５ｍｌの溶液が得られ、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析によって主要なタンパク質成分として期待された５５ｋＤの９−ＨＰＬのバンドを含んでいた。部分的に精製された９−ＨＰＬのＵＶ可視スペクトルは４１６ｎｍで０．３５ＡＵの吸収を有するヘムタンパク質のメジャーなソレー帯を示した。
【００９７】
例５．発現されたメロンのクローンＣの触媒活性
Ａ．室温、ｐＨ７．６での９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸を使用する９−ＨＰＬの代謝回転数
測定は分光分析的アッセイ（２３５ｎｍでの吸光度における減少）及び反応の初期速度を使用して実施した。基質として９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸を使用する精製された９−ＨＰＬ酵素の代謝回転数（酵素１分子あたりに形成される生成物分子の数）を公知の酵素濃度（４１６ｎｍでのソレー極大で測定し、１０００００のモル吸光係数を使用する）及び基質濃度の測定された変化速度（共役ジエンの２３５ｎｍでの２３０００のモル吸光係数を使用する）から算出した。得られた値は最も活性な９−ＨＰＬの調製物に関して１秒間に３０００の代謝回転であった。
【００９８】
この計算は反応の観察される初期速度に関連している。酵素が代謝回転依存性の失活を被るので該速度は時間とともに低下する。
【００９９】
Ｂ．９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸から、精製された９−ＨＰＬ酵素によって形成される生成物の同定
精製された酵素（２μｌ中約０．４μｇ）を１００μｌのバッファー（リン酸カリウム、０．１Ｍ、ｐＨ７．６）中の３μｇの「Ｕ−１４Ｃ］９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸と反応させた。反応が完了する室温での３０秒後に、メタノール（２００μｌ）を添加した。該溶液を混合し、ベンチトップ遠心分離器で簡単に回転させ、かつ上清をＨＰＬＣに注入した。
【０１００】
ＨＰＬＣシステムはＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ５μｍのＯＤＳカラム（２５×０．４６ｃｍ）、メタノール／水／氷酢酸（７５／２５／０．０１、ｖ／ｖ／ｖ）及び流速１．１ｍｌ／分を使用した。該カラムを、ＵＶ吸収化合物の検出のためにヒューレット・パッカード１０４０Ａダイオードアレイ検出器（Hewlett-Packard 1040A diode array detector）に接続し、次いで溶出液を１４Ｃ代謝物のプロフィールの記録のためにパッカードＦｌｏ−Ｏｎｅ放射活性オンライン検出器（Packard Flo-One radioactive on-line detector）に通した。
【０１０１】
不均一に１４Ｃで標識された基質を２つの主要な放射線標識された生成物に変換し、これらは面積において等しかった。初期に溶出する生成物（３．５分の滞留時間で）はＣＧ−ＭＳによって引き続き９−オキソ−ノナン酸（以下参照）として同定され；この生成物は１８個の炭素基質の最初の９個の炭素を表す。９分の滞留時間での第２の主要な生成物は厳密に滞留時間において３Ｚ−ノネナールと一致した。この生成物は基質の炭素１０〜１８を表す。ピークにおける非常に小さい後方の肩、ピーク面積の約５％は基準の２Ｅ−ノネナールと一致した。
【０１０２】
Ｃ．９−オキソ−ノナン酸の同定
９−ＨＰＬと９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸との反応から初期に溶出する生成物（３．５分の滞留時間）はＵＶにおける弱い最終吸収（end absorbance）のみを阻害する。この生成物を前記のＨＰＬＣシステムを使用して精製し、かつジエチルエーテルを有するカラム溶媒から抽出した。アリコートを２０μｌのメタノール中に再溶解させ、かつエーテル性のジアゾメタンで処理して、遊離酸をメチルエステルに変換した。このメチル化された試料の一部をピリジン中の２％メトキシルアミン塩酸（ＭＯＸ）で試料を処理することによってメトキシム誘導体に変換した。
【０１０３】
