JP4955764B2

JP4955764B2 - 酵母発現系における組み換え外来タンパク質の分泌効率を増強するための方法

Info

Publication number: JP4955764B2
Application number: JP2009516385A
Authority: JP
Inventors: リム・ヒュンクォン; キム・スングン
Original assignee: Mogam Institute for Biomedical Research
Current assignee: Mogam Institute for Biomedical Research
Priority date: 2006-06-20
Filing date: 2006-06-20
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2026-06-20
Also published as: EP2041280B1; CN101473035A; WO2007148840A1; CN101473035B; US8298787B2; JP2009540820A; EP2041280A1; US20100184136A1; EP2041280A4

Description

本発明は、酵母発現系における組み換え外来タンパク質の分泌効率を改善するための方法に関する。

微生物を使用する外来タンパク質の大量産生は、タンパク質製薬産業における最も重要な技術領域である。所望される産物を回収および生成するためには、組み換え外来タンパク質を細胞内で発現させてもよく、または細胞外に分泌させてもよい。タンパク質の細胞内発現時に、タンパク質の過剰発現は、多くの場合、非活性および水不溶性形態のタンパク質の細胞内蓄積を頻繁にもたらし得、そして固体の微生物を破砕するための煩雑なプロセスおよび所望されるタンパク質を細胞に存在する多様な種類の宿主タンパク質から分離するための複雑かつ困難な精製プロセスのような産生性を低下させる要因である多様な欠点を生じ得る。これに対して、所望されるタンパク質の細胞外分泌は、前者のようなタンパク質の細胞内発現に関連する困難および問題を回避するための容易な方法を提供し得る。さらに、細胞外タンパク質分泌は、転写プロセス後のタンパク質の正確なフォールディングおよび修飾の後にしか首尾よく達成することができないため、細胞外分泌を介するタンパク質産生は、正確な三次構造を有する活性形態の可溶性タンパク質を得ることが可能な便益性を提供する。従って、タンパク質の細胞外分泌は、タンパク質の産生収量ならびにタンパク質の品質管理において、組み換え外来タンパク質の細胞内蓄積系より優れていると言うことができる。

しかし、多くの場合、強力なプロモーターを使用する組み換えタンパク質発現における細胞外タンパク質分泌系は、細胞内蓄積系と比較して、有意に低いレベルの発現および分泌を頻繁に蒙る。細胞外分泌のそのような欠点および問題を克服するために、タンパク質の細胞外分泌収量を増強するための多数の研究が行われている。ほとんどの研究は、タンパク質の効率的な分泌のためのシグナル配列の直接的最適化、または新規かつ強力な分泌シグナル配列を見出すことに焦点を当てている（非特許文献１；および非特許文献２）。

別のアプローチとして、分子生物学的技術（非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５）を使用して、組み換え外来タンパク質の過剰発現時の初期の律速段階に対応するタンパク質フォールディングを容易にすることによって、ならびにタンパク質のフォールディングおよび水可溶化を支援するシャペロンの過剰発現の導入を介して、タンパク質の細胞外分泌前に生じ得る不溶性沈殿を防止することによって、所望されるタンパク質の分泌効率を増強するための多くの研究が行われている。

酵母における外来組み換えタンパク質の発現を誘導するために従来使用されているガラクトースプロモーターは、誘導因子としてガラクトースを利用する強力な誘導性プロモーターである。タンパク質発現の強力な誘導は、外来タンパク質の細胞内蓄積または発現レベルを増大するのに有利であり得るが、これは、所望されるタンパク質を細胞外で分泌させることを所望する場合、分泌の初期の段階の細胞における不溶性沈殿の発生による分泌効率の減少または細胞機能不全をもたらし得る。そのような事象はまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系および酵母発現系のような組み換え発現系においても時折観察される。そのような難点を克服するために、インキュベーション温度を低下させるための多様な試みが行われている（非特許文献６；および非特許文献７）。

しかし、インキュベーション温度を低下させるそのような方法は、長期のインキュベーション期間による組み換え外来タンパク質の産生コストの増加に関連する欠点を蒙る。従って、インキュベーション温度の低下を伴わずに、ガラクトース誘導性プロモーターの活性の調節を介して組み換え外来タンパク質の分泌効率を増強することが可能な方法の開発が、当該技術分野において緊急に必要とされている。

この目的のために、ガラクトース誘導性プロモーターの活性が、宿主におけるガラクトースの利用可能性を制御することによって調節され得るという考えに基づいて、本発明の発明者らは、ガラクトースの吸収に関与するガラクトースパーミアーゼ遺伝子を欠く変異株を使用することによってか、またはカタボライト抑制を仲介するガラクトースとグルコースとの所定の比率の同時供給を伴う流加培養を介して、形質転換酵母株を培養することによって、組み換え外来タンパク質の分泌効率を改善することが可能であることを確認した。本発明は、これらの所見に基づいて完成されている。

Nucleic Acids Res Suppl.,2003(3):261-2 Biochem Cell Biol.1993,71:401-5 Robinson and Wittrup,Biotech.Prog.,11:171,1995 Robinson et al.,Biotechnology,12:381-384,1994 Wulfing and Plukthun,Mol.Microbiol.12(5):685-692,1995 Baneyx F.,Curr.Opin.Biotechnol.,10:411-421,1999 George Georgiou and Pascal, Curr. Opin. Biotechnol., 7:190-197,1996

従って、本発明は、上記の課題を鑑みて達成されたものであり、そして本発明の目的は、酵母宿主株の遺伝子改変または培養条件の改変によって、酵母発現系における組み換え外来タンパク質の細胞外分泌効率を改善するための方法を提供する。

本発明の態様に従って、上記および他の目的は、（ａ）酵母宿主を、ガラクトース誘導性プロモーター、分泌シグナル配列および外来タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる組み換え外来遺伝子構築物で形質転換して、形質転換酵母株を構築する工程；ならびに（ｂ）形質転換酵母株を、ガラクトース誘導性プロモーターの活性が制御される条件下で培養する工程を含んでなる、外来タンパク質の分泌効率を改善するための方法の供給によって達成することができる。

本発明に従う外来タンパク質の分泌効率を改善するための方法は、細胞においてガラクトース誘導性プロモーターの誘導因子として機能するガラクトースのレベルの適度な制御を介して、従来のガラクトース誘導性プロモーターに基づく酵母発現系により蒙る組み換え外来タンパク質の過剰発現誘導性の不溶性沈殿を低減することによって、組み換え外来タンパク質の分泌効率の改善を達成することができる。従って、本発明の方法は、酵母発現系における組み換え外来タンパク質の産生性を改善し、そして産生コストを下げるのに有効である。

