JP5025874B2 - 高アニオン性タンパク質の精製方法 - Google Patents

Description

【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許出願６０／１９３，３５１（２０００年３月２７日出願）、表題”高アニオン性タンパク質の精製方法”の優先権を主張する。この引用によりこの出願の内容全体を本明細書に援用する。
【０００２】
発明の背景
ターゲットタンパク質の精製は、ＤＮＡ／タンパク質相互作用のためＤＮＡが除去されにくいことにより、しばしば妨げられる。ＤＮＡ／タンパク質相互作用は、高アニオン性タンパク質、たとえばスルフェート化（ｓｕｌｆａｔｅｄ）タンパク質の精製に際してはより問題となる。
【０００３】
発明の概要
本発明は、高アニオン性タンパク質および免疫グロブリンドメインを含むターゲットタンパク質、たとえばスルフェート化タンパク質の単離および精製のための方法を提供する。アニオン性タンパク質は正味マイナス電荷をもつタンパク質である。スルフェート化タンパク質は、正味マイナス電荷が少なくともほぼ１つのスルフェート化残基によるタンパク質である。ターゲットタンパク質のスルフェート化とは、ターゲットタンパク質に含有されるアミノ酸上またはアミノ酸間の少なくとも１つのヒドロキシル基（−ＯＨ）が−ＳＯ₄Ｈで置換されることを表わす。好ましい態様において、スルフェート化タンパク質は少なくともほぼ１つのスルフェート基をもつ。少なくともほぼ２、３、４、５、６またはそれより多いスルフェート基を含むスルフェート化タンパク質、たとえばＰＳＧＬ−１（Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１）のようにＮ末端チロシン上に６つのスルフェート基を含むものも本発明方法に包含される。
【０００４】
１態様において本発明は、ターゲットタンパク質の精製に適した条件下でのイオン交換クロマトグラフィー工程を含む、高アニオン性ターゲットタンパク質の精製方法を提供する。たとえばこの方法は、（１）荷電分子を可逆的に結合しうる支持体と試料を接触させ、これによりターゲットタンパク質を支持体に結合させ、（２）試料中の複数のタンパク性および非タンパク性不純物は結合しないかまたは支持体から洗い去られ、一方、高アニオン性ターゲットタンパク質は結合したままであるのに適した条件下で、第１洗浄溶液により支持体を洗浄し、（３）試料を第１溶離溶液で溶離し、その際、第１溶離溶液は高モル濃度の塩類溶液を含み、そして（４）精製されたアニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を採集することを含む。
【０００５】
１態様において、第１洗浄溶液のｐＨは約４．０〜８．０である。他の態様において、第１洗浄溶液のｐＨは約６．５である。
好ましい態様において、高アニオン性ターゲットタンパク質はスルフェート化タンパク質であり、不純物はスルフェート化形のターゲットタンパク質を含む。
【０００６】
他の態様においては、精製されたターゲットタンパク質を含有するイオン交換クロマトグラフィー精製からの溶離試料を、後続精製することができる。この後続精製は、たとえば高アニオン性ターゲットタンパク質の精製に適した条件下での疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／または金属キレートクロマトグラフィー工程を含む。たとえばこの後続精製は、（１）ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を金属キレートクロマトグラフィーカラムまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに通し、これにより溶離試料をカラムに捕獲し、（２）試料に含有されるＤＮＡ／ヒストン複合体が解離するのに適した条件下で、カラムを第２洗浄溶液により洗浄し、（３）試料を第２溶離溶液で溶離し、そして（４）精製された高アニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を採集する工程を含む。
【０００７】
１態様において、第２洗浄溶液は高い塩類濃度を含み、第２溶離溶液は第２洗浄溶液より低い塩類濃度を含む。たとえば疎水性相互作用クロマトグラフィー条件下で、第２洗浄溶液の塩類濃度は約４Ｍ、第２溶離溶液の塩類濃度は約０．４８Ｍである。あるいは、疎水性相互作用クロマトグラフィー条件下で、第２洗浄溶液は（ａ）約４ＭのＮａＣｌならびに約２０ｍＭおよびｐＨ約７．４のトリスを含む溶液、（ｂ）約５％のイソプロパノールおよび約１．２Ｍの硫酸アンモニウムを含む溶液、（ｃ）約５％のエタノールおよび約１．２Ｍの硫酸アンモニウムの溶液、（ｄ）約５％のエタノールおよび約４ＭのＮａＣｌの溶液よりなる群から選択される。
【０００８】
鉄キレート化クロマトグラフィー条件下で、たとえば第２洗浄溶液は約２Ｍの塩類濃度を含み、第２溶離溶液は約２００ｍＭ〜１Ｍの塩類濃度を含む。あるいは、鉄キレート化クロマトグラフィー条件下で、第２洗浄溶液は約４０ｍＭのＭＥＳ、約２ＭのＮａＣｌおよび約５ｍＭのイミダゾールを含み、第２溶離溶液は約４０ｍＭのＭＥＳ、約１ＭのＮａＣｌおよび約３５ｍＭのイミダゾールの溶液を含む。
【０００９】
