JP5065569B2 - Industrially produced pravastatin sodium-containing composition - Google Patents

Description

【０００７】
を有する化合物を、工業的に生産されたプラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量まで除去することに関連する発明に関する。
【０００８】
【従来の技術】
プラバスタチンは、特開昭５７−２２４０号公報（ＵＳＰ４３４６２２７）にＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤として開示されている化合物であり、下記式（ＩＩ）
【０００９】
【化３】

【００１０】
を有し、現在、プラバスタチンナトリウムが高脂血症治療剤として発売されている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤として、プラバスタチンの他に多くの化合物が知られているが、例えば、アトロバスタチン、フルバスタチン、イタバスタチン等は、全て合成により製造される化合物である。
【００１２】
一方、ロバスタチン及びシンバスタチンは、プラバスタチンと同様に発酵により製造されるものの、一段階の発酵により生成され、この点、プラバスタチンの二段階発酵と相違する。すなわち、プラバスタチンナトリウムは、下記式に示すとおり、二段階にわたって菌により変換培養することにより生成されるものである。
【００１３】
【化４】

【００１４】
そもそも、菌を発酵させた場合、化学反応で合成を行うよりも、予想し得ない多くの不純物が生成してしまうものである。各工程毎に精製を行ったとしても不純物を除去しきれるものではなく、特に工業的生産を目的とした大量培養における、各工程の生成物についてはなおさらである。
【００１５】
一方、「安全で有効な医薬を製造するための重要な因子の一つが、高純度の生成物を得ることである。化学物質は、原料物質から化学合成、生物により生産された当該物質を単離・精製する又は遺伝子組換え細胞等を利用した生産で生成された当該物質を単離・精製する等の製法により取得される。一般的に、遺伝子組換法を含めいかなる製法を採用しようが、原料の純度、反応の不完全性、単離・精製過程での分解等により、製造される化学物質は１００％の純度のものを得ることは困難なことが多い。また、医薬の分野において、診断薬、治療薬は、不純物を含むと診断や治療に好ましくない影響を及ぼす可能性を否定することができないのは、本願発明の属する技術分野における技術常識に属することは明らかであり、できる限り高純度の生成物を得る事が重要とされている。」（東京高裁平成９年（行ケ）第３０２号事件（１２年２月１７日判決））のである。
【００１６】
そして、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤は、血中コレステロールを有効に低下させるために、投与期間が長期にわたるような薬剤であるため、特に高純度であることが必要とされる。
【００１７】
従って、上記のとおり、二段階発酵により生成されるプラバスタチン類は、一段階発酵により生成されるシンバスタチン及びロバスタチンに比べて、不純物もより多く含有するため、精製工程が特に重要であり、不純物を除去し高純度のプラバスタチンを単離・精製する方法を見出すための研究が続けられていた。
【００１８】
本発明者等は、特に、プラバスタチンを二段階発酵して生成する際に、下記一般式（Ｉ）
【００１９】
【化５】