２つの試料（メチルエステル及びメチルエステルメトキシム誘導体）を電子衝撃モードで、ＳＰＢ−５融解石英キャピラリカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍの内径）を備えたヒューレット・パッカード５８９０ガスクロマトグラフに接続されたＦｉｎｎｉｇａｎ Ｉｃｏｎｓ５０マススペクトロメーターを使用して作動されるＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）によって分析した。これらの試料を５０℃で注入し、かつ温度を引き続き１０℃／分で３００℃にプログラムした。これらの条件下に、９−オキソ−ノナン酸メチルエステルは１３分の滞留時間で溶出した。質量スペクトルはｍ／ｚ１８５（Ｍ+−Ｈ）、１５８（Ｍ+−ＣＯ）、１５５（Ｍ+−ＯＣＨ３）、１４３（Ｍ+−ＣＨ２ＣＨＯ）で特徴的なフラグメントを示し、ｍ／ｚ７４及び８７でメチルエステルマクラファティーフラグメントを示した。メチルエステルのＭＯＸ誘導体化は約１４．５分で一緒に溶出されるｓｙｎ−及びａｎｔｉ−オキシム異性体からなる二重のガスクロマトグラフィーピークをもたらす。これらの質量スペクトルはイオン強度において僅かな差異を有する同一の主要なフラグメントイオンを示す。主要なイオンはｍ／ｚ２１５（Ｍ+）、１８４（Ｍ+−ＮＨ２ＯＣＨ３）、１５２（Ｍ+−ＮＨ２ＯＣＨ３−ＣＨ３ＯＨ）、１２４（１８４−ＣＨ３ＣＯ２Ｈ）及び７３（ＣＨ３−ＣＮＨ−ＯＣＨ３+）で検出された。
【０１０４】
Ｄ．３Ｚ−ノネナールの同定
９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸と精製された９−ＨＰＬとの反応物をヘキサンで抽出し、かつヘキサン抽出物のアリコートを前記のＧＣ−ＭＳシステムに注入した。２つのピークが３Ｚ−ノネナール（約８分）及び２Ｅ−ノネナール（約９分）の基準のスタンダードの滞留時間で留出した。ピーク面積によって判断すれば、２つのアルデヒドは１０：１の３Ｚ対２Ｅの比で形成した。２つのアルデヒドの同定のために、３Ｚ−ノネナールのスタンダードを化学的に合成し（例６参照）かつ２Ｅ−ノネナールをAldrich（Milwakee, WI）から購入した。９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸との９−ＨＰＬの反応によって製造された両方のアルデヒドに関する質量スペクトルは基準のスタンダードと実質的に同一である。３Ｚ−ノネナールはｍ／ｚ１４０（Ｍ+）、１２２（Ｍ+−Ｈ２Ｏ）及び１１１（Ｍ+−ＣＨＯ）において特徴的なフラグメントイオンを示すが、他方で２Ｅ−ノネナールはｍ／ｚ１３９（Ｍ+−Ｈ）、１２２（Ｍ+−Ｈ２Ｏ）及び１１１（Ｍ+−ＣＨＯ）でのイオンを示した。
【０１０５】
例６．３Ｚ−ノネナールの化学合成
３Ｚ−ノネナール合成をCorey及びSuggsの方法（１９７５）及びAndre及びFunkの方法（１９８６）の僅かな変更によって実施した。簡単にＮａＯＡｃ緩衝された、塩化メチレン中のピリジニウムクロロクロメートの溶液に、塩化メチレン中に溶解された３Ｚ−ノネノールを添加した。室温での撹拌の後に、ジエチルエーテルの添加によって反応を終了させ、かつ直ちにシリカゲルのカラムを通して濾過し、塩化メチレンで溶出させ、酸化剤を除去した。ＴＬＣ分析は、３Ｚ−ノネナールへの変換が約５０％完了であることを示した。粗製生成物をオープンベッドクロマトグラフィーによって単離し、かつＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。精製の間の全ての段階において、３Ｚ−ノネナールが４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナールに酸化しないように気をつけた。化学合成された３Ｚ−ノネナールのＧＣ−ＭＳ分析は、化学合成された３Ｚ−ノネナールの質量スペクトルが特徴的なフラグメントイオンを示す基準のスタンダードと実質的に同一であることを示した。
【０１０６】
例７．粗製の細菌溶解物中の９−ＨＰＬ酵素によって９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸から形成される生成物の同定
細菌による発現の粗製溶解物を９−ＨＰＬの起源として使用する場合に、精製された酵素を使用して得られた生成物と比較して異なる生成物プロフィールが得られた。以下に記載される分析調査（特にトラッピング試験）は、最初の酵素による生成物が精製酵素を使用して特徴付けられた生成物と同一であるという結論に導いた。しかしながら粗製の細菌溶解物中で２種の一次酵素生成物の１つ、３Ｚ−ノネナールは容易に酸化されて（恐らく非酵素的に）４−ヒドロキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＮＥ）、４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＰＮＥ）及び９−オキソ−ノナン酸及び４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナールの間に形成されるヘミアセタール誘導体（ヘミアセタール）からなる３種のアルデヒドの混合物になった。３種の極性のアルデヒドの構造及び３Ｚ−ノネナールからのそれらの形成を図６に示す。またこれは３Ｚ−ノネナールの２Ｅ−ノネナールへのマイナーな異性体化を示し、後者は精製酵素又は粗製の細菌溶解物のいずれかを使用しても少量が観察される。粗製の細菌溶解物において、他の一次９−ＨＰＬ生成物、９−オキソ−ノナン酸は主に未変換で回収される。少量のフラクションを図６に示されるようにヘミアセタールに変換する。
