JP5022906B2 - カスパーゼ−２／−６二重阻害剤として有用な新規ペプチドおよびそれらの生物学的適用 - Google Patents

Description

本発明は、カスパーゼ−２／−６二重阻害剤として有用な新規ペプチドに関する。本発明はまた、それらの生物学的適用に関する。

全てのカスパーゼ（システイン・アスパルタート・プロテアーゼ）は、アスパラギン酸残基と切断部位への通常４連続アミノ酸Ｎ末端の認識配列との後の切断の絶対条件との高度な特異性を示す。コンビナトリアルの研究方法を用いると、それらは、３つの相異なる特異性の群に分類される：Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐに対して選択的である群I（カスパーゼ−１、−４、−５）、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｐに対して選択的である群II（カスパーゼ−２、−３、−７）および（Ｌｅｕ／Ｖａｌ）−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｐに対して選択的である群III（カスパーゼ−６、−８、−９および−１０）である。この特徴的な特異性はアポトーシスの過程にとって重要である。アポトーシス過程が、無秩序なタンパク質分解よりむしろ順序化された方法において特定群のタンパク質の切断を必要とするからである。細胞に関連したそれらの役割に基づいて、カスパーゼは、実行因子（細胞構造（architecture）、細胞周期調節、シグナル伝達経路等において役割を果たす特定の下流タンパク質基質の直接切断）または開始カスパーゼ（アポトーシス経路の上流制御因子として作用する）と考えられ得る。アポトーシスの調節におけるそれらの極めて重要な役割を前提として、カスパーゼは重要な治療ターゲットである。多くの神経系疾患は、カスパーゼのアポトーシス経路に結び付けられ、若干の少数のカスパーゼ阻害剤は、神経細胞死の作用を阻止することを示した。癌および神経変性疾患の治療にとって望ましいような、カスパーゼの制御された活性化は、達成するのがより困難である。可能性のある戦略は、全てのカスパーゼよりもむしろ所与の病的環境において必須のカスパーゼを特異的に阻害する化合物の設計を必要とし得る。

カスパーゼ−２は、最初の哺乳類のアポトーシスのカスパーゼとして発見された。最近の研究により、カスパーゼ−２は、非神経細胞の外因性および内因性の両方のアポトーシス経路において開始因子として関与することが明らかにされた（Lassusら，２００２年）。加えて、カスパーゼ−２は、初期設定（default）開始因子および初期設定実行因子の両方のカスパーゼとして作用する。最近になって、本発明者らは、カスパーゼ−２が一次皮質ニューロン（インビボ脳虚血に部分的に似た症状を呈するインビトロモデル）において無血清誘導アポトーシスを開始することを証明した（Chauvierら，２００５）。カスパーゼ−２はまた、ハンチントンを分裂させることができる可能性があり、それ故に、ハンチントンの発症に関与している可能性がある。その基質特異性は十分に理解されたわけではなく、２つのペンタペプチドＶＤＶＡＤおよびＬＤＥＳＤをベースとする阻害剤が利用可能であるのみである。

カスパーゼ−６は、神経（発生的）細胞の死にかかわっており、開始因子というよりむしろ実行因子カスパーゼである。カスパーゼ−６が活性化されることが知られている少なくとも４つの病的状態がある：アルツハイマー病のジストロフィーの軸索突起および神経原線維変化；ヒトの胎児および成人の脳虚血（Guoら，２００４）；てんかん誘発症（eliptogenesis）およびてんかんについての役割を示唆するラットのカイニン酸発作モデル；胃腸上皮細胞（gastrointestinal lining epithelial cell）のアノイキスである。カスパーゼ−６の基質特異性は十分には知られていない。テトラペプチドＶＥＩ（またはＨ）Ｄをベースとする阻害剤が利用可能であるが、カスパーゼ−６阻害に利用可能なペンタペプチドをベースとする阻害剤はない。

（I／本発明の分野）
本発明は、分子モデリング、医薬生物学および化学の領域内にあり、プロアポトーシス性のカスパーゼ−２（Ｎｅｄｄ−２；Ｉｃｈ−１）を阻害し、かつ／または、プロアポトーシス性のカスパーゼ−６（Ｍｃｈ２）を阻害し、カスパーゼ−２および／またはカスパーゼ−６の活性が関係する疾患および損傷を治療するために有用である、新規化合物およびこの化合物を含む医薬組成物に関する。

本発明は、下記を含む群において選択されるコア配列を有する新規ペプチドに関する：
配列番号１：ＶＤＥＡＤ
配列番号２：ＬＤＥＧＤ
配列番号３：ＶＤＥＧＤ
配列番号４：ＶＤＥＳＤ
配列番号５：ＬＤＥＫＤ
配列番号６：ＦＤＥＳＤ
配列番号７：ＬＤＥＡＤ
上記ペプチドは、有利には、Ｎ末端および／またはＣ末端の保護基を有する。

本発明の一実施形態によると、ペプチドは、Ａ−（ＣＨ_２）_ｎ１を示すＮ末端保護基Ｍを有し、ここで、
・ｎ１＝０〜２０
・ｎ１＝０である時、ＭはＨであり、
・Ａは、Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル、１以上の縮合環および／またはヘテロ環であり、
・Ａは、Ｈと異なる場合、かつ、ｎ１が２より大きい場合、飽和または不飽和であり、場合によっては、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ_ａ、（ＣＨ_２）_ｎ１ＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎ１ＯＲ_ａ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ_ａ、（ＣＨ_２）_ｎ１ＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎ１ＣＯＯＲ_ａ、Ｃ_１−Ｃ_３アルキルまたはシクロアルキル、（ＣＨ_２）_ｎ１−アルキル、ＣＯ−ＮＨ−アルキル、Ａｒ、（ＣＨ_２）_ｎ１−Ａｒ、ＣＯ−ＮＨ−Ａｒ、ハロゲン、ＣＦ_３、ＳＯ_３Ｈ、（ＣＨ_２）_ｘＰＯ_３Ｈ_２、Ｂ（ＯＨ）_２、ＮＯ_２、ＳＯ_２ＮＨ_２、ＳＯ_２ＮＨＲ_ａ（ｘ＝０、１または２；Ｒ_ａはＣ_１−Ｃ_３アルキルであり、Ａｒは置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール基である）等の１以上の基によって置換されるか、または
・Ａは、１以上のアミノ酸残基であるか、または
・Ａは、発色団、蛍光性、発光性、吸収性（ＵＶから近ＩＲまで）の群、放射性、金属性の粒子、例えば、電子顕微鏡法に用いられるもの、比色分析の群、ビオチン／ストレプトアビジン／ニュートラアビジン・ラベリングシステム、または類似体を示す。

別の実施形態によると、最終的には上記開示の実施形態と組み合わされて用いられて、本発明のペプチドはＸを有するカルボニル基を有し、ＸはＨ、または、ＯＲ_ｂ、ＮＨＲ_ｂ、ＳＲ_ｂ、ＣＨ_２ＯＲ_ｂ、ＣＨ_２ＮＨＲ_ｂ、ＣＨ_２ＳＲ_ｂ、ＣＨ_２ＯＲ_ｂおよびＣＨ_２Ｙからなる群において選択されるカルボキシ保護基であり、ここで、Ｒ_ｂ＝アシル、アルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたはヘテロアリール（場合によっては、１以上の環および／またはヘテロ環または非環基と縮合される）、Ｃ_１−Ｃ_２０置換または無置換脂肪族、アラルキル炭素環、アルキル炭素環、またはヘテロ環基（場合によっては、１以上の芳香族と縮合される）であり、Ｙは、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）またはＮＯ_２であるか、または、Ｘは、発色団、蛍光性、発光性、吸収性（ＵＶから近ＩＲまで）の群、放射性、金属性の粒子、例えば、電子顕微鏡法に用いられるもの、比色分析の群、ビオチン／ストレプトアビジン／ニュートラアビジン・ラベリングシステム、または類似体を示す。

実施例によって例示されるように、上記の開示されたペプチドは、特に、カスパーゼ−２および／または−６の活性に対して阻害剤特性を有する。

本発明は、それ故に、細胞死、特にニューロン、神経細胞または非神経細胞におけるカスパーゼ−２活性を妨げるまたは防止するための阻害剤としてのそれらの使用にも関する。

さらに、本発明のペプチドの無害性は高い。無毒性は、成熟Swissマウスにおける静脈内または腹腔内注射による１００ｍｇ／ｋｇにおいて観察される。

前記特性は、有利には、医薬組成物において用いられる。

本発明は、それ故に、上記に規定されたような少なくとも１種のペプチドすなわちカスパーゼ−２および／または−６阻害剤の治療上有効量を、製薬上許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物にも関する。

前記医薬組成物は、経口、経鼻、局所（皮下、脳室内、化合物または医薬組成物を含浸させられた物質の脳内移植、機械的送達用器具の脳内移植等）、全身（例えば、腹腔内、静脈内）投与による細胞死を低減させるための投与に適切な形態の下にある。

本発明の組成物は、治療されるべき病状および患者の年齢に適した用量で投与される。この用量は、特に、１０^−９ｍｇ〜１００ｇ／ｋｇ、特に０．１〜１０ｍｇ／ｋｇである。

