JP4972161B2 - タクロリムス標準物質及びそれを使用する方法 - Google Patents

Description

本発明は総体的には、タクロリムス標準物質に関する。より詳しくは、本発明は、タクロリムス非特異的タンパク質を利用するタクロリムス標準物質、並びにこのような標準物質を作製及び使用する方法に関する。

タクロリムス（ＦＫ５０６としても公知）は、真菌ストレプトミセス・ツクバエンシス（Streptomyces tsukubaenis）から単離された中性マクロライドである。タクロリムスは、臓器移植における及び自己免疫疾患を治療するための免疫抑制剤として臨床的に使用されている。Wallemacq et al., “FK 506 (Tacrolimus), a Novel Immunosuppressant in Organ Transplantation: Clinical, Biomedical, and Analytical Aspects,” Clinical Chemistry, 39/ 11, 2219-2228 (1993)を参照されたい。多くの治療薬と同様に、タクロリムスの血中濃度をモニターして、薬物の適切な有効性を定量的に確認でき、かつ治療中に起こり得る毒性に対して保護できることが望ましい。

タクロリムスの血中濃度をモニターするために、多様な測定方法が開発されてきた。これらの方法の多くは、複数の較正溶液又はタクロリムスの既知の、あらかじめ決めておいた濃度で注意深く調製されたキャリブレーターを使用することによって、化学分析装置のための較正曲線を使用することを必要とする。これらの較正溶液及び標準溶液を、１回又はそれ以上アッセイして、得られた平均反応シグナルを、それらのそれぞれ既知のタクロリムス濃度に対してプロットすることができる。連続的な較正曲線は、反応シグナルとタクロリムス濃度との間の関係を正確に複製するために選択された幾つもの数学的手法の何れかを使用して作成され得る。正確さを最大にするために、較正曲線を、規則正しい間隔で確立して、試薬の個々の事項を補償し、そして個々の分析装置に関して装置性能を補償する。

幾つもの課題が、タクロリムスの較正組成物及び標準組成物の調製において生じている。例えば、タクロリムスに関する幾つかの標準溶液は、不安定で、試験結果を不正確にする急速な分解にさらされる。さらに、タクロリムスは、水に不溶であり、幾つかの標準溶液は、残留物を残したり、又はさもなくば自動分析装置等の試験機器の操作若しくは精密さに干渉しかねない有機溶媒を含んできた。

従って、改善されたタクロリムス標準組成物に関する必要性が引き続き存在する。

本発明の組成物は、タクロリムスの改善された、安定した標準物質を提供する。

本発明の一側面において、アッセイにおいて標準物質として使用するのに適した組成物は、タクロリムス又はその誘導体の既知の量、及びタクロリムスに非特異的であり及びタクロリムス又はその誘導体と可溶性複合体を形成できるタンパク質とを有する溶液を含み、タンパク質は本質的に脂肪酸を含まない。

本発明の別の側面において、アッセイにおいて標準物質として使用するのに適した組成物は、タクロリムス又はその誘導体の既知の量と、タクロリムスに非特異的であり及びタクロリムス又はその誘導体と可溶性複合体を形成できるタンパク質とを有する溶液を含み、該溶液は本質的に有機溶媒、及びタクロリムス又はその誘導体に特異的なタンパク質を含まない。

本発明の別の側面において、診断アッセイにおいて使用するのに適したキットは、タクロリムス又はその誘導体の第一の既知の量と、タクロリムス又はその誘導体と水溶性複合体を形成できるタンパク質とを含む。

本発明の別の側面において、タクロリムスのアッセイにおいて使用するための方法が提供される。方法は、タクロリムス又はその誘導体の既知の量、及びタクロリムス又はその誘導体と水溶性複合体を形成できるタンパク質を含む標準溶液を用意すること、並びにタクロリムス又はその誘導体の既知の量に対応する測定結果を測定するため、標準溶液に関してアッセイを行うことを含む。

これまでの段落は、概略紹介を目的として提供されており、後述の特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。本発明の他の側面と一緒に現在好ましい実施態様については、添付する図面と併せて把握される以下の詳細な説明によって最善の理解が得られるであろう。

