JP5021183B2 - タンパク質固定化膜および固定化方法、ならびにバイオセンサ - Google Patents

Description

本発明は、被固定化部材にチトクロムを含むタンパク質を固定化する技術に関する。

バイオセンサとしては、電気化学的手法あるいは光学的手法により試料の分析を行えるように構成されたものが汎用されている。電気化学的手法により試料の分析を行うためのバイオセンサとしては、たとえば本願の図１２に示したバイオセンサ９がある（たとえば特許文献１参照）。

図示したバイオセンサ９は、作用極９０および対極９１が形成された基板９２に対して、スペーサ９３を介してカバー９４が接合されたものである。このバイオセンサ９はさらに、基板９２、スペーサ９３およびカバー９４によって規定された流路９５を有している。この流路９５は、毛細管力により試料を移動させるものであり、その内部に試薬層９６が形成されている。

試薬層９６は、作用極９０および対極９１の端部どうしを繋げるように形成されており、酸化還元酵素を含んでいる。酸化還元酵素は、たとえばグルコースから電子を取り出す反応を触媒するものであり、グルコースから取り出された電子は作用極９０に供給される。作用極９０に対する電子供給量は、作用極９０および対極９１を利用して応答電流として測定することができる。

ここで、試薬層９６を形成するための代表的な方法、すなわち酸化還元酵素を固定化するための代表的な方法としては、次に説明するような４つのものがある（たとえば非特許文献１参照）。

第１の方法は、酸化還元酵素を含む材料液を対象物の目的部位に点着した後、材料液を乾燥させることにより対象物の目的部位に酸化還元酵素を固定化する方法である。

第２の方法は、グルタルアルデヒドなどの架橋剤を用いて、対象物の目的部位に酸化還元酵素を固定化する方法である。

第３の方法は、カルボメチルセルロース（ＣＭＣ）などのポリマー中に酸化還元酵素を包括させた状態でポリマーとともに酸化還元酵素を固定化する方法である。

第４の方法は、カーボンペーストなどの導電性成分中に酸化還元酵素を分散させたペーストを用い、このペーストを対象物の目的部位に塗り付けて酸化還元酵素を固定化する方法である。

しかしながら、従来の酸化還元酵素の固定化方法では、酸化還元酵素の活性発現に効率の良い向き（位置）に活性部位が位置するように、個々の酸化還元酵素を固定化できない。すなわち、酸化還元酵素の配向性を制御して固定化できないといった問題がある。たとえば、従来の方法においては、隣接して存在する酸化還元酵素の活性部位が向き合って存在し、あるいはタンパク質どうしが凝集して活性部位が凝集塊の内部に存在するため、効率良く利用できる酸化還元酵素（活性部位）の割合が相対的に低い。そのため、酸化還元酵素が基質と接触できる確率が低くなり、固定化された酸化還元酵素の全体としての活性は低くなる。その結果、固定化された酸化還元酵素によって目的とする機能を発現させるためには、酸化還元酵素の仕込み量を大きくしなければならず、コスト的に不利となる。
とくに、酸化還元酵素に高価なものが多いため、酸化還元酵素においては仕込み量を多く必要とすることに起因するコスト的なデメリットは、より顕著に現れる。

また、酸化還元酵素の配向性を制御できないことから、酸化還元酵素の仕込み量が同じであっても、バイオセンサ毎に実際に利用できる酸化還元酵素の割合にバラつきが生じる。その結果、配向性を制御できない従来の固定化方法では、この固定化方法に起因して測定結果にバラつきが生じる。

先に説明したバイオセンサ９ではさらに、酸化還元酵素における活性部位において基質から取り出した電子は作用極９０に供給されるが、そのときに酸化還元酵素の配向性がランダムであると、酸化還元酵素から作用極９０への電子伝達効率が悪くなる。そのため、酸化還元酵素の配向性がランダムとなる固定化方法を採用する場合には、酸化還元酵素と作用極９０との間の電子授受を媒体するための電子伝達物質を添加する必要が生じる。したがって、従来の手法により酸化還元酵素が固定化されたバイオセンサ９では、電子伝達物質が必要な分だけコスト的に不利である。また、電子伝達物質としては、フェロシアン化カリウムなどの金属錯体が使用されており、それらの金属錯体の中には人体に悪影響を及ぼすものも存在する。そのため、バイオセンサ９をはじめとするバイオセンサにおいては、電子伝達物質を使用するのは好ましくない。