このような用量は、新生児（満期産）、子供、成人の全身性虚血を治療するために有効である。

それらは、経口ルートまたは腹腔内、静脈内または皮下注射によって投与される（１回または複数回）。

前記医薬組成物は、下記の治療のために特に有用である：
・低酸素虚血（Ｈ−Ｉ）（低酸素症／低血糖を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様の状態（脳、腎臓、心不全等）を含む病的状態；
・脳の低酸素虚血（Ｈ−Ｉ）（低酸素症／低血糖を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様の状態（脳、腎臓、心不全等）を含む病的状態；
・ニューロン死、特に全体性または限局性のＨ−Ｉ（低酸素症／低血糖を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様状況（脳、腎臓、心不全等）におけるもの；
・ニューロン死、特に、成人、胎児または周産期のＨ−Ｉ（低酸素症／低血糖を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様の状況（脳、腎臓、心不全等）におけるもの；
・ニューロン死、特に、一過性または永続性のＨ−Ｉ（低酸素症／低血糖を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様の状況（脳、腎臓、心不全等）におけるもの；
・ニューロン死、特に、再灌流の状況を伴うまたは伴わないＨ−Ｉ（低酸素症／低血糖を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様状況（脳、腎臓、心不全等）の脳損傷におけるもの；
・ニューロン死、特に、成人、胎児または周産期Ｈ−Ｉにおける中大脳動脈閉塞症（Middle Cerebral Artery Occlusion：ＭＣＡＯ）におけるもの；
・ニューロン死、特に、下記病的事象の少なくとも１つが結合した場合のもの；全体性または限局性の、一過性または永続性の、成人、胎児または周産期の、脳レベルまたは体全体のレベルにおける、再灌流を伴うまたは伴わない、Ｈ−Ｉ（低酸素／低血糖を伴うまたは伴わない虚血）；
・ニューロン死、特に、下記脳損傷の少なくとも１つの場合のもの；
・ニューロン死、特に、下記周産期脳損傷の少なくとも１つの場合もの。

より詳細には：
（ａ）本発明は、ペンタペプチド−カスパーゼ−２タンパク質複合体の分子ドッキングであって、（ｉ）カスパーゼ−２との接触を提供するのに必要とされるアミノ酸残基を識別することおよび（ｉｉ）これらの配列とカスパーゼ−２との間の相互作用の性質を規定することを可能にするものに関する；
（ｂ）本発明は、新規のペンタペプチド配列／ペンタペプチドをベースとする阻害剤であって、カスパーゼ−２との可逆的または不可逆的複合体（すなわち、より低い最少エネルギーを有する）の形成を誘導し、結果として、カスパーゼ−２活性の実験的な阻害をもたらすものの獲得に関する；
（ｃ）本発明は、最初のペンタペプチド配列／ペンタペプチドをベースとする化合物であって、カスパーゼ−２およびカスパーゼ−６の両方の活性を阻害するが、他のカスパーゼまたはプロテアーゼ（カルパイン、グランザイムＢ）を阻害しないものの獲得に関する；
（ｄ）本発明は、最初のペンタペプチド配列またはペンタペプチドをベースとする化合物であって、カスパーゼ−６の阻害をもたらすものの獲得に関する；
（ｅ）本発明は、最初のペンタペプチド配列またはペンタペプチドをベースとする化合物であって、カスパーゼ−２およびカスパーゼ−６の両方の活性を同様の用量範囲で阻害するものの獲得に関する；
（ｆ）新規カスパーゼ−２阻害剤の合理的な設計は、分子ドッキングとインビトロアッセイにおける機能的な切断とを組み合わせることによって達成され得る；
（ｇ）限定的でない実施形態において、これらの配列は、Ｎ末端においてメチルマロニル誘導体、キノリニル誘導体に結合され得る；限定的でない実施形態において、２，６−ジフルオロフェニルエステル、２，６−ジフルオロフェノキシ、２−ブロモベンゾイロキシ、フッ素等の脱離基が、カルボキシ末端位に付加され得る；限定的でない実施形態において、アミノ酸側鎖は、細胞透過性および保持を向上させるためにメチル基等の保護基を含み得る；従前のデータに基づいて、このようなペンタペプチド配列／関連化合物は、インビトロの虚血性神経細胞死（特に、アポトーシス，Chauvierら，２００５）、および脳（低酸素）虚血損傷（限局性一過性周産期Ｈ−ＩまたはＭＣＡＯ（中大脳動脈閉塞症））を含むインビボの病的状態の阻害のための的確な鋳型である（テラプトシス ＳＡの名の下の仏国特許出願０３ ０６ １９０およびＷＯ２００４／１０３３８９）；
（ｈ）本発明は、新規カスパーゼ−２阻害剤が、心不全または心臓血管損傷の間の血流減少／低酸素症後の脳の全体的成人虚血を含めてインビボの病的状態にある脳細胞死を防止または減少させることを発見したことに関する；
（ｉ）本発明は、血流および酸素圧が乱されている病的状態、すなわち、脳の（一過性または永続性の）限局性または全体性の虚血の間の脳細胞死を低減させるための局所（脳室内、海馬内等）送達または全身性（腹腔内、静脈内等）投与を含む新規カスパーゼ阻害剤の新しい適用に関する；
（ｊ）本発明はまた、細胞死を伴う病状、特に、虚血および卒中様損傷を治療する方法であって、上記の医薬組成物の治療上の有効量を投与する工程を包含する方法に関する；
（ｋ）本発明によるペプチドの有効量を含む医薬組成物は、細胞死を伴う病状、特に、Ｈ−Ｉ損傷および卒中様状況の脳損傷：例えば、全体性または限局性の、一過性または永続性の、成人、胎児、周産期の、脳または心臓レベルで発生する、再灌流を伴うまたは伴わない、Ｈ−Ｉ（低酸素／低血糖を伴うまたは伴わない虚血）またはＭＣＡＯ（中大脳動脈閉塞症）を予防し、減少させかつ治療するのに特に有用である。

本発明の正確な特徴および利点は、下記データにおいて図１〜１７を参照しながら与えられる。

（II．配列およびカスパーゼ−２阻害剤の合理的設計）
（II-1／方法論）
カスパーゼ−２−阻害剤の複合体は、Protein Data Bankの構造１ｐｙｏに対応する（Schweizerら，２００３）。未変化体においておよび１の誘電定数で全モデルが研究された。阻害剤は、手作業的に、Biopolymer module of Accelrys（San Diego，ＣＡ）によって改変された。酵素の原子が固定され、阻害剤が、Discover moduleにより、２０００ステップの共役勾配を用いてＲＭＳが０．０００１ｋｃａｌ／ｍｏｌ・Å未満になるまで最少にされた。非共有エネルギーの値（ファンデルワールス力およびクーロン力）は、Insight IIモジュールにより計算された。

（II-2／結果と考察）
図１は、上記方法論を用いた分子モデリングによって研究された一連の化合物を示す。カスパーゼ−２酵素を阻害するためのこれらの化合物の有効性は、対応する酵素−阻害剤複合体の最少エネルギー（Ｅ_最少（ｋｃａｌ／ｍｏｌ））によって特徴付けられる（図１）。このエネルギーは、２つの構成要素からなる：
（ｉ）水素結合および阻害剤と酵素残基との間の塩橋からもたらされる電気的またはクーロン的要素（Ｅ_クーロン）；
（ｉｉ）阻害剤と酵素との間のファンデルワールス相互作用からもたらされる反発−誘引の要素（Ｅ_{ファンデルワールス}）。

図２は、カスパーゼ−２の活性部位中の基準分子Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ（１）を示す。示されるように、このペンタペプチドの原子は、次のように表される：（ａ）緑色＝炭素、（ｂ）白色＝水素、（ｃ）青色＝窒素、（ｄ）赤色＝酸素。この阻害剤とカスパーゼ−２酵素との間の電気的相互作用（水素結合および塩橋）は、緑色の破線によって表される。この図では、阻害剤（１）と相互作用する酵素の残基は黄色で表され、阻害剤と相互作用しないものは、マゼンタ色で示される。阻害剤の残基は、それらの１文字コードによって表され、この１文字コードの後ろの数は、阻害剤配列中のそれらの位置を示す。１番目の残基上のアミノ基の保護も示される。明快さの理由のために、ファンデルワールス相互作用は図１に示されていない。他の新規に設計されたペンタペプチド阻害剤とカスパーゼ−２酵素との間で形成された複合体を表すために本明細書の全体にわたって同一の論理が用いられた。

図２に示されるように、Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ（１）とカスパーゼ−２の活性部位との間で複合体を安定にする水素結合および塩橋は次の通りである：Ｌ１（ＮＨ）−Ｔ Ｂ２３３（ＯＨ）、Ｌ１（ＣＯ）−Ｔ Ｂ２３３（ＮＨ）、Ｄ２（ＮＨ）−Ｙ Ｂ２７３（ＣＯ）、Ｄ２（Ｏδ_２）−Ｙ Ｂ２７３（ＮＨ）、Ｄ２（Ｏδ_１）−Ｗ Ｂ２３８（インドール）およびＮ Ｂ２３２（ＮＨ_２）、Ｅ３（ＮＨ）−Ｒ Ｂ２３１（ＣＯ）、Ｅ３（Ｏδ_１）−Ｒ Ｂ２３１（グアニジン、塩橋）、Ｅ３（ＣＯ）−Ｒ Ｂ２３１（ＮＨ）、Ｄ５（ＮＨ）−Ａ Ｂ２２９（ＣＯ）、Ｄ５（Ｏδ_１）−Ｑ Ａ１５３（ＮＨ_２）およびＲ Ａ５４（ＮＨ_２）、Ｄ５（Ｏδ_２）−Ｒ Ｂ２３１（グアニジン、塩橋）およびＲ Ａ５４（グアニジン、塩橋）、Ｄ５（ＣＯ）−Ｃ Ａ１５５（ＮＨ）およびＨ Ａ１１２（イミダゾール）およびＧ Ａ１１３（ＮＨ）。残基を設計するために用いられた命名法、残基の側鎖の酸素原子および１番目の残基のアミノ基保護は、図３において示される。