本発明の上記および他の目的、特徴ならびに他の利点は、添付の図面とあわせて、以下に記載の詳細な説明からより明確に理解されよう。図面について：

図１は、培養培地中のガラクトースが酵母細胞膜を通過し、そして外来タンパク質発現を誘導するプロモーターに作用するプロセス、および細胞においてグルコースによるカタボライト抑制が生じるプロセスを例示する略式図である。図２は、本発明において使用される組み換えＬＫ８タンパク質発現ベクターＭδＬＫ８の切断地図である。図３は、それぞれがＧａｌ２遺伝子を例外として同じ遺伝的背景を有する２つの酵母宿主を、唯一の炭素源としてガラクトースの供給を伴って培養した場合のガラクトース消費率を経時的に比較したグラフである。図４は、形質転換酵母株Ａの外来遺伝子の発現時における細胞内の全外来タンパク質のウエスタンブロット分析の結果を、発現誘導期間と共に示す写真である。図５は、形質転換酵母株Ａにおける細胞内の水溶性外来タンパク質のウエスタンブロット分析の結果を示す写真である。図６は、形質転換酵母株Ｂの外来遺伝子の発現時における細胞内の全外来タンパク質のウエスタンブロット分析の結果を、発現誘導期間と共に示す写真である。認められ得るように、外来タンパク質の細胞内不溶性蓄積は、宿主としてＧＡＬ２遺伝子を有する酵母株Ａを使用するタンパク質発現と比較して、時間と共に相対的に減少する。図７は、形質転換酵母株ＡおよびＢの流加培養による外来遺伝子の発現時において培養培地に分泌される組み換え外来タンパク質の量を、発現誘導期間に対して比較したグラフである。ならびに図８は、酵母における外来タンパク質の発現時に、ガラクトース誘導性のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子（ＰＤＩ１）の同時発現を可能にするように適応された発現ベクターｐＭＰＤＩ１の切断地図である。

以下に、本発明をより詳細に説明する。

本発明に従う外来タンパク質の分泌効率を改善するための方法は、（ａ）酵母宿主を、ガラクトース誘導性プロモーター、分泌シグナル配列および外来タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる組み換え外来遺伝子構築物で形質転換して、形質転換酵母株を構築する工程；ならびに（ｂ）形質転換酵母株を、ガラクトース誘導性プロモーターの活性が制御される条件下で培養する工程を含んでなる。

ここでは、工程（ａ）は、酵母宿主を、組み換え外来遺伝子発現構築物で形質転換するために行われる。形質転換方法に特に制限はない。好ましくは、形質転換は、組み換え外来遺伝子構築物の酵母宿主の染色体への挿入（もしくは複数の挿入）か、または遺伝子構築物が環状ベクターの形態で存在することができるような遺伝子構築物の酵母宿主の細胞質への挿入によって、行われる。遺伝子構築物の染色体への組み入れは、酵母を使用する形質転換において「組込み」と呼ばれるが、環状ベクターの形態の遺伝子構築物の酵母細胞質への組み入れは、エピソーム発現方法を指し、ここで、外来遺伝子は、エピソームの形態で導入されて、酵母系に適用可能であるベクター（またはプラスミド）への外来遺伝子発現構築物の挿入後に、外来タンパク質を発現および分泌する。エピソームは、細胞質に存在する環状ＤＮＡであり、そして宿主細胞の染色体とは独立して、遺伝子機能を実施することが可能である。

本発明において使用することができるガラクトース誘導性プロモーターの例には、誘導因子としてガラクトースを使用することによって、プロモーターが酵母系において機能的に作動可能である限り、特に限定されない任意の種類のプロモーターが含まれ得る。好ましくは、配列番号１に記載のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ１プロモーター、配列番号２に記載のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ１０プロモーター、配列番号３に記載のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ７プロモーター、またはそれらの組み合わせもしくは融合を使用してもよい。ＧＡＬ１がより好適である。

分泌シグナル配列は、酵母系において分泌シグナルとして使用されるか、または当該技術分野において従来から公知である任意の配列であってもよい。例えば、シグナル配列は、配列番号４に記載のＭＡＴαシグナル、配列番号５に記載のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＫ１キラートキシンシグナル（Brown,J.L. et al.,The K1 killer toxin: molecular and genetic applications to secretion and cell surface assembly. In:Johnston,J.R.Molecular Genetics of Yeast-a practical approach. The practical approach series,1994,p.217-265；およびTokunaga,M. et al., Biochem.Res.Commun.,144:613-619,1987）、配列番号６に記載のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のインベルターゼシグナル（Japanese Unexamined Patent Publication No.1985-041488）、配列番号７に記載のクリュイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）のキラートキシンシグナル（Sugisaki,Y. et al.,Eur.J.Biochem., 141:241-245,1984）、配列番号８に記載のピキア・アカシアエ（Ｐｉｃｈｉａａｃａｃｉａｅ）のキラートキシンシグナル（US Patent No.6,1,07,057）、ハンセニアスポラ・ウバラム（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａｕｖａｒｕｍ）のキラートキシンシグナル（Radler,F. et al.,Arch.Microbiol.,154(2):175-178,1990；およびSchmitt,M.J. et al.,J.Virol.,68(3):1765-1772,1994）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）（ハンセヌラル（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｒ））アノマラ（ａｎｏｍａｌａ）のキラートキシンシグナル、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択してもよい。

さらに、タンパク質またはペプチドの分泌効率を増強するために、分泌シグナル配列は、プロペプチド配列、なおさらに、（キラー発現１のための）ＫＥＸ１またはＫＥＸ２（US Patent No.4,929,553）のようなシグナルペプチダーゼの認識部位をさらに含んでもよい。シグナルペプチダーゼの認識部位の例として、Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒを挙げることができる。

同時に、遺伝子操作技術および培養技術のような多様な方法を使用して、ガラクトース誘導性プロモーターの活性が制御される条件を確立してもよい。ガラクトース誘導性プロモーターの活性を制御することが可能である限り、所望される培養条件の確立のためのそのような技術に特に制限はない。好ましくは、培養培地から形質転換酵母株へのガラクトースの輸送率を低減することによって、ガラクトース誘導性プロモーターの活性を制御してもよい。

これに関して、ガラクトースの細胞への送達を低減することが可能である限り、ガラクトースの細胞内輸送率を低減するために、遺伝子操作に基づく株改変技術および培養技術を含むあらゆる方法を使用してもよい。例えば、標的として形質転換酵母のガラクトースパーミアーゼ遺伝子を非機能的にするために、多様な遺伝子操作技術を使用してもよい。好ましくは、ガラクトースパーミアーゼ遺伝子を欠損させるか、またはそれを部分的に破壊して、それによって非機能的にすることによって、ガラクトースの輸送率を低減することが好適である。

方法が、ガラクトースパーミアーゼの機能を（部分的もしくは完全に）無効にすることを意図する限り、遺伝子の欠損導入または破壊のための方法に特に制限はない。例えば、遺伝子の欠損（欠失）または部分的（もしくは完全な）破壊は、当該技術分野において従来から公知である多様な遺伝子操作技術を使用して行ってもよい。

さらに、本発明において使用することができるガラクトースパーミアーゼ欠損株は、特に制限されない。例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＪ３５０１（ＡＴＣＣ２０８２８０）が、典型的に公知である。

好ましくは、工程（ｂ）におけるガラクトース誘導性プロモーター活性のモジュレーションのための条件は、細胞の培養中における培養ブロスへの所定の比率のガラクトースおよびグルコースの同時供給である。バッチ培養、連続培養、流加培養などを含む培養方法に特に制限はない。流加培養が好適である。

さらに、グルコースカタボライト抑制がガラクトースの細胞内輸送の阻害を生じる一方、ガラクトースによる誘導が阻害されない限り、ガラクトースおよびグルコースの比率に特に制限はない。好ましくは、ガラクトースおよびグルコースの比率は、４：１〜１：１の範囲にある。

ガラクトース誘導性プロモーター、分泌シグナル配列および外来タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる組み換え外来遺伝子構築物による酵母宿主の形質転換による形質転換酵母株の構築において、酵母宿主は、好ましくは、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下で発現されるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼコード遺伝子を含有する組み換え外来遺伝子構築物で形質転換される。

好ましくは、外来タンパク質の分泌効率を改善するための方法は、工程（ａ）と（ｂ）との間に、工程（ａ）の形質転換酵母株を、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下で発現されるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼコード遺伝子を含有する組み換え外来遺伝子構築物でさらに形質転換する工程（ａ−１）をさらに含んでなる。