特公平８−１０２０８号公報 水谷文雄，「酵素薄膜修飾電極のセンサーへの応用」，分析化学，日本分析化学学会，１９９９年９月，第４８巻，第９号，ｐ８０９〜８２１

本発明は、酸化還元酵素などのタンパク質を配向性良く固定化するとともに、少ない酵素量で活性にバラつきを生じさせることなく適切かつコスト的に有利に目的とする活性を発現させることを課題としている。

本発明はさらに、バイオセンサにおいて、電子伝達物質を使用することなく、適切にグルコース濃度の測定を行えるようにすることを課題としている。

本発明の第１の側面においては、グルコース脱水素活性を有するαサブユニットおよび電子伝達機能を有するチトクロムＣを含むＣｙＧＤＨが、その配向性を制御しうる細胞膜構造に類似した細胞膜類似構造層を表面側に有する被固定化部材に、上記チトクロムＣが上記被固定化部材に近い側に位置し、上記αサブユニットが上記被固定化部材から遠い側に位置するように固定されたことを特徴とする、タンパク質固定化膜が提供される。

本発明の第２の側面においては、被固定化部材にグルコース脱水素活性を有するαサブユニットおよび電子伝達機能を有するチトクロムＣを含むＣｙＧＤＨを固定化する方法であって、上記被固定化部材における目的部位に、親水処理を施すステップと、上記目的部位に、シランカップリング剤を導入させた、上記ＣｙＧＤＨの配向性を制御しうる細胞膜構造に類似した細胞膜類似構造層を形成するステップと、上記細胞膜類似構造層に対して、上記ＣｙＧＤＨを、上記チトクロムＣが上記被固定化部材に近い側に位置し、上記αサブユニットが上記被固定化部材から遠い側に位置するように自己組織化させるステップと、を含んでいることを特徴とする、タンパク質の固定化方法が提供される。

本発明の第３の側面では、グルコース脱水素活性を有するαサブユニットおよび電子伝達機能を有するチトクロムＣを含むＣｙＧＤＨが被固定化部材に対して固定化されたバイオセンサであって、上記ＣｙＧＤＨは、上記被固定化部材の表面側に形成した、上記ＣｙＧＤＨの配向性を制御しうる細胞膜構造に類似した細胞膜類似構造層に対して、上記チトクロムＣが上記被固定化部材に近い側に位置し、上記αサブユニットが上記被固定化部材から遠い側に位置するように自己組織化した状態で上記被固定化部材に固定化されていることを特徴とする、バイオセンサが提供される。

好ましくは、細胞膜類似構造層は、リン脂質ポリマーを含むものとして形成される。リン脂質ポリマーとしては、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）重合体が使用される。

本発明のバイオセンサは、たとえば試料を移動させるための流路と、流路の内部に設けられ、かつ上記ＣｙＧＤＨを含む試薬層と、を備えている。この場合において、ＣｙＧＤＨは、流路の規定する面に対して固定化される。

本発明のバイオセンサは、たとえば流路において一部が露出し、かつ試料に電圧を印加するのに利用される作用極および対極を有するもの、すなわち電気化学的手法によりグルコース濃度を測定するのに適合したものとして形成される。この場合、細胞膜類似構造層は、少なくとも作用極上に形成するのが好ましい。

一方、本発明のバイオセンサは、試薬層が発色剤を含んだ発色層を有するもの、すなわち、光学的手法によりグルコース濃度を測定するのに適合したものとして形成される。この場合、細胞膜類似構造層は、発色層を介して、流路を規定する面に固定化するのが好ましい。

以下、本発明の好ましい実施の形態について、第１および第２の実施の形態として、図面を参照して説明する。

まず、本発明の第１の形態について、図１ないし図３を参照しつつ説明する。

図１ないし図３に示したバイオセンサＸ１は、使い捨てとして構成されたものであり、濃度測定装置（図示略）に装着して血糖値を測定するために使用するものである。このバイオセンサＸ１は、電気化学的手法により血糖値を測定するのに適合したものであり、長矩形状の基板１に対して、スペーサ２を介してカバー３を積層した形態を有している。バイオセンサＸ１においては、各要素１〜３により、基板１の長手方向（図中のＮ１，Ｎ２方向）に延びるキャピラリ４が規定されている。キャピラリ４は、導入口４０から導入された血液を、毛細管現象を利用して基板１の長手方向（図中のＮ１，Ｎ２方向）に移動させるとともに、導入された血液を保持するためのものである。

