JP5007321B2 - Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

本発明は、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ又はその作製方法、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に特異的なモノクローナル抗体又はそのフラグメント、並びに、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の検出用試薬、検出方法、検出キット、及び検出器に関する。

二枚貝類の種の判別や同定は、形態学的手法に基づいて専門家によって行われていた。しかしながら、各種二枚貝の付着期幼生は形態が非常に似ており、専門家においても種の判別や同定が困難とされている。そのため、二枚貝の付着期幼生の判別や同定を容易に行うことができる手法の開発が求められている。

現在までに、アサリ浮遊幼生を同定する方法として、アサリ浮遊幼生に特異的なモノクローナル抗体の開発がなされている（例えば、特許文献1参照）。しかしながら、ミドリイガイ等のＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に特異的なモノクローナル抗体の開発はなされておらず、また、ミドリイガイ等のＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生を迅速かつ簡便に同定する方法の開発も行われていなかった。

特開平１１-１９６８６６号公報

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に反応し、Ｍｙｔｉｌｕｓ属に属するイガイ幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、その抗体及びそのフラグメント、並びに、その利用方法を提供することを目的とする。

これまで、Ｐｅｒｎａ属とＭｙｔｉｌｕｓ属は同じイガイ科に属し、分類上非常に近縁の二枚貝であるため、当業者にとっても、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に反応し、Ｍｙｔｉｌｕｓ属に属するイガイ幼生には反応しない抗体が得られるかどうか、全く不明であったし、むしろ、そのような近縁のイガイを区別する抗体が得られるとは考えられていなかった。

本発明者らは、ミドリイガイ幼生を抗原とすることで、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイの幼生を認識し、Ｍｙｔｉｌｕｓ属に属するイガイの幼生は認識しないモノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に反応し、Ｍｙｔｉｌｕｓ属に属するイガイ幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントである。ここで、前記Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生がミドリイガイ（Perna viridis）幼生であり、前記Ｍｙｔｉｌｕｓ属に属するイガイ幼生がムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）幼生であることが好ましい。また、前記モノクローナル抗体又はそのフラグメントは、ミドリイガイ幼生の面盤に反応することが好ましい。また、アサリ幼生、甲殻類プランクトン又はフジツボ幼生にも反応しないことが好ましい。前記モノクローナル抗体又はそのフラグメントとしては、例えば、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８０５で寄託されているハイブリドーマ、および、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８０６から産生されるモノクローナル抗体又はそのフラグメント等が挙げられる。

また、本発明にかかる検出用試薬は、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生を特異的に検出する検出用試薬であって、前記いずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを有効成分として含有する。

また、本発明にかかる検出キットは、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生を特異的に検出する検出キットであって、前記いずれかのモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含む。

さらに、本発明にかかる検出器は、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生を特異的に検出する検出器であって、前記いずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントが固定化されていることを特徴とする。

さらに、本発明にかかるハイブリドーマは、前記いずれかのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。このようなハイブリドーマとしては、例えば、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８０５で寄託されているハイブリドーマ、および、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８０６で寄託されているハイブリドーマ等が挙げられる。

本発明によれば、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に反応し、Ｍｙｔｉｌｕｓ属に属するイガイ幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、その抗体及びそのフラグメント、並びに、その利用方法を提供することができる。