上記のさらなる工程（ａ−１）は、細胞内において産生されるタンパク質の細胞外分泌に対して優れた効果を及ぼすタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子による酵母株の再形質転換を指す。

タンパク質ジスルフィドイソメラーゼコード遺伝子による酵母株の形質転換は、ガラクトース誘導性プロモーター、分泌シグナル配列および外来タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる組み換え外来遺伝子構築物による酵母宿主の形質転換を介して、形質転換酵母を構築する工程（ａ）の前のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼコード遺伝子による酵母株の先の形質転換によってか、またはそうでなければ工程（ａ）後のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼコード遺伝子による形質転換酵母株のさらなる形質転換工程（ａ−１）によって、行うことができる。

本発明において使用することができるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼコード遺伝子は、それらがジスルフィド異性化を実施することができる限り、所定の種由来の特定の配列に特に限定されない。好ましくは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子は、配列番号９に記載のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＰＤＩ１（Tachikawa,H. et al.,J.Biochem.,110(2):306-313,1991）、配列番号１０に記載のタガヤサンミナシ（Ｃｏｎｕｓｔｅｘｔｉｌｅ）のＰＤＩ（US Patent Application No.US2004/0203132A1）、配列番号１１に記載のＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＰＤＩ（Page,A.P., DNA Cell Biol., 16(11): 1335-1343,1997）、配列番号１２に記載のヒト膵臓ＰＤＩ遺伝子（Desilva,M.G. et al., DNA Cell Biol.,15(1):9-16,1997）、配列番号１３に記載の麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）のＰＤＩ（WO95/00636）、配列番号１４に記載のカンジダボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ）のＰＤＩ（US Patent No.5,965,426）、配列番号１５に記載のフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）のＰＤＩ（US Patent No.5,700,659）およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子構築物は、特定のベクターまたはそれらの均等物に特に限定されない。図８に示される切断地図を有するｐＭＰＤＩが好適である。

酵母発現系において、強力な発現強度を有するガラクトース誘導性プロモーターが広範に使用されている。ガラクトース誘導性プロモーターは、誘導因子としてのガラクトースの細胞内での存在下で活性化され、次いで、上記のガラクトース誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子の大量発現をもたらす。そのような誘導性のため、ガラクトース誘導性プロモーターは、酵母における外来組み換えタンパク質の発現において有用な手段として用いられる。

しかし、先に考察したように、本発明者らは、外来タンパク質の不溶性沈殿が、外来タンパク質の分泌が生じる前の発現の初期段階で細胞において生じることを観察した（図４を参照のこと）。

本発明者らは、上記の課題を解決し、外来タンパク質の細胞外分泌を改善するための多様な広範ならびに集約的研究および実験を行った。この目的のために、細胞における過剰なガラクトースによるガラクトース誘導性プロモーターの過剰活性化が、外来タンパク質の分泌前の外来タンパク質の細胞内不溶性沈殿を主に担うという事実に基づいて、本発明者らは、組み換え外来タンパク質の分泌効率が、ガラクトース誘導性プロモーターの発現誘導因子として使用されるガラクトースの細胞内流入を制御することによって改善されるかどうかを確認するために研究した。

まず、ガラクトースの細胞内取り込み経路の分析時に、ガラクトースの細胞内輸送が多様な経路を介して生じ得る。ガラクトース輸送の主な経路は、ガラクトースオペロンの構成分として、ガラクトースの存在下で発現され、そしてガラクトースに最も高い親和性を示すガラクトースパーミアーゼ（Ｇａｌ２）である。

しかし、宿主細胞がガラクトースパーミアーゼ（Ｇａｌ２）活性を欠損する場合であっても、ガラクトース輸送は完全には遮断されない。その代わり、そのようなＧａｌ２欠損宿主細胞は、さらなる方法によって、例えば、ＨＸＴ１、ＨＸＴ９、ＨＸＴ１１、およびＨＸＴ１４（Wieczorke R. et al.,FEBS.Lett.464(3): 123-128,1999）のような細胞膜上に存在する多様な種類のヘキソーストランスポーターを介して、ガラクトースの細胞内輸送を達成することができるが、但し、他のヘキソーストランスポーターは、ガラクトースに相対的に低い親和性を有する。そのため、ＧＡＬプロモーターの作動に必要な少なくとも最小量のガラクトースを、細胞に輸送することができる（図１を参照のこと）。図１は、培養培地中のガラクトースが酵母細胞膜を通過し、次いで、外来タンパク質発現を誘導するプロモーターに作用するプロセス、および細胞においてグルコースがカタボライト抑制を生じるプロセスを例示する概念図である。

図１に示されるこのスキームに基づいて、本発明者らは、Ｇａｌ２、ガラクトースの主要なトランスポーターをコードする遺伝子（Ｇａｌ２）を欠損する酵母宿主を使用することによって、ガラクトースの細胞内輸送を最小限にすることが可能であり得ることを考慮した。この目的のために、まず、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下で外来遺伝子を発現する組み換え外来遺伝子構築物は、宿主としてＧａｌ２遺伝子の欠損を伴うサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＪ３５０１（ＡＴＣＣ２０８２８０）（以後、「酵母宿主Ｂ」と称する）に導入され、それによって、形質転換酵母（以後、「形質転換酵母株Ｂ」と称する）が構築されるが、そのようにして形質転換された酵母株を、ガラクトース含有培地において培養した。その後、形質転換酵母株Ｂにおける組み換え外来タンパク質の分泌効率を、宿主としてＧａｌ２遺伝子の欠損を伴わない正常な酵母株（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２８０５、以後、「酵母宿主Ａ」と称する）の形質転換によって得られた別の形質転換酵母株（以後、「形質転換酵母株Ａ」と称する）における分泌効率と比較した。

図３に示されるように、それぞれがＧａｌ２遺伝子を例外として同じ遺伝的背景を有する酵母宿主ＡおよびＢを、唯一の炭素源としてガラクトースを含有する培地において培養し、そして培養培地における経時的なガラクトースの濃度を決定し、そして２つのグループ間で比較した場合、ガラクトースの細胞への流入率が、Ｇａｌ２遺伝子の存在／非存在に依存して有意に変動することが確認された。

さらに加えて、外来タンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロット分析を介して、Ｇａｌ２遺伝子の非作動により細胞へのガラクトースの低い流入率を有する酵母宿主Ｂを、外来タンパク質の発現のための宿主として用いた場合（図６を参照のこと）、酵母宿主Ａを、外来タンパク質の発現のための宿主として用いた場合（図４および５を参照のこと）と比較して、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下で外来タンパク質の過剰発現を生じる外来タンパク質の細胞内不溶性沈殿が相対的に減少したことが確認された。さらにまた、外来タンパク質の細胞外分泌および分泌効率が増加する培養培地に分泌される外来タンパク質のＨＰＬＣ分析を介して、本発明の究極的目的がまた、実際の培養条件下における外来タンパク質の不溶性沈殿の減少と共同して達成されたことが確認された（図７を参照のこと）。本発明の一実施形態では、ガラクトースの細胞内流入を低減するために、ガラクトースパーミアーゼ遺伝子の欠失を伴う酵母株を使用したが、ガラクトースパーミアーゼ遺伝子の機能を抑制するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、抗体、アンタゴニストなどを、同じ目的のために使用してもよい。