【００２０】
を有する化合物が必ず生成され、しかも上記化合物（Ｉ）の生産量が、プラバスタチンに変換培養する際に生成される不純物の中で最も多いことを見出した。しかしながら、このように、高純度のプラバスタチンを得るためには、医薬を製造するにあたり不純物とされる化合物の中でも、上記化合物（Ｉ）を確実に除去することが重要な課題であることがわかったものの、上記化合物（Ｉ）は、プラバスタチンの一つの不斉炭素上の水酸基にかかる光学異性体であるため、他の不純物に比べて除去することが非常に困難であった。
【００２１】
従って、クロマトグラフィーのような煩雑なものではなく、工程生産性を損なわず、しかもクロマトグラフィーで精製される程度の高純度で、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を単離・精製する方法、更に上記化合物（Ｉ）を除去し高純度のプラバスタチンを得ることができるような、簡便な単離・精製方法が望まれていた。
【００２２】
一方、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製方法としては、以下のものが知られている。
（１）ＷＯ９２／１６２７６号公報（特表平６−５０６２１０号公報）
本公報は、「高性能液体クロマトグラフィーを使用することを特徴とするＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製方法、及び、該精製方法により得られたＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤」に関する。
【００２３】
本公報の精製方法は、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製工程において、高性能液体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする。一方、本発明の単離・精製方法は、酢酸n-プロピル、酢酸n-ブチルのような式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）を有する溶媒を使用することにより、プラバスタチンの不純物を除去するか、及び／又は、無機酸及び／又は無機塩基を用いて分解することにより不純物を除去し、高性能液体クロマトグラフィーを用いずに、高純度のプラバスタチンを得られることを特徴としている点で、本公報の精製方法とは相違する。
【００２４】
また、本発明の「上記化合物（Ｉ）をプラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下まで除去することを特徴とする」単離・精製方法については記載も示唆もされていない。
【００２５】
ところで、高性能液体クロマトグラフィーは、大量の溶媒を要し、それらに少量の不揮発性不純物が含まれ得るが故に、大規模生産の場合にはより深刻になる。溶媒の除去に際し、これらの不純物は試料に混入する。加えて、このように多量の溶媒を用いることにより、深刻な環境汚染や多額の蒸溜費用を招くことになる。
【００２６】
従って、高性能液体クロマトグラフィーは、煩雑であり、工業的なプラバスタチンの単離・精製に用いられる操作であるとは考えられない。
【００２７】
そして、プラバスタチンの工業生産にあたって、高性能液体クロマトグラフィーを用いたとしても、プラバスタチンの光学異性体である上記化合物（Ｉ）を除去し所望の純度のプラバスタチンを得ることは困難である。
（２）ＷＯ９９／４２６０１号公報
本公報は、「ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の濃縮培養液を、酸でｐＨ４．５乃至７．５に調節した後、酢酸エチルでＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を抽出し、所望によりラクトン化させた後結晶化することにより、９９．６％以上の純度を有するＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を得る単離・精製方法」に関する。
【００２８】
本公報の精製方法は、菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、酢酸エチルを使用していることに対して、本発明の精製方法は、酢酸ｎ-プルピル、酢酸n-ブチルのような式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）を有する溶媒を使用している点で、本発明の単離・精製方法とは相違する。
【００２９】
更に、本発明の単離・精製方法は、プラバスタチンの不純物を、無機酸及び／又は無機塩基を用いて分解する工程を行うことにより高純度のプラバスタチンを得ることも特徴としているが、本公報では、無機酸及び／又は無機塩基を用いてＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の不純物を分解する工程については、記載も示唆もされていない。
【００３０】
また、本発明の「上記化合物（Ｉ）をプラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下まで除去することを特徴とする」単離・精製方法については、記載も示唆もされていない。
【００３１】
確かに、本公報の実施例３では、プラバスタチンの単離・精製方法が記載されているが、本実施例では、酢酸エチルで抽出されたプラバスタチンの純度が７０．３％足らずに留まっており、その後本発明の単離・精製方法とは相違するクロマトグラフィーを用いて精製する記載はあるものの、最終的に得られたプラバスタチンの純度については全く記載されていない。従って、最終的に高純度のプラバスタチンが得られているのか否かはそもそも不明であるし、加えて上記化合物（Ｉ）がプラバスタチンに対して、０．１重量％以下まで精製されているかどうかについても記載も示唆もされていない。
【００３２】
また、本公報の実施例において、９９．６％以上の高純度で得られるとされているロバスタチンでさえ、最終生成物のＨＰＬＣのチャート（Fig.4）を見る限り、純度が９９．６％以上のロバスタチンが得られているとは考えにくく、信憑性がない。
（３）ＷＯ００／１７１８２号公報
本公報は、「置換クロマトグラフィーを使用することを特徴とするＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製方法、及び、該精製方法により得られたＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤」に関する。
【００３３】
本公報の精製方法は、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製工程において、置換クロマトグラフィーを用いることを特徴とする。一方、本発明の単離・精製方法は、酢酸n-プロピル、酢酸n-ブチルのような式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）を有する溶媒を使用して、プラバスタチンの不純物を除去するか、及び／又は、無機酸及び／又は無機塩基を用いて分解することにより不純物を除去し、置換クロマトグラフィーを含む一切のクロマトグラフィーを用いずに、高純度のプラバスタチンが得られることを特徴としている点で、本公報の精製方法とは相違する。
【００３４】
また、本発明の「上記化合物（Ｉ）をプラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下まで除去することを特徴とする」単離・精製方法については、記載も示唆もされていない。
【００３５】