本発明の一実施例における、ハイブリドーマＢ（１）Ａ２培養上清のミドリイガイウンボ期幼生、および、ムラサキイガイ付着期幼生の粗抽出液との反応性を表すＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。 本発明の一実施例における、ハイブリドーマＥ１−Ａ培養上清のミドリイガイウンボ期幼生、および、ムラサキイガイ付着期幼生の粗抽出液との反応性を表すＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。 本発明の一実施例における、ハイブリドーマＢ（１）Ａ２培養上清を精製して得られた精製モノクローナル抗体と、ミドリイガイウンボ期幼生、および、ムラサキイガイ付着期幼生の粗抽出液との反応性を表すＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。 本発明の一実施例における、ハイブリドーマＥ１−Ａ培養上清を精製して得られた精製モノクローナル抗体と、ミドリイガイウンボ期幼生、および、ムラサキイガイ付着期幼生の粗抽出液との反応性を表すＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。 本発明の一実施例における、ハイブリドーマＢ（１）Ａ２培養上清、あるいは、ハイブリドーマＥ１−Ａ培養上清の、ミドリイガイＤ型幼生に対する反応性を、免疫組織化学染色法により調べた結果を示す顕微鏡写真である。 本発明の一実施例における、ハイブリドーマＢ（１）Ａ２培養上清、あるいは、ハイブリドーマＥ１−Ａ培養上清の、ミドリイガイウンボ期〜付着期幼生に対する反応性を、免疫組織化学染色法により調べた結果を示す顕微鏡写真である。 本発明の一実施例における、ハイブリドーマＢ（１）Ａ２培養上清、あるいは、ハイブリドーマＥ１−Ａ培養上清の、ムラサキイガイＤ型幼生に対する反応性を、免疫組織化学染色法により調べた結果を示す顕微鏡写真である。 本発明の一実施例にける、ハイブリドーマＢ（１）Ａ２培養上清、あるいは、ハイブリドーマＥ１−Ａ培養上清の、ムラサキイガイ付着期〜ウンボ期幼生に対する反応性を、免疫組織化学染色法により調べた結果を示す顕微鏡写真である。

上記知見に基づき完成した本発明を実施するための形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

＝＝モノクローナル抗体又はそのフラグメント＝＝
本発明にかかるモノクローナル抗体は、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に反応し、Ｍｙｔｉｌｕｓ属に属するイガイ幼生には反応しないことを特徴とする。ここで、イガイは二枚貝類のイガイ目イガイ科に属する貝の総称であって、イガイ科Ｐｅｒｎａ属には、ミドリイガイ（Perna viridis）、モエギイガイ（Perna canaliculatus）等が属し、イガイ科Ｍｙｔｉｌｕｓ属には、イガイ（Mytilus coruscus）、ムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）等が属している。なお、モノクローナル抗体が幼生に反応するというとき、その幼生の形状は、ｗｈｏｌｅ-ｍｏｕｎｔであっても、組織切片であっても、粗抽出液（超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物）であっても、当業者が抗体反応に用いる形状であれば、特に限定されない。また、その幼生に対して行う処理（固定、溶解、抽出等）も、当業者が抗体反応に用いるために通常行う処理であれば、特に限定されない。

この抗体は、イガイ以外の二枚貝類（特に、マガキ、アサリ、及びバカガイ）幼生には反応しない方が好ましく、甲殻類プランクトンやフジツボ幼生にも反応しない方が好ましい。それによって、捕獲したプランクトンの中に、多種類の幼生が混在していても、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生のみを同定できる。

本発明にかかるフラグメントとしては、前述のモノクローナル抗体の一部からなり、可変領域を含む抗原結合部位であれば特に制限されるものではないが、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント等を用いることができる。これらのフラグメントは、例えば、前述のモノクローナル抗体をタンパク質分解酵素によって部分消化することにより得ることができる。なお、タンパク質分解酵素としては、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）_２フラグメントを得ることができるものであればどのようなものであってもよいが、例えば、ペプシン、フィシン等の分解酵素を用いることができる。

＝＝モノクローナル抗体の製造方法＝＝
本発明のモノクローナル抗体は、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に反応し、Ｍｙｔｉｌｕｓ属に属するイガイ幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（以下、「本発明にかかるハイブリドーマ」と称する。）から得ることができる。

本発明にかかるハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の製造は、常法に従って行うことができる。例えば、該ハイブリドーマを適当な培養培地で培養し、培養上清を回収することにより行ってもよいが、前述のハイブリドーマを哺乳類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル等）の腹腔内に投与し、腹水を回収することにより行ってもよい。なお、モノクローナル抗体の精製は、前述のハイブリドーマの培養上清又は培養したハイブリドーマを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物、又は前述のハイブリドーマを腹腔内に投与した哺乳類動物から採取した腹水を、常法、例えば、硫安塩析、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等）、ゲル濾過等の方法、又はこれらの方法を適宜組み合わせた方法により行うことができる。

前述のハイブリドーマとしては、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８０５で寄託されているＢ（１）Ａ２、あるいは、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８０６で寄託されているＥ１-Ａを用いることができる。