【０１０７】
メロン９−ＨＰＬを発現する粗製の細菌溶解物を使用して、９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸との反応を酸素電極（該電極は時間に対する溶液中のＯ２濃度を記録する）を使用してモニタした。酸素電極の閉鎖された２ｍｌのセル中でインキュベーションを実施することによって、９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸と粗製溶解物からの９−ＨＰＬの反応が溶液中でのＯ２濃度の低下と関連があることが観察された。Ｏ２濃度の低下はＯ２と３Ｚ−ノネナールとが反応して、３種の極性アルデヒドが得られることに相当する。定量的に、Ｏ２濃度の低下（消費されたナノモルのＯ２）はＨＰＬＣ分析によって検出された極性アルデヒド誘導体のナノモルにほぼ相当した。粗製の酵素調製物との対比によって、精製された９−ＨＰＬと９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸との反応は、溶液中の不変のＯ２濃度と関連した。
【０１０８】
メロン９−ＨＰＬを発現する粗製の細菌溶解物を使用して９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸との反応をＯ２電極を使用するか、又は前記のような２３５ｎｍでの分光分析によってモニタした。次いで該溶液をＣ１８抽出カートリッジ（Bond-Elut,Varian）を使用して抽出し、かつジエチルエーテルを使用して溶出させた。エーテル抽出物を蒸発させて乾燥させ、かつＨＰＬＣによって分析した。放射線標識された生成物のプロフィールを、［１−１４Ｃ］９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸（炭素−１において１４Ｃ）及び［Ｕ−１４Ｃ］９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸（全ての１８炭素で均一に１４Ｃ）を基質として使用して得た。ＵＶ吸収材料のプロフィールを２０５ｎｍ及び２２０ｎｍでのモニタリングによって検出した。１−１４Ｃ基質を使用する場合、基質の炭素−１を保持する生成物だけが放射線標識され（すなわち９−オキソ−ノナン酸及びヘミアセタール生成物）、かつＵ−１４Ｃ基質からは、全ての生成物が放射線標識された。
【０１０９】
１−１４Ｃ及び均一に標識された１４Ｃ基質の両方から形成される最も高い放射線標識ピークは９−オキソ−ノナン酸として同定された。これは本来の基質の炭素１−９に相当し、かつこの９−ＨＰＬの一次アルデヒド生成物は主にインキュベーションからインタクトに回収される。少量が図６に示されるようにヘミアセタールに変換される。
【０１１０】
３種の生成物は３Ｚ−ノネナールの最初の酸化を介して得られる。３Ｚ−ノネナールを酸化させて、まず４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＰＮＥ）を形成することは、恐らく粗製の細菌溶解物中で簡単に生じる非酵素的反応である。４−ＨＰＮＥは４−ＨＮＥに部分的に還元される。また４−ＨＰＮＥは９−オキソ−ノナン酸と反応して、ヘミアセタール誘導体を形成する（図６）。
【０１１１】
例８．粗製の細菌溶解物中の９−ＨＰＬの一次生成物が９−オキソ−ノナン酸及び３Ｚ−ノネナールであることの証拠
この一連の試験のために、粗製の９−ＨＰＬとの反応の前に、バッファー中の酸素濃度をゼロに減らす。これはナトリウムジチオナイトの溶液の少量のアリコートを添加することによって達成し、他方でＯ２濃度を酸素電極を使用してモニタする。
【０１１２】
酸素が枯渇したバッファーを使用して、９−ＨＰＬと９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸との反応速度はＯ２の不在によって低下しないことが示された。これは分光分析アッセイを使用して証明された（２３５ｎｍでのＵＶ吸収の消失速度）。
【０１１３】