そして、プラバスタチンの工業的生産にあたって、置換クロマトグラフィーを用いたとしても、煩雑であり、また、プラバスタチンの光学異性体である上記化合物（Ｉ）を除去することは困難である。
【００３６】
なお、上記精製方法の他に、通常、当業者が採用する単離・精製方法としては、例えば、分析用高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を挙げることができるが、分析用ＨＰＬＣは、プラバスタチンの単離・精製方法としては実用的手段ではない。分析用ＨＰＬＣは、非常に細い直経の充填カラム（直径4.6ｍｍ×長さ25ｃｍ）を用い、一回の分析毎に高圧にあるカラムに約10μg(1×10^-2mg)の試料を添加するものであり、一回の分析は、約３０分を要する。試料はいずれはカラムから流出するものの、極端に稀釈された溶液状であり、分析系では成分検出は可能であるが、収集は実用的でない。更に、分析用ＨＰＬＣには収集系は付属しておらず、それを設置するにしても、固体試料を得たい場合には溶媒除去を要する。プラバスタチンの単離・精製に分析用ＨＰＬＣを使うとすると、僅か1個の5mg錠を作るに必要なプラバスタチンを単離・精製するのに、500回の分析と250時間を要することとなり、分析用ＨＰＬＣはプラバスタチンの単離・精製の目的には非現実的な操作であるかが明らかである。
【００３７】
また、分取用ＨＰＬＣも、前述の理由により、商業規模のプラバスタチンの単離・精製に適した手法とはいえない。
【００３８】
シリカゲルクロマトグラフィーは、シリカゲル粒子の大きさに基づき、カラムクロマトグラフィーとフラッシュクロマトグラフィーに大別できるが、商業規模の単離・精製に使うに適した手法であるとは期待されなかった。
【００３９】
実際に、各種クロマトグラフィーを用いて、上記化合物（Ｉ）及びその他の不純物の分離を試みたが、上記化合物（Ｉ）はプラバスタチンの立体異性体であるため、該化合物をプラバスタチンから分離できなかった。
【００４０】
再結晶は、医薬品分野で広く用いられている単離・精製操作である。しかしながら、再結晶を使用しても、構造的にプラバスタチンと類似する上記化合物（Ｉ）をプラバスタチンから選択的に分離し、組成物中のプラバスタチンの純度を所望の水準まで改善するには効果的でなかった。
【００４１】
ガスクロマトグラフィーや蒸溜といった、他の単離・精製法も考慮したが、いずれも試料分子の大きさの差異に準拠した分離に基づいており、両者とも試料の加熱を要する。しかしながら、プラバスタチンはその融点では分解する傾向があるため、これらを単離・精製法とすることができない。
【００４２】
また、上記化合物（Ｉ）を除去するため前記単離・精製方法のいずれかを繰り返し行ったとしても逆にプラバスタチンの収率をも減少させてしまう。
【００４３】
更に、上述されているような、従来知られているいかなる単離・精製方法を組み合わせても、上記化合物（Ｉ）を０．１％以下の量まで除去し、プラバスタチンの工業的生産に適用することはできなかった。
【００４４】
従って、工程生産性を損なうこともなく、高純度のプラバスタチン、特に、プラバスタチンの類縁物質である上記一般式（Ｉ）を有する化合物を除去することにより高純度であるプラバスタチンを得る事ができる単離・精製方法は、今まで全く知られていない。
【００４５】
本発明者らは、プラバスタチンを含有する医薬組成物について鋭意研究を行った結果、高純度のプラバスタチンを得る単離・精製方法、更にプラバスタチンの類縁物質である上記化合物（Ｉ）を含めた不純物を該医薬組成物から除去する単離・精製方法、特に上記化合物（Ｉ）をプラバスタチンを含有する医薬組成物全量に対して０．１％以下の量まで除去する単離・精製方法を見出し、本発明を完成した。
【００４６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１） 菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用することを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（２） プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を単離・精製する工程において、不純物を無機酸を用いて、分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（３） プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を単離・精製する工程において、不純物を無機塩基を用いて、分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法
に関する。
【００４７】
好適には、
（４） Ｒがn-プロピル基又はn-ブチル基である、（１）記載のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（５） 無機酸が、リン酸である、（２）記載のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（６） 無機酸を用いて分解する工程のｐＨが、２乃至５である、（２）又は（５）に記載のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法
を挙げることができる。
【００４８】
更に本発明は、
（７） 菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、かつ、不純物を無機酸を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（８） プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を単離・精製する工程において、不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（９） 菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、並びに、不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法に関し、好適には、
（１０） Ｒがn-プロピル基又はn-ブチル基である、（７）又は（９）記載のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（１１） 無機酸が、リン酸である、（７）乃至（１０）から選択されるいずれか一項に記載にのプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（１２） 無機酸を用いて分解する工程のｐＨが、２乃至５である、（７）乃至（１１）から選択されるいずれか一項に記載のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法
を挙げることができる。
また、本発明は、
（１３） 菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、かつ、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法に関し、好適には、
（１４） Ｒがn-プロピル基又はn-ブチル基である、（１３）記載のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法
を挙げることができる。
【００４９】
また、本発明は、
（１５） 菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、かつ、不純物を無機酸を用いて分解する工程を行うことにより、一般式（Ｉ）
【００５０】
【化６】