＝＝＝ハイブリドーマの作製＝＝＝
本発明にかかるハイブリドーマは、常法により作製することができる。以下に一例を示す。

まず、ミドリイガイウンボ期（付着前駆期）幼生を集める。具体的には、ミドリイガイウンボ期幼生が含まれているミドリイガイ幼生集団を飼育ビーカーから取り出し、顕微鏡観察によって、殻頂（ウンボ）が形成されたウンボ期の個体を選別し、収集を行なう。なお、幼生を育成するための卵は、例えば、天然から採取した成貝を人工授精して得ることができる。

次に、ミドリイガイウンボ期幼生又はその粗抽出液等を抗原として用い、適当な量の抗原（アジュバントを使用してもよい。）を哺乳類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル等）の静脈内、皮下、腹腔内等に（1〜複数回）投与して免疫する。

その後、免疫した動物から抗体産生細胞を採取し、採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させてハイブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマの中で、ムラサキイガイ幼生には反応性を示さないが、ミドリイガイ幼生には反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選定することにより、本発明にかかるＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。

前記抗体産生細胞とミエローマ細胞は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等の細胞融合促進剤を用いて細胞融合することができるが、エレクトロポレーション等の電気刺激を利用して細胞融合することもできる。なお、細胞融合の効率を高めるために、ジメチルスルホキシドやレシチン等の補助剤を細胞融合促進剤に含ませてもよい。

前記抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等を用いることができる。これらの細胞は、動物から脾臓、リンパ節、胸腺、又は末梢血を摘出し、摘出した組織を破砕、濾過、遠心分離等することにより得ることができる。また、前記ミエローマ細胞としては、各種動物由来の細胞株を用いてもよいが、それ自身薬剤に対して抵抗性を示さないが、融合すると薬剤に対して抵抗性を示す細胞株を用いることが好ましい。これにより、細胞融合した後、薬剤を添加した培養培地（例えば、ＨＡＴ培地等）で培養することにより、細胞融合によって得られたハイブリドーマの選択が容易となる。なお、融合させる抗体産生細胞とミエローマ細胞は、同種の動物由来の細胞を用いることが望ましいが、異なる種の動物由来の細胞を用いてもよい。

前述のハイブリドーマの選定は、常法のスクリーニングやクローニングにより行うことができる。ハイブリドーマのスクリーニングには、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Enzyme ImmunoAssay、ＥＬＩＳＡ：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ：Radio Immuno Assay）、ウエスタンブロッティング等を用いることができ、ハイブリドーマのクローニングには、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等を用いることができる。本発明にかかるハイブリドーマの選定において、上記スクリーニング及びクローニングを繰り返し行うことにより、ミドリイガイ幼生又はその粗抽出液に対して特異性の高いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することが可能となる。

なお、前述のハイブリドーマのスクリーニングでは、最低限ミドリイガイ幼生（ウンボ期幼生）及びムラサキイガイ幼生との反応性を調べればよいが、さらに、他の二枚貝類の幼生、フジツボ幼生（キプリス幼生）、甲殻類プランクトン等の他の幼生若しくはプランクトンとの反応性を調べることがより好ましい。これにより、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に対してより特異性の高いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができ、このハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いることにより、様々な幼生又はプランクトンを含む試料（例えば、海水等）中からＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生を特異的に検出することができるようになる。すなわち、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の存在の有無の確認、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の同定、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の量の測定等を行うことができるようになる。

＝＝モノクローナル抗体又はそのフラグメントの使用＝＝
本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、Ｍｙｔｉｌｕｓ属に属するイガイ幼生には反応性を示さないが、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に対して特異的に反応性を示す。従って、イガイ科に属する生物間において、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の属特異的な検出に有用であると考えられる。

また、本発明にかかるモノクローナル抗体は、イガイ以外の二枚貝類（特に、マガキ、アサリ、及びバカガイ）の幼生には反応性を示さない方が好ましい。このようなモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、類似の生物間におけるＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の特異的な検出にも有用であると考えられる。

さらに、本発明にかかるモノクローナル抗体又はフラグメントは、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生を効率的に選択して回収するのに有用であると考えられる。Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の回収は、モノクローナル抗体又はそのフラグメントとの親和性を利用して行うことができる。例えば、磁性体を結合させた本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントをＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に作用させ、その後、磁石を用いて本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを回収することにより行うことができる。なお、前記磁性体としては、例えば、鉄、酸化鉄等を用いることができる。その他、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の回収において、ＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）、ｐａｎｎｉｎｇ等の方法を用いてもよい。