本発明は、概して、タクロリムスのアッセイに有用な組成物及びキット、並びに該組成物及びキットを作製及び使用する方法に関する。本発明の組成物は、タクロリムス又はその誘導体の既知の量と、タクロリムス又はその誘導体と複合体を形成できるタクロリムス非特異的タンパク質の十分な量とを含む。

タクロリムスは、以下の式を有する。

本明細書で使用されるように、タクロリムスの「誘導体」とは、タクロリムスの基本骨格及び／又は特性を大体保持するが、１つ又はそれ以上の置換を含む化合物を意味する。多くの例において、これらの誘導体は、それら自体タクロリムスのアッセイにおける試薬として有用である。例えば、２２位炭素でストレプトアビジン化された酵素によって標識されたタクロリムス類似体は、Deerfield, ILに本社を有するDade Behring, Inc.によっ
て販売されているタクロリムスのEMIT^(R)イムノアッセイにおいて有用な公知の誘導体である。

公知の誘導体の他の例は、Ｃ３２及び／又はＣ２４でのエステル及びカルバマート誘導体を記載する「Method and Composition Useful For Determining FK-506」という表題の２００３年１１月２１日に出願された出願番号第10/719,868号に開示されたものを含む。別の例は、「Monoclonal Antibodies To Tacrolimus And Immunoassay Methods For Tacrolimus」という表題の１９９９年８月３日に出願された出願番号第09/368,010号に開示されたＣ２２オキシム誘導体である。適切な公知の誘導体の他の例は、米国特許第5,260,301号、第5,196,437号及び第5,665,727号に開示されている。

本発明において有用な非特異的結合タンパク質は、タクロリムス又はその誘導体と複合体を形成でき、溶液中タクロリムスの溶解を可能にするのに十分安定であり、かつタクロリムスに特異的に結合することはない、任意のものである。

本発明の一実施態様において、非特異的タンパク質とは、分子表面上に疎水性空洞を有する親水性タンパク質である。タクロリムスは、水素結合等の非共有結合を通じて非特異的タンパク質の疎水性空洞と複合体形成する。好適なタンパク質には、アルブミン及びα_１酸性糖タンパク質が含まれる。本発明の一実施態様において、アルブミンは、ウシ血清アルブミンである。

本発明の好ましい実施態様において、非特異的結合タンパク質を処理して、その疎水性空洞から脂肪酸を除去する。脂肪酸の欠如によって、タクロリムスと疎水性空洞との間で複合体がより安定となる。本発明の特に好ましい実施態様において、タンパク質は、本質的に脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン又はα_１酸性糖タンパク質である。本質的に脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンは、例えばミズーリ州セントルイス（Saint Louis, Missouri）のSigma-Aldrich-Flukaから市販されている。

本明細書で使用されるように、「本質的に脂肪酸を含まない」とは、脂肪酸を含まないタンパク質、及び本質的に脂肪酸を含まないが、タンパク質に対するタクロリムスの結合に実質的に干渉しない脂肪酸の少残量を有していてもよいタンパク質を指す。一般的に、タンパク質は、少なくとも９５％脂肪酸不含、より好ましくは少なくとも９７％脂肪酸不含、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％脂肪酸不含である場合、本質的に脂肪酸不含であり得る。脂肪酸は、本分野で公知の方法に従って、非特異的タンパク質から除去され得る。このような方法の１つには、冷アルコールによる脂肪酸の沈殿が含まれる。

非特異的結合タンパク質は、溶液にタクロリムス又はその誘導体の溶解を可能にするのに十分な量で存在すべきである。典型的には、タンパク質：タクロリムスの比は、重量ベースで２５,０００：１〜１,０００：１の範囲となる。幾つかの実施態様において、タンパク質：タクロリムスの重量比は、少なくとも約２,０００：１又は少なくとも約５,０００：１又は少なくとも約１０,０００：１となる。

本発明の一実施態様において、組成物には水溶液が含まれる。典型的には、タクロリムス又はその誘導体は、水１００ｍＬあたり約０.１〜約１０.０ｍｇの量で存在することになる。タンパク質は典型的には、１００ｍＬの水あたり約１〜約２５ｇの量で存在することになる。