他の態様において、ターゲットタンパク質は少なくともほぼ１つのスルフェート化をもつ。少なくともほぼ２、３、４、５、６またはそれより多いスルフェート化をもつアニオン性ターゲットタンパク質、たとえばＰＳＧＬ−１タンパク質も本発明に包含される。本発明により精製できるアニオン性タンパク質は、天然または組換えタンパク質であってよい。
【００１０】
他の態様において、本発明は免疫グロブリンドメイン（免疫グロブリンＦｃドメイン）を含む高アニオン性ターゲットタンパク質、たとえばＰＳＧＬ−１融合タンパク質の精製方法を提供する。この方法は、（１）免疫グロブリンドメインを含むターゲットタンパク質のＦｃ部分を結合しうる支持体と試料を接触させ、これによりターゲット分子を支持体に結合させ、（２）試料に含有される不純物を洗い去るのに適した条件下で、第１洗浄溶液により支持体を洗浄し、（３）試料を第１溶離溶液で溶離し、その際、第１溶離溶液のｐＨは低く、たとえば約４．０であり、そして（４）精製されたアニオン性ターゲット分子を含有する溶離試料を採集する工程を含む。
【００１１】
他の態様において、Ｆｃ結合支持体からの、免疫グロブリンドメインを含む精製された高アニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を、後続精製する。たとえば後続精製は、（１）免疫グロブリンドメインを含む精製されたアニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を、荷電分子を可逆的に結合しうる支持体と接触させ、これにより試料中の複数のタンパク性および非タンパク性不純物は結合しないかまたは支持体から洗い去られ、一方、ターゲットタンパク質は支持体に結合したままであり、（２）第２支持体を第２洗浄溶液で洗浄し、その際、第２洗浄溶液のｐＨは低く、たとえば約４．０であり、（３）試料を第２溶離溶液で溶離し、そして（４）免疫グロブリンドメインを含む精製されたアニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を採集する工程を含む。
【００１２】
１態様において、免疫グロブリンドメインを含むターゲットタンパク質は少なくともほぼ１つのスルフェート化をもつ。少なくともほぼ２、３、４、５、６またはそれより多いスルフェート化をもつタンパク質を含む免疫グロブリンドメイン、たとえばＰＳＧＬ−Ｉｇも本発明に包含される。
【００１３】
好ましい態様において本発明の精製方法は、汚染タンパク質について少なくとも約９９．９％純度の精製された高アニオン性ターゲットタンパク質および免疫グロブリンドメインを含む精製された高アニオン性ターゲットタンパク質（たとえばＰＳＧＬ−Ｉｇ）を提供する。
【００１４】
好ましい態様において本発明の精製方法は、高アニオン性ターゲットタンパク質および免疫グロブリンドメインを含む高アニオン性ターゲットタンパク質から少なくとも約９５％または２．５ ｌｏｇ₁₀除去値（ＬＲＶ）の汚染ＤＮＡを除去する。
【００１５】
本発明の他の特色および利点は以下の詳細な記述および特許請求の範囲から明かになるであろう。
発明の詳細な記述
本発明は少なくとも一部は、高アニオン性ターゲットタンパク質および免疫グロブリンドメインを含む高アニオン性ターゲットタンパク質、たとえばスルフェート化タンパク質（たとえばＰＳＧＬ−１）を精製するための新規方法を見いだしたことに基づく。アニオン性タンパク質は、正味マイナス電荷をもつタンパク質である。スルフェート化タンパク質は、正味マイナス電荷が少なくともほぼ１つ、より好ましくは５以上のスルフェート化、たとえば少なくともほぼ６つのスルフェート化によるものであるアニオン性タンパク質である。ターゲットタンパク質のスルフェート化とは、ターゲットタンパク質に含有されるアミノ酸上またはアミノ酸間の少なくとも１つのヒドロキシル基（−ＯＨ）が−ＳＯ₄Ｈで置換されることを表わす。スルフェート化は、たとえばＰＳＧＬ−１のようにＮ末端チロシン上において起きる可能性がある。
【００１６】
好ましい態様において、スルフェート化タンパク質はＰＳＧＬ−１、たとえばＵＳＰ５，８２７，８１７に示されたアミノ酸を含むＰＳＧＬ−１であり、その内容を本明細書に援用する。ＰＳＧＬ−１タンパク質の完全アミノ酸配列（すなわち成熟ペプチド＋リーダー配列）は、ＵＳＰ５，８２７，８１７に示されたアミノ酸配列のアミノ酸１からアミノ酸４０２までで表わされ、本明細書中にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示される。疎水性分析および既知の開裂パターンとの比較から、アミノ酸２０〜２２個のシグナル配列、すなわちＰＳＧＬ−１のアミノ酸１〜２０またはアミノ酸１〜２２が推定される。ＰＳＧＬ−１は、アミノ酸残基３８〜４１にＰＡＣＥ（塩基性アミノ酸対変換酵素）開裂部位（−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）を含む。成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中のアミノ酸４２からアミノ酸４０２までに示されるアミノ酸配列で表わされる。可溶性形Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質は、ＵＳＰ５，８２７，８１７に示されたアミノ酸配列のアミノ酸２１からアミノ酸３１０までで表わされる。他の可溶性形成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質は、ＵＳＰ５，８２７，８１７に示されたアミノ酸配列のアミノ酸４２からアミノ酸３１０までで表わされる。可溶性形Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質はさらに、室温で水溶液中に可溶性であることを特色とする。