本発明にかかるＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の検出は、試料（例えば、海水若しくは川水又はそれを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物等）に、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを加えて試料中のＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生由来の抗原と反応させることにより、その抗原を同定することにより行うことができる。

従って、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に特異的に反応し、Ｍｙｔｉｌｕｓ属に属するイガイ幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含む試薬、キット、又は器具は、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の検出用試薬、検出キット、及び検出器として利用可能である。

なお、本発明にかかるＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の検出用試薬は、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含むものであればどのようなものでもよく、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の、抗体又はそのフラグメント以外に抗原の検出用試薬に含ませる一般的な物質が１又は２以上、さらに含まれていてもよい。

本発明にかかるＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の検出器は、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントが媒体（例えば、濾紙等の紙、ガラス、繊維、ニトロセルロース等の変性セルロース、ナイロン、プラスチック等から成るフィルター、メンブレン、プレート、ディッシュ等）に固定化されているものを含めばどのようなものでもよく、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の、抗体又はそのフラグメント以外に抗原の検出器に含ませる一般的な物質が１又は２以上、さらに含まれていてもよい。

本発明にかかるＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の検出器の一例としては、試料を滴下する部分又は試料を浸す第一の部分と、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントが固定化された第二の部分と、本発明にかかるモノクローナル抗体が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体等が固定化された第三の部分を有し、第二の部分が第一の部分と第三の部分との間に備えられ、第一の部分には、金属コロイド粒子（例えば、金コロイド粒子等）、重金属（例えば、金、白金等）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ローダミン、ファロイジン等）、着色ラテックス粒子等の標識物質で標識された、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含むクロマトグラフ媒体を挙げることができる。前記クロマトグラフ媒体としては、例えば、ガラスやシリカ等の無機繊維からなる濾紙、ニトロセルロース等の変性セルロース等を用いることができる。このようなクロマトグラフ媒体を用いることにより、試料中にＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生が存在するかどうかを検出することが可能になる。

その原理としては、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生又はその溶解物を含む試料をクロマトグラフ媒体の第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、試料中のＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生又はその溶解物は、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体又はそのフラグメントと反応して複合体を形成し、液が媒体中を広がるのを利用して、その複合体は第二の部分へと移動し、第二の部分において固定化された前述のモノクローナル抗体又はそのフラグメントに捕捉されてその位置で標識物質によりＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の検出が可能となる。第一の部分からくるフリーの抗体は、第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分で発色が生じる。この第三の部分での発色は、検出の陽性対照となる。これに対して、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生由来の抗原を含まない試料を第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体又はそのフラグメントが、第二の部分を素通りして第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分でのみ発色が生じる。このように、第二の部分にシグナルが現れたか否かによって、試料中にＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生が存在するかどうかを判定することが可能となる。

一方、本発明にかかるＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の検出キットは、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含むものであればどのようなものでもよく、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメント以外に、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の抗原の検出キットに含ませる一般的な物質、若しくは前述のような本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントが媒体に固定化されている検出器、又はこれらのうち２以上を組み合わせたものが含まれていてもよい。

なお、標識物質としては、例えば、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）等）、放射性同位元素（例えば、^３Ｈ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ等）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジン等の物質を用いることができるがこれらに制限されるものではなく、公知の標識物質を用いてもよい。また、発色基質としては、前述の酵素に対する発色基質であれば特に制限されるものではなく、例えば、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｏ-フェニレンジアミン(o-Phenylenediamine)、過酸化水素水、ＢＣＩＰ/Ｎｉｔｒｏ-ＴＢ（5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/Nitrotetrazolium blue）、ｐＮＰＰ（para-nitorophenylphosphate）等を用いることができる。発色増強剤としては、前述の基質の発色を増強させることができるものであればどのようなものでもよく、例えば、硫酸等を用いることができ、二次抗体としては、例えば、本発明にかかるモノクローナル抗体が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体、抗ＩｇＧ（Ｈ+Ｌ）、抗ＩｇＧ（Ｆｃ）等を用いることができる。
また、前述の免疫学的手法としては、ＥＩＡ（Enzyme Immunoassay）、蛍光免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、ＲＩＡ（Radioimmuno assay）、ウエスタンブロッティング、ラテックス凝集法、イムノクロマト法、サンドイッチ法等の公知の方法を用いることができる。