カスパーゼ−２酵素を阻害するために研究された化合物のそれぞれの能力は、用いられたモデルにおいて−７６．６ｋｃａｌ／ｍｏｌの最少エネルギー（Ｅ_最少）を示した基準ペンタペプチドＡｃ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ（１）の能力と比較された。

以下の結論は、それ故に、本発明者らの研究成果から引き出され得る。

（II-2.1／残基の置換）
Ｖ１（Ａｃ−ＶＤＥＳＤ−ｃｈｏ（７）、Ｅ_最少＝−１０１．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）によるＬ１の置換は、阻害剤−カスパーゼ−２複合体のより良好な安定性を可能にする。阻害剤の有効性は、Ｓ４が（i）Ｋ４（Ａｃ−ＬＤＥＫＤ−ｃｈｏ（２７）、Ｅ_最少＝−１０１．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、（ii）Ａ４（Ａｃ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏ、化合物（１４）、Ｅ_最少＝−１３３．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）または（iii）Ｇ４（Ａｃ−ＬＤＥＧＤ−ｃｈｏ、化合物（２６）、Ｅ_最少＝−１３５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）によって置き換えられる場合に一層より大きかった。これらの観察は、それ故に、化合物（７）、（１４）、（２６）および（２７）が、基準化合物（１）（Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ）より良好なカスパーゼ−２の阻害剤であることを示した。図４は、カスパーゼ−２の活性部位中の化合物（１）および（１４）（Ａｃ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏ）の重ね合わせを示す。

化合物（２０）（Ｅ_最少＝−１１３．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｖ１によるＬ１およびＡ４によるＳ４の置換、Ａｃ−ＶＤＥＡＤ−ｃｈｏ）の化合物（７）（Ｅ_最少＝−１０１．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｖ１によるＬ１の置換、Ａｃ−ＶＤＥＳＤ−ｃｈｏ）との比較は、４位において、アラニン（Ａ４）は、セリン（Ｓ４）より良好な酵素−阻害剤複合体の安定化を可能にすることを示す。

化合物（８）（Ｅ_最少＝−８５．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｖ１によるＬ１、Ｖ３によるＥ３およびＡ４によるＳ４の置換、Ａｃ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ）および化合物（２０）（Ｅ_最少＝−１１３．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｖ１によるＬ１およびＡ４によるＳ４の置換、Ａｃ−ＶＤＥＳＤ−ｃｈｏ）により得られた結果は、グルタミン酸（Ｅ３）がバリン（Ｖ３）より良好なカスパーゼ−２の安定化を３位において可能にすることを示す。さらに、化合物（３）（Ｅ_最少＝−９７．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｆ１によるＬ１の置換、Ａｃ−ＦＤＥＳＤ−ｃｈｏ）の化合物（５）（Ｅ_最少＝−１２８．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ）との比較は、１位において、ロイシン（Ｌ１）がフェニルアラニン（Ｆ１）残基より良好な酵素−阻害剤複合体の安定化を可能にすることを示す。

さらに、他のアミノ酸によるＤ２および／またはＤ５の置換は、研究された全化合物において阻害剤−カスパーゼ−２複合体の最少エネルギー（Ｅ_最少）における大きな増加を示し（結果は示さない）、新規に設計されるカスパーゼ−２阻害剤においてこれらの２つの残基が未変化に維持される必要があることを示した。

（II-2.2／１番目の残基のアミノ基保護）
カスパーゼ−２酵素のより強い阻害剤を識別するために、１番目の残基のアミノ基のための異なる保護基の、阻害剤−酵素複合体の安定性に関する効果が研究された。この目的のために、異なる４つのペンタペプチド配列が用いられた：ＬＤＥＳＤ、ＶＤＶＡＤ、ＬＤＥＡＤおよびＶＤＥＡＤ。結果は、以下に示される（用いられた略語は、本明細書の末部に定義される）。

（ａ）ＬＤＥＳＤ系統。カスパーゼ−２酵素と化合物（１）（Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−７６．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、化合物（２）（Ｑｏｐ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−８．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、化合物（４）（Ｓｕｃ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−８５．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、化合物（５）（Ｍａｌ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−１２８．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、化合物（６）（Ｑｍａｌ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−５３．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）または化合物（３１）（Ｏｘａ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）との間で形成された複合体は、以下を示す：
（i）スクシニル（Ｓｕｃ）およびマロニル（Ｍａｌ）基は、アセチル基よりはるかに良好なカスパーゼ−２酵素の阻害を可能にする；
（ii）３−オキソ−３−キノリニルプロピオニル（Ｑｏｐ）、３−（２−キノリニル）マロニル（Ｑｍａｌ）およびオキサリル（Ｏｘａ）は、アセチル基より安定性に乏しい酵素−阻害剤複合体の形成をもたらす。

（ｂ）ＶＤＶＡＤ系統。カスパーゼ−２と、化合物（８）（Ａｃ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−８５．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、化合物（９）（Ｑｏｐ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−１４．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、化合物（１０）（Ｍａｌ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−１３４．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、化合物（１１）（Ｓｕｃ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−９１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、化合物（１２）（Ｑｍａｌ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−５９．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、化合物（１３）（Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝＋３８．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）（図５）、化合物（１７）（Ｂｚ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−４．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、化合物（１８）（Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−３１．８ｋｃａｌ／）、化合物（１９）（Ｈｘａ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−５９．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）または化合物（２４）（ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−３２．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）との間で形成された複合体は、以下を示す：
（i）スクシニル（Ｓｕｃ）およびマロニル（Ｍａｌ）基は、アセチル基より安定な酵素−阻害剤複合体の形成をもたらし、それ故に、より良好なカスパーゼ−２の阻害をもたらす；
（ii）３−オキソ−３−キノリニルプロピオニル（Ｑｏｐ）、２−キノリニルマロニル（Ｑｍａｌ）、２−キノリニルカルボニル（Ｑｃｏ）、ベンゾイル（Ｂｚ）およびヘキサノイル（Ｈｘａ）基は、アセチル基より強力性に乏しい阻害剤をもたらす；保護されていないペンタペプチド（２４）により示されるように、１番目の残基上の保護の欠如も、より安定性に乏しい酵素−阻害剤複合体の形成をもたらす；ドッキングは固定された酵素の原子により実現されることが留意されるべきである；これは、２−キノリニルカルボニル化合物（１３）、（２３）および（３０）の最少エネルギーについて観察された正の値を説明し得る。

この系統の化合物も、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ（１３）がカスパーゼ−２酵素のより強力性に乏しい阻害剤であるようであることを示す。実際に、上記表１に示されるように、化合物（８）が化合物（１３）によって置き換えられた場合、Ｅ_最少の電気的（Ｅ_クーロン）および疎水性（Ｅ_{ファンデルワールス}）要素の両方が増加した。下記表２および３は、阻害剤−カスパーゼ−２複合体の安定化についての種々の残基（Ｖ１、Ｄ２、Ｖ３、Ａ４およびＤ５）の寄与および保護基（アセチルおよび２−キノリニルカルボニル）の寄与を示す。これらの結果は、２−キノリニルカルボニル基によるアセチル基の置換（表２）が下記をもたらすことを示す：
・１位のバリン（Ｖ１）とカスパーゼ−２の活性部位との間のより弱い相互作用；
・カルボニル（Ｃ＝Ｏ）保護基と酵素との間のより弱い相互作用；
・立体的に込み合った２−キノリニルカルボニル基による不安定な酵素−阻害剤複合体。

研究所において合成されたＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ＣＨ_２Ｏ（２，６−ジフルオロフェニル）は、カスパーゼ−２の強力な阻害剤であることが示された（ＩＣ_５０＝８０ｎＭ）。これは、酵素−阻害剤複合体の形成の間にカスパーゼ−２の活性部位への阻害剤のより良好なかみ合いを誘導するような酵素の転形があったかもしれないこと示す。別の説明は、酵素上のアロステリック部位へのこのタイプの化合物のバインディングであり得る（化合物（１３）、（２３）および（３２）、図１も参照）。Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ＣＨ_２Ｏ（２，６−ジフルオロフェニル）の観察された生物学的結果への見識を得るために、固定されていないカスパーゼ−２残基によるさらなる研究が行われることになる。

（ｃ）ＬＤＥＡＤ系統。化合物（１４）（Ａｃ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−１３３．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、化合物（１５）（Ｍａｌ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−１７９．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、化合物（１６）（Ｍｅｍａｌ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−１４５．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、化合物（２８）（Ｍａｃ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−９７．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）および化合物（２９）（Ｐｓ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−７１．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の研究は、マロニル（Ｍａｌ）および３−メチルマロニル（Ｍｅｍａｌ）基によるアセチル基より良好な酵素−阻害剤複合体の安定化のさらなる確認を提供する。この系統はまた、３−メトキシアセチル（Ｍａｃ）およびフェニルスルホニル（Ｐｓ）基が、アセチル基より強力性に乏しい阻害剤をもたらすことを示す。

（ｄ）ＶＤＥＡＤ系統。化合物（２０）（Ａｃ−ＶＤＥＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−１１３．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）および化合物（２１）（Ｍｅｍａｌ−ＶＤＥＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−１２６．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ）により得られた結果は、３−メチルマロニル（Ｍｅｍａｌ）がアセチル基より強力な阻害剤をもたらすことをさらに証明する。