【００１７】
ＰＳＧＬ−１の融合タンパク質（たとえばＰＳＧＬ−Ｉｇ）はＵＳＰ５，８２７，８１７（本明細書に援用する）の教示に従って製造できる。
ＰＳＧＬ−１は糖タンパク質であり、下記の末端炭水化物を１以上含む可能性がある：
【００１８】
【化１】

【００１９】
これらにおいてＲは炭水化物鎖の残りの部分であり、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質に直接に、またはＰ−セレクチンリガンドタンパク質に共有結合した脂質部分に、共有結合している。ＰＳＧＬ−１はさらにスルフェート化または他の形で翻訳後修飾されている可能性がある。ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞において発現する全長Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質は、非還元性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により示される見掛け分子量２２０ｋＤのホモダイマータンパク質である。
【００２０】
全長ＰＳＧＬ−１の構造は、細胞外ドメイン（ほぼアミノ酸２１〜３１０）、膜貫通ドメイン（ほぼアミノ酸３１１〜３３２）、および細胞内細胞質ドメイン（ほぼアミノ酸３３３〜４０２）を含む。細胞外ドメインは、Ａｓｎ残基６５、１１１および２９２から始まる潜在Ｎ−結合グリコシル化の３つのコンセンサストリペプチド部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含む。細胞外ドメインはさらに、残基４６、４８および５１に３つの潜在チロシンスルフェート化部位を含む。残基５５〜２６７からなる領域は、高い割合のプロリン、セリンおよびトレオニンを含む；これには１０アミノ酸コンセンサス配列Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ／Ｌｅｕ−Ａｌａ／Ｔｈｒのデカマー反復配列１５のサブドメインが含まれ、ここでＸはＰｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＡｒｇであってよい。このような領域は高Ｏ−グリコシル化タンパク質に特徴的である。
【００２１】
Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質活性を維持した状態でＰＳＧＬ−１配列を実質的に欠失させることができる。たとえばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸４２からアミノ酸１８９までの配列、アミノ酸４２からアミノ酸１１８までの配列、またはアミノ酸４２からアミノ酸８９までの配列を含むＰＳＧＬ−１は、それぞれＰ−セレクチンタンパク質結合活性およびＥ−セレクチン結合能を保持する。１以上のＮ−結合グリコシル化部位（たとえばアミノ酸６５、１１１および２９２）が他のアミノ酸に変化した、または欠失したＰＳＧＬ−１タンパク質も、Ｐ−セレクチンタンパク質結合活性およびＥ−セレクチン結合能を保持する。アミノ酸４２からアミノ酸６０までを含む（アミノ酸４５からアミノ酸５８までの高アニオン領域を含む）Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質も、Ｐ−セレクチンタンパク質結合活性を保持する；しかしそのような配列に限定されたＰ−セレクチンリガンドタンパク質は、Ｅ−セレクチンには結合しない。好ましくは、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質はアミノ酸４６、４８および５１にみられるチロシン残基を少なくとも１つ（より好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは３つすべて）保有する；そのスルフェート化がＰ−セレクチンリガンドタンパク質活性に関与すると思われる。
【００２２】
本発明をさらに下記の例により説明する。これらを限定と解すべきではない。本明細書全体、ならびに図面および付表Ａにおいて引用したすべての参考文献、特許および公開特許出願を本明細書に援用する。ＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列についての記述はすべて、ＵＳＰ５，８２７，８１７に示された、および本明細書にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示された、ＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列に基づく。
【００２３】
実施例