以上のように、本発明にかかるＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の検出方法を用いることにより、Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の同定やＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生の分離及び量の測定が可能となるが、検出キットや検出器を用いることにより、より容易にＰｅｒｎａ属に属するイガイ幼生を同定することができるようになる。

以下に本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。

＜実施例１＞
本実施例では、ミドリイガイ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。

＝＝ミドリイガイ幼生の飼育方法＝＝
ミドリイガイ成貝を、高知県深浦港にて採取した。これらの成貝の放卵・放精によって受精した卵を回収した。受精卵をろ過海水にて洗浄後、２０μｍメッシュを用いて繰り返し洗浄を行った。さらに、抗生物質（最終濃度、ストレプトマイシン ２６．４ｍｇ／ｌ、ペニシリン １２ｍｇ／ｍｌ）を添加したろ過海水を満たしたビーカーに収容し、エアレーションしながら飼育した。この際、水温は２３〜２５℃で、イソクソリシス（Isochrysis galbana、約１０００細胞／ｍｌ）およびパブロバを給餌し、１〜２日毎に換水を行った。受精卵の飼育開始１２日後、ウンボ期幼生にまで成長したミドリイガイ幼生を凍結し、マウスに接種する時まで凍結保存した。

＝＝ミドリイガイ幼生によるマウス免疫方法＝＝
凍結保存したミドリイガイウンボ期幼生を滅菌ＰＢＳで洗浄し、３００〜４００μｌ滅菌ＰＢＳあたり２００〜３００個体になるように調製した。１回の注射につき、この全量をＢＡＬＢ/ｃマウス（メス、７週齢）の腹腔内に接種し、これを平成１９年１１月１９日から３〜４週間毎に４回繰り返した。さらに、平成２０年８月２２日、１１月１４日、１２月１２日に同量のミドリイガイウンボ期幼生を接種し、マウスを免疫した。

＝＝ハイブリドーマの作製＝＝
最終接種から３日後に抗体価が上がったマウスを解剖して脾臓を摘出し、１％の抗生物質（Antibiotic-Antimycotic、GIBCO社）を添加した１０％のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、GIBCO社）含有（ＦＢＳ⁺）ＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO社）中で滅菌ステンレスメッシュにより裏漉した後、分散・懸濁することにより浮遊細胞を得た。この浮遊細胞を１％ Antibiotic-Antimycotic添加ＲＰＭＩ１６４０（ＦＢＳ⁺）培地で洗浄・遠心した後、ＲＰＭＩ１６４０（ＦＢＳ^-）培地（抗生物質無添加）で３回遠心・洗浄し、ハイブリドーマ作製のための脾臓細胞（１０^８個程度）を回収した。この脾臓細胞を３７℃で維持した。

セルバンカーを用いて−８０℃凍結保存しておいたミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１細胞株）を融解し、遠心法（１０００ｒｐｍ、５分）を用いて洗浄後、１％ Antibiotic-Antimycotic（GIBCO社）添加ＲＰＭＩ１６４０（ＦＢＳ⁺）培地で約５×１０^４ 細胞／ｍｌの密度で培養した。対数増殖期のミエローマ細胞を回収し、１％ Antibiotic-Antimycotic（GIBCO社）添加ＲＰＭ１６４０（ＦＢＳ^-）培地で遠心、洗浄した後、３７℃で維持した。

