JP4986564B2 - スライド構造 - Google Patents

Description

本発明は、主としてバイオテクノロジの分野に使用されるスライド構造であって、特に細胞の形態観察や定量的な解析に有効な容器に関する。

従来生細胞の培養・観察・保管・輸送などの用途には多数の培養用セル（小さな培養容器の単位）を同一のスライド（顕微鏡での観察やまとめて保管する単位）内に構成するものが必要となる。スライドの基本構成としては、一般的に顕微鏡で観察が容易なＳＢＳ規格のウェルピッチを実現したものが多い。（SBS:Society for Biomolecular Screening）
図１１に標準的なスライドのセル孔５１を示す。スライドはガラス板で形成され、セル孔５１の直径Ｄが２．５ｍｍあって、隣接するセル孔５１のピッチ間距離Ｌが４．５ｍｍであり、例えば、４列×１２行の４８タイプのものがある。従来この種のスライドにはプラスチック製の一体成型品やガラス製でも表面に疎水コートしてウェルを分割した製品が主であった。
そして、セル孔５１に細胞などの試料を入れ、培養液を内部にいれて細胞の培養を行っていた。生細胞の詳細な観察には、顕微鏡による蛍光観察が行われる。図１２に示すように、蛍光観察は、スライド５０の下に顕微鏡を配置し、スライドの上には光源５２を配置し、特定の部位に蛍光標識された細胞を観察する方法である。対物レンズ５３には浸積媒質（水、イマージョンオイル、グリセリン）が塗られる。
特開平１１−１２７８４３号公報（光不透過性樹脂で形成したスライドが開示されている）

従来のスライドでは、培養や保管に不都合があったり、細胞の培養量が多く、多くの細胞を一度に培養できないなどの問題があった。更に、培養細胞の形態観察には励起光による蛍光観察が行われるが、図１１に示すように、隣接するセル孔に対して光ａの漏洩などがあり、明確な観察ができにくい場合があった。スライドを移動するには細胞の活性を保つため、液体窒素などの極低温下で保存する必要があり、スライドの破損、強度や低下などの制約があるなどの問題があった。

蛍光観察を行うためのスライドが必要とする基本的事項をまとめると以下の通りである。
（１）スライドには所定の数のセルを所定とおりの配置とすること。
（２）セル内で溶剤が溶出することによって、生細胞へ悪影響を生じないこと。
（３）セル内に必要量の培養液及び細胞数が確保できる最小限の容積を有すること。
（４）生細胞の詳細状態を観察のため蛍光法を用いるが、セルから不要なノイズ光を発生しないこと。
（５）セル間で励起光によるセル内での蛍光が、リークなどで隣接するセル内に干渉しない（セル間は遮光する）こと。
（６）スライドとして保管・移動などのために、液体窒素環境での冷却を可能とすること。
（７）底板を通した顕微鏡観察（下側からの高倍率観察）では、底板の平面度が良好かつ異常な蛍光を発することがないことで、内部の細胞が歪みなく明瞭に観察できること。
（８）培養細胞を剥離することなくセル内の培養液の補充、交換がしやすいこと、などの基本的事項がある。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、上記基本的事項を従来よりも、培養細胞を剥離することなく、より優れた方法で培養細胞を形態観察することができるスライドを提供することを目的とする。

本発明のスライド構造は、上記目的を達成するために、スライドの表面側に試料を入れるセル孔を有し、該セル孔の底部に顕微鏡観察用の透視面を有するスライド構造であって、
前記セル孔の底部を形成する底板と、該底板の上に設けられ前記セル孔としての貫通孔を形成したホルダー板とから構成され、前記底板がホウ珪酸ガラスによって形成され、前記ホルダー板が結晶シリコンで形成されている。該スライド構造は、ホウ珪酸ガラスの底板と結晶シリコンのホルダー板とを陽極接合法又は常温接合法で接合していることが好ましい。
上記スライド構造は、前記底板の厚さが０．０５ｍｍ〜０．２５ｍｍの範囲であることが好ましい。
上記スライド構造は、前記セル孔の底部に該底部から上方へ突出する段部を形成することが好ましい。

本発明によれば、スライドの底板がホウ珪酸ガラスによって形成され、ホルダー板が結晶シリコンで形成されているので、セル間の光漏れを防止し培養細胞などの顕微鏡による形態観察を行うことができる。さらに、前記底板が石英ガラスによって形成され、前記ホルダー板が黒色石英ガラスで形成されることによって、隣接するセル間のさらなる遮光の実施が可能となる。
上記発明は、底板の厚さが０．０５ｍｍ〜０．２５ｍｍの範囲とすることにより、４０倍以上の液浸対物レンズが使用できるようになった。
上記発明は、セル孔の底部に該底部から上方へ突出する段部を形成したので、段部を介してセル孔に溶液を供給することができ、セル孔の培養細胞等の剥離を防止することができる。