方法：タンパク質精製のための一般法は下記にみられる：Ｊａｎｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ Ｌ．Ｒｙｄｅｎ（編）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＶＨＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社，ニューヨーク（１９８９）、ＵＳＰ５，４２９，７４６（表題：抗体精製）、およびＵＳＰ５，１１５，１０１（表題：抗体調製物からのタンパク質の除去）；これらの内容を本明細書に援用する。
【００２４】
実施例１：組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質の精製−方法Ｉ
この実施例は、組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質のカラムクロマトグラフィーによる精製を記載する（図１）。
【００２５】
可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質をＣＨＯ細胞において発現させ、コンディショニングした培地をタンパク質精製のために収集した。床深さ８ｃｍのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを製造業者の指示に従って調製した。コンディショニングした培地中のＰＳＧＬに対するカラム容量は約１ｍｇ ＰＳＧＬ／ｍｌ樹脂である。
【００２６】
アニオン交換クロマトグラフィーを下記に従って実施した。マイクロフィルトレーションしたＣＨＯコンディショニング培地を、ほぼｐＨ７、伝導率２０ｍＳ／ｃｍ未満でカラムに装填した。カラムを２０ｍＭヒスチジン、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で洗浄して低スルフェート化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ（たとえば４以下のスルフェート化）を除去した。装填および洗浄工程を３．５ｃｍ／分で実施した。カラムをｐＨ６．５で１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．５により＜１．１ｃｍ／分において溶離した。この工程のｐＨは４〜８であってよいが、好ましくは６．５である。溶出ピークはＰＳＧＬ−Ｉｇ、ＤＮＡおよびヒストンならびに他の汚染物質を含有する。ＱカラムはＤＮＡを結合し、ヒストンはこのＤＮＡに結合している。ＰＳＧＬ溶出（塩類濃度上昇により起きる）はＤＮＡ溶出と一致する。ＰＳＧＬ−Ｉｇの純度は＞８０％である。ＤＮＡの５０％がこの工程で実施されたにすぎない。
【００２７】
これらの条件下で、高スルフェート化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ分子（たとえば５または６のスルフェート化）が優先的に精製される。理想的には活性ｒＰＳＧＬ−ＩｇはＮ末端チロシン上に５または６のスルフェート化をもつ。
【００２８】
アニオン交換カラムからの溶出液を、下記のように疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムによりさらに精製した。
床深さ９ｃｍのＰｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃカラム（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）を製造業者の指示に従って調製した。ＨＩＣカラム容量は約３．５ｍｇ ＰＳＧＬ／ｍＬ樹脂である。カラムを１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４中、≦１．３ｃｍ／分で平衡化した。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶出液を、３Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４の添加により、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４に調整し、ＨＩＣに装填した。あるいは、１．２Ｍ硫酸アンモニウムではなく４Ｍ ＮａＣｌで装填することができる。カラムを１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で洗浄した。装填および洗浄の両工程とも約１．３ｃｍ／分の速度で実施した。ＨＩＣカラムを０．４８Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４により０．６５ｃｍ／分で溶離した。これらの条件下で、ＨＩＣカラムからまずＨ２ＡおよびＨ２Ｂヒストンが除去される。これらはＨ３およびＨ４ヒストンほど強固にＤＮＡを結合しない。Ｈ２ヒストンは洗浄画分中に出現し、ピークはＨ３およびＨ４ヒストン、ならびに少量のＨ２ヒストンを含有する。さらに、ＤＮＡの大部分がヒストン上に留まり、このピーク中に溶出する。生成物は汚染タンパク質について＞９５％の純度であり、８５％のＤＮＡがこの工程で除去される。
【００２９】
ＨＩＣカラムからの溶出液を、下記のように金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムによりさらに精製した。