このように調製したミエローマ細胞（５×１０^７細胞）と脾臓細胞（１０^８細胞）を混合し、その後遠心して上清を除去し、細胞ペレット（沈殿）を作製した。

オートクレーブ滅菌後に低温保存していた１ｇのＰＥＧ４０００（ポリエチレングリコール、MERCK社、Article No.9727）を使用当日加熱融解し、ＲＰＭＩ１６４０（ＦＢＳ^-）培地１ｍｌを混合してＰＥＧ液を調製し、３７℃で維持した。
上記細胞ペレットに、このＰＥＧ液１ｍｌを加え、1分間かけてゆっくりと添加しながら撹拌した。さらに、３７℃に加温したＲＰＭ１６４０（ＦＢＳ^-）培地を２ｍｌ加え、１分間攪拌した。その後、３７℃に加温したＲＰＭ１６４０（ＦＢＳ^-）培地を８ｍｌ加え、１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、細胞融合を行った。ここで上清を除去し、ＲＰＭ１６４０（ＦＢＳ⁺）培地１０ｍｌを添加して沈殿を懸濁、攪拌し、融合細胞懸濁液とした。この融合細胞懸濁液を、ＲＰＭ１６４０（ＦＢＳ⁺）培地１０ｍｌの入った分室シャーレ１０枚に、各１ｍｌずつ播種しＣＯ_２インキュベータで３７℃で静置培養した。培養開始から１日、各シャーレから５ｍｌずつ培地を取り、この培地に１×ＨＡＴ培地１０ｍｌを添加（最終濃度０．７×ＨＡＴ培地）した後ＣＯ_２インキュベータで静置培養した。さらに、その翌日、２×ＨＡＴ培地を添加し最終濃度１×ＨＡＴ培地とした後、５日間〜１０日間、３７℃で培養を続けた。

＝＝ハイブリドーマ細胞のスクリーニング＝＝
各セル内で明瞭な増殖が確認されたハイブリドーマ細胞のコロニーのうち、各セル内で単一のコロニーを形成しているコロニーをピックアップし、選択増殖培地（１０％の細胞増殖因子（conditioned medium from J774A.1 cells）添加１×ＨＴ培地、Sigma-aldrich社）の入った９６ウェルプレートに移し、ハイブリドーマの培養を行った。その後、明瞭なハイブリドーマの増殖が確認されたウェルについて、その培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により抗体の産生を確認した。

＝＝ＥＬＩＳＡ法＝＝
以下に記載のＥＬＩＳＡ法において、特に記載がない過程は室温にて処理（反応を含む）を行った。

（１）「ミドリイガイ幼生の飼育方法」に記載した方法で調製し、凍結保存したミドリイガイウンボ期幼生５００個体に１００μlの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）を加え、氷中でホモジナイズ・超音波（数秒×５回）処理を行い、５０００ｒｐｍで２０分間遠心することにより得たミドリイガイウンボ期幼生粗抽出液をタンパク質濃度５０μｇ／ｍｌになるように調製した。
（２）（１）で得られたミドリイガイウンボ期幼生粗抽出液５０μlを、９６穴イワキＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、４℃一晩インキュベートして抗原をウェル底面に吸着させた。
（３）（２）で吸着処理した各ウェルをＴＢＳ（０．５ Ｍ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５））２００μlで洗浄した。
（４）各ウェルを１％ ＢＳＡを含むＴＢＳ １００μlで１時間ブロッキングした。
（５）各ウェルをＴＴＢＳ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）２００μｌで３回洗浄した。
（６）ハイブリドーマを培養することにより得られた培養上清（一次抗体）５０μｌを、Ｂ（１）Ａ２については１（希釈なし）、１０、２０、５０、あるいは１００倍、Ｅ１−１については、１０、２０、５０、あるいは１００倍に希釈して各ウェルに加え、２時間反応させた。
（７）各ウェルをＴＴＢＳ ２００μｌで４回洗浄した。
（８）各ウェルに２次抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ+Ｌ）ヤギ抗体、ZYMED laboratory 社）溶液（ＴＢＳで１０００倍に希釈した溶液）５０μｌを加えて１時間反応させた。
（９）各ウェルをＴＴＢＳ ２００μｌで５回洗浄した。
（10）各ウェルに基質（アルカリフォスファターゼ基質キット、BIO-RAD 社）溶液 １００μｌを加え、１時間振盪することにより発色させた。
（11）マイクロプレートリーダー（BIO-RAD Model550）を用いて、各ウェルの溶液の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

本ＥＬＩＳＡ法により高い抗体産生能が確認されたハイブリドーマについて、段階的に希釈した培養液をさらにＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定し、抗体産生能が高いハイブリドーマをピックアップするという操作を３回繰り返して行い（２回目及び３回目の培養は、ＨＴを含まない１０％ ＦＢＳ、１％ Antibiotic-Antimycotic（GIBCO社）、及び１０％ 細胞増殖因子（conditioned medium from J774A.1 cells、Sigma-aldrich社）を含むＲＰＭＩ１６４０を用いた。これにより、ミドリイガイウンボ期幼生粗抽出液に対して結合性の高い抗体を産生するハイブリドーマ（Ｂ（１）Ａ２、および、Ｅ１−Ａ）を得た。