スペーサ２は、基板１の上面１０からカバー３の下面までの距離、すなわちキャピラリ４の高さ寸法を規定するためのものであり、たとえば両面テープにより構成されている。このスペーサ２には、先端部が開放したスリット２０が形成されている。スリット２０は、キャピラリ４の幅寸法を規定するためのものであり、スリット２０における先端の開放部分は、キャピラリ４の内部に血液を導入するための導入口４０を構成している。

カバー３は、キャピラリ４の内部の気体を外部に排気するための排気口３０を有している。このようなカバー３は、たとえばビニロンや高結晶化ＰＶＡなどの濡れ性が高い熱可塑性樹脂により形成されている。

図２および図３によく表れているように、基板１は、たとえばＰＥＴなどの絶縁樹脂材料により形成されており、その上面１０に、作用極１１、対極１２、絶縁膜１３、および試薬層１４が形成されたものである。

作用極１１および対極１２は、全体としてＬ字状の形態に形成されている。より具体的には、作用極１１および対極１２は、大部分が基板１の長手方向（図中のＮ１，Ｎ２方向）に延びているとともに、端部１１ａ，１２ａが基板１の短手方向（図中のＮ３，Ｎ４方
向）に延びている。一方、作用極１１および対極１２の端部１１ｂ，１２ｂは、濃度測定装置（図示略）に設けられた端子に接触させるための端子部を構成している。作用極１１および対極１２は、たとえばカーボンペーストを用いたスクリーン印刷により形成することができる。作用極１１および対極１２の形成は、カーボン以外の導電性材料を用いて行うことができ、またスピンコート、熱転写、カーボンロッドスライス、蒸着、スパッタあるいはＣＶＤによって行うこともできる。

絶縁膜１３は、作用極１１および対極１２の端部１１ａ，１２ａ，１１ｂ，１２ｂを露出させるようにして作用極１１および対極１２の大部分を覆っている。この絶縁膜１３は、作用極１１および対極１２の端部１１ａ，１２ａを露出させるための開口部１３ａを有している。この開口部１３ａは、試薬層１４を形成するための領域を規定するものであり、基板１の長手方向（図中のＮ１，Ｎ２方向）に延びる長矩形状に形成されている。

絶縁膜１３は、撥水性の高い材料を含むインクを用いたスクリーン印刷、あるいは感光性樹脂材料を用いたフォトリソグラフィにより形成することができる。

試薬層１４は、絶縁膜１３の開口部１３ａにおいて、作用極１１および対極１２の端部１１ａ，１２ａどうしを橋渡すようにして設けられている。この試薬層１４は、細胞膜類似構造層１４ＡおよびＣｙＧＤＨ層１４Ｂを有している。

細胞膜類似構造層１４Ａは、配向性を持たせた状態でＣｙＧＤＨを固定化するためのものである。この細胞膜類似構造層１４Ａは、リン脂質ポリマーを含んだ溶液を、基板１、作用極１１および対極１２における絶縁膜１３の開口部１３ａを介して露出した部分１４′（以下「露出部分１４′」という）に点着した後に、乾燥させることにより形成することができる。

リン脂質ポリマーとしては、たとえば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）重合体を使用することができる。ＭＰＣ重合体としては、ＭＰＣを単独で重合させ、あるいはＭＰＣをメタクリル酸エステル（たとえばブチルメタクリレート）などの疎水性モノマーと共重合させたものを使用することができる。

細胞膜類似構造層１４Ａを形成するためのリン脂質ポリマーは、細胞膜を構成するリン脂質と類似の構造を分子内に有するモノマー単位を含む重合体であればよく、ＭＰＣ重合体以外のポリマーを使用することもできる。

また、リン脂質ポリマーとしては、シランカップリング剤を導入したものを使用するのが好ましい。これにより、露出部分１４′に対するリン脂質ポリマーの結合性を高めることができる。

また、細胞膜類似構造層１４Ａを形成するに当たっては、露出部分１４′を親水処理しておくのが好ましい。これにより、露出部分１４′に水酸基やカルボキシル基などの親水基が導入され、この親水基がシランカップリング剤と結合することによって、より強固に露出部分１４′にリン脂質ポリマーを固定化することができる。