【００５１】
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量まで除去することを特徴とする、プラバスタチンナトリウムの単離・精製方法、
（１６） プラバスタチンナトリウムを単離・精製する工程においてに、不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことにより、
一般式（Ｉ）
【００５２】
【化７】

【００５３】
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量まで除去することを特徴とする、プラバスタチンナトリウムの単離・精製方法、
（１７） 菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、並びに、不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことにより、
一般式（Ｉ）
【００５４】
【化８】

【００５５】
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量まで除去することを特徴とする、プラバスタチンナトリウムの単離・精製方法
に関し、好適には、
（１８） Ｒがn-プロピル基又はn-ブチル基である、（１５）又は（１７）記載のプラバスタチンナトリウムの単離・精製方法、
（１９） 無機酸が、リン酸である、（１５）乃至（１８）から選択されるいずれか一項に記載のプラバスタチンナトリウムの単離・精製方法、
（２０） 無機酸を用いて分解する工程のｐＨが、２乃至５である、（１５）乃至（１９）から選択されるいずれか一項に記載のプラバスタチンナトリウムの単離・精製方法
を挙げることができる。
【００５６】
更に本発明は、
（２１） 菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、かつ、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことにより、
一般式（Ｉ）
【００５７】
【化９】

【００５８】
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量まで除去することを特徴とする、プラバスタチンナトリウムの単離・精製方法に関し、好適には、
（２２）一般式（Ｉ）
【００５９】
【化１０】

【００６０】
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量で含有することを特徴とする、工業的に生産されたプラバスタチンナトリウムを含有する組成物、
（２３） Ｒがn-プロピル基又はn-ブチル基である、（２１）記載のプラバスタチンナトリウムの単離・精製方法
を挙げることができる。
【００６１】
また、本発明は、
（２４） （１）乃至（２３）のいずれか一項に記載の単離・精製方法により得られ、一般式（Ｉ）
【００６２】
【化１１】

【００６３】
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量で含有することを特徴とする、プラバスタチンナトリウムを含有する組成物に関する。
【００６４】
本発明において、「プラバスタチン類」とは、下記式（ＩＩ）
【００６５】
【化１２】