以下、本発明の第１の実施形態のスライド構造について、図面を参照しながら説明する。
図１は、本発明に係るスライド１を示す。スライド１は、ホルダー板２と底板３とから構成されている。ホルダー板２及び底板３は共に四角形の板材によって形成されている。ホルダー孔２には、該ホルダー板２を上下に貫通するセル孔４を形成している。図１では、セル孔４を４隅のみ示しているが、セル孔４はＳＢＳ規格のウェルピッチによって形成されている。ただし、仕様よっては、ＳＢＳ規格準じないウェルピッチや孔径のものであってもよい（これについては、以下の実施形態についても同じである）。
本実施形態では、図２に示すように、ホルダー板２の高さＴ１は標準５ｍｍとし、１〜１０ｍｍのものがある。底板３の厚さは、標準０．１５ｍｍとしているが、０．０５〜０．２５ｍｍとすることが好ましい。

ホルダー板２の材質は、純粋な結晶シリコン（多結晶又は単結晶）板を用い、底板３はホウ珪酸系ガラスを使用している。ホルダー板２と底板３の結合、すなわち結晶シリコンとホウ珪酸ガラスの異種接合は、陽極接合法（他に常温接合法などでも可能）によって接合できる。このスライド構成では、細胞の培養のための培養容器と顕微鏡観察のためのガラス窓部としての透視面５を有する。

陽極接合法では、通常の接合で必要なエポキシ系などの接着剤を使用しないため、これらからでる有害な成分の影響を受けず、細胞に影響を及ぼさない。ホルダー板２の材料の結晶シリコンは、不純物がなく細胞への影響は少ない。一方、底板のホウ珪酸系ガラスにはＮａやＬｉなどのアルカリ系金属が入っているので不要な蛍光ノイズを発したりするが観察に対する影響は少ない。

蛍光による顕微鏡観察などではガラス厚を薄くすることで顕微鏡の焦点距離の影響と不要な蛍光を極限まで減らすことが可能となる。この様な用途では、ガラス厚を０．０５〜０．２５ｍｍ程度迄薄く加工することで、顕微鏡での明瞭な観察を容易にすることができる。本実施形態でも、従来観察が困難であった４０倍以上の液浸対物レンズを使用して培養細胞の観察が可能になった。
スライド１の移動・保管面では液体窒素環境での保冷に対し、問題なく使用することができる。理由としては、結晶シリコンとホウ珪酸系ガラスの熱膨張係数（ＣＴＥ）がほぼ同じであることに拠っている。なお、室温時のＣＴＥとして、結晶シリコンは約３．３ｐｐｍ／Ｋであり、ガラスは３．５ｐｐｍ／Ｋとほぼ同一である。スライド１の輸送・保管のために強度を増強する必要がある場合には、底板３を２重構造にしてもよい。

次に、本発明の第２の実施形態のスライド構造について、図面を参照しながら説明する。
図３は、本実施形態に係るスライド１１の断面図であり、図４はスライド１１の製造過程における斜視図である。
スライド１１は、ホルダー板１２と底板１３及び円筒形のパイプ１４から構成されている。ホルダー板１２にはパイプ１４が軸を上下方向に向けて配置され、ホルダー板１２の下部には、底板１３が設けられている。パイプ１４の内部はセル孔１５として形成され、セル孔１５の底面には底板１３で形成されている透視面１６が設けられている。ホルダー板１２の材質は、不透明プラスチックを使用し、底板１３及びパイプ１４の材質は、それぞれ石英ガラスが用いられている。

スライド１１の製造については、図４に示すように、初めに底板１３の表面にパイプ１４の一端部を載せて底板１３とパイプ１４を接合する。石英ガラス同士の接合は、周知であり高温法や低温法により接合できる。そして、底板１３のパイプ１４が配設されていない部分について、不透明プラスチックや他のモールド材を使用して充填し、パイプ１４を含む矩形のホルダー板１２が形成される。ホルダー板１２及び底板１３の厚さについては、上記第１の実施形態と同じである。