（II-2.3／Ｄ５残基の配置）
カスパーゼ−２の阻害のＤ５残基の配置に関する影響を研究するために、化合物（３０）（ｄ５、Ｅ_最少＝＋６５．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）も研究された。そのように観察された最少エネルギー（Ｅ_最少）の、化合物（１３）（Ｅ_最少＝＋３８．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）および化合物（３０）（ｄ５、Ｅ_最少＝＋６５．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の最少エネルギー（Ｅ_最少）との比較は、５位のＤ配置が阻害剤の減少した強力性をもたらすことを明らかに示す。これは、酵素と化合物（２０）（Ａｃ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−１３３．７ｋｃａｌ／ｍｉｎ）および化合物（２５）（Ａｃ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−１０７．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）との間で形成された複合体のエネルギーを比較することによって確認された。実際に、図６に示されるように、化合物（２５）と酵素との間で形成された複合体は、Ｄ５カルボニルとカスパーゼ−２のシステインＡ１５５残基のチオール基との間のＣ−Ｓ共有結合性が奪われるだろう。さらに、このアスパラギン酸残基の側鎖と酵素との間の水素結合が失われるだろう。

（II-2.4／途切れたペプチド）
化合物（２２）（Ｚ−ＶＡＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝−７．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）および化合物（２３）（Ｚ−ＶＤ−ｃｈｏ、Ｅ_最少＝＋６６．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）により得られた結果は、これらの途切れたペプチドがより強力性に乏しいカスパーゼ−２阻害剤であることを示す。

（II-3／結論）
（II-3.1／ペプチド配列）
新規カスパーゼ−２阻害剤についてのこの探索は、以下を示す。

（ａ）ＶＤＶＡＤ配列は、ＬＤＥＳＤ配列よりわずかに大きい強力性のカスパーゼ−２阻害剤をもたらす（化合物（１）と（８）、（２）と（９）、（４）と（１１）、（５）と（１０）および（６）と（１２）を比較して）
（ｂ）ＬＤＥＡＤ、ＬＤＥＧＤおよびＬＤＥＫＤ配列は、ＶＤＶＡＤ配列より大きい強力性のカスパーゼ−２阻害剤をもたらす（化合物（８）〜（１４）、（１０）〜（１５）、（８）〜（２６）および（８）〜（２７）を比較して）
（ｃ）ＶＤＥＳＤ（化合物（７）を参照）およびＶＤＥＡＤ（化合物（２０）を参照）の配列は、ＶＤＶＡＤ配列より良好なカスパーゼ−２酵素阻害剤を提供する。

（II-3.2／ルーチングおよび放射性ラベリング）
この研究は、カスパーゼ−２の活性部位が、ペンタペプチド阻害剤の４位の種々の残基に適合し得ることを明らかに示す。例えば化合物（２７）では、これは、図７に示されるように、酵素の活性部位の外側のリジン残基（Ｋ４）側鎖の位置調整によって達成される。

この場合（化合物（２７）、４位においてセリンをリジンにより置換）に形成される高度に安定な複合体は、蛍光発色団（例えば、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Alexa Fluor）またはビオチンがこの位置に導入され得、これにより、生物学的系においてこれらのペンタペプチド阻害剤のルーチングが可能であることを示す。

４位において複数の残基に適合するカスパーゼ−２酵素のこの能力はまた、放射性ラベリングの目的のためにこの位置にハロゲン化されたフェニルアラニンまたはチロシン残基を導入し得ることを示す。

（II-3.3／５位のアスパラギン酸の配置）
化合物（１）のアルデヒドまたはメチルケトン類似体（図１）の合成のための有用な手順は、しばしば、Ｄ５残基のエピマー化を引き起こす。形成された異性体の混合物は、しばしば、単離することが困難である。セクションII-2.3に示されるように、そのようにして形成されたＤ−エピマーは、この残基と酵素との間の水素結合および共有結合の両方の相互作用の喪失に起因してＬ−異性体よりも強力性に乏しい。

（II-3.4／１位アミノ基の保護）
アセチル基の他の保護基による置換は、以下の結論および見解をもたらした：
（ａ）２−キノリニルカルボニル（Ｑｃｏ）基は、不安定な酵素−阻害剤複合体をもたらすようである（化合物（１３）、（２３）および（３０）を参照）；この観察は、厳密には、Ｑｃｏ−ＶＤ（Ｏｍｅ）ＶＡＤ（Ｏｍｅ）−ＣＨ_２Ｏ（２，６−ジフルオロフェニル）により得られた生物学的データと合致しておらず、これは、誘導された適合メカニズムが、阻害剤−カスパーゼ−２複合体の形成の間に作動しているかもしれないことを示している。アロステリックバインディングも、インシリコおよびインビトロの結果間のこの観察された相違を説明し得る；
（ｂ）研究された保護基の中で、マロニル（Ｍａｌ）が、他の基よりはるかに良好なカスパーゼ−２阻害もたらすようである（化合物（１５）、Ｅ_最少＝−１７９．２ｋｃａｌ／ｍｏｌを参照）。さらに、３−メチルマロニル基（Ｍｅｍａｌ、化合物（１６）、Ｅ_最少＝−１４５．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）も、高度に安定化された酵素−ペンタペプチド複合体をもたらすようである。（１６）のような化合物がエステラーゼによって対応する誘導体（１５）に加水分解され、その後に、カスパーゼ−２の活性部位にバインディングし得るならば、一層より強力な阻害が観察されるだろう。それ故に、新規なカスパーゼ−２阻害剤を設計するために多くの注意はこのＭｅｍａｌ基上に集中される。

（II-3.5／脱離基の選択）
これらの阻害剤の強力性に関する脱離基の影響を研究するために、Ｄ５残基上に種々の脱離基を有するペンタペプチドが合成され、種々の生物学的系において評価された。これらの脱離基は、それらの物理化学特性およびそれらの報告された生物学的特性（例えば、毒性、細胞透過性、保持）に従って選択された。