本発明の別の実施態様において、組成物は、有機溶媒を含まず又は実質的に含まない。好ましい実施態様において、組成物は、メタノール、エタノール、プロパノール等のようなアルカノール溶媒を含まず又は実質的に含まない。組成物から有機溶媒を排除することにより、その組成物を使用する分析装置のような任意の装置に有機残留物をほとんど残さず、それにより長期間装置の精度を維持するのをより容易にするという利点が得られる。

本発明の別の実施態様において、組成物は、タクロリムス又はその誘導体に特異的に結合するタンパク質を本質的に不含であり得る。特異的に結合するタンパク質を排除することにより、経費が削減され、そして干渉化合物のより少ない溶液が得られる。

本発明の他の実施態様において、組成物には、他の成分又は添加物が含まれ得る。本発明の特定の一実施態様において、乳化剤が溶液へ添加される。乳化剤は、タクロリムス又はその誘導体の溶解を促進するために、水溶液で特に有用である。好適な乳化剤には、ポリオキシラート化された（ｐｏｌｙｏｘｙｌａｔｅｄ）ヒマシ油等の非イオン性乳化剤が含まれる。このような乳化剤の１つは、登録商標「Cremophor^(R) EL」のもとにＢＡＳＦによって市販されており、０.０１〜０.５質量％の範囲で組成物中において好ましく使用される。他の好適な乳化剤には、サポニン、ドデシル硫酸ナトリウム、及びドデシル硫酸リチウムが含まれるが、それらに限定されない。

本発明の別の実施態様において、タクロリムス標準物質に有用な組成物には、タクロリムス又はその誘導体の既知の量と、上述のような溶液にタクロリムス又はその誘導体を可溶化できる乳化剤が含まれる。

本発明の別の実施態様において、組成物は、その後の希釈のためのストック溶液として保存され得る。一実施態様において、ストック溶液は、溶血血液ベースで希釈される。例えば、ストック溶液は、約１：１０〜１：１０００、より典型的には１：５０〜１：５００ほど使用前に希釈され得る。典型的には、溶血血液は、ＥＤＴＡ中に保存された全血から作製され、反復される凍結及び融解のサイクルに曝露される。他の実施態様において、溶血血液は、１つ又はそれ以上の血液成分から作製され得る。

本発明の別の側面によると、上述の組成物は、試料中のタクロリムスの存在又は量を検出する方法において使用され得る。適切なアッセイ技術には、本分野で一般的に公知のイムノアッセイ技術が含まれる。

本発明の組成物には、タクロリムスの既知の量が含まれる。従って、タクロリムスについてのアッセイは、特定の技術の反応のための較正曲線を確立するために、本組成物で行われ得る。一実施態様において、タクロリムス又はその誘導体の各種濃度を有する複数の組成物は、較正曲線確立用の複数のポイントを提供するためにアッセイされ得る。

一般的に、本発明のアッセイ技術は、
（１）タクロリムスを含有すると推測される試料を用意すること；
（２）試料を
（ａ）タクロリムスに対する抗体；及び
（ｂ）場合により、タクロリムス類似体
と反応させること、ここで抗体の１つ又はタクロリムス類似体は、検出可能なシグナルを生成する標識で標識される；並びに
（３）（ａ）抗体に結合したタクロリムスに関連するシグナル；
（ｂ）抗体に結合していないタクロリムスに関連するシグナル；又は
（ｃ）試料中のタクロリムスの存在又は濃度を検出又は測定するための存在するシグナル全体：
のうちの１つを観察又は測定すること、
の工程を含む。

このようなアッセイは、均一系又は不均一系の何れかであるといわれる。不均一系アッセイにおいて、抗原に結合した抗体は、抗原に結合していない抗体から分離される。この分離は、別の抗体との差次的な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）溶解度、反応性、又は他の特性等の、本分野でよく知られた多くの工程によってなされ得る。このようなアッセイは、本分野でよく知られており、さらに詳細に本明細書で説明する必要性はない。抗体に結合したタクロリムスと関連したシグナル、又は抗体に結合していないタクロリムスと関連したシグナルの何れかを、検出又は測定しようとする場合、不均一系アッセイが行われる。対照的に、均一系アッセイでは、存在するシグナル全体が検出または測定される。均一系アッセイでは、抗原−抗体複合体の存在が、抗体に結合していない抗原から抗体に結合した抗原を分離する必要なしに、そのシグナルレベルが変化するよう、シグナルを変える。