【００６６】
を有するプラバスタチン又はその薬理上許容される塩、及び、上記式（ＩＩ）と類似の構造を有する化合物、即ちプラバスタチンの類縁物質（例えば、上記化合物（Ｉ）を挙げることができる。）をいう。
【００６７】
プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製は、通常、以下に記載する単離・精製方法によって達成される。
【００６８】
まず、変換培養を終えたプラバスタチンを含む培養液を、常法に従って、ろ過及び／又は遠心法により、菌体を分離し、その後濃縮して培養濃縮液を得る。
【００６９】
得られた培養濃縮液は、所望により、酸を用いてpHを調節した後、酢酸エチルのような水と混和しにくい有機溶媒を用いてプラバスタチン類を抽出する。例えば、ＷＯ９９／４２６０１号公報では、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む培養濃縮液を、酸を用いてpHを４．５〜７．５（好適には５．５〜７．５）に調節した後、酢酸エチルを用いて抽出している。
【００７０】
そのようにして得られたプラバスタチン類は常法に従って、上記抽出液から採取される。例えば、上記抽出液を、水、飽和食塩水等で洗浄後、水酸化ナトリウムを加え、抽出分液し、逆抽出水層としてプラバスタチン塩の水溶液を得る事ができる。得られたプラバスタチン塩は、所望により結晶化することもできる。
【００７１】
所望により行なわれる結晶化は、一般に有機合成化学の技術において周知の方法、例えば、Ullmann's, Encyclopedia of Industrial Chemistry" Vol. A24, 5th edition (1993) , pp. 437-505に記載の方法により以下のように行うことができる。
【００７２】
結晶化の方法としては、例えば、得られたプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の組成物に、有機溶媒及び水を加え、加温溶解し、接種することにより、結晶体としてプラバスタチンを得る事ができる。
【００７３】
結晶化に使用される有機溶媒としては、例えば、ヘキサン、ヘプタンのような脂肪族炭化水素類；トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸n-ブチルのようなエステル類；酢酸のような有機酸類；メタノ−ル、エタノ−ル、ｎ−プロパノ−ル、イソプロパノ−ル、ｎ−ブタノ−ル、イソブタノ−ル、ｔ−ブタノ−ル、イソアミルアルコ−ル、ジエチレングリコール、グリセリン、オクタノールのようなアルコ−ル類；アセトン、メチルエチルケトンのようなケトン類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテルのようなエ−テル類；ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルリン酸トリアミドのようなアミド類；ジメチルスルホキシドのようなスルホキシド類；水と１種類以上の上記有機溶媒との混合溶媒；であり、好適には、水と１種類以上の上記有機溶媒との混合溶媒であり、更に好適には、水と、アルコ−ル類、エステル類及びケトン類から選択される１種類以上の有機溶媒との混合溶媒であり、最も好適には、水、アルコール類及びエステル類の混合溶媒である。
【００７４】
本発明の単離・精製方法は、上述のように常法に従って、培養濃縮液を得た後、酢酸エチルではなく、式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）を有する有機溶媒を用いて抽出することを特徴とする。
【００７５】
上記式中、Ｒの定義における「炭素数３以上のアルキル基」は、例えば、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル基のような基であり、好適には、炭素数３乃至６個の直鎖又は分枝鎖アルキル基であり、好適にはＣ₃−Ｃ₄アルキル基であり、最も好適には、n-プロピル又はn-ブチル基である。
【００７６】
また、本発明の単離・精製方法は、上述のようなプラバスタチンの単離・精製方法において、プラバスタチンの不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び／又は、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことを特徴とする。
【００７７】
プラバスタチンの不純物を無機酸を用いて分解する工程及び不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行う場合は、順不同で希望する工程を、単離・精製方法において適宜実施することができる。そのような単離・精製方法の具体例としては、例えば、
（ａ） 菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、かつ、不純物を無機酸を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（ｂ） 菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、かつ、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（ｃ） プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を単離・精製する工程において、不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を順不同で行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（ｄ） 菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式 ＣＨ₃ＣＯ₂Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、並びに、不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法