本実施形態の構成では、底板の石英ガラスの成分は二酸化シリコンである。光の透過性に優れていて蛍光観察に対して影響がない。隣接するセルからの蛍光の散乱などの影響に対しては、セル間に遮光のための隔離部（不透明プラスチックなど）を設けることで対応可能となる。底板１３とパイプ１４の素材が同一であるため、耐熱特性は全く問題がない。
この様な用途では石英ガラス厚を０．１〜０．２ｍｍ程度薄く加工することで、顕微鏡での明瞭な観察を容易にすることができる。本実施形態では、従来観察が困難であった４０倍以上の液浸対物レンズの観察が可能になった。

次に、本発明の第３の実施形態のスライド構造について、図５を参照しながら説明する。
図５は、本実施形態に係るスライド２１の斜視図である。スライド２１は、ホルダー板２２と底板２３とから構成されている。ホルダー板２２及び底板２３は共に四角形の板材によって形成されている。ホルダー板２２には、該ホルダー板２２を上下に貫通するセル孔２４を形成している。
本実施形態では、図２に示すように、ホルダー板２の高さＴ１は標準５ｍｍとし、１〜１０ｍｍのものがある。底板３の高さは、標準０．１５ｍｍとしているが、０．０５〜０．２５ｍｍとすることが好ましい。

ホルダー板２２の材質は、黒色石英ガラス板を用い、底板２３は透明な石英ガラス板を使用している。黒色石英ガラスの素材としては、二酸化珪素でなり、製法によって黒色、光の非透過としているものを用いる。ホルダー板２２と底板２３の結合、すなわち黒色石英ガラス板と石英ガラス板の異種接合は、上述の高温法又は低温法によって接合できる。このスライド構成では、細胞の培養のための培養容器と顕微鏡観察のためのガラス窓部としての透視面（図示せず、図２の符合５を参照、以下の実施形態も同じである）を有する。

本実施形態では、上記第２の実施形態のスライドよりもさらに、隣接セル孔２４間の遮光が可能となる。黒色石英ガラスを用いることで隣接するセル間の光の干渉もなく、素材が石英のため、蛍光等のノイズの影響もない。

次に、本発明の第４の実施形態について図面を参照にして説明する。
図６は、有底円筒形状のセル筒３２を示し、セル筒３２は筒状のパイプ３３と円板形状の底板３４とからなる。パイプ３３の材質は、黒色石英ガラス板であり、上記第３の実施形態と同じ素材のものを使用し、底板３４は透明な石英ガラス板を使用している。パイプ３３の高さは、標準５ｍｍとし、１〜１０ｍｍのものがある。底板３４の高さは、標準０．１５ｍｍとしているが、０．０５〜０．２５ｍｍとすることが好ましい。

図７に示すように、ホルダー板３５は、セル筒３２の形状と同じ貫通孔３６を複数形成し、貫通孔３６の長さはセル筒３２の軸方向長さに一致させている。ホルダー板３５の材質は、プラスチックなどの安価な材料を利用できる。このホルダー板３５の貫通孔３６にセル筒３２を嵌合し、接着することによってスライド３１が完成する。
このようなスライド３１は、セル筒３２の内部がセル孔となって、底板３４の底部が顕微鏡のための透視面となる。
黒色石英ガラスは、一般的に高価なため、各セルを最小限の分離・独立の容器とし、それらをプラスチック素材などに配置・固定することによって、コストの安いスライドを得ることができる。

図８は、本第４の実施形態の変形例を示す。
図６に示すセル筒３２は、パイプ３２の材質を黒色石英ガラス板とし、底板３４を透明な石英ガラス板を使用したが、図８に示すようにセル筒３７のパイプ３８を石英ガラスとし、底板３９を石英ガラスとし、図７に示すホルダー板３５の貫通孔３６にセル筒３７を挿入してもよい。このようにしても、コストの安いスライドを得ることができる。

次に、本発明の第５の実施形態について図面を参照にして説明する。
図９は、本実施形態のスライドの平面図であり、図１０は図９のＡ−Ａ線方向の断面図である。ほぼ有底円筒形状のセル筒４２を示し、セル筒４２は筒状のパイプ４３と円板形状の底板４４とからなる。パイプ４３の材質は、石英ガラス又は黒色石英ガラス板であり、黒色石英ガラスは、上記第３の実施形態と同じ素材のものを使用し、底板４４は透明な石英ガラス板を使用している。パイプ４３の高さは、標準５ｍｍとし、１〜１０ｍｍのものがある。底板４４の高さは、標準０．１５ｍｍとしているが、０．０５〜０．２５ｍｍとすることが好ましい。
使用するホルダー板については、図７に示すホルダー板３５と同じであり、セル筒４２の形状と同じ貫通孔３６を複数形成し、貫通孔３６の長さはセル筒４２の軸方向長さに一致させている。ホルダー板３５の材質は、プラスチックなどの安価な材料を費用できる。このホルダー板３５の貫通孔３６にセル筒４２を嵌合し、接着することによってスライド４１が完成する。