適切な均一系イムノアッセイシステムの例は、D.D. Schottelius, “Homogeneous Immunoassay System (EMIT) for Quantitation of Antiepileptic Drugs in Biological Fluids”in Antiepileptic Drugs: Quantitative Analysis and Interpretation (C.E. Pippenger et al., Raven Press, New York, 1978, Chapt 10, pp. 98-101)に記載され、及び米国特許第３,８１７,８３７号にさらに記載されるＥＭＩＴとして公知である。不均一系アッセイの例は、アフィニティカラムイムアッセイ（ＡＣＭＩＡ）である。

本発明の別の側面によると、タクロリムスについてのアッセイにおいて使用するためのキットが提供される。キットには、タクロリムス又はその誘導体の既知の量と、タクロリムス又はその誘導体と複合体を形成できる非特異的タンパク質の十分な量とが含まれる。一実施態様において、該タンパク質は、本質的に脂肪酸を含まない。別の実施態様において、キットは、有機溶媒、及びタクロリムス又はその誘導体に特異的に結合するタンパク質を本質的に含まない。

タクロリムス及び非特異的タンパク質は、一緒に包装してもよく、又は別々に包装してもよい。これらの構成要素は、溶液であってもよく、又は好ましい実施態様において、これらの構成要素に更なる貯蔵期間を与えるために凍結乾燥してもよい。

キットの好ましい一実施態様において、非特異的タンパク質は、約１〜２５ｇの量で存在し、タクロリムスは、約０.１〜約１０ｍｇの量で存在する。

また、キットには、蒸留水、乳化剤、酵素標識、溶血血液又は上で論議した組成物の他の構成要素など、他の適切な材料を含め得る。キットは、また、本明細書に記載されているような方法を実施するためのタクロリムス及び非特異的タンパク質の使用説明書も含有し得る。

キットは、タクロリムス又はその誘導体の単一の既知の量を含有し得、又は複数の既知の量を含有し得る。例えば、キットは、タクロリムスの第一の既知の量と第二の既知の量とを含有し得、第二の既知の量は、第一の量とは異なる。同様に、キットは、第三の既知の量、第四の既知の量等を含有し得、各既知の量は、他の既知の量とは異なる。各既知の量に関してアッセイを行うことによって、較正曲線の構築において使用するための複数のデータポイントが測定できる。

実施例１
タクロリムス標準溶液の調製
脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich-Fluka製）１４ｇを１００ｍLの精製水と混合して、溶液を作った。コントロールとして、メタノールと水との５０：５０質量％溶液を調製した。各溶液に、タクロリムス１.００ｍｇを添加し、室温で２４時間撹拌するにまかせた。乳化剤として作用するよう、Cremophor^(R) EL（CAS番号61791-12-6）２５０μLを各溶液に添加した。次に、各溶液を水で１：２５に希釈した後、最終的な希釈比が１：２５０になるよう、水で再度１：１０に希釈した。アフィニティカラムイムアッセイを使用するDimension^(R) RxL Max^(R)統合型化学分析装置で各試料を試験した。Bioresources of Fort Lauderdale, Floridaによって供給されるタクロリムスマスタープールを使用して、分析装置をまず較正した。ウシ血清溶液及びコントロール溶液は、実質的に同等の結果を与えた（それぞれ６１５０ｎｇ／ｍＬ及び５９８５ｎｇ／ｍＬ）。

実施例２
タクロリムスの回収に及ぼすタンパク質及び乳化剤の効果
タクロリムスの回収に及ぼすタンパク質及び乳化剤の効果を研究するために、表１において特定された試料に対して、実施例１の検査手法を反復した。各試料を１００ｍＬの水に溶解した後、水で１：５００に希釈した。結果は、脂肪酸を含まないＢＳＡ及び乳化剤の両者が、タクロリムスの回収に寄与することを示した。

実施例３
タクロリムスの回収に及ぼすタンパク質からの脂肪酸除去の効果
タクロリムスの回収に及ぼすタンパク質からの脂肪酸除去の効果を研究するために、表２において特定された試料に対して、実施例１の検査手法を反復した。各試料を１００ｍＬの水に溶解した後、水で１：５００に希釈した。結果は、ＢＳＡを脂肪酸不含とすることで、タクロリムスの回収が有意に増大することを示した。