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｃｈｅｌａｔｅ（Ｍ）（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）上のＩＭＡＣ銅（ＩＩ）カラムを製造業者の指示に従って調製した。ＩＭＡＣカラムは６．４〜７．２ｃｍの床深さ、および約６．６ｍｇ ＰＳＧＬ／ｍＬ樹脂の容量をもっていた。
【００３０】
カラムを５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰＯ₄）、２．０Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭイミダゾール、ｐＨ７中、５ｃｖ、≦５ｃｍ／分で平衡化した。ＨＩＣカラムからの溶出液を２ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＫＰＯ₄、ｐＨ７，２００ｍＭ ＮａＣｌに調整し、ＩＭＡＣカラムに装填した。カラムをまず平衡化緩衝液で洗浄し、次いで４０ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．６中、≦５ｃｍ／分で平衡化した。この低い塩類濃度では、ＩＭＡＣカラム上のヒストン／ＤＮＡ複合体は分解されない。カラムを４０ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、３５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．６で溶離した。ＩＭＡＣカラムからまずＨ３およびＨ４ヒストンが除去される。ＩＭＡＣピーク中に少量のＨ３およびＨ２ヒストンがみられるが、Ｈ３およびＨ４ヒストン、ならびに少量のＨ２はストリップ液中にある。得られた生成物は汚染タンパク質について＞９９．９％の純度であり、９５％のＤＮＡがこの工程で除去される。全体として、この全工程で約２．５ＬＲＶのＤＮＡクリアランスである。
【００３１】
ＤＮＡはＱカラムに直接結合したので、この方法でＤＮＡは全プロセス工程を通して運ばれた。Ｑ工程でＤＮＡは、Ｑカラムへの本発明の装填物中に存在する天然のＤＮＡ結合タンパク質であるヒストン（たとえばＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４）にも結合した。したがってＱカラム上にはＤＮＡがＱカラムに結合し、このＤＮＡにヒストンに結合したサンドイッチがあった。後続工程でサンドイッチは逆転した；ＤＮＡはＨＩＣまたはＩＭＡＣカラムには直接結合しないので、その代わりヒストンがＨＩＣまたはＩＭＡＣカラムに結合し、ＤＮＡはこれらのヒストンに結合した。ヒストンがＨＩＣまたはＩＭＡＣカラムから溶出すると、それらと共に汚染物質ＤＮＡが運ばれる。ＤＮＡ／タンパク質相互作用のため、タンパク質精製に際し、特に高アニオン性ターゲットタンパク質の場合、殊にこれらのアニオン性タンパク質をアニオン交換カラムから溶離する場合、しばしばＤＮＡが除去されにくい可能性がある。
【００３２】
実施例２：組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質の精製−方法ＩＩ
この実施例は、組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質のカラムクロマトグラフィーによる精製を記載する；これは汚染性のヒストン／ＤＮＡ複合体を塩類またはアルコール類で解離し、これによりＰＳＧＬ−Ｉｇタンパク質の純度を高める工程を含む（図２）。
【００３３】
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上でのアニオン交換クロマトグラフィーを実施例１の記載に従って実施した。
アニオン交換カラムからの溶出液を、下記のように疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムによりさらに精製した。床深さ９ｃｍのＰｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃカラム（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）を製造業者の指示に従って調製し、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で平衡化した。この工程のｐＨは６〜８であってよいが、好ましくはｐＨ７．４である。
【００３４】
Ｑピークを、３Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４の添加により、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４に調整し、カラムに装填した。あるいは、１．２Ｍ硫酸アンモニウムではなく４Ｍ ＮａＣｌで装填することができる。カラムを１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、続いて４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で洗浄した。４Ｍ ＮａＣｌによる洗浄で９０％のＤＮＡがカラムから除去される（または１ ｌｏｇ₁₀除去値、すなわち１ ＬＲＶ）。あるいは５％イソプロパノールおよび１．２Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄してもよい。これにより９９．９％のＤＮＡがカラムから除去される（”３ ｌｏｇ₁₀除去値”、すなわち３ ＬＲＶ）。あるいは５％エタノールおよび１．２Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄してもよい。これにより９９．９％のＤＮＡがカラムから除去される（”３ ｌｏｇ₁₀除去値”、すなわち３ ＬＲＶ）。あるいは５％エタノールおよび４Ｍ ＮａＣｌで洗浄してもよい。これにより９９．９％のＤＮＡがカラムから除去される（”３ ｌｏｇ₁₀除去値”、すなわち３ ＬＲＶ）。あるいは５％イソプロパノールおよび４Ｍ ＮａＣｌで洗浄してもよい。これにより９９．９％のＤＮＡがカラムから除去される（”３ ｌｏｇ₁₀除去値”、すなわち３ ＬＲＶ）。装填および洗浄の両工程とも約１．３ｃｍ／分の速度で実施した。次いでカラムを０．４８Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４により０．６５ｃｍ／分で溶離した。
【００３５】
前記のように、これらの条件を用いるＨＩＣによりまずＨ２ＡおよびＨ２Ｂヒストンが除去される。これらはＨ３およびＨ４ヒストンほど強固にＤＮＡを結合しない。Ｈ２ヒストンは洗液中に出現する。ピークはＨ３およびＨ４ヒストン、ならびに少量のＨ２ヒストンを含有する。しかし本発明者らは、より高い塩類濃度で洗浄するとＤＮＡ／ヒストン相互作用を破壊しうることを見いだした。たとえば１．２Ｍ硫酸アンモニウムではなく４Ｍ ＮａＣｌで洗浄すると、ＤＮＡはヒストンから分離し、洗液中へ流出する。これらの条件下では、ＤＮＡの大部分が洗液中へ流出し、ヒストンはなおピーク中に溶出する。あるいはこのＨＩＣ工程をＩＭＡＣ工程（下記を参照）の後に実施してもよい。これにより９９．９％以上のＤＮＡが除去される（３ ＬＲＶ）。
【００３６】
ＨＩＣカラムからの溶出液を、下記のように金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムによりさらに精製した。
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｃｈｅｌａｔｅ（Ｍ）（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）上のＩＭＡＣ銅（ＩＩ）カラムを製造業者の指示に従って調製した。ＩＭＡＣカラムは６．４〜７．２ｃｍの床深さ、および約６．６ｍｇ ＰＳＧＬ／ｍＬ樹脂の容量をもっていた。この工程のｐＨは４．８〜８であってよいが、好ましくはｐＨ６．６である。
【００３７】
カラムを５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰＯ₄）、２．０Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭイミダゾール、ｐＨ７中、５ｃｖ、≦５ｃｍ／分で平衡化した。あるいは、２Ｍ ＮａＣｌではなく２００ｍＭ ＮａＣｌで５カラムを平衡化してもよい。ＨＩＣカラムからの溶出液を２ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＫＰＯ₄、ｐＨ７、２００ｍＭ ＮａＣｌに調整し、ＩＭＡＣカラムに装填した。あるいは、２Ｍ ＮａＣｌではなく２００ｍＭ ＮａＣｌで装填を行ってもよい。
【００３８】
カラムをまず平衡化用緩衝液で洗浄し、次いで４０ｍＭ ＭＥＳ、２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．６中、≦５ｃｍ／分で平衡化した。カラムを４０ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、３５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．６で溶離した。ＩＭＡＣカラムからまずＨ３およびＨ４ヒストンが除去される。これらのヒストンおよび少量のＨ２ヒストンはストリップ液中にある。少量のＨ３およびＨ４ヒストンがＩＭＡＣピーク中にもみられる。
【００３９】
この工程で実施例１の方法Ｉの工程（１ ＬＲＶ）より９０％多いＤＮＡが除去される。この工程の新規性は、ヒストン／ＤＮＡ複合体からＤＮＡを分離するために２Ｍ ＮａＣｌで装填するか、または２Ｍ ＮａＣｌで洗浄することである。ヒストンはＩＭＡＣカラムに付着し、ＤＮＡはこれらのヒストンに付着する。ＤＮＡはＨ３／Ｈ２または単にＨ２複合体よりＨ３／Ｈ４複合体の方により良く結合するので、Ｈ３／Ｈ４複合体を可能な限り速やかに除去するのが有益である。したがって、ＩＭＡＣ実施後にＨＩＣを実施すると、より大きなＤＮＡクリアランス（９９．９％高いクリアランス、すなわち３ ＬＲＶ）を達成できることが示された。したがってＩＭＡＣを可能な限り早期にプロセスに挿入すると、さらにＤＮＡを減少させうると考えられる。しかしＩＭＡＣを第１工程にすると、低分子量アミノ酸および他のアミン含有基を装填物から除去するために限外濾過／透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）が必要となる。
【００４０】
実施例３：組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質の精製−方法ＩＩＩ