図９に示すように、セル筒４２にはセル孔４５を形成し、セル孔４５には該セル孔４５に隣接させて段差部４６を形成している。セル孔４５の底部から段差部４６までの高さＨは、本実施形態では、０．１ｍｍである。
本実施形態では、段差部４６を形成しているので、セル孔４５内に細胞を培養しているときに、培養液等の注入や交換をするような場合に、セル孔４５にピペット（図示せず）によって培養液を注入する。この際、ピペットの培養液の注出先を段差部４６に向けることで、段差部４６に培養液を滴下し、段差部４６を介して培養液をセル孔４５に入れることができる。よって、細胞がピペットから直接、培養液を注がれることを防止し、液交換、液注入を繰り返しても細胞の剥がれや損傷を防止できる効果がある。

このように、本発明の各実施形態では、底板の厚さを０．０５〜０．２５ｍｍの範囲とすることで、４０倍以上の液浸対物レンズを使用して培養細胞などを観察することができるようになった。特に内部の細胞の形態観察や定量的な解析を各種光学的手法により明確に観察できるようになった。セル孔の培養細胞が触れる部分についての接合は、有機溶剤を使用していないので、培養細胞に影響を与えることがない。

以上、本発明の実施の形態について説明したが、本発明の技術的思想に基づいて、勿論、本発明は種々の変形又は変更が可能である。
上記第２の実施形態では、石英ガラスのパイプ１４を用いて、パイプ１４を石英ガラスの底板１３に接合したが、上記第１及び第３の実施形態のように、セル孔を形成した石英ガラスのホルダー板を用い、このホルダー板を底板１３に接合してもよい。
上記第５の実施形態の段差部４６については、上記第１〜第３の実施形態のスライド１，１１，２１のように、ホルダー板２，１２，２２と底板３，１３，２３から構成されるものについても適用できる。このような場合は、底板３，１３，２３に段差部４６を形成する。セル筒４２については、パイプ４３側に段差部４６を形成したが、底板４４側に段差部４６を形成してもよい。さらには、この段差部４６については、従来のガラスや透明プラスチックなどのセル孔に段差部を形成しても、細胞の剥離を防止できる。

本発明の第１の実施形態におけるスライド構造の斜視図である。 図１に示すスライドの部分断面図である。 本発明の第２の実施形態におけるスライド構造の断面図である。 図３のスライドの製造過程の途中を示す斜視図である。 本発明の第３の実施形態におけるスライド構造の斜視図である。 本発明の第４の実施形態におけるスライド構造のセル筒の斜視図である。 図６のセル筒と該セル筒が挿入されるホルダー板の斜視図である。 本発明の第４の実施形態におけるセル筒の変形例の斜視図である。 本発明の第５の実施形態におけるセル筒の平面図である。 図９のＡ−Ａ線方向の断面図である。 従来のスライドの標準的なセル孔を示す平面図である。 従来のスライドを用いて顕微鏡で蛍光観察している状態の側面図である。

符号の説明

１１，２１，４１，５０ スライド
２，１２，２２，３５ ホルダー板
３，１３，２３，３４，４４ 底板
４，１５，２４，４５ セル孔
１５，１６ 透視面
３７，４２ セル筒
４６ 段差部

Claims (4)

1. スライドの表面側に試料を入れるセル孔を有し、該セル孔の底部に顕微鏡観察用の透視面を有するスライド構造であって、
   前記セル孔の底部を形成する底板と、該底板の上に設けられ前記セル孔としての貫通孔を形成したホルダー板とから構成され、
   前記底板がホウ珪酸ガラスによって形成され、前記ホルダー板が結晶シリコンで形成されていることを特徴とするスライド構造。
2. 前記底板の厚さが０．０５ｍｍ〜０．２５ｍｍの範囲であることを特徴とする請求項１に記載のスライド構造。
3. 前記セル孔の底部に該底部から上方へ突出する段部を形成したことを特徴とする請求項１又は２に記載のスライド構造。
4. ホウ珪酸ガラスの底板と結晶シリコンのホルダー板とを陽極接合法又は常温接合法で接合している請求項１に記載のスライド構造。

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