ここで、ポリマーにおけるシランカップリング剤の量は、たとえばポリマー成分１００重量部に対して、１０〜５００重量部とされる。シランカップリング剤としては、たとえばテトラエトキシシラン、ビニルトリクロロシラン、ビニルトリス（２−メトキシエトキシ）シラン、γ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、γ−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、β−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、γ−グリシドキプロピルトリエトキシシラン、γ−アミノプロピルトリエトキシ
シラン、Ｎ−フェニル−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、γ−クロロプロピルトリメトキシシラン、あるいはγ−メルカプトプロピルトリメトキシシランを挙げることができ、これらのシランカップリング剤は、単独で使用しても、複数種を併用してもよい。

一方、露出部分１４′の親水処理は、公知の種々の方法により行うことができる。本発明において採用することができる親水処理としては、ＶＵＶ処理、ＵＶ処理、コロナ放電処理、あるいはプラズマ処理などを挙げることができる。

ＣｙＧＤＨ層１４Ｂは、細胞膜類似構造層１４Ａに対してＣｙＧＤＨを自己組織的に固定化させたものである。なお、図３においては、細胞膜類似構造層１４Ａの表面にＣｙＧＤＨが固定化された様子が描かれているが、これは本案を説明するために便宜的に示した模式図である。すなわち、本発明者らは、細胞膜類似構造層１４Ａに対してＣｙＧＤＨが自己組織的に固定化されることは確認しているものの、細胞膜類似構造層１４Ａに対してＣｙＧＤＨがどのような状態で固定化されているのかについては現段階では確認しておらず、また、後述するブルクホルデリア・セパシアに属する微生物に由来のＣｙＧＤＨは膜貫通タンパク質であるために、必ずしも図３に示したようにＣｙＧＤＨが細胞膜類似構造層１４Ａの表面にのみ固定化されずに、ＣｙＧＤＨが細胞膜類似構造層１４Ａを貫通して細胞膜類似構造層１４Ａに固定化されている可能をも含んでいる。

細胞膜類似構造層１４Ａに対するＣｙＧＤＨの自己組織的固定化は、たとえば露出部分１４′に細胞膜類似構造層１４Ａを形成した基板１を、ＣｙＧＤＨを含んだ酵素溶液中に浸漬した後に、あるいは細胞膜類似構造層１４Ａに上記酵素溶液を噴霧した後に乾燥させることにより行うことができる。

細胞膜類似構造層１４Ａに対してＣｙＧＤＨを自己組織的に固定化した場合には、後述するＡＦＭ像（図８参照）から推測できるように、ＣｙＧＤＨが配向性をもった状態で固定化される。すなわち、ＣｙＧＤＨは、αサブユニットの活性部位が試薬層１４の表層に位置した状態とされる一方で、チトクロムＣが露出部分１４′（作用極１１）に近い位置もしくは接触した状態で細胞膜類似構造層１４Ａに固定化される。

ここで、本発明において使用されるＣｙＧＤＨは、少なくともグルコース脱水素活性を有するαサブユニット、および電子伝達機能を有するチトクロムＣを含むものをさし、αサブユニットおよびチトクロムＣ以外のサブユニットをさらに有するものも含まれる。このようなＣｙＧＤＨの例は、国際公開第ＷＯ０２／３６７７９号パンフレットに開示されている。先の国際出願に記載のＣｙＧＤＨは、ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物に由来するものであり、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａであり、かつＦＡＤを補欠因子としてもつとともに、グルコース脱水素活性を有するαサブユニットと、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａであり、電子伝達機能を有するチトクロムＣと、を含むものである。また、本発明のＣｙＧＤＨには、ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物から採取したＣｙＧＤＨをコードする遺伝子が移入された形質転換体を利用して得られるものも含まれる。

ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物に由来のＣｙＧＤＨは、膜貫通タンパク質である。すなわち、先の微生物由来のＣｙＧＤＨは、本来、細胞膜に存在するものであるため、そのようなＣｙＧＤＨを用いた場合には、細胞膜類似構造層１４Ａに対して自己組織的に、かつ細胞膜に存在する場合と同様に配向性をもった状態でＣｙＧＤＨを固定化することができる。このようなＣｙＧＤＨの自己組織的固定化は、ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物に由来のＣｙＧＤＨに限らず、本来、細胞膜に存在するＣｙＧＤＨを用いた場合に達成することができる。