ガラクトースの細胞内での利用可能性の適切な調節のために、本発明者らは、あるストラテジーを適応し、ここで、カタボライト抑制（グルコースが細胞の培養培地環境において優勢な炭素源である場合にグルコース利用を選好する所定の糖代謝遺伝子の発現の抑制）を引き起こすグルコースおよびガラクトース誘導性プロモーターの誘導因子としての役割を果たすガラクトースを、外来タンパク質の過剰発現が、培養培地に含まれるグルコースの割合に依存して、カタボライト抑制により適切に調節されるように、２つの糖の同時消費を誘導するために流加培養培地に「同時供給」した。

図１は、細胞中のガラクトース誘導性プロモーターの誘導および抑制に対するガラクトースおよびグルコースの２つの逆の作用を例示する略式図である（K.-D.Entian and H.-J. Schuller,Glucose Repression in Yeast.In:Yeast Sugar Metabolism,F.K.Zimmermann,K.-D.Entian.,eds.pp.409-434.Technomic Publishing AG,Bassel,Switzerland,1997）。

これに関して、グルコースによるガラクトース誘導性プロモーターの完全な抑制を、培養培地において０．１ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を維持するために適応されるグルコース制限流加培養を介して混合炭素源を供給することによって、防止した。

本発明者らは、上記の方法を、混合炭素源供給ストラテジーと命名した。本発明では、多様な比率のグルコース／ガラクトースを含有する流加培養培地において細胞を培養し、そして外来タンパク質の分泌を、各場合について人為的に制御した。さらに、異なる比率のグルコース／ガラクトースにおいて分泌される外来タンパク質の量を比較し、それによって、異なるガラクトース輸送能を有する酵母宿主株における外来タンパク質の分泌に必要な至適グルコース／ガラクトース比率を確認した（以下の表１および２を参照のこと）。

本発明によって設計される混合炭素源供給方法が酵母宿主ＡおよびＢに適用される場合、細胞あたりの外来タンパク質の産生収量および誘導因子あたりの外来タンパク質の産生収量は、唯一の炭素源としてガラクトースを使用する従来の発現誘導方法と比較して、それぞれ、１０５％（表１）および８５％（表２）だけ増加した。さらに、上記の形質転換酵母株ＡおよびＢを、混合炭素源供給方法の適用によって、それぞれ、流加培養した場合、異なる至適グルコース／ガラクトース濃度が存在することが示された。

ガラクトースの相対的に高い細胞内流入および消費率を有する形質転換酵母株Ａは、外来タンパク質の至適分泌のために、約１：１のグルコース／ガラクトース比率の混合炭素源を示したが、ガラクトースパーミアーゼの非作動により減少したガラクトース輸送能を有する形質転換酵母株Ｂは、約２：３の至適比率の混合炭素源（グルコース／ガラクトース）を示し、従って、形質転換酵母株Ａと比較して、培地中に相対的に高い割合のガラクトースを必要とした（表１および２を参照のこと）。これらの結果は、ガラクトース誘導性プロモーターを使用する外来タンパク質発現系における外来タンパク質の発現に対するガラクトース輸送能および混合炭素源の効果が、本発明の目的に良好に一致することを間接的に実証する。

一方、本発明者らは、タンパク質分泌効率が、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下で発現される外来遺伝子構築物との共同で、タンパク質フォールディングの支援として公知であるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子（ＰＤＩ１）による宿主細胞の形質転換によって改善されるかどうかを確認するために研究した。

まず、配列番号９に記載のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子（ＰＤＩ１）を含有する発現ベクターｐＭＰＤＩ１を構築し、そして外来遺伝子構築物と共同で得られる発現ベクターを、それぞれ、酵母宿主株ＡおよびＢに形質転換した。次いで、形質転換酵母株を、ガラクトース含有培地で培養し、そしてタンパク質分泌効率を決定した（表３を参照のこと）。結果として、外来遺伝子構築物およびｐＭＰＤＩ１ベクターによる酵母宿主Ａの形質転換は、対照群（ＰＤＩ１遺伝子が組み入れられていない酵母宿主Ａ）と比べて、タンパク質分泌効率において３０％の増加を示したが、酵母宿主Ｂを使用する形質転換は、対照群と比べて、タンパク質分泌効率において７２％の増加を示したことが認められ得る。

上記において詳細に検討したように、本発明に従う外来タンパク質の分泌効率を改善する方法は、細胞においてガラクトース誘導性プロモーターの誘導因子として機能するガラクトースのレベルの適度な制御を介して、従来のガラクトース誘導性プロモーターに基づく酵母発現系において遭遇する外来タンパク質の過剰発現誘導性の不溶性沈殿を低減することによって、組み換え外来タンパク質の分泌効率の改善を可能にする。従って、本発明の方法は、酵母発現系における組み換え外来タンパク質の産生性を改善し、そして産生コストを下げるために有用に用いることができる。

これより、以下の実施例を参考に、本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのみに提供され、本発明の範囲および趣旨を制限するものと解釈すべきではない。

実施例１：酵母宿主ＡおよびＢの間の細胞内ガラクトース輸送能の比較
酵母宿主Ａ（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２８０５、遺伝子型：ＭＡＴα ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ｐｒｂ１−Δ１．６Ｒｈｉｓ３−Δ２００ｕｒａ３−５２ＧＡＬ２ｃａｎ１、Sohn,J.H.et al.Proc.Biochem., 30:653-660,1995；およびKim,T.H. et al.Biotechnol.Lett.24:279-286,2002）および酵母宿主Ｂ（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＪ３５０１、遺伝子型：ＭＡＴα ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ｐｒｂ１−Δ１．６Ｒｈｉｓ３−Δ２００ｕｒａ３−５２ｇａｌ２ｃａｎ１、ＡＴＣＣ２０８２８０、米国）を、ＹＰＤ寒天プレート上に画線し、そして３０℃で約１８時間、インキュベーターに配置し、そしてコロニーを単離した。酵母株ＡおよびＢの各コロニーを、個別のＹＰＧ［酵母抽出物１％（ｗ／ｖ）、ペプトン２％（ｗ／ｖ）、およびガラクトース２％（ｗ／ｖ）］液体培地に播種し、そしてインキュベーターにおいて、３０℃で約８０時間、振盪培養した。ガラクトース消費を経時的に決定するために、培地中の残留ガラクトース濃度は、３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）アッセイを介する還元糖の定量化（Mohun,A.F. and Cook,I.J.,J. Clin. Pathol.,15:169-180,1962、図３を参照のこと）によって決定した。

図３は、それぞれがＧａｌ２遺伝子の欠損を例外として同じ遺伝的背景を有する２つの酵母宿主を、唯一の炭素源としてガラクトースの供給を伴って培養した場合のガラクトース消費率を経時的に比較したグラフである。図３において認められ得るように、Ｇａｌ２遺伝子欠損酵母宿主Ｂは、Ｇａｌ２遺伝子が正常に機能する酵母宿主Ａと比較して、単位時間あたりのガラクトースの消費率の減少を示したことが確認された。