それ故に、これらの選択された阻害剤は、一般式（３２）：

を有する。

式中、
（i）ＧＰは、Ｍに対して上記に定義された通りであり、特に、保護基、例えば、マロニル、メチルマロニル、２−キノリニルカルボニル、スクシニル、メチルスクシニル、アセチル、２−キノリニルマロニル、または、ヘテロ環、例えば、置換または無置換テトラヒドロキノリン、テトラヒドロイソキノリン、ジヒドロアクリジン、ベンズアゼピン、ピロリジン、モルホリン、チオモルトリン、ピペラジン、ピペリジン、ジヒドロピリジン、ベンズイミダゾール、イミダゾール、イミダゾリン、ピロール、ピロリジン、ピロリン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、チアゾール、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、カルバゾール、フェノチアジン、フェノキサジン、ジヒドロフェナジン、ジヒドロシンノリン、ジヒドロキノキサリン、ジヒドロナフチリジン、テトラヒドロナフチリジン、ジヒドロアクリジン、インドール、イソインドール、ジヒドロインドール、インドリン、インダゾール、プリン、９，１０−ジヒドロフェナントリジン、５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン、１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン、β−カルボリン、ピリド［４，３−ｂ］インドール、２，３，９−トリアゾフルオレン、９−チア−２，１０−ジアザアントラセン、チエノ［３，２ｂ］ピロール、ジヒドロフェナントリン、ベンジロキシカルボニル等、水素原子、Ｃ_１−２０脂肪族基、アリール、置換アリール（例：４−ニトロフェニル、クマリン誘導体）、ヘテロアリール（例：２−ピリジン）、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、ナフチル、置換ナフチル、（ＣＨ_２）_ｎシクロアルキル、（ＣＨ_２）_ｎフェニル、（ＣＨ_２）_ｎ置換フェニル（例：２，６−ジハロフェニル）、（ＣＨ_２）_ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ_２）_ｎヘテロアリールまたは（無）置換（２−、３−、４−、５−、６−、７−または８−）キノリニル、フルオレンメチルであり、
ＧＰはまた、Ｒ、Ｕ、ＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（Ｕ）、ＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＳ（Ｕ）であってよく、ここで、
Ｕは、（無）置換（２−、３−、４−、５−、６−、７−または８−）キノリニル、Ｃ_１−２０直鎖または分枝鎖アルキル、（ＣＨ_２）_ｎシクロアルキル、（ＣＨ_２）_ｎフェニル、（ＣＨ_２）_ｎ置換フェニル、（ＣＨ_２）_ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ_２）_ｎヘテロアリール、ビオチン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ヨードアセトアミド、ＤＴＮＢ、ＣＯＲ（例：２−キノリニルカルボニル）、ＣＯＯＲ、ＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（Ｚ）、アクリジン誘導体（赤色、黄色、オレンジ色等）、フルオレセイン誘導体（フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、５−（および−６）−カルボキシナフトフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、ＢＣＥＣＦ、ナフトフルオレセイン等）、オレゴングリーン（登録商標）（２’，７’−ジフルオロフルオレセイン）染料（オレゴングリーン（登録商標）４８８、オレゴングリーン（登録商標）５１４等）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）染料（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６６５等）、Bimane、クマリン誘導体（アミノメチルクマリン（ＡＭＣ）、ＡＭＣＡ、アミノクマリン、ジエチルアミノクマリン、ヒドロキシメチルクマリン、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、ＡＦＣ等）、シアニン誘導体（フィコシアニン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＣＹ３．１８、ＣＹ５．１８、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等）、エリトリン／フィコエリトリン誘導体（Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、Ｂ−フィコエリトリン等）、ＡＰＣ／ＰＥ−Ｃｙ接合体（ＰＥ−Ｃｙ５接合体、ＰＥ−Ｃｙ７接合体、ＡＰＣ−Ｃｙ７接合体等）、カルセイン誘導体（カルセイン、ＳＮＡＦＬカルセイン等）、ＤＡＮＳ、ＤＡＮＳＡ、カスケードブルー、ルシファーイエロー、ＮＢＤ、Ｒｅｄ ６１３、ＦｌｕｏｒＸ、ローダミン誘導体（ローダミン１２３、ローダミン１１０、ローダミンＢ、ローダミン６Ａ、ローダミン６Ｇ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−ローダミン、スルホローダミン、ローダミン Ｒｅｄ−Ｘ、リッサミン（登録商標）ローダミンＢ、ＤＨＲ、ローダミングリーン等）、ＰｅｒＣＰ、テキサスレッド、ＴｒｕＲｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏ（登録商標）（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０等）、Ｑ−ＤＯＴｓ（登録商標）誘導体（６５５、６０５、５８５、５２５等）、ＳＮＡＲＦ、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）誘導体（Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）アロフィコシアニン、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）ビオチン−ＸＸ、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ｒ−フィコエリトリン等）；ＮＢＤ、テキサスレッド（登録商標）、ＱＳＹ（登録商標）染料（ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＱＳＹ（登録商標）２１）、ヘキスト（３３３４２、３３２５８）、ＤＡＰＩ、クロモマイシンＡ３、ミトラマイシン、ＳＹＴＯＸ（ブルー、グリーン、オレンジ）、エチジウム、臭化エチジウム、７−ＡＡＤ、ＴＯＴＯ染料、ＹＯＹＯ染料、ＴＯ−ＰＲＯ染料、ＢＯＢＯ染料、ＪＯ−ＰＲＯ染料、ＬＯ−ＰＲＯ染料、ＰＯ−ＰＲＯ染料、ＹＯ−ＰＲＯ染料、チアゾールオレンジ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＬＤＳ７５１、Ｉｎｄｏ（登録商標）染料（Ｉｎｄｏ−１等）、Ｆｌｕｏ（登録商標）染料（Ｆｌｕｏ−３等）、ＤＣＦＨ、ｐＮＡ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ＳｙＰｒｏ（オレンジ、ルビー）、ＥＤＡＮＳ、ＩＲ８００、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤｉＤ、ＳＮＡＲＦ（登録商標）誘導体、Ｆｕｒａ染料、ＱＵＩＮ染料、ＮＡＮＯＧＯＬＤ粒子、ＮＡＮＯＧＯＬＤマレイミド、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ＦｌｕｏｒｏＮＡＮＯＧＯＬＤ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ＦｌｕｏｒｏＮＡＮＯＧＯＬＤストレプトアビジン、マラカイトグリーン、Ｄａｂｃｙｌ、Ｄａｂｓｙｌ、カスケードイエロー、ダンシル、Ｄａｐｏｘｙｌ、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ベンゾオキサジアゾール誘導体、ストレプトアビジン−／ニュートラアビジン−ビオチン標識蛍光ミクロスフェア、ストレプトアビジンのＣＭＮＢ−ｃａｇｅｄ蛍光接合体、ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ ｗｈｉｔｅ、ナイルレッド、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、ＥＢＦＰ、ＧＦＰ野生型、ＱＦＰ突然変異Ｈ９／Ｐ４／Ｐ９／Ｐ１１／Ｗ、ＧＦＰｕｖ、ＥＣＦＰ、Ｙ６６Ｗ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｔ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ、ＤｓＲｅｄ１、ＤｓＲｅｄ２、ＮＡＮＯＧＯＬＤ（登録商標）粒子、ストレプトアビジン−Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｍｏｎｏｍａｌｅｉｄｏ Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｍｏｎｏ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｍｏｎｏａｍｉｎｏ Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、陽／陰荷電Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）（ＮＮ、ＮＨＳＮ、ＮＨＳＮＡ、ＮＨＳＮＳ）、Ｎｏｎ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｍｏｎｏｍａｌｅｉｄｏ Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｍｏｎｏ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｍｏｎｏａｍｉｎｏ Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）接合体、Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）−ストレプトアビジン、脂質−Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）（Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、ＤＰＰＥ Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ Ｕｎｄｅｃａｇｏｌｄ、ＤＰＰＥ Ｕｎｄｅｃａｇｏｌｄ）、Ｎｉ−ＮＴＡ−Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ ＦｌｕｏｒｏＮａｎｏｇｏｌｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ ＦｌｕｏｒｏＮａｎｏｇｏｌｄ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ＦｌｕｏｒｏＮａｎｏｇｏｌｄ、ＨＲＰ基質−Ｎａｎｏｇｏｌｄ、比色分析群（ｐＮＡ等）または生物発光基質、放射性同位体（例：Ｉ^１２５、Ｈ^３、Ｓ^３５、Ｃ^１４、Ｐ^３３、Ｐ^３２、Ｃｒ^５１、Ｃａ^４５、Ｆｅ^５９、Ｎｉ^６３、Ｂａ^１３３、Ｃｓ^１３７、Ｅｕ^１５２、Ｒａ^２２６、Ｘｅ^１３３、テクネチウム９９、タリウム２０１）である。制限的ではない態様において、発光する蛍光性部分は、電子を受容体（ＦＲＥＴ）に移すか、または、切断後にクエンチされるか、または、ＦＬＩＰ、ＦＬＩＭ、ＦＲＡＰ技術の影響を受けやすい；
（ii）Ｘ＝ハロゲン原子、ＯＲ、ＮＨＲ、ＳＲ、ＣＨ_２ＯＲ、ＣＨ_２ＮＨＲ、ＣＨ_２ＳＲ、ＣＨ_２ＯＲおよびＣＨ_２Ｙであり、
ここで、Ｒ＝アシル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、その中に、脂肪族基、アリール基、アラルキル基、カルボ環基、アルキルカルボ環基、または、ヘテロ環基があり、Ｙはハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）またはＮ_２であり；
Ｘはまた、Ｃ_１−２０脂肪族、置換または無置換アリール、シクロアルキル、ナフチル、置換ナフチル、２−ベンゾキサゾリル、置換２−オキサゾリル、（ＣＨ_２）_ｎシクロアルキル、（ＣＨ_２）_ｎフェニル、（ＣＨ_２）_ｎ置換フェニル、（ＣＨ_２）_ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ_２）_ｎヘテロアリール、ＣＨ_２Ｎ_２、ＣＨ_２Ｙ、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、ＣＯＲ、ＣＯ_２Ｒ、ＣＯＮＲ_２、ＣＨ_２ＯＣＯＲ、ＣＨ_２Ｏ−ＣＯアリール、ＣＨ_２Ｏ−Ｃ（Ｏ）置換アリール（例：２，６−ジメチルベンゾイルメチル）、ＣＨ_２Ｏ−Ｃ（Ｏ）置換アリール、ＣＨ_２Ｏ−Ｃ（Ｏ）ヘテロアリール、ＣＨ_２Ｏ−Ｃ（Ｏ）置換ヘテロアリールまたはＣＨ_２ＯＰＯＲ_２であってよく；
ここでＲ＝水素原子、Ｃ_１−２０脂肪族基、アリール、置換アリール（例：４−ニトロフェニルまたはクマリン誘導体）、ヘテロアリール（例：２−ピリジン）、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、ナフチル、置換ナフチル、（ＣＨ_２）_ｎシクロアルキル、（ＣＨ_２）_ｎフェニル、（ＣＨ_２）_ｎ置換フェニル（例：２，６−ジハロフェニル）、（ＣＨ_２）_ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ_２）_ｎヘテロアリール、または（無）置換（２−、３−、４−、５−、６−、７−または８−）キノリニル、フルオレンメチルであり、
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ等のハロゲン、アリールまたはアルキルスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシを含む電気陰性脱離基、ＯＲ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ_２であり、ここで、Ｒは、脂肪族基、アリール基、アラルキル基、カルボ環基、アルキルカルボ環基またはヘテロ環基であり、
Ｘ＝Ｕとして、（無）置換（２−、３−、４−、５−、６−、７−または８−）キノリニル、Ｃ_１−２０直鎖または分枝アルキル、（ＣＨ_２）_ｎシクロアルキル、（ＣＨ_２）_ｎフェニル、（ＣＨ_２）_ｎ置換フェニル、（ＣＨ_２）_ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ_２）_ｎヘテロアリール、ビオチン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ＤＴＮＢ、アクリジン誘導体（赤色、黄色、オレンジ色等）、フルオレセイン誘導体（フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、５−（および−６）−カルボキシナフトフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、ＢＣＥＣＦ、ナフトフルオレセイン等）、オレゴングリーン（登録商標）（２’，７’−ジフルオロフルオレセイン）染料（オレゴングリーン（登録商標）４８８、オレゴングリーン（登録商標）５１４等）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）染料（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６６５等）、Bimane、クマリン誘導体（アミノメチルクマリン（ＡＭＣ）、ＡＭＣＡ、アミノクマリン、ジエチルアミノクマリン、ヒドロキシメチルクマリン、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、ＡＦＣ等）、シアニン誘導体（フィコシアニン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＣＹ３．１８、ＣＹ５．１８、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等）、エリトリン／フィコエリトリン誘導体（Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、Ｂ−フィコエリトリン等）、ＡＰＣ／ＰＥ−Ｃｙ接合体（ＰＥ−Ｃｙ５接合体、ＰＥ−Ｃｙ７接合体、ＡＰＣ−Ｃｙ７接合体等）、カルセイン誘導体（カルセイン、ＳＮＡＦＬカルセイン等）、ＤＡＮＳ、ＤＡＮＳＡ、カスケードブルー、ルシファーイエロー、ＮＢＤ、Ｒｅｄ ６１３、ＦｌｕｏｒＸ、ローダミン誘導体（ローダミン１２３、ローダミン１１０、ローダミンＢ、ローダミン６Ａ、ローダミン６Ｇ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−ローダミン、スルホローダミン、ローダミン Ｒｅｄ−Ｘ、リッサミン（登録商標）ローダミンＢ、ＤＨＲ、ローダミングリーン等）、ＰｅｒＣＰ、テキサスレッド、ＴｒｕＲｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏ（登録商標）（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０等）、Ｑ−ＤＯＴｓ（登録商標）誘導体（６５５、６０５、５８５、５２５等）、ＳＮＡＲＦ、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）誘導体（Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）アロフィコシアニン、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）ビオチン−ＸＸ、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ｒ−フィコエリトリン等）；ＮＢＤ、テキサスレッド（登録商標）、ＱＳＹ（登録商標）染料（ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＱＳＹ（登録商標）２１）、ヘキスト（３３３４２、３３２５８）、ＤＡＰＩ、クロモマイシンＡ３、ミトラマイシン、ＳＹＴＯＸ（ブルー、グリーン、オレンジ）、エチジウム、臭化エチジウム、７−ＡＡＤ、ＴＯＴＯ染料、ＹＯＹＯ染料、ＴＯ−ＰＲＯ染料、ＢＯＢＯ染料、ＪＯ−ＰＲＯ染料、ＬＯ−ＰＲＯ染料、ＰＯ−ＰＲＯ染料、ＹＯ−ＰＲＯ染料、チアゾールオレンジ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＬＤＳ７５１、Ｉｎｄｏ（登録商標）染料（Ｉｎｄｏ−１等）、Ｆｌｕｏ（登録商標）染料（Ｆｌｕｏ−３等）、ＤＣＦＨ、ｐＮＡ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ＳｙＰｒｏ（オレンジ、ルビー）、ＥＤＡＮＳ、ＩＲ８００、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤｉＤ、ＳＮＡＲＦ（登録商標）誘導体、Ｆｕｒａ染料、ＱＵＩＮ染料、ＮＡＮＯＧＯＬＤ粒子、ＮＡＮＯＧＯＬＤマレイミド、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ＦｌｕｏｒｏＮＡＮＯＧＯＬＤ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ＦｌｕｏｒｏＮＡＮＯＧＯＬＤストレプトアビジン、マラカイトグリーン、Ｄａｂｃｙｌ、Ｄａｂｓｙｌ、カスケードイエロー、ダンシル、Ｄａｐｏｘｙｌ、ＰｙＭＰＯ、Ｐｙｒｅｎｅ、ベンゾオキサジアゾール誘導体比色分析群（ｐＮＡ等）または生物発光基質、放射性同位体（例：Ｉ^１２５、Ｈ^３、Ｓ^３５、Ｃ^１４、Ｐ^３３、Ｐ^３２、Ｃｒ^５１、Ｃａ^４５、Ｆｅ^５９、Ｎｉ^６３、Ｂａ^１３３、Ｃｓ^１３７、Ｅｕ^１５２、Ｒａ^２２６、Ｘｅ^１３３、テクネチウム９９、タリウム２０１）である。制限的ではない態様において、発光する蛍光性部分は、電子を受容体（ＦＲＥＰ）に移すか、または、切断後にクエンチされるか、または、ＦＬＩＰ、ＦＬＩＭ、ＦＲＡＰ技術の影響を受けやすい；
（iii）Ｒ^１、Ｒ^３およびＲ^４＝天然または非天然アミノ酸側鎖であり、各アミノ酸の絶対配置はＬまたはＤのいずれかであり；
（iv）Ｒ^２およびＲ^５＝水素原子、アルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり、
（v）ｎは０〜２０である。