＝＝抗体精製法＝＝
上記ハイブリドーマ（Ｂ（１）Ａ２、および、Ｅ１−Ａ）培養上清を、アフィニティクロマトグラフィー法により精製し、各精製モノクローナル抗体を得た。Ｂ（１）Ａ２については２０、あるいは１００μｇ／ｍｌ、Ｅ１−１については５、２０、あるいは１００μｇ／ｍｌに調製した各精製モノクローナル抗体を用いて上記ＥＬＩＳＡ法を行い、ミドリイガイウンボ期幼生粗抽出液およびムラサキイガイ付着期幼生粗抽出液との反応性を調べた。なお、ムラサキイガイ付着期幼生粗抽出液（５０μｇ／ｍｌ）は、ミドリイガイと同様にして飼育したムラサキイガイを顕微鏡で観察して眼点および足が形成されている付着期幼生を選別し、上記ミドリイガイと同様の方法で調製した。

図１および図２に示すように、ハイブリドーマＢ（１）Ａ２およびハイブリドーマＥ１−Ａの培養上清は、どちらもミドリイガイウンボ期幼生粗抽出液との反応性が顕著に高いが、ムラサキイガイ付着期幼生粗抽出液との反応性が低い。

また、図３および図４に示すように、ハイブリドーマＢ（１）Ａ２およびハイブリドーマＥ１−Ａの培養上清を精製して調製した精製モノクローナル抗体は、どちらもミドリイガイウンボ期幼生粗抽出液との反応性が顕著に高いが、ムラサキイガイ付着期幼生粗抽出液との反応性が低い。

以上の結果は、本実施例で作製したハイブリドーマＢ（１）Ａ２およびＥ１−Ａクローンが産生するモノクローナル抗体はムラサキイガイ幼生に対して反応性が低く、ミドリイガイ幼生に特異的に反応することを示している。よって、これらのモノクローナル抗体によって、ミドリイガイ幼生を特異的に検出することができる。

＜実施例２＞
本実施例では、実施例１において得られた２つのハイブリドーマの培養上清に含まれるモノクローナル抗体が、ミドリイガイ幼生に対して特異的に反応することを示す。

アカフジツボ（Megabalanus rosa）キプリス幼生、甲殻類プランクトン（アルテミア（Artemia salina）ノープリウス幼生）、アサリ（Ruditapes philippinarum）付着期幼生の粗抽出液との反応性を、実施例１に記載のＥＬＩＳＡ法に従って確認した。

各粗抽出液は、各幼生又はプランクトンを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．５）に加えてホモジナイズ・超音波（数秒×５回）処理し、５０００ｒｐｍで２０分間の遠心を行うことにより得た。これをタンパク質濃度１００μｇ／ｍｌに調製し、上記ＥＬＩＳＡ法に従い５０μｌを各ウェルに滴下した。陰性対照として、タンパク質を含まない５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）を用いた。また、陽性対照として同様の方法で調製したミドリイガイウンボ期幼生又はＤ型幼生の粗抽出液（タンパク質濃度：５０μｇ／ｍｌ）を用いた。
ＥＬＩＳＡの結果（ＯＤ_４０５値）を表１に示す。

表１に示されるように、Ｂ（１）Ａ２、および、Ｅ１−Ａ共に吸光度測定値は、アカフジツボ（Megabalanus rosa）キプリス幼生、甲殻類プランクトン（アルテミア（Artemia salina）ノープリウス幼生）、アサリ（Ruditapes philippinarum）付着期幼生ではミドリイガイウンボ期幼生、Ｄ型幼生の粗抽出液よりも高濃度のタンパク質粗抽出液を用いたにも関わらず、ミドリイガイ幼生に比較して顕著に低く、対照群と同程度であった。この測定結果は、いずれのハイブリドーマの培養上清も、アカフジツボ、甲殻類プランクトン、アサリの粗抽出液に対して反応性が低いことを示している。