このようなバイオセンサＸ１は、濃度測定装置（図示略）に装着した上で、バイオセンサＸ１の導入口４０を介してキャピラリ４に血液を供給することにより、濃度測定装置(
図示略)において血糖値の測定を自動的に行わせることができる。

バイオセンサＸ１に対する血液の供給は、バイオセンサＸ１を濃度測定装置（図示略）に装着する前、あるいは装着した後のいずれであってもよい。通常は、被験者の皮膚を切開して血液を出液させた後、その血液をバイオセンサＸ１の導入口４０に付着させることにより行われる。

濃度測定装置(図示略)に対してバイオセンサＸ１を装着した場合、バイオセンサＸ１の作用極１１および対極１２が濃度測定装置の端子(図示略)に接触する。一方、バイオセンサＸ１においては、導入口４０に付着させられた血液は、キャピラリ４において生じる毛細管現象により排気口３０に向けて進行し、キャピラリ４に充填される。

キャピラリ４においては、ＣｙＧＤＨが血液中のグルコースと特異的に反応してグルコースから電子が取り出される。その一方、血液に対して作用極１１および対極１２を利用して電圧を印加した場合には、ＣｙＧＤＨによって取り出された電子が作用極１１に供給される。そして、濃度測定装置では、作用極１１および対極１２に対する電圧印加時に、たとえば作用極１１に対する電子供給量を応答電流値として測定することにより、応答電流値に基づいて血糖値を演算することができる。

バイオセンサＸ１では、ＣｙＧＤＨは、αサブユニットの活性部位が試薬層１４の表面に位置するようにＣｙＧＤＨが配向性をもった状態で固定化される。そのため、試薬層１４においては、グルコースから効率良く電子を取り出すことができる。これにより、バイオセンサＸ１では、目的とする活性発現のために必要とされるＣｙＧＤＨの量を少なくし、コスト的に有利に目的とする活性を発現させることができる。

また、ＣｙＧＤＨが配向性をもって固定化されることから、バイオセンサＸ１毎に、試薬層１４に含まれるＣｙＧＤＨの量および活性部位の向き（位置）にバラつきが生じることを抑制することができる。これにより、バイオセンサＸ１毎の感度のバラつきが生じることを抑制し、適切な血糖値測定を行うことができるようになる。

バイオセンサＸ１ではさらに、ＣｙＧＤＨが配向性をもって固定化されることから、チトクロムＣが露出部分１４′（作用極１１）に近い位置もしくは接触した状態で存在する。そのため、試薬層１４においては、グルコースから取り出された電子を効率良く作用極１１に供給することができる。これにより、バイオセンサＸ１では、金属錯体のような電子伝達物質を使用することなく、適切な応答電流を得ることができる。

次に、本発明の第２の実施の形態について、図４および図５を参照しつつ説明する。

図４および図５に示したバイオセンサＸ２は、光学的手法により血糖値を測定するのに適合したものとして構成されている点において、先に説明したバイオセンサＸ１（図１ないし図３参照）とは異なっている。

バイオセンサＸ２は、長矩形状の基板５に対して、一対のスペーサ６を介してカバー７を積層した形態を有している。バイオセンサＸ２においては、各要素５〜７により、基板５の長手方向（図中のＮ１，Ｎ２方向）に延びるキャピラリ８が規定されている。キャピラリ８は、導入口８０から導入された血液を、毛細管現象を利用して基板５の長手方向（図中のＮ１，Ｎ２方向）に移動させ、かつ導入された血液を保持するためのものである。

キャピラリ８の内部には、試薬層５０が形成されている。この試薬層５０は、発色層５０Ａ上に、細胞膜類似構造層５０ＢおよびＣｙＧＨＤ層５０Ｃを形成したものである。

発色層５０Ａは、発色剤を含んだものであり、たとえば発色剤を含む溶液を基板５における目的部位に塗布した後に乾燥させることにより形成することができる。

ここで、本発明において使用することができる発色剤としては、たとえばMTT(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)、INT(2-(4-lodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride) 、WST-４(2-(4- lodophenyl) -3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4- disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt)、および4AA(4-Aminoantipyrine)を挙げることができる。