本明細書において用いられる場合、特に明記しない限り下記定義が適用される。略語Ｑｃｏはキノリニルカルボニルを表す。本明細書における用語「脂肪族」は、直鎖または分枝鎖のＣ_１−２０炭化水素を意味し、それは、完全に飽和しているか、または、１以上の不飽和構成単位を含む。単独でまたはより大きな部分の一部として用いられる用語「アルキル」は、１〜２０個の炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖の両方を指す。用語「アリール」は、５〜１４個の原子を有する単環または多環の芳香族環基、例えば、フェニル、ナフチル、アントリル等を指す。用語「ヘテロ環基」は、１以上のヘテロ原子を含有し、リングサイズが３〜９である飽和または不飽和の多環または単環系、例えば、フラニル、チエニル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ジオキソラニル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサロリル（isoxalolyl）、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、ジオキサニル、モルホリニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、トリアジニル、トリチアニル、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、インドリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンズアミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、１，８−ナフチリジニル、プテリジニル、キヌクリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル等を指す。「ヘテロアリール」は、芳香族であるヘテロ環を指す。用語「カルボ環基」は、アリールまたはヘテロ環基に縮合されてもよい３〜１４個の炭素原子の不飽和単環または多環の炭素環系を指す。単独でまたはより大きい部分の一部として用いられる脂肪族、アルキル、アリール、ヘテロアリール（例：キノリン）、ヘテロシクリルまたはカルボシクリルは、置換または無置換の基を指す。置換されている場合、これらの基は、１以上の置換基を含んでよい。これらの置換基は、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ＯＨ、Ｕ、ＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（Ｕ）、ＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＳ（Ｕ）、ＯＲ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、ＯＣＯＲ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ_２であり得る。ここで、Ｒは脂肪族基、アリールまたは置換アリール基、アラルキル基、カルボ環基、アルキルカルボ環基、ヘテロ環基または放射性同位体（例：Ｉ^１２５、Ｈ^３、Ｓ^３５、Ｃ^１４、Ｐ^３３、Ｐ^３２、Ｃｒ^５１、Ｃａ^４５、Ｆｅ^５９、Ｎｉ^６３、Ｂａ^１３３、Ｃｓ^１３７、Ｅｕ^１５２、Ｒａ^２２６、Ｘｅ^１３３、テクネチウム９９、タリウム２０１）である。ＦＩＴＣは、フルオレセインイソチオシアナートを表す。

この研究は、ペプチド・アルデヒドにより実現されたが、輸送の間にアルデヒドが分解する傾向があることが分かったので、メチルケトン誘導体またはフェノキシ誘導体のような治療面で信頼性が高い化合物が強調されるだろう。さらに、これらの誘導体は、
・対応するアルデヒドより代謝的に安定であり；
・不可逆的カスパーゼ阻害をもたらす
ようである
（III／配列およびカスパーゼ−２阻害剤の機能検証）
（III-1／方法論）
新規に設計された阻害剤（Ａｃ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏ、Ａｃ−ＶＤＥＡＤ−ｃｈｏ等）が、下記手順によるインビトロのカスパーゼ−２切断アッセイにおいてＡｃ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏと比較された（図８）。ヒト組換えカスパーゼ（２５〜５０Ｕ；QuantiZyme（登録商標）Assay System，BIOMOL，Plymouth，Pennsylvania，米国）が、３０分間にわたって阻害剤（０．００５〜２μＭ）と共に、最終１００μＬの最終アッセイバッファ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ グリセロール）において予備的インキュベートされ、次いで、２００ μｍの蛍光発光カスパーゼ基質（BIOMOL）Ａｃ−ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣと混合された。カスパーゼ活性の５０％を阻害することができる濃度に相当するＩＣ_５０値は、用量−応答シグモイド曲線から決定された。ＡＭＣをベースとする基質のヒト組換えカスパーゼ１−１０による切断は、３７℃で２時間後に蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍで励起した時の５１０ｎｍの発光をモニタリングすることにより測定された。

（III-2／結果と考察）
分子ドッキングおよびインビトロのカスパーゼアッセイによって測定されるように、ＬＤＥＡＤおよびＶＤＥＡＤをベースとする化合物は、推定上有効なカスパーゼ−２阻害剤であり、通常のＶＤＶＡＤまたはＬＤＥＳＤをベースとする阻害剤によって提供されるよりもカスパーゼ−２に対してより高いＥ_最少およびより低いＩＣ_５０値を有する（図８；表１および４）。他の新規に設計されたペンタペプチドをベースとするカスパーゼ−２阻害剤は、ＬＤＥＡＤおよびＶＤＥＡＤをベースとする化合物より高いＩＣ_５０値を有するが、（それらのＩＣ_５０値に従って）中程度（ＶＤＥＳＤ、ＶＤＥＧＤ、ＬＤＥＫＤ）または弱い（ＬＤＥＧＤ、ＦＤＥＳＤ）カスパーゼ−２阻害剤と考えられ得る（図８および表４）。それにもかかわらず、これらのペンタペプチドをベースとする化合物のカスパーゼ−２を阻害するための固有の阻害有効性はまた、それらのそれぞれの阻害曲線にしたがって規定され得（表４および図９）；第２群はＶＤＶＡＤをベースとする阻害剤を示し、特徴的なシグモイド用量応答を有し；第１群は、より低い用量でカスパーゼ−２に対してＶＤＶＡＤをベースとする阻害剤より相対的に活性で、類似のＩＣ_５０値を有する阻害剤（ＬＤＥＡＤおよびＶＤＥＡＤ）を指す；第３群は、より低い用量でカスパーゼ−２に対してＶＤＶＡＤをベースとする阻害剤より活性が低く、より高いＩＣ_５０値を呈するペンタペプチドをベースとする阻害剤を指す（ＬＤＥＧＤ、ＦＤＥＳＤ、ＬＤＥＳＤ、ＬＤＥＫＤ、ＶＤＥＳＤ、ＶＤＥＧＤ）。それ故に、これらの実験データは、図９に示すようにカスパーゼ−２阻害剤の合理的な設計についての同意を提供する（Ｐ５Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１の共通のペプチド性カスパーゼ阻害剤の命名に従う）：（i）Ｄ１およびＤ４の必要条件；（ii）Ｖ３またはＤ３の必要条件；Ｓ２またはＧ２は、Ｐ２残基として許容されたが、Ｖ１はＬ１より好ましい。このような場合、ＬＤＥＡＤおよびＶＤＥＡＤをベースとする化合物は、ＶＤＶＡＤをベースとする阻害剤と比較してより低い用量で低ＩＣ_５０値および阻害有効性の両方を有するため、より興味のあるペンタペプチドをベースとするカスパーゼ−２阻害剤として現れた。このような配列は、他の空想的（chimeric）分子に、細胞上およびインビボ目的のためにＮおよびＣ末端において下記に記載されるような改変を提供するための非常に興味深いテンプレートである。