［Ｕ−１４Ｃ］９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸（４０μｇ）と粗製の細菌溶解物からの９−ＨＰＬとの反応をＯ２枯渇したバッファー中で酸素電極の２ｍｌのセル中で実施した。反応がほとんど完了すると期待される１分後に、新たに調製されたＮａＢＨ４の１０ｍｇ／ｍｌ溶液５０μｌを注入し、かつ還元反応を５分間進行させた。この手順はアルデヒドを相応のアルコール（９−ヒドロキシ−ノナン酸及び３Ｚ−ノネノール）として還元（かつそれにより安定化された）。
【０１１４】
２ｍｌの溶液を引き続きＣ１８抽出カートリッジ（Bond-Elut,Varian）を使用して抽出し、かつ生成物をジエチルエーテルでの溶出によって回収した。５０μｇの未標識の基準の３Ｚ−ノネノール及び５０μｇの２Ｅ−ノネノール（Aldrichから入手）を試料のアリコートに添加し、次いで該試料をＨＰＬＣによって分析した。
【０１１５】
１つのクロマトグラムは放射線標識された生成物を示し、かつもう１つのクロマトグラムは２０５ｎｍでのＵＶプロフィールを示した。ＵＶクロマトグラムにおける２つのメインピークは２つの添加されたスタンダードに相当し、従って３Ｚ−ノネノール及び２Ｅ−ノネノールの正確な滞留時間を達成した。ＵＶクロマトグラムにおける後方のピークは使用されない基質（９−ヒドロキシ−リノール酸）及びその１０トランス−１２トランスの異性体の還元生成物に相当し、これらは本来の基質のマイナーな汚染物であることがある。
【０１１６】
１４Ｃクロマトグラムは９−ヒドロキシ−ノナン酸、一次酵素生成物のＮａＢＨ４−還元生成物、９−オキソ−ノナン酸として同定される３分で早くに溶出するピークを示した。８．８分で溶出する第２の放射線標識されたメインピークは３Ｚ−ノネノール、３Ｚ−ノネナールのＮａＢＨ４−還元生成物に相当した。２Ｅ−ノネノールはＮａＢＨ４−トラッピング実験においては検出されなかった。このことは相応のアルデヒド、２Ｅ−ノネナールは一次酵素生成物であるが、むしろ非酵素的な異性体化によって形成されることを暗示している。ＮａＢＨ４−トラッピング実験においては、その形成は３Ｚ−ノネナールのより安定なアルコールへの迅速な変換の故に低減された。
【０１１７】
トラッピング実験の結果は、粗製の細菌溶解物中の９−ＨＰＬの活性が９Ｓ−ヒドロペルオキシ−リノール酸の２つの一次アルデヒド、９−オキソ−ノナン酸及び３Ｚ−ノネナールへの変換に限定されることを示している。粗製の細菌溶解物中の９−ＨＰＬの反応から回収された他のアルデヒドは一次生成物と分子の酸素との引き続いての反応によるか、又は２Ｅ−ノネナールの異性体化によって形成された。
【０１１８】
例９．４−ヒドロペルオキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＰＮＥ）及び４−ヒドロキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＮＥ）の同定
例７に記載されたインキュベーションから、４−ＨＰＮＥは逆相ＨＰＬＣによって単離され、かつ１Ｈ−ＮＭＲ分光法（９．５８ｐｐｍ、ｄ，Ｊ＝７．８、Ｈ１；６．９ｐｐｍ、ｄｄ，Ｊ＝１５．９、６．２、Ｈ３；６．２５、ｄｄｄ，Ｊ＝１５．９、７．８、１．２、Ｈ２；４．６ｐｐｍ、ｑ（幾つかの微細構造を有する），Ｊ＞＞６．５、Ｈ４）によって特徴付けられた。４−ヒドロキシ−２Ｅ−ノネナール（４−ＨＮＥ）の形成はまた、４−ＨＰＮＥの非特異的な還元によって形成され、微生物溶解物中でみられた（例７参照）。酵素インキュベーションから回収された４−ＨＮＥはそのＵＶスペクトル及びＨＰＬＣ滞留時間においてCayman Chemical Co.（Ann Arbor, MI）から得られる４−ＨＮＥの基準の試料と同一であった。
【０１１９】
４−ＨＰＮＥの質量分析法のために、アリコートを、トリフェニルホスフィンを使用して還元して、相応のアルコール、４−ＨＮＥにし、かつＨＰＬＣによって再精製した。前記のＧＣ−ＭＳシステムを使用して４−ＨＮＥを直接及びＢＳＴＦＡでの処理の後に分析し、トリメチルシリルエーテル誘導体を得た。誘導体化されていない４−ＨＮＥに関して得られたフラグメントイオンは文献（Gardner et al., 1992）における報告と一致している。特に、以下のフラグメントイオンが観察された：ｍ／ｚ１３８（Ｍ+−Ｈ２Ｏ）、１２７（Ｍ+−ＣＨＯ）、１０９（Ｍ+−ＣＨＯ−Ｈ２Ｏ）、９９、８６及び８５。トリメチルシリルエーテル誘導体はｍ／ｚ１９９（Ｍ+−ＣＨＯ）、１５７（ＣＨＯ−Ｃ２Ｈ２−ＣＨ−ＯＳｉ（ＣＨ３）３+）及び１２９（ＣＨＯ−Ｃ２Ｈ２−ＣＨ−ＯＳｉ（ＣＨ３）３+−ＣＯ）において診断イオンを示した。