細胞膜類似構造層５０ＢおよびＣｙＧＤＨ層５０Ｃは、先に説明したバイオセンサＸ１（図１ないし図３参照）の場合と同様にして形成することができる。

このバイオセンサＸ２においても、試薬層５０が細胞膜類似構造層５０ＢおよびＣｙＧＤＨ層５０Ｃを含んだものとして、先に説明したバイオセンサＸ１（図１ないし図３参照）の場合と同様にして形成されており、しかも、細胞膜類似構造層５０Ｂが発色層５０Ａに接触した状態とされている。そのため、試薬層５０は、ＣｙＧＤＨが配向性を持った状態、すなわちＣｙＧＤＨにおけるαサブユニットの活性部位が表層に存在する一方で、ＣｙＧＤＨにおけるチトクロムＣが発色層５０Ａに接触し、あるいは発色層５０Ａの近くに存在した状態で細胞膜類似構造層５０Ｂに固定化される。したがって、バイオセンサＸ２においても、先に説明したバイオセンサＸ１（図１ないし図３参照）と同様な効果を享受することができる。

本発明は、上述の実施の形態には限定されず、種々に変更可能である。たとえば、本発明は、使い捨てとして構成されたバイオセンサに限らず、たとえば少なくとも電極部分を人体に埋め込んで連続的に血糖値を測定するために使用するバイオセンサについても適用することができる。

本実施例では、ＰＥＴ基材の表面に、カーボン電極、リン脂質ポリマー層およびＣｙＧＤＨ層を形成する一方で、それらの層を形成する前後における表面性状を、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）（商品名「Ｄ−３１００」；デジタル インスツルメンツ社製）を用いて観察した。

（カーボン電極表面の観察）
カーボン電極は、日本アチソン社製のカーボンインクを用いたスクリーン印刷により形成した。カーボン電極のＡＦＭ像については、図６に示した。図６から分かるように、カーボン電極層の表面は、カーボン粒子（平均粒子径が１００ｎｍ程度）が現れた比較的に大きな凹凸面となっていた。

（リン脂質ポリマー層表面の観察）
リン脂質ポリマー層は、カーボン電極の表面をＶＵＶ処理（親水処理）した後に、カーボン電極の表面にＭＰＣ重合体溶液を塗布して乾燥させることにより形成した。なお、ＶＵＶ処理は、「ＭＥＣＬ−Ｍ３−７５０」（エム・ディ・エキシマ社製）を用いて、大気中において、波長が１７２ｎｍのエキシマレーザ光を、照射距離を１ｍｍとして、カーボン電極層の表面に１８０秒間照射することにより行った。ＭＰＣ重合体溶液としては、シランカップリング剤としてのテトラエトキシシランを導入したＭＰＣ重合体（商品名「リ
ピジュア」；日本油脂社製）を使用した。

リン脂質ポリマー層を形成した後のＡＦＭ像については図７に示した。図７から分かるように、リン脂質ポリマー層の表面には、ポリマーにおけるリン脂質部位が現れているものの、リン脂質部位の直径が２〜３ｎｍとカーボン粒子に比べて小さいため、リン脂質ポリマー層の表面はカーボン電極層に比べて滑面となっていた（図６参照）。

（ＣｙＧＤＨ層表面の観察）
ＣｙＧＤＨ層は、リン脂質ポリマー層が形成されたカーボン電極を、ＣｙＧＤＨ溶液に１０分間含浸することにより形成した。ＣｙＧＤＨ溶液におけるＣｙＧＤＨの濃度は、活性基準において１００Ｕ／μＬとした。ＣｙＧＤＨ層を形成した後のＡＦＭ像については、図８に示した。

図８から分かるように、リン脂質ポリマー層の表面には、規則的に並んで配置された直径６〜３０ｎｍ程度の塊状物（ＣｙＧＤＨ）が確認された。すなわち、リン脂質ポリマーに対しては、少なくともＣｙＧＤＨの一部が表層に現れるようにＣｙＧＤＨが固定化されていた。また、塊状物が規則的に並んで配置されていることから、ＣｙＧＤＨは、配向性を持ってリン脂質ポリマー層に固定化されているものと推測される。

本実施例においては、リン脂質ポリマー層を介してＣｙＧＤＨを固定化した電極（本案電極）およびリン脂質ポリマーを介さずにＣｙＧＤＨを固定化した電極（比較電極）のそれぞれについて、応答性を検討した。