（IV／カスパーゼ−６を対象とする配列および阻害剤の機能検証）
（IV-1／方法論）
新規に設計された阻害剤（Ａｃ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏ、Ａｃ−ＶＤＥＡＤ−ｃｈｏ等）は、カスパーゼ（１〜１０）の大パネルに対して、インビトロの切断アッセイの間に、下記手順に従って試験された。ヒト組換えカスパーゼ（２５〜５０Ｕ；Biomol）が、３０分間にわたって阻害剤（０．００５〜２μＭ）とともに、最終１００μＬの最終アッセイバッファ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ グリセロール）において予備インキュベートされ、次いで、２００μＭのそれらの特定の蛍光発光カスパーゼ基質（BIOMOL）（Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−１）、Ａｃ−ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−２）、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−３／−７）、Ａｃ−ＶＥＩＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−６）、Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−８／−１０）、Ａｃ−ＬＥＨＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−９）と混合された。ヒト組換えカスパーゼ１〜１０によるＡＭＣをベースとする基質の切断は、２時間後に３７℃で、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍで励起した時の５１０ｎｍの発光をモニタリングすることにより測定された。

（IV-2／結果と考察）
ペンタペプチド配列のカスパーゼ−２との分子ドッキングが他のカスパーゼの認識および阻害のために予言的でないので、大部分の強力なペンタペプチドをベースとするカスパーゼ−２阻害剤（Ａｃ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏおよびＡｃ−ＶＤＶＥＡＤ−ｃｈｏ）の阻害プロファイルが、ヒト組換えカスパーゼのパネルを用いて決定された（図１４〜１６）。

通常のＡｃ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏカスパーゼ−２阻害剤の用量増加は、他のカスパーゼ（高用量で阻害の２０％未満の受容可能な閾値の中）に対して高い交差反応を示さなかった（図１１）。

驚くべきことに、新規なＬＤＥＡＤおよびＶＤＶＡＤをベースとする阻害剤は、カスパーゼ−６に対してある程度の交差阻害を示す（図１５および１６）。これらの化合物が、カスパーゼ−２活性の５０％を阻害するのに１００ｎＭ範囲を示す（表４、図８）一方で、それらはまた、カスパーゼ−６を阻害することができ、ＬＤＥＡＤおよびＶＤＥＡＤをベースとする化合物それぞれについて２μＭ前後および０．１〜０．５μＭでより高いＩＣ_５０（図１５および１６）を有していた。ＶＤＥＡＤは、ＬＤＥＡＤより強力なカスパーゼ−６阻害剤である（図１５および１６）。それは、ペンタペプチドをベースとするカスパーゼ−６阻害剤の最初の記載である。

さらに、それは、ペンタペプチドをベースとするカスパーゼ−２およびカスパーゼ−６の二重阻害剤の最初の記載である。これらの阻害剤は、２種のカスパーゼ、すなわちカスパーゼ−２およびカスパーゼ−６に対して異なる感受性を示す。ＶＤＥＡＤ誘導化合物は、ほぼ同様のレベルでほぼ同様の用量範囲で両方のカスパーゼを阻害することができた（図１３）。対照的に、ＬＤＥＡＤ誘導阻害剤は、カスパーゼ−６に対して活性が低かった用量でカスパーゼ−２を阻害することができた（図１２）。

（V／他のプロテアーゼに対する非交差反応性）
（V-1／方法論）
追加的に、新規に設計された阻害剤の特異性が、カルパインおよびグランザイムＢに対してチェックされた。ヒト組換えカルパインI（０．８Ｕ）およびラット組換えカルパインII（２０Ｕ）（双方、Biomolから）が、３０分間にわたって、阻害剤とともに、最終１００μＬの最終アッセイバッファ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ グリセロール、２ｍＭ βメルカプトエタノール）において予備インキュベートされ、次いで、２０μＭの蛍光発生カルパイン基質IまたはII（Calbiochem）とそれぞれ混合された。ＡＬＬＮおよびＡＬＬＭ（１μＭ）が阻害の内部対照であった。組換え酵素による基質の切断は、２時間後に３７℃で蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、カルパインIについては３８０ｎｍで励起した時の４６０ｎｍの発光を、カルパインIIについては４８５ｎｍで励起した時の５３０ｎｍの発光をモニタリングすることにより測定された。ヒトグランザイムＢ（５０Ｕ；Biomol）は、１０分間にわたり、阻害剤とともに、最終１００μｌの最終グランザイムアッセイバッファ（Biomol）において予備インキュベートされ、次いで、４００μＭのＡｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡ（Biomol）と混合された。３，４ＤＣＩＣ（１μＭ）が阻害の陽性対照として用いられた。基質の切断は、１時間後に３７℃で、分光光度計を用いて３６０ｎｍで測定された。

（V-2／結果と考察）
ＬＤＥＡＤおよびＶＤＥＡＤをベースとする阻害剤（２μＭ）は、他のシステインプロテアーゼ・カルパインI／IIについて強い阻害剤ではなかった（図１４）。ＬＤＥＡＤおよびＶＤＥＡＤをベースとする阻害剤（２μＭ）は、他のプロテアーゼであるグランザイムＢについて強い阻害剤ではなかった（図１５）。

（VI／カスパーゼ阻害は、周産期の虚血損傷を低減させる）
（VI-1／方法論）
新生ウィスターラット（Wistar rat）（寝わら当たり雌親プラスその９匹の仔ラット）が、仔ラットが３〜４日齢である時に、Janvier（Le Genest-St-Isle,フランス）から得られた。仔ラットは、食物および水が自由に利用可能な１２：１２時間の明暗サイクルの元でそれら雌親と共に収容された。動物実験は、実験動物の注意および使用のためのフランスおよび欧州共同体のガイドラインに従って行われた。仔ラットは、抱水クロラール（３５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔をかけられた。虚血は、既に記載される（Renolleauら，1998）ように７日齢のラット（１７〜２１ｇ）に実施された。麻酔をかけられたラットは仰向けに置かれ、首に正中切開がなされて左総頸動脈を露出させた。次いで、ラットは、右側を下にする横向きに置かれ、耳と目との間に斜位（oblique）皮膚切開がなされた。側頭筋（temporal muscle）の切除の後、頭蓋骨（cranial bone）が額縫合線（frontal suture）から頬骨弓（zygomatic arch）より下の高さ位置にかけて除かれた。次いで、鼻の裂け目の上のその出現のすぐ後に露出される左中大脳動脈は、大脳静脈より下方の高さ位置で凝固させられた。この手順の後、左総頸動脈を塞ぐためにクリップが置かれた。次いで、ラットは、低体温を回避するためにインキュベータ内に置かれた。５０分後、クリップが取り除かれた。頸動脈血流回復が顕微鏡を用いて検査された。次いで、首および頭蓋の皮膚が閉じられた。外科手順の間、体温は３７〜３８℃に維持された。仔ラットは、回復するまでインキュベータ（３２℃）に移され、次いで、その後にそれらの雌親の元（dam）に移された。

化合物は、虚血１時間後に（再灌流に対応する）腹腔内または静脈内投与された。対照動物は、ペンタペプチドカスパーゼ阻害剤を可溶化するために必要とされる担体の等価容積を受け入れた。ラットは、再灌流から４８時間後に殺され、脳が取り出された。梗塞病変（薄色ゾーン）は、動物の処理が知らされていない観察者によって視覚的にスコアリングされた。明らかな虚血の薄色ゾーンのない脳は、拡大鏡の下で観察された。明らかでないＭＣＡ（middle cerebral artery：中大脳動脈）閉塞を示すものは廃棄された。

前方線条体（anterior striatum）から後方海馬（posterior hippocampus）にわたる切片（Paxinosのラット脳アトラスにおけるプレート９〜２７に対応する）が選ばれ、同じスペースの０．５ｍｍ間隔で取られた。病変域は、クレジルバイオレット染色された切片について画像解析装置を用いて測定され、各環状切片間の間隔は、梗塞容積を計算するために用いられた。

（VI-2／結果と考察）

配列８（新規に設計されたペンタペプチド阻害剤）の特異性が、組換えカスパーゼ−２に対して試験された。カスパーゼ−２によるインビトロのＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ切断は、市販の可逆的カスパーゼ−２阻害剤（Ａｃ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ）または不可逆的カスパーゼ−２阻害剤（Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ）と同等の効果で、配列８によって阻止される（図１６）が、カスパーゼ−９阻害剤（ｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋ）によって阻止されない。