【０１２０】
本明細書を通して、種々の文献を引用している。これらの文献の開示は参照することにより本願にその全体が記載され、その発明の関連する分野の状態をより完全に記載するものとする。
【０１２１】
【外１】
【外２】
【外３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、グァバ−ＨＰＬ、バナナ−ＨＰＬ、トウガラシ−ＨＰＬ、アラブ−ＡＯＳ、アマ−ＡＯＳ、グアユール−ＡＯＳ、メロンＡＯＳ、及びメロン９−ＨＰＬのための全長のアミノ酸配列を示している。
【図２】 図２のＡはメロンｃＤＮＡ及び他のＨＰＬ及びＡＯＳに基づく縮重プライマーが結合して、１５０ｂｐ及び７０ｂｐのメロンからクローニングされた生成物を生成する領域を示し、図２のＢはグァバ−ＨＰＬ、バナナ−ＨＰＬ、トウガラシ−ＨＰＬ、アラブ−ＡＯＳ、アマ−ＡＯＳ、グアユール−ＡＯＳ、メロンＡＯＳ、及びメロン９−ＨＰＬからの部分アミノ酸配列のアラインメントを示している。
【図３】 図３はメロンＨＰＬ及びＡＯＳの１５０ｂｐ及び７０ｂｐを得るために使用される縮重プライマーの配列を示している。
【図４】 図４はメロンＨＰＬ及びＡＯＳの３つの異なる１５０ｂｐのクローンのアミノ酸配列のアラインメントを示している。
【図５】 図５はメロンからのクローンＡ、クローンＢ及びクローンＣの３′末端によってコードされる部分アミノ酸配列及びグァバ、トウガラシ及びバナナからの１３−ＨＰＬ及びアマ、グアユール及びアラビドプシスからのＡＯＳのＣ末端配列の間の同一性を比較している。
【図６】 図６はメロン９−ＨＰＬ：９−オキソノナン酸及び３Ｚ−ノネナールの存在下での９Ｓ−ヒドロペルオキシリノール酸の２つの一次酵素生成物の図を示している。
【配列表】
Claims (9)
- ９-ヒドロペルオキシド基質及び１３-ヒドロペルオキシド基質に対する分解活性を有し、配列番号７のアミノ酸配列を含む、単離された脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ。
- ストリンジェントな条件下でCucumis sativus中に存在するリアーゼをコードする核酸とハイブリダイズせず、配列番号８の核酸とハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件に特異的にハイブリダイズする、核酸によってコードされる請求項１記載のリアーゼ。
- リアーゼがCucumis meloから単離されたタンパク質中に存在するアミノ酸配列を含む、請求項１記載のリアーゼ。
- 請求項１記載のリアーゼをコードする単離された核酸。
- 配列番号８に記載される核酸配列を有する、請求項４記載の核酸。
- 請求項４に記載の核酸を有するベクター。
- 請求項４に記載の核酸を有する外因性核酸を有する細胞。
- （９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９-ヒドロペルオキシオクタデカ-１０，１２-ジエン酸又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）９-ヒドロペルオキシオクタデカ-１０，１２，１５-トリエン酸をＣ9−アルデヒド及びＣ9−オキソノナン酸に分解する方法において、請求項１に記載のリアーゼを（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）９-ヒドロペルオキシオクタデカ-１０，１２-ジエン酸又は（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）９-ヒドロペルオキシオクタデカ-１０，１２，１５-トリエン酸と接触させることを特徴とする方法。
- （９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３-ヒドロペルオキシオクタデカ-９，１１-ジエン酸又は（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）１３-ヒドロペルオキシオクタデカ-９，１１，１５-トリエン酸をＣ6−アルデヒド及びＣ12−オキソカルボン酸に分解する方法において、請求項１記載のリアーゼを（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ）１３-ヒドロペルオキシオクタデカ-９，１１-ジエン酸又は（９Ｚ，１１Ｅ，１３Ｓ，１５Ｚ）１３-ヒドロペルオキシオクタデカ-９，１１，１５-トリエン酸と接触させることを特徴とする方法。
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