本案電極としては、実施例１と同様に、カーボン電極にリン脂質ポリマー層を形成した後に、ＣｙＧＤＨを固定化したものを使用した。

一方、比較電極は、リン脂質ポリマー層を形成しなかった点を除いては、本案電極と同様にして形成した。

本案電極および比較電極の応答性は、図９に示した電流値測定装置Ｙを構築し、この電流値測定装置Ｙによってグルコース溶液に電圧を印加したときの応答電流値として評価した。

電流値測定装置Ｙは、作用極Ｙ１、参照極Ｙ２および対極Ｙ２を備えたものであり、それらの電極Ｙ１〜Ｙ３がポテンシオスタットＹ４に接続されたものである。この電流値測定装置Ｙでは、電極Ｙ１〜Ｙ３をグルコース溶液に浸漬してグルコース溶液に電圧を印加することが可能であり、また電圧印加時の応答電流値を測定することが可能である。ここで、作用極Ｙ１は、先に説明した方法により形成した本案電極または比較電極であり、参照極Ｙ２は、銀／塩化銀電極（商品名「ＲＥ−１Ｂ」；ＢＡＳ社製）であり、対極Ｙ３は白金電極である。

（リニアスイープボルタンメトリー）
本実施例においては、本案電極および比較電極の応答性を検討する前に、濃度の異なる複数種のグルコース溶液のそれぞれについて、本案電極を作用極Ｙ１として、先に説明した電流値測定装置Ｙを用いてリニアスイープボルタンメトリー測定を行った。

この測定においては、掃引電圧は、１００ｍＶ／ｓｅｃとし、−４００ｍＶ〜＋７００ｍＶの範囲で応答電流値を測定した。グルコース溶液としては、０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、６００ｍｇ／ｄＬの
ものを使用した。その結果、＋１００〜＋７００ｍＶの範囲において、グルコース溶液の濃度の差に応じた応答電流値の差が見受けられた。この結果を踏まえて、以下に行う応答電流値の測定においては、グルコース溶液に対する印加電圧を＋６００ｍＶに設定した。

（応答性）
本案電極および比較電極の応答性は、濃度の異なる複数種のグルコース溶液のそれぞれについて、本案電極または比較電極を作用極Ｙ１として、先に説明した電流値測定装置Ｙを用いて応答電流値のタイムコースを測定することにより行った。応答電流値測定時の印加電圧は、上述の通り＋６００ｍＶとし、グルコース溶液としては、０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、６０００ｍｇ／ｄＬのものを使用した。それぞれのグルコース溶液に対する応答電流値のタイムコースについては、本案電極の結果は図１０（ａ）として、比較電極の結果は図１０（ｂ）としてそれぞれ示した。また、測定開始から１秒後の応答電流値について、グルコース濃度の関係として図１１に示した。

図１０および図１１から分かるように、本案電極ではμオーダーの応答電流値が測定されている一方で、比較電極ではｎオーダーの応答電流値しか測定されていない。すなわち、比較電極では、従来より報告されている金属錯体などの電子伝達物質を使用しない系における応答電流値の測定結果（ｎオーダー）と同様な結果が得られた。その一方で、本案電極では、従来の報告よりも遥かに大きなμオーダー応答電流値が得られ、本案電極の応答性（感度）が高いことが確認された。

また、図１０および図１１からは、本案電極を用いた場合には、グルコース濃度の相違を応答電流値の相違として適切に反映させることができることも分かる。そのため、本案電極を用いた場合には、少なくとも本実施例において応答電流値を測定したグルコース濃度の範囲（０〜６００ｍｇ／ｄＬ）において、適切にグルコース濃度を測定することができる。

このように、リン脂質ポリマーを介してＣｙＧＤＨを固定化した本案電極は、金属錯体などの電子伝達物質を用いなくても、グルコース濃度を測定するのに十分な応答性（感度）を有している。そのため、本案電極では、電子伝達物質を用いずとも適切なグルコース濃度（たとえば血糖値）の測定が可能であるばかりか、電子伝達物質を用いる必要がないために、人体に埋め込んで使用しても人体に対する悪影響はない。その結果、本発明は、人体に埋め込んで血糖値を連続的に測定するために使用するバイオセンサに対して問題なく適用することができる。