次いで、配列８は、発育中の脳における低酸素虚血損傷の急性モデルにおいて試験された。ここでは、細胞死は、ネクローシスよりはむしろアポトーシスによって起こされる。この一過性の片側の限局性虚血モデルにおいて、仔ラットは、再灌流を伴う左総頸動脈の一過性の閉塞と合併した永続性の左中大脳動脈閉塞症を経た。次いで、この周産期虚血モデルに投与された時の配列８の神経保護作用が検討された。配列８の１回の用量（０．１または１ｍｇ／ｋｇ）または担体が、虚血開始１時間後に腹腔（図１７）または静脈内（図１８）に投与された。次いで、脳は、重大な水腫がなく（１．５％以下）梗塞が安定化された時点である４８時間後に分析された。虚血梗塞容積は、病変の同側半球において約２２〜２５％の損傷を示す。虚血後１時間で腹腔内によって与えられた配列８の単一の用量（０．１または１ｍｇ／ｋｇ）は、４４〜５３％まで梗塞容積を著しく低下させた（図１７）。研究された動物について、５０％超が、部分的にまたは非常に著しく低減させられた梗塞を示した（ヒストグラム中の中央値およびクレシルバイオレット染色された部分を参照）。さらに、配列８の単一の用量（１ｍｇ／ｋｇ）はまた、虚血後１時間に与えられた場合に梗塞容積を大きく低減させた（少なくとも３０％まで）（図１８）。研究された動物についで、５０％近くが、部分的にまたは非常に著しく低減した梗塞を示した（ヒストグラムの中央値および新しく抜き出された脳上の薄い破線領域を参照）。結論として、本発明者らのデータは、新規カスパーゼ−２阻害剤が、新生児虚血脳損傷に対して強い神経保護を提供することを証明する。

（VII／カスパーゼ阻害は、成人虚血損傷を低減させる）
（VII-1／方法論）
全体性の脳虚血は、完全脳虚血（four-vessel occlusion：４ＶＯ）によって、Pulsinelliの誘導法（PulsinelliおよびBuchman、１９８８）に従って、若齢成熟ラット（１０〜１２週齢の雄ウィスター，３２０ｇ±１０ｇ；Janvier）において誘導された。第一日に、麻酔がかけれれたラットの頭部が脳定位イヤーバー（stereotaxic ear bar）内に置かれ、水平方向に対して約３０°下に傾けられた。頸椎レベルでの正中切開の後、両方の椎骨動脈が顕微鏡下に露出させられ、次いで、翼状孔（alar foramina）を通して第一頸椎のレベルで電気灼熱ニードルによって凝固させられた。次いで、両方の総頸動脈が、２４時間後に露出させられ、２０〜３０分にわたりクランプ固定された（両方の椎骨動脈の電気灼熱が首尾良く行われた時に、ラットは昏睡状態に陥った）。次いで、頸動脈は、血流の再灌流を可能とするようにクランプ固定が解かれた。賦形剤および配列８が、左の脳室のレベルに、虚血（頸動脈閉塞）の最初の１５分内に投与された。ラットは、水および食餌が無制限に与えられるそれらのケージ内に置かれた。

脆弱な細胞の選択的な喪失および配列８の効果が７２時間において評価された。ラットは犠牲にされ、脳がパラホルムアルデヒドによる経心臓灌流によって固定された。前部脳スライス（２５μｍ）がクレシル−バイオレットによって染色され、または、ヘキスト３３３４２およびFluoro Jade Bによって共染色されて、海馬および皮質における細胞死が評価された。クレシル−バイオレットは、生細胞における細胞質体Nissl（小胞体構造）および核をラベリングするためのピンク〜赤の染料であり、これにより、死細胞では、淡いまたは染色が欠落することになる。Fluoro Jade B（緑色蛍光）の取込は、浸透性の形質膜を有する細胞においてのみ可能であり、それ故に、死細胞においてより特徴的である。ヘキスト３３３４２（青色蛍光）は全細胞の核をラベリングし、細胞死の間の核の形態変化を評価することを可能にする。細胞は、左脳半球中の海馬（ＣＡ１）におけるようなレベルにおける３連続スライスにおいて計数される。クレシル−バイオレット染色スライスは、白色光下に観察された。Fluoro Jade Bおよびヘキストの両方により染色されたスライスは、４０倍対物レンズおよびLEICA IM1000/Qfluorobaseソフトウェア（ＢＰ ３４０−８０励起フィルタ）を備えるLeica DMIRB反転蛍光顕微鏡下に観察された（ＢＰ ３４０−８０励起フィルタは、ヘキスト用のＬＰ ４２５発光フィルタと組み合わされ、ＢＰ ４８０／４０励起フィルタは、FluoroJade B用のＢＰ ５１５−５６０励起フィルタと組み合わされた）。

（VII-1／結果と考察）
図２３〜２５は、細胞死が、虚血後７２時間成熟ラットの海馬のＣＡ１のレベルで起こり；細胞の９０〜１００％が、それらのクレシルバイオレット染色を失い、異常な細胞の形態を有し（図１９）、４０〜６０％が、虚血脳のＣ１において核変化および保持されたFluoroJadeBの両方を呈することを示す（図２０）。

ＣＡ１レベルにおける配列８の細胞保護効果が、単一の食間６０ｎｇの配列８の投与の後に、虚血後７２時間の脳において調査された。虚血ラットとは際だって対照的に、配列８処理動物は、より異常の少ない核を有し（核は、より大きくかつ縮小性がより小さい）、Fluoro JadeBを取り込んだ細胞はより少ない（５０〜６０％に対して１０〜２０％）（図２０）。それ故に、有色スライスは、虚血していないものに対して強調されて見える。さらに、クレシルバイオレット染色強度は、非虚血動物のレベルに部分的に回復させられるが、細胞形態の完全な回復はない（図１９）。

虚血後７２時間の細胞死の定量化。成熟ラットにおける虚血後７２時間の海馬（ＣＡ１、ＣＡ３、ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）における細胞死。全体性および一過性の脳虚血は、完全脳虚血（４ＶＯ；ｎ＝５）によって誘導された。ラットは、ＤＭＳＯ（ここで、７．２２５％；０．７２５５％不図示）により処理された（静脈（i.c.v），ｎ＝５）。Ａ；ＤＭＳＯまたはＴＲＰ６（１）、６５０μｍの後（２）または７８０μｍの後（３）の注射のレベルにおけるクレシルバイオレット陽性細胞の定量化。Ｂ；虚血および非虚血脳の海馬（ＣＡ１_{ａ、ｂ、ｃ}、ＣＡ３、ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）においてヘキスト染色によって評価される異常核の定量化。Ｃ；虚血および非虚血脳における海馬（ＣＡ１_a、b、c、ＣＡ３、ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）におけるFluoro JadeB陽性細胞の定量化。

本発明のカスパーゼ−２阻害剤の構造 カスパーゼ−２の活性部位中の化合物（１）（Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ） Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ（１）およびいくつかの残基および官能基の構造 カスパーゼ−２の活性部位中のＡｃ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ（１）およびＡｃ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏ（１４）の重ね合わせ カスパーゼ−２の活性部位中のＡｃ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ（１）およびＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏ（１３）の重ね合わせ カスパーゼ−２の活性部位中のＡｃ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ（１）およびＡｃ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏ（２５）の重ね合わせ カスパーゼ−２の活性部位中のＡｃ−ＬＤＥＳＤ−ｃｈｏ（１）およびＡｃ−ＬＤＥＫＤ−ｃｈｏ（２７）の重ね合わせ 新規に設計されたペンタペプチド阻害剤のヒト組換えカスパーゼ−２に対する阻害曲線 本発明のペンタペプチド阻害剤によるヒト組換えカスパーゼ−２阻害の３つの典型的パターン カスパーゼ−２阻害の実験による論理的根拠（ＩＣ_５０はｎＭで示される） Ａｃ−ＶＤＶＡＤ−ｃｈｏの阻害プロファイル Ａｃ−ＬＤＥＡＤ−ｃｈｏの阻害プロファイル Ａｃ−ＶＤＥＡＤ−ｃｈｏの阻害プロファイル 新規に設計されたペンタペプチド阻害剤の組換えカルパインIおよびIIに対する阻害プロファイル 新規に設計されたペンタペプチド阻害剤の組換えグランザイムＢに対する阻害プロファイル 配列８によるカスパーゼ−２のインビトロ阻害 虚血後１時間で腹腔内投与したときの新生児虚血脳障害（４８時間）に対して配列８が提供した梗塞容積の縮小

Claims (10)

1. 式（I）または式（II）：
   

   

   （式中、Ｘは、Ｈまたは、ＯＲ _ｂ およびＣＨ _２ ＯＲ _ｂ からなる群から選択されるカルボニル保護基であり、ここで、Ｒｂは、アシル、アルキルまたはアリールである）
   からなるペプチド化合物。
2. マロニル、メチルマロニル、スクシニルおよびメチルスクシニルからなる群から選択されるＮ末端保護基を有する、請求項１に記載のペプチド化合物。
3. ＸはＨである、請求項１または２に記載のペプチド化合物。
4. 請求項１〜３のいずれか１つに記載の少なくとも１種のペプチド化合物の治療上の有効量を、製薬上許容される担体と共に含む医薬組成物。
5. 全体性または限局性の、一過性または永続性の、成人、胎児または周産期の、低酸素／低血糖を伴うまたは伴わない虚血の治療のための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド化合物の使用。
6. 低酸素／低血糖を伴うまたは伴わない脳虚血損傷または卒中様の状況の治療のための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド化合物の使用。
7. 脳損傷の治療のための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド化合物の使用。
8. 慢性変性疾患の間の細胞死の治療のための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド化合物の使用。
9. 前記疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症または痴呆である、請求項７に記載のペプチド化合物の使用。
10. てんかんの治療のための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド化合物の使用。

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