この実施例は、組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質のカラムクロマトグラフィーによる精製のための別法を記載する。実施例１に記載した精製方式と異なり、この方法は第１精製工程としてアフィニティー工程を用いる（図３）。このアフィニティー精製工程には、ｒＰＳＧＬ−ＩｇキメラのＦｃ部分を結合するプロテインＡを用いる。ｒＰＳＧＬ−ＩｇはプロテインＡカラムから低いｐＨ、この場合ｐＨ３．７で溶出する。装填後にカラムを１Ｍ ＮａＣｌで洗浄すると、プロテインＡ工程はより良いクリアランスを与える。この塩類濃度は一般に用いられるものより高い（通常は約１５０ｍＭ ＮａＣｌ）ので、新規である。この塩工程の付加により、この工程からのＤＮＡクリアランスは４ ｌｏｇ₁₀除去値（ＬＲＶ）ないし６ＬＲＶになる。これは１００倍のＤＮＡ除去増加である。
【００４１】
プロテインＡ工程はヒストンを結合しないと思われ、良好なＤＮＡクリアランスを与える。したがってプロテインＡ工程後の各工程には認めうるほどのヒストンは存在しない。しかしプロテインＡがプロテインＡカラムから浸出するので、プロテインＡを除去するための後続工程を実施する。浸出したプロテインＡを除去するための最良の方法は、プロテインＡ溶出液を中性もしくは低いｐＨで直接Ｑカラムに装填するか、またはＱカラムを低いｐＨで洗浄するものである。Ｑカラムは普通は低いｐＨ、特にｐＨ４で操作されることはない。したがって、低いｐＨでｒＰＳＧＬ−ＩｇをプロテインＡ溶出液から直接捕獲することまたはＱカラムを洗浄すること、あるいはそれらの組合わせは、新規である。ｒＰＳＧＬ−ＩｇおよびプロテインＡは低いｐＨにあるので、大部分のｒＰＳＧＬ−Ｉｇは浸出したプロテインＡに結合していない。その結果、プロテインＡはＱカラムに結合せず、Ｑ通過液中にみられる。これも新規である。したがってＱカラムはプロテインＡを除去するために用いられる。
【００４２】
床深さ６〜１０ｃｍのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を製造業者の指示に従って調製する。カラム容量は約１ｍｇ／ｍＬである。カラムを２０ｍＭトリス、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２〜８、好ましくはｐＨ７．４で平衡化する。マイクロフィルトレーションしたコンディショニング培地を、ｐＨ７〜８、好ましくはｐＨ７．４、約３０〜３００ｃｍ／時、好ましくは１５０ｃｍ／時でカラムに装填する。カラムを２０ｍＭトリス、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７〜８、好ましくはｐＨ７．４で洗浄し、２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３〜４、好ましくはｐＨ３．７、約５０〜３００ｃｍ／時で溶離する。純度はタンパク質については＞９５％であり、ＤＮＡの＞９９％がこの工程で除去される。
【００４３】
プロテインＡカラムからの溶出液をさらに、床深さ８ｃｍのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製する。プロテインＡ工程後のＱ ＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムのＰＳＧＬに対する容量は、ｐＨ３．６〜４．０、好ましくはｐＨ３．７において約≧６ｍｇ ＰＳＧＬ／ｍＬ樹脂である。
【００４４】
プロテインＡピークをｐＨ調整せずに直接にＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに装填するか、またはピークをＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに装填する前に中性にする。いずれの場合も、カラムを２００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５〜４、好ましくはｐＨ３．７で洗浄して、残留プロテインＡを除去する。両方法とも、浸出プロテインＡ、低スルフェート化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ、Ｎ末端クリップｒＰＳＧＬ−Ｉｇ、およびｐｒｏ−ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ（ｒＰＳＧＬ−Ｉｇの前駆物質種；Ｎ末端の酵素開裂部位をもたない）を除去する。ｐＨ３．５〜４での洗浄後、カラムを２０ｍＭヒスチジン、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で洗浄して低スルフェート化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇを除去することができる。低スルフェート化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ分子は４以下のスルフェート化をもち、これに対し活性ｒＰＳＧＬ−Ｉｇは理想的には５または６のスルフェート化をＮ末端チロシン上にもつ。カラムの装填および洗浄工程を３．５ｃｍ／分の速度で実施する。カラムをｐＨ６．５で１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．５により溶離する。あるいは、ｐＨ３．５〜４．０、好ましくはｐＨ３．７、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸、＜１．１ｃｍ／分で溶離してもよい。タンパク質はピークの＜２％である。