実施例２：酵母宿主ＡおよびＢを使用する外来タンパク質を分泌する酵母形質転換体の構築
２−１．酵母宿主Ａを使用する外来タンパク質を分泌する酵母形質転換体Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２８０５／ＭδＬＫ８の構築
本発明者らにより、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）において組み換えＬＫ８を産生させるために使用した発現ベクターｐＭＢＲＩ−ＬＫ８（Korean Patent Publication Laid-open No.2004-0069840）を使用して、α−因子分泌シグナルおよびＬＫ８ｃＤＮＡの同時単離を行った。この出願は、本明細書においてその全体が参考として援用される。ｐＭＢＲＩ−ＬＫ８ベクターを、ＥｃｏＲＩで７時間、処置し、そしてＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を使用して、洗浄した。次いで、ベクターを、ＢａｍＨＩで７時間、処置し、そしてＤＮＡを、ゲル電気泳動によって単離した。ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を使用して、配列番号４のα−因子分泌シグナルおよび配列番号１６のＬＫ８ｃＤＮＡ配列を有するＤＮＡフラグメントを得た。そのようにして得られたＤＮＡフラグメントを、ｐ４２６ＧＡＬ１（ＡＴＣＣ８７８３３、米国）ベクターのＧＡＬ１プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターとの間に挿入して、それによって、酵母において組み換えＬＫ８を産生させるために使用することができる発現ベクターｐＭＣＬＫ８（６．９ｋｂ）を構築した。得られるベクターｐＭＣＬＫ８は、ＧＡＬ１プロモーターを含有し、それ故、ガラクトースによるタンパク質発現の誘導を可能にする。酵母の形質転換後、選択マーカーとしてＵＲＡ３マーカーを使用する選択培地において、形質転換体を選択した。以後、α−因子分泌シグナル配列およびＬＫ８ｃＤＮＡからなる発現カセットを酵母の染色体に挿入するために、所望される遺伝子を、δ配列、酵母染色体に局在する転移因子の１つに挿入することができることを確実にするように、以下のように、δ配列および挿入されたベクターの選択のためのネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を含有するｐδｎｅｏベクター（Lee,F.W. and Da Silva,N.A.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,48:339,1997）に、発現カセットを挿入した。

まず、ＧＡＬ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターの両方の末端をそれぞれ切断する制限酵素ＳａｃＩおよびＫｐｎＩを使用して、ｐＭＣＬＫ８ベクターからＬＫ８発現カセットを分離した。ここでは、ＬＫ８発現カセットおよびｐδｎｅｏベクターの両方の配列が、ＳａｌＩ制限部位を含有し、そしてｐδｎｅｏベクター上に存在するＳａｌＩ制限部位は、ベクターの酵母染色体への組み入れに本質的に必要であるため、ＤＮＡブランティングキット（Ｔａｋａｒａ、日本）を用いて、ＬＫ８発現カセット上に存在するＳａｌＩ制限部位を取り出した。一方、ｐδｎｅｏベクターはＫｐｎＩ制限部位を含有しないため、上記のＤＮＡブランティングキットを使用して、ｐδｎｅｏベクターのＸｂａＩ制限部位および分離されたＬＫ８発現カセットのＫｐｎＩ制限部位の両方を平滑末端に変換した。次いで、そのようにして得られたＬＫ８発現カセットおよびｐδｎｅｏベクターを、リガーゼで連結して、組み換えベクターを構築し、ＭδＬＫ８組み換え発現ベクターと表した（図２）。図２は、本発明において使用した組み換えＬＫ８タンパク質発現ベクターＭδＬＫ８の切断地図である。

その後、ＡｌｋａｌｉＣａｔｉｏｎＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ、加国）を使用して、上記の組み換えＭδＬＫ８発現ベクターで、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２８０５（Sohn,J.H. et al.Proc.Biochem., 30:653-660,1995；およびKim,T.H. et al.,Biotechnol.Lett.,24:279-286,2002）を形質転換した。ＭδＬＫ８組み換え発現ベクターで形質転換した酵母株を、抗生物質Ｇ４１８硫酸塩を含有するＹＰＤプレート［２％（ｗ／ｖ）ペプトン、１％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、２％（ｗ／ｖ）グルコースおよび２％（ｗ／ｖ）寒天］を使用して、選択した。Ｇ４１８硫酸塩の濃度を、それぞれ５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌおよび１５ｇ／Ｌに調整し、それによって、最も高い抗生物質耐性酵母株を選択し、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２８０５／ＭδＬＫ８と表した。以後、この酵母株を、簡潔および簡便のために「形質転換酵母Ａ」と称する。

２−２：酵母宿主Ｂを使用する外来タンパク質を分泌する酵母形質転換体Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＪ３５０１／ＭδＬＫ８の構築
実施例２−１と同じ様式に従って、ＧＡＬ２遺伝子の欠損を例外として、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２８０５と同じ遺伝子型を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＪ３５０１（ＡＴＣＣ２０８２８０、米国）を、実施例２−１において構築した組み換え発現ベクターＭδＬＫ８で形質転換した。次いで、コロニースクリーニングを行って、最も高い分泌効率を有するコロニーを選択し、最終的に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＪ３５０１／ＭδＬＫ８＃３６と表し、そして受託番号ＫＣＴＣ１０５８２ＢＰ（２００４年１月１３日に寄託した）でＫｏｒｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＴＣ）、ＫｏｒｅａＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ，Ｄａｅｊｏｎ、韓国）に寄託した。以後、この形質転換体株を、簡潔および簡便のために「形質転換酵母Ｂ」と称する。

実施例３：炭素源としてガラクトースを使用する流加培養における形質転換酵母株ＡおよびＢの間の外来タンパク質分泌能の比較
実施例２において構築した酵母形質転換体ＡおよびＢを、ガラクトースを使用して、流加培養した場合、以下の分析を実施して、外来タンパク質の分泌効率を比較した。まず、マスターシードとしての形質転換酵母株を、２％（ｗ／ｖ）グルコースを補充したＹＰＤ［酵母抽出物１％（ｗ／ｖ）、およびペプトン２％（ｗ／ｖ）］培地において、１〜３ｖｖｍの通気および２００〜１０００ｒｐｍで、２４時間、所望される細胞塊および活性（２０倍希釈、ＯＤ６００＝０．８〜１．２）が入手され得るように、シード培養した。ＹＰＤ培地においてシード培養を行った後、シード培養溶液を、出発培地に播種した。まず、バッチ培養段階は、細胞増殖期間、および外来タンパク質ＬＫ８の発現誘導因子として使用されるガラクトースへの適応期間である。この目的のために、細胞を、ガラクトース適応期間に付与し、その一方で、１％（ｖ／ｖ）を超えるシード培養溶液を播種し、炭素源としてグルコースおよびガラクトースを供給することによる細胞の増殖を可能にした。ここでは、出発培地は、２％（ｗ／ｖ）グルコース、３％（ｗ／ｖ）ガラクトース、４％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、０．５％（ｗ／ｖ）カザミノ酸、０．５ｇ／Ｌのウラシルおよび０．５ｇ／Ｌのヒスチジンからなった。

バッチ培養段階における出発培地に供給される炭素源の枯渇時に、細胞の呼吸作用（酸素消費）が低下し、これは、発酵槽上に提供される溶存酸素プローブによって、溶存酸素レベルの急速な増加から確認することができる。この時点から、ＤＯスタット供給ストラテジーを使用して、唯一の炭素源としてガラクトースを含有する培地の添加を伴う流加培養を行った。流加培養（fed-batch culture）を行って、さらに、細胞濃度を増加し、そしてさらに、外来タンパク質の発現誘導期間を連続的に維持し、それによって、外来タンパク質の産生性を改善した。

具体的には、５０％（ｗ／ｖ）ガラクトース、３０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、１ｇ／Ｌのウラシルおよび２ｇ／Ｌのヒスチジンを含む流加培地（fed-batch medium）を使用した（流加培地Ｉ）。外来タンパク質ＬＫ８の高レベルの分泌を誘導するために、１ｍＬ／時〜３０ｍＬ／時の速度でガラクトースを供給することによって、培養培地中の残留ガラクトースの量を、５％（ｗ／ｖ）未満に維持した。培養培地中のガラクトースの残留濃度を決定し、そしてそのようにして得られた値に基づいて適切な量のガラクトースを添加して、それによって、残留ガラクトースのレベルを適切な値に維持することによって、ガラクトース供給を行った。ガラクトースの添加速度を制御することによって、発酵期間を通して、発酵槽中の残留ガラクトースの濃度を５％（ｗ／ｖ）未満に維持しながら、ＬＫ８の発現および分泌を継続的に増大することができた。