また、本案電極において採用されていたＣｙＧＤＨの固定化方法、すなわちリン脂質ポリマー溶液の点着およびＣｙＧＤＨ溶液に対する浸漬は、極めて簡易な作業であり、その手法をμＴＡＳに代表される微細流路を有するバイオセンサに対しても適切に適用できる。その場合、微細流路に形成されるリン脂質ポリマー層およびＣｙＧＤＨ層は極めて薄層であるために、それらの層を形成したとしても微細流路における試料の移動が著しく妨げられることもない。そのため、微細流路における大部分において、リン脂質ポリマー層およびＣｙＧＤＨ層からなる試薬層を形成しても何らの問題も生じない。したがって、微細流路に対して広範囲に亘って試薬層を形成することにより、μＴＡＳの欠点であった感度の低さを改善し、感度の高いμＴＡＳを提供することができるようになる。

本発明の第１の実施の形態に係るバイオセンサを示す全体斜視図である。 図１に示したバイオセンサの分解斜視図である。 図１のIII‐III線に沿う断面図およびその要部拡大図である。 本発明の第２の実施の形態に係るバイオセンサの全体斜視図である。 図４のＶ−Ｖ線に沿う断面図およびその要部拡大図である。 実施例１において、カーボン電極の表面状態を、ＡＦＭによって観察した結果を示すＡＦＭ像である。 実施例１において、カーボン電極の表面にリン脂質ポリマー層を形成した状態を、ＡＦＭによって観察した結果を示すＡＦＭ像である。 実施例１において、リン脂質ポリマー層の表面にＣｙＧＤＨを固定化した状態を、ＡＦＭによって観察した結果を示すＡＦＭ像である。 実施例２において用いた電流値測定装置の概略構成を示す模式図である。 実施例２における応答電流値の測定結果をタイムコースとして示したグラフである。 実施例２における電流値の測定結果を、グルコース濃度との関係として示したグラフである。 従来のバイオセンサの一例の要部を示す断面図である。

符号の説明

Ｘ１，Ｘ２ バイオセンサ
１，５ （バイオセンサの）基板（被固定部材）
１４Ａ，５０Ｂ 細胞膜類似構造層

Claims (5)

1. グルコース脱水素活性を有するαサブユニットおよび電子伝達機能を有するチトクロムＣを含むＣｙＧＤＨが、その配向性を制御しうる細胞膜構造に類似した細胞膜類似構造層を表面側に有する被固定化部材に、上記チトクロムＣが上記被固定化部材に近い側に位置し、上記αサブユニットが上記被固定化部材から遠い側に位置するように固定されたことを特徴とする、タンパク質固定化膜。
2. 上記細胞膜類似構造層は、リン脂質ポリマーを含んでいる、請求項１に記載のタンパク質固定化膜。
3. 上記リン脂質ポリマーは、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体である、請求項２に記載のタンパク質固定化膜。
4. 被固定化部材にグルコース脱水素活性を有するαサブユニットおよび電子伝達機能を有するチトクロムＣを含むＣｙＧＤＨを固定化する方法であって、
   上記被固定化部材における目的部位に、親水処理を施すステップと、
   上記目的部位に、シランカップリング剤を導入させた、上記ＣｙＧＤＨの配向性を制御しうる細胞膜構造に類似した細胞膜類似構造層を形成するステップと、
   上記細胞膜類似構造層に対して、上記ＣｙＧＤＨを、上記チトクロムＣが上記被固定化部材に近い側に位置し、上記αサブユニットが上記被固定化部材から遠い側に位置するように自己組織化させるステップと、
   を含んでいることを特徴とする、タンパク質の固定化方法。
5. グルコース脱水素活性を有するαサブユニットおよび電子伝達機能を有するチトクロムＣを含むＣｙＧＤＨが被固定化部材に対して固定化されたバイオセンサであって、
   上記ＣｙＧＤＨは、上記被固定化部材の表面側に形成した、上記ＣｙＧＤＨの配向性を制御しうる細胞膜構造に類似した細胞膜類似構造層に対して、上記チトクロムＣが上記被固定化部材に近い側に位置し、上記αサブユニットが上記被固定化部材から遠い側に位置するように自己組織化した状態で上記被固定化部材に固定化されていることを特徴とする、バイオセンサ。