【００４５】
均等物
当業者には本明細書に記載した具体的態様の多くの均等物が自明であるか、またはルーティン程度の実験により確認できるであろう。そのような均等物は本発明に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１に記載した本発明の精製方法、方法Ｉを示す。
【図２Ａ】 実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。
【図２Ｂ】 実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。
【図２Ｃ】 実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。
【図２Ｄ】 実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。
【図２Ｅ】 実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。
【図２Ｆ】 実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。
【図２Ｇ】 実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。
【図３】 実施例３に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩＩを示す。

Claims (12)

1. 試料中のアニオン性ターゲットタンパク質を試料中の複数のタンパク性および非タンパク性不純物ならびにＤＮＡ／ヒストン複合体から精製する方法であって、
   （ａ）イオン交換クロマトグラフィーを用いてアニオン性ターゲットタンパク質を精製し；
   （ｂ）ターゲットタンパク質を含有する試料を金属キレートクロマトグラフィー支持体上に装填し、ここで該タンパク質が支持体上に捕獲され；そして
   （ｃ）支持体をｐＨ４．８〜８の洗浄溶液によって洗浄し、これにより試料中のアニオン性ターゲットタンパク質が精製されることを含む方法であって、
   ここで金属キレートクロマトグラフィー支持体上に装填される試料または金属キレートクロマトグラフィー支持体のための洗浄溶液、もしくは装填された試料および洗浄溶液の両方が、少なくとも２ＭのＮａＣｌを含む、方法。
2. ターゲットタンパク質がスルフェート化タンパク質を含み、不純物が低スルフェート化形のターゲットタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
3. スルフェート化タンパク質がＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１またはＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１融合タンパク質である、請求項２に記載の方法。
4. 金属キレートクロマトグラフィー支持体からターゲットタンパク質を溶離溶液中に溶離することをさらに含む、請求項１に記載の方法であって、ここで溶離溶液が洗浄溶液より低い塩類濃度を含む、方法。
5. ターゲットタンパク質を含有する試料を金属キレートクロマトグラフィーカラムに通し、洗浄溶液が２Ｍの塩類濃度を含み、溶離溶液が２００ｍＭ〜１Ｍの塩類濃度を含む、請求項４に記載の方法。
6. 溶離溶液が１Ｍの塩類濃度を含む、請求項５に記載の方法。
7. 洗浄溶液が４０ｍＭのＭＥＳ、２ＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのイミダゾールを含み、溶離溶液が４０ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌおよび３５ｍＭのイミダゾールの溶液を含む、請求項５に記載の方法。
8. ターゲットタンパク質が少なくとも５つのスルフェート化を有する、請求項１に記載の方法。
9. ターゲットタンパク質が組換えタンパク質である、請求項１に記載の方法。
10. 請求項１に記載の方法であって、ここでアニオン性ターゲット分子が免疫グロブリンＦｃドメインを含み、そしてここで該方法がさらに（ａ’）アニオン性ターゲット分子のＦｃ部分を結合しうる支持体と試料を接触させ、（ｂ’）洗浄溶液により支持体を洗浄し、（ｃ’）試料を溶離溶液で溶離し、その際、溶離溶液のｐＨは４．０であり、そして（ｄ’）精製されたアニオン性ターゲット分子を含有する溶離試料を採集することを含む方法。
11. 分子がＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１融合タンパク質である、請求項１０に記載の方法。
12. Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１融合タンパク質がｒＰＳＧＬ−Ｉｇである、請求項１１に記載の方法。

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