流加培養方法を、同じ培養条件下で実施例２において構築した形質転換酵母株ＡおよびＢに適用し、そして酵母のガラクトース輸送能に関する外来タンパク質の発現および分泌プロファイルを、２つの酵母グループの間で比較した。まず、酵母細胞に蓄積された外来タンパク質の分布プロファイルを比較するために、抗ＬＫ８抗体を使用するウエスタンブロット分析を、インキュベーション期間の所定の時点でブロス酵母グループから回収した培養サンプルに対して行った。この目的のために、インキュベーション期間中に定期的に回収したそれぞれの形質転換酵母株を、等量に調整し、等容積のサンプル緩衝液中で煮沸し、そしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して、細胞内タンパク質を展開した。このようにして展開されたタンパク質を、ニトロセルロース膜に移した。ブロッティングのために、ニトロセルロース膜を、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）および５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含有するＰＢＳ緩衝溶液を補充した溶液に置き、室温で２時間、穏やかに撹拌した。その後、ウサギ抗ＬＫ８Ａｂを同じ溶液に添加し、次いで、室温で１時間、穏やかに撹拌し、そして０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有するＰＢＳ緩衝液で５回繰り返し洗浄した。次に、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（抗−ウサギＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ、Ｓｉｇｍａ、米国）を、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）および５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含有するＰＢＳ緩衝溶液を補充した溶液に添加し、そしてそのようにして処置したニトロセルロース膜を、溶液に浸責し、これに抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを添加し、そして室温で１時間、穏やかに撹拌した。次いで、膜を、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有するＰＢＳ緩衝溶液で５回繰り返し洗浄した。膜を取り出し、そして検出溶液の添加を伴い、化学発光検出キット（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＴＭＷｅｓｔＰｉｃｏｋｉｔ，Ｐｉｅｒｃｅ、米国）において発酵反応を経験するように誘導し、そして感光性フィルム上に固定した。フィルム上の陰影を調べた（図４、５および６を参照のこと）。図４は、形質転換酵母株Ａにおける外来遺伝子の発現時における細胞内の全外来タンパク質のウエスタンブロット分析の結果を、発現誘導期間と共に示す写真であり；図５は、形質転換酵母株Ａにおける細胞内水溶性外来タンパク質のウエスタンブロット分析の結果を示す写真であり；そして図６は、形質転換酵母株Ｂにおける外来遺伝子の発現時における全細胞内外来タンパク質のウエスタンブロット分析の結果を、発現誘導期間と共に示す写真である。

図４に示されるように、ＧＡＬ２遺伝子の正常な作動により、ガラクトース輸送能が正常である場合、外来遺伝子の発現を誘導する流加培養の継続は、外来タンパク質のより高い細胞内蓄積をもたらすことが認められ得る。しかし、図５に示されるように、細胞中の水溶性タンパク質に対してのみウエスタンブロット分析を実施した場合、外来タンパク質は、時間の経過に関連して、可溶性タンパク質の形態ではなく、主に、不溶性タンパク質の形態であったことが認められ得る。一方、図６に示されるように、Ｇａｌ２遺伝子の欠損による減少したガラクトース輸送能を有する形質転換酵母株Ｂは、発現期間中に外来タンパク質の細胞内蓄積の減少を示したことが認められ得る。

図６の結果が、ＧＡＬ２遺伝子の欠損を伴う形質転換酵母株Ｂにおける外来タンパク質の分泌効率の改善によるか、またはそうでなければ、タンパク質発現レベルの全体的な減少によるかを確認するために、実施例２において構築した形質転換酵母株ＡおよびＢを、同じ培養条件下で流加培養し、そして細胞培養を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供して、分泌された外来タンパク質を定量した。まず、細胞培養物を遠心分離し、そして得られる上清を、０．２□フィルターを介してろ過した。次いで、１００□のろ過されたサンプルを、ＨＰＬＣにおいて、２１４ｎｍでの吸光度（ＯＤ）の決定に供した。展開溶媒、例えば、１％（ｗ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＣＡ）を含有するアセトニトリルおよび移動相として１％（ｗ／ｖ）ＴＣＡを含有する水を使用し、逆相分離カラム（ＶｙｄａｃＴＭｃ１８カラム、ＧｒａｃｅＶｙｄａｃ、米国）によって、外来タンパク質ＬＫ８を分離した。ここでは、移動相は、２５％（ｖ／ｖ）から４０（ｖ／ｖ）までの勾配のアセトニトリルを含有し、それによって、疎水相互作用を利用して、単一のピークを有する純粋な外来タンパク質を分離することが可能である。さらに、標準として、高純度の外来タンパク質をビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって決定した後、ＨＰＬＣにおける面積の積分および外来タンパク質の濃度の検量線を得ることができた。このようにして得られた検量線を使用して、細胞を含まない培養上清を、ＨＰＬＣ分析に供し、それによって、積分面積を算出し、そして得られた値を、標準サンプル（ＬＫ８）を使用して、検量線に当てはめ、それによって、培養上清中の外来タンパク質を定量した（図７）。

図７は、形質転換酵母株ＡおよびＢの流加培養による外来遺伝子の発現時における発現誘導期間中の培養培地に分泌される組み換え外来タンパク質の量を比較したグラフである。このグラフでは、黒丸（−●−）は、形質転換酵母株Ａ（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２８０５／ＭδＬＫ８）における組み換え外来タンパク質の細胞外分泌を表すが、白四角（−□−）は、形質転換酵母株Ｂ（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＪ３５０１／ＭδＬＫ８）における組み換え外来タンパク質の細胞外分泌を表す。図７に示されるように、ガラクトース輸送の減少を伴う形質転換酵母株Ｂは、正常なガラクトース輸送機能を有する形質転換酵母株Ａと比較して、タンパク質の細胞外分泌において２倍を超える増加を示したことが認められ得る。

実施例４：形質転換酵母株Ａにおけるガラクトース誘導性プロモーターの活性の抑制に対する混合炭素源供給の効果および外来タンパク質の分泌収量の比較
−７０℃で貯蔵下の実施例２−１の形質転換酵母株Ａを、５〜１０％（ｖ／ｖ）の濃度で１０ｍＬのＹＰＤ培地上に播種し、そして振盪インキュベーター中、３０℃および１８０ｒｐｍで２４時間、シード培養した（第１のシード培養段階）。次いで、培養細胞を、２００ｍＬのＹＰＤ培地において継代し、そして同じ培養条件下で２４時間、シード培養した（第２のシード培養段階）。４％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、３％（ｗ／ｖ）カザミノ酸、０．０５％（ｗ／ｖ）ヒスチジン、０．０５％（ｗ／ｖ）ウラシル、２％（ｗ／ｖ）グルコースおよび３％（ｗ／ｖ）ガラクトースからなる培養培地において、培養条件をそれぞれ３０℃、６００ｒｐｍ、ｐＨ５．０に調整しながら、バッチ培養を行った。バッチ培養の制御は、溶存酸素の量に依存して、撹拌速度を変動することによって行った。バッチ培養の後期の段階では、細胞の活発な呼吸のため、溶存酸素が減少する。溶存酸素の減少を防止するために、空気の供給および撹拌速度を制御して、バッチ培養が完了するまで、溶存酸素が最大溶存酸素の４０％を超えるように保った。その後、３％（ｗ／ｖ）酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ、米国）、２％（ｗ／ｖ）ペプトン（Ｄｉｆｃｏ、米国）、０．２％（ｗ／ｖ）ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ、米国）、および０．１％（ｗ／ｖ）ウラシル（Ｓｉｇｍａ、米国）からなる培養培地において、流加培養を行った。対照群として、ガラクトースの濃度を５０％（ｗ／ｖ）に調整した。１：４の比率のグルコースおよびガラクトースを伴う実験群では、グルコースおよびガラクトースを、それぞれ１０％（ｗ／ｖ）グルコースおよび４０％（ｗ／ｖ）ガラクトースの濃度で添加した。１：１の比率のグルコースおよびガラクトースを伴う実験群では、グルコースおよびガラクトースを、それぞれ２５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび２５％（ｗ／ｖ）ガラクトースの濃度で添加した。４：１の比率のグルコースおよびガラクトースを伴う実験群では、グルコースおよびガラクトースを、それぞれ４０％（ｗ／ｖ）グルコースおよび１０％（ｗ／ｖ）ガラクトースの濃度で添加した。