実施例４
タクロリムスの回収に関する脂肪酸不含ウシ血清アルブミン濃度の比較
タクロリムスの回収に及ぼすタンパク質の濃度の効果を研究するために、表３において特定された試料に対して、実施例１の検査手法を反復した。各試料を１００ｍＬの水に溶解した後、水で１：５００に希釈した。結果は、タクロリムスの回収が、ＢＳＡ濃度の関数であることを示した。

本発明が広範な効用及び適用を可能にすることは、当業者によって容易に理解されるべきである。本明細書に記載されたもの以外の本発明の多くの実施態様及び適応、並びに多くの変形、改変及び均等配置は、本発明の本質又は範囲から逸脱することなしに本発明及びそのこれまでの記述から明らかであろうし、又はそれらによって合理的に示唆されるであろう。

従って、本発明を、特定の実施態様との関連で本明細書に詳細に記載してきたが、当然ながら、本開示は本発明の単なる実例及び典型に過ぎず、本発明の完全かつ可能にする開示を提供する目的のためにのみなされている。前述の開示は、本発明を限定するよう又はさもなくばいずれかのこのような他の実施態様、適応、変形、改変及び均等配置を排除するよう意図したものではなく、又はそのように解釈すべきではなく、本発明は、後述の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ制限される。

Claims (21)

1. アッセイにおいて標準物質として使用するのに適した組成物であって、
   タクロリムス又はその誘導体の既知の量、及びタクロリムスに非特異的であり、かつタクロリムス又はその誘導体と可溶性複合体を形成できるタンパク質を有する溶液
   を含み、該タンパク質が少なくとも９５％脂肪酸不含であり、タンパク質：タクロリムスの比が重量ベースで２５,０００：１〜１,０００：１の範囲である、組成物。
2. 溶液が水溶液を含み、かつ複合体が水溶性である、請求項１に記載の組成物。
3. 溶液が、アルカノール溶媒を含まない、請求項１に記載の組成物。
4. 溶液が、メタノールを含まない、請求項１に記載の組成物。
5. 溶液が、タクロリムスに特異的に結合できるタンパク質を含まない、請求項１に記載の組成物。
6. タンパク質がアルブミンを含む、請求項１に記載の組成物。
7. アルブミンが、脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを含む、請求項１に記載の組成物。
8. 溶血血液をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
9. 乳化剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
10. 抗体と複合体を形成でき、かつ検出可能なシグナルを生成させるのに適した標識をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
11. アッセイにおいて標準物質として使用するのに適した組成物であって、
    タクロリムス又はその誘導体の既知の量、及び
    タクロリムスに非特異的であり、少なくとも９５％脂肪酸不含であり、かつタクロリムス又はその誘導体と可溶性複合体を形成できるタンパク質を有する溶液
    を含み、溶液が有機溶媒、及びタクロリムス又はその誘導体に特異的なタンパク質を含まない、組成物。
12. 溶液が水溶液を含み、かつ複合体が水溶性である、請求項１１に記載の組成物。
13. アルブミンが、脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを含む、請求項１１に記載の組成物。
14. 溶血血液をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
15. 乳化剤をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
16. 抗体と複合体を形成でき、かつ検出可能なシグナルを生成させるのに適した標識をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
17. タクロリムスについてのアッセイにおいて使用するための方法であって、
    タクロリムス又はその誘導体の既知の量、及びタクロリムス又はその誘導体と水溶性複合体を形成できるタンパク質を含み、タンパク質が少なくとも９５％脂肪酸不含であり、タンパク質：タクロリムスの比が重量ベースで２５,０００：１〜１,０００：１の範囲である、標準溶液を用意すること；及び
    タクロリムス又はその誘導体の既知の量に対応する測定結果を測定するために、標準溶液に関してアッセイを行うこと
    を含む、方法。
18. 標準溶液が、乳化剤をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
19. 標準溶液が、溶血血液をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
20. 溶液が、脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを含む、請求項１７に記載の方法。
21. 標準溶液が、アルカノール溶媒を含まない、請求項１７に記載の方法。