この結果は、実施例１で作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が、フジツボ、甲殻類プランクトン、アサリ等の幼生には反応しないことを示している。さらに、ムラサキイガイ幼生にも反応しないという実施例１の結果を考慮すると、このモノクローナル抗体がミドリイガイ幼生に高度に特異的な抗体であることを示している。

＜実施例３＞
本実施例では、実施例１で得られたハイブリドーマであるＡ２（１）およびＥ１−Ａが産生するモノクローナル抗体がミドリイガイ幼生に特異的に反応することを免疫組織化学的に示す。

＝＝免疫組織化学染色法＝＝
ハイブリドーマＡ２（１）およびＥ１−Ａが産生するモノクローナル抗体を用いて、ミドリイガイ（Ｄ型幼生およびウンボ期〜付着期幼生）、およびムラサキイガイ（Ｄ型幼生およびウンボ期〜付着期幼生）に対する免疫染色を以下のように行った。また、以下において、特に記載がない過程については室温にて処理を行った。

（１）７５％エタノールで固定されたミドリイガイ（Ｄ型幼生、ウンボ期〜付着期幼生）、およびムラサキイガイ（Ｄ型幼生、ウンボ期〜付着期幼生）を、５０％エタノールを経て２０％エタノールに置換した。
（２）固定した各幼生を、ＴＢＳおよびＴＴＢＳで洗浄した。
（３）１％ＢＳＡを含むＴＴＢＳで、１時間半ブロッキングした。
（４）実施例１で作製したハイブリドーマ（Ｂ（１）Ａ２あるいはＥ１−Ａ）の培養上清を１％ＢＳＡを含むＴＴＢＳで２０倍に希釈し、これを一次抗体溶液として幼生を１時間半インキュベートした。
（５）ＴＴＢＳで４回洗浄した。
（６）二次抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ+Ｌ）ヤギ抗体（ZYMED社）、１％ ＢＳＡを含むＴＴＢＳで５０００倍に希釈、で１時間インキュベートした。
（７）ＴＴＢＳで４回洗浄した。
（７）アルカリフォスファターゼ基質キット（BIO-RAD社）を加え、５〜３０分インキュベートして発色させた。
（８）蒸留水で洗浄して発色を停止した。
なお、対照群の幼生は（４）において一次抗体溶液のかわりに１％ＢＳＡを含むＴＴＢＳを用い、その他の工程は同様に行った。

図５および図６に示すように、ミドリイガイＤ型幼生（図５）およびミドリイガイウンボ期〜付着期幼生（図６）においてはＢ（１）Ａ２およびＥ１−Ａの培養上清が幼生の面盤に免疫反応を示した（矢印）。一方、ムラサキイガイＤ型幼生（図７）およびムラサキイガイウンボ期〜付着期幼生（図８）においてはいずれのハイブリドーマの培養上清も反応を示さなかった。

この結果は、実施例１で作製されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体は、サンプルがwhole-mountであっても、ミドリイガイ幼生には反応するが、ムラサキイガイ幼生には反応しないことを示している。従って、これらのモノクローナル抗体により、ミドリイガイ幼生を特異的に検出することができる。

Claims (10)

1. Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生に反応し、Ｍｙｔｉｌｕｓ属に属するイガイ幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントであって、
   前記フラグメントは、抗原結合部位を含むことを特徴とするモノクローナル抗体又はそのフラグメント。
2. Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生がミドリイガイ（Perna viridis）幼生であり、Ｍｙｔｉｌｕｓ属に属するイガイ幼生がムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）幼生であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメント。
3. ミドリイガイ幼生の面盤に反応することを特徴とする請求項２に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメント。
4. アサリ幼生、甲殻類プランクトン、およびフジツボ幼生に反応しないことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメント。
5. 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８０６で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメント。
6. Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生を特異的に検出する検出用試薬であって、
   請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを有効成分として含有する検出用試薬。
7. Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生を特異的に検出する検出キットであって、
   請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含むことを特徴とする検出キット。
8. Ｐｅｒｎａ属に属するイガイ幼生を特異的に検出する検出器であって、
   請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントが固定化されていることを特徴とする検出器。
9. 請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
10. 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８０５、あるいは、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８０６で寄託されていることを特徴とする請求項９に記載のハイブリドーマ。