液体培地の供給速度を制御して、溶存酸素が最大溶存酸素の２０〜８０％レベルで維持され、培地において残存する全還元糖（ガラクトース＋グルコース）の濃度が０．５〜５％（ｗ／ｖ）のレベルで維持され、そしてグルコース濃度が０．１ｇ／Ｌ未満で維持されることを確実にすることによって、流加培養を行った。バッチ培養および流加培養中、サンプルを定期的に回収し、そして６００ｎｍにおけるＯＤの決定、炭素源の決定および分泌された外来タンパク質（ＬＫ８）の定量化を行った（表１）。

炭素源の決定は、培地中のグルコースおよびガラクトースの残留量を測定することによって、行った。まず、以下のように、グルコースアッセイキット（Ｇｌｕｃｏｓｅ−ＥＫｉｔ、カタログ番号ＢＣ１０３−Ｅ，Ｙｏｕｎｇ−ＤｏｎｇＰｈａｒｍ．、韓国）を使用する酵素方法によって、グルコース濃度の決定を行った。回収したサンプルを１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、そして生じる上清を採取した。酵素方法を使用する上記のアッセイキットに含有される１００ｍＬの希釈された粉体のＰＧＯ酵素（ペルオキシダーゼ１００Ｕ＋グルコースオキシダーゼ５００Ｕ）および１００ｍＬの緩衝液を混合して、発色試薬を調製した。２０□のグルコース標準サンプルを、３ｍＬの発色試薬に添加した。上記と同じ方法に従って、２０□のアッセイサンプルもまた、発色試薬に添加した。得られた混合物を、３７℃で５分間、反応させ、そして各サンプルの吸光度（ＯＤ）を、５０５ｎｍの波長において決定した。グルコース標準サンプルおよびアッセイサンプルの吸光度値を所定の式に適用し、そして培地中の残留グルコースの量を算出した。培地中の全炭素源を、全還元均等物を測定するＤＮＳ（３，５−ジニトロサリチル酸）アッセイによって決定した。グルコースおよびガラクトースは両方とも還元糖であり、そしてＤＮＳ発色試薬の同じ均等物に対して同じ応答性を示す。１００□のアッセイサンプルを１ｍＬのＤＮＳ試薬に添加し、これに対し、全３００ｍＬの試薬に基づいて、２Ｍ水酸化ナトリウム、０．２５ｇの３，５−ジニトロサリチル酸、および７５ｇの酒石酸ナトリウムカリウムを添加した。これに続いて、混合物を約５分間、煮沸し、そして５５０ｎｍにおける吸光度を測定して、培地に残存する全炭素源を決定した。培養培地に分泌される外来タンパク質の量を、実施例３と同じ様式でＨＰＬＣ分析によって決定した。

炭素源としてガラクトースのみを伴う、およびバッチ培養を完了した後に多様な比率のガラクトースおよびグルコースを伴う流加培養を行った場合、それぞれ、細胞増殖、炭素源の消費、および外来タンパク質の分泌を比較した。

表１に示されるように、唯一の炭素源としてガラクトースのみを使用する流加培養は、約１００ｍｇ／Ｌまでの濃度で外来タンパク質（ＬＫ８）の細胞外分泌を示し、そして他の実験群と比較して、最も高い細胞増殖（ＯＤ６００＝１２０）を示した。

１：４の比率のグルコースおよびガラクトースで細胞を流加培養した場合、外来タンパク質の分泌は、１１４ｍｇ／Ｌまでのレベルを示し、そして添加した発現誘導因子（ガラクトース）あたりの外来タンパク質の分泌は、４０％まで増加した。添加されたグルコースは、２４時間以内に完全に消費されたが、その期間中にバッチ培養が行われ、そして流加培養中に添加されたグルコースもまた迅速に消費されて、０．１ｇ／Ｌ未満の残留濃度を保った。

１：１の比率のグルコースおよびガラクトースを伴う流加培養時において、ＬＫ８の分泌は、他の実験群と比較して、約１５０ｍｇ／Ｌまでの最も高い値を示した。さらに、対照群と比較して、細胞外分泌が５０％まで増加し、そして細胞あたりの産生収量（Ｙｐ／ｘ：ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）および誘導因子あたりの産生収量（Ｙｐ／ｉ、ｍｇ／ｇ）が、それぞれ、１０４％および１１４％まで増加したことが確認され、それによって、外来タンパク質の分泌効率の増加が確認された。

４：１の比率のグルコースおよびガラクトースを伴う流加培養時において、高い割合のグルコースにより、外来タンパク質の発現および分泌が阻害され、それ故、約４４ｍｇ／Ｌのただ１つの最大分泌が示された。

実施例５：形質転換酵母株Ｂにおけるガラクトース誘導性プロモーターの活性の抑制に対する混合炭素源供給の効果および外来タンパク質の分泌収量の比較
実施例２−２において構築した形質転換酵母株Ｂを株として使用したことを除いて、実施例４と同じ様式で、それぞれ、炭素源としてガラクトースのみを伴って、および多様な比率のガラクトースおよびグルコースを伴って酵母株Ｂの流加培養を行った場合の細胞増殖、炭素源の消費および外来タンパク質の分泌を比較した（表２を参照のこと）。

表２に示されるように、唯一の炭素源としてガラクトースのみを使用する流加培養は、約２５０ｍｇ／Ｌの濃度で外来タンパク質（ＬＫ８）の細胞外分泌を示した。

１：４の比率のグルコースおよびガラクトースを伴う流加培養を行った場合、外来タンパク質の分泌は、３００ｍｇ／Ｌ以下のレベルを示した。さらに、グルコースは、２４時間以内に完全に消費され、この期間中にバッチ培養が行われ、そして流加培養中に添加されたグルコースもまた、迅速に消費された。

２：３の比率のグルコースおよびガラクトースを伴う流加培養時において、ＬＫ８の最大分泌が１６０時間の時点で出現し、そして細胞増殖を反映する吸光度は、ＯＤ６００＝４７であった。糖の蓄積と関連して、グルコースおよびガラクトースの両方とも炭素源として利用されたこともまた確認された。外来タンパク質の最大分泌量は約３５０ｍｇ／Ｌであり、それ故、他の実験群と比較して、最大分泌量に到達するまでの時間が最も短いことが示された。さらに、対照群と比較して、外来タンパク質の分泌が４０％増加し、そして細胞あたりの産生収量（Ｙｐ／ｘ：ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）および誘導因子あたりの産生収量（Ｙｐ／ｉ、ｍｇ／ｇ）が、それぞれ、２９３％および８５％まで増加したことが確認され、それによって、外来タンパク質の分泌効率の顕著な増加が確認された。

１：１の比率のグルコースおよびガラクトースを伴う流加培養時は、他の実験群と比較して、細胞増殖が最も活性であった。さらに、ＬＫ８の分泌量は、約３５０ｍｇ／Ｌまで有意に高い値を示した。しかし、類似の最大分泌量を示す２：３の比率のグルコースおよびガラクトースを使用する実験と比較するとき、１：１のグルコースおよびガラクトース比率を使用する実験は、３５０ｍｇ／Ｌの分泌量に到達するまで約３８０時間かかったが、これは、外来タンパク質の同じ最大分泌レベルに到達するのに約２．５倍長いインキュベーション期間が必要であることを示す。

３：２の比率のグルコースおよびガラクトースを伴う流加培養時は、細胞増殖が比較的高く、そして糖消費もまた活性であった。しかし、高い割合のグルコースにより、外来タンパク質の発現および分泌が阻害され、それ故、約１４０ｍｇ／Ｌのただ１つの最大分泌が示された。

実施例６：酵母株ＡおよびＢにおけるＰＤＩ１遺伝子の過剰発現を介する外来タンパク質の分泌効率の改善
６−１．ＰＤＩ１同時発現株の構築
６−１−１．ＰＤＩ１発現ベクターの構築
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）がガラクトース誘導によって発現され得ることを確実にするために、以下の方法に従って、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするＰＤＩ１遺伝子を、ＧＡＬ１０プロモーターを含有する発現ベクターに挿入した：まず、２μ酵母複製開始点を取り出すために、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を、ＭｕｎＩおよびＳｎａＢＩで切断し、そしてＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、米国）で処置し、それによって、得られる５．９ｋｂの平滑末端化ＤＮＡフラグメントを再連結して、最適化されたベクターｐＭＫ７１を得た。得られるベクターｐＭＫ７１、テンプレートしてのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２８０５由来の染色体、および２つのプライマーＰＤＩ１Ｆ：５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＣＡＴＣＴＡＴＣＣＣＧＴＴＡＴＧＡＡＧ−３’（配列番号１７）およびＰＤＩ１Ｒ：５’−ＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＴＣ−３’（配列番号１８）を使用して、ＰＣＲを行い、ＮｏｔＩ／ＳｐｅＩ制限切断部位を有するＰＤＩ１遺伝子を含有し、配列番号９に記載の１．７ｋｂのＤＮＡフラグメントを得た。次いで、線状化したｐＭＫ７１および１．７ｋｂのＤＮＡフラグメントを、それぞれ、ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩで切断し、そして切断した産物を相互に連結して、ＰＤＩ１遺伝子発現ベクターを構築し、ｐＭＰＤＩ１と表した（図８）。図８は、酵母における外来タンパク質の発現時に、ガラクトースによるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ１）の同時発現を可能にするように適応されたｐＭＰＤＩ１発現ベクターの切断地図である。

６−１−２．ＰＤＩ１？同時発現ＬＫ８産生株の構築
形質転換酵母株ＡおよびＢを、実施例６−１−１において構築したベクターｐＭＰＤＩ１でそれぞれ形質転換した。ＡｌｋａｌｉＣａｔｉｏｎＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ、加国）を使用して、製造者の指示に従って、形質転換を行った。そのようにして得られた酵母株を、それぞれ、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２８０５／ＭδＬＫ８／ＰＤＩおよびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＪ３５０１／ＭδＬＫ８／ＰＤＩと表した。

６−２．外来タンパク質の分泌に対するＰＤＩ１の同時発現効果ならびに酵母株ＡおよびＢの間の比較
外来タンパク質の分泌に対するＰＤＩ１遺伝子の同時発現効果を比較するために、形質転換酵母株ＡおよびＢ、ならびにｐＭＰＤＩ１形質転換酵母株ＡおよびＢ（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２８０５／ＭδＬＫ８／ＰＤＩおよびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＪ３５０１／ＭδＬＫ８／ＰＤＩ）を、−７０℃の貯蔵下で採取し、次いで、実施例３と同じ様式で流加培養して、外来タンパク質の発現および分泌を誘導した（表３を参照のこと）。

表３において認められ得るように、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２８０５／ＭδＬＫ８は、１００ｍｇ／ＬのＬＫ８分泌を示したが、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２８０５／ＭδＬＫ８／ＰＤＩ１は、１３０ｍｇ／ＬのＬＫ８分泌を示し、それ故、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２８０５／ＭδＬＫ８／ＰＤＩ１において、外来タンパク質のより多い分泌が達成されたことが示された。

さらに、別の酵母株Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＪ３５０１／ＭδＬＫ８は、２５０ｍｇ／ＬのＬＫ８分泌を示したが、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＪ３５０１／ＭδＬＫ８／ＰＤＩ１は、４３０ｍｇ／ＬのＬＫ８分泌を示し、それ故、外来タンパク質の分泌は、ＰＤＩ１の同時発現を伴う酵母株においてより多かったことがさらに示された。即ち、２つの異なる株において、ＰＤＩ１の同時発現を伴う酵母株は、ＰＤＩ１の同時発現を伴わない酵母株より多い分泌量のＬＫ８を示した。

例示を目的として、本発明の好適な実施形態について開示してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲において開示した本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、さまざまな変更、付加および置換が可能であることを理解するであろう。

配列表は、電子形態で添付されている。

Claims

外来タンパク質の分泌効率を改善するための方法であって、以下の工程：
（ａ）酵母宿主を、ガラクトース誘導性プロモーター、分泌シグナル配列および外来タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる組み換え外来遺伝子構築物で形質転換して、形質転換酵母株を構築すること；ならびに
（ｂ）前記形質転換酵母株を、前記ガラクトース誘導性プロモーターの活性が、ガラクトースの培養培地から前記形質転換酵母株への輸送率を低減することによって、制御される条件下で培養すること、ここで、前記培養は流加培養によって行われ、ガラクトースおよびグルコースが４：１〜１：１の比率で培養時に前記培養培地に同時供給される
を含んでなる、方法。
前記工程（ａ）の形質転換が、前記酵母宿主の染色体への前記組み換え外来遺伝子構築物の挿入によってか、または前記酵母宿主の細胞質への前記組み換え外来遺伝子構築物の環状ベクターの形態での挿入によって行われる、請求項１に記載の方法。
前記ガラクトース誘導性プロモーターが、配列番号１に記載のＧＡＬ１プロモーター、配列番号２に記載のＧＡＬ１０プロモーター、または配列番号３に記載のＧＡＬ７プロモーターである、請求項１に記載の方法。
ガラクトースの培地から前記形質転換酵母株への前記輸送率の低減が、形質転換酵母のガラクトースパーミアーゼ遺伝子を欠損させるか、またはそれを部分的に破壊して、それによって非機能的にすることによって達成される、請求項１に記載の方法。
前記酵母宿主が、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下で発現されるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼコード遺伝子を含んでなる組み換え外来遺伝子構築物で形質転換される、請求項１に記載の方法。
前記工程（ａ）と（ｂ）との間に、前記工程（ａ）の前記形質転換酵母株を、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下で発現されるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼコード遺伝子を含んでなる組み換え外来遺伝子構築物でさらに形質転換する工程（ａ−１）をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子を含有する前記構築物が、下記：

に示される切断地図を有するｐＭＰＤＩである、請求項５または６に記載の方法。