を挙げることができる。
【００７８】
プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の不純物を無機酸により分解する工程は、不活性溶媒の存在下又は非存在下（好適には、存在下）、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を、ｐＨ２乃至５を付与する条件（好適にはｐＨ３乃至４）で行われる。
【００７９】
不純物の無機酸分解で使用される「無機酸」とは、通常、酸として用いられる無機物質であれば特に限定はないが、例えば、臭化水素酸、塩酸、硫酸、過塩素酸、リン酸、硝酸のような無機酸を挙げることができ、好適には、リン酸又は硫酸である。
【００８０】
反応温度及び反応時間は、ｐＨ値にも依存するが、基本的には、反応温度が低ければ反応時間は長くする必要があり、反応温度が高ければ反応時間は短くする必要があるが、例えば、２０℃〜８０℃（好適には、４０℃〜６０℃）にて、１分間乃至６時間（好適には、５分間乃至２０分間）、処理することにより行なわれる。
【００８１】
不純物の無機酸分解で使用される「不活性溶媒」は、通常、溶媒として使用されるものであれば特に限定はないが、例えば、メタノ−ル、エタノ−ル、ｎ−プロパノ−ル、イソプロパノ−ル、ｎ−ブタノ−ル、イソブタノ−ル、ｔ−ブタノ−ル、イソアミルアルコ−ル、ジエチレングリコール、グリセリン、オクタノール、シクロヘキサノール、メチルセロソルブのようなアルコ−ル類；水；水と上記有機溶媒との混合溶媒；であり、好適には、水又は水と上記有機溶媒との混合溶媒であり、最も好適には、水又は水とエタノ−ルとの混合溶媒である。
【００８２】
反応終了後、目的化合物であるプラバスタチンは常法に従って、反応液から採取される。例えば、酢酸エチルのような水と混和しない有機溶媒を加え、目的化合物を含む有機層を分離し、水等で洗浄して、溶剤を留去することによって得られる。更に必要ならば、活性炭を加えて脱色し、ろ過して活性炭を除去した後、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシドのような塩を形成する試薬を加え、ロータリエバポレーター等により減圧下濃縮して、プラバスタチンの塩を得ることができる。
【００８３】
プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の不純物を無機塩基で分解する工程は、不活性溶媒の存在下又は非存在下（好適には、存在下）に、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を、ｐＨ１０〜１４を付与する条件（好適には、ｐＨ１１〜１３）で行われる。
【００８４】
不純物の無機塩基分解で使用される「無機塩基」とは、通常の反応において塩基として使用される無機物質であれば特に限定はないが、例えば、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムのようなアルカリ金属炭酸塩類；炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムのようなアルカリ金属重炭酸塩類；水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウムのようなアルカリ金属水素化物類；水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなアルカリ金属水酸化物類；リチウムメトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシドのようなアルカリ金属アルコキシド類を挙げることができ、好適には、アルカリ金属水酸化物類であり、最も好適には、水酸化ナトリウムである。
【００８５】
反応温度及び反応時間は、ｐＨ値にも依存するが、基本的には、反応温度が低ければ反応時間は長くする必要があり、反応温度が高ければ反応時間は短くする必要があるが、例えば、−１０℃〜１１０℃（好適には、０℃〜１００℃）にて、１５分乃至６０時間（好適には、３０分間乃至７２時間）、処理することにより行なわれ、より好適には、０℃付近で、３０時間前後である。
【００８６】
不純物の無機塩基分解で使用される「不活性溶媒」は、本反応に不活性なものであれば特に限定はないが、不純物の無機酸分解で使用される不活性溶媒と同様のものを挙げることができる。
【００８７】
反応終了後、目的化合物であるプラバスタチンは常法に従って、上記反応液から採取される。例えば、硫酸水溶液のような酸を加え、酢酸エチルのような水と混和しない有機溶媒を加え、目的化合物を含む有機層を分離し、水等で洗浄して、溶剤を留去することによって得られる。更に必要ならば、活性炭を加えて脱色し、ろ過して活性炭を除去した後、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、水酸化ナトリウムのような塩を形成する試薬を加え、ロータリエバポレーター等により減圧下濃縮して、プラバスタチンの塩を得ることができる。
【００８８】
更に、本発明の単離・精製方法は、得られたプラバスタチン塩を結晶化する工程を含んでいてもよく、結晶化する方法は、上述のように常法に従って行うことができる。
【００８９】
なお、本発明の精製度の分析は、、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を介して行うことができる。ＨＰＬＣの測定条件は、
Ａ：移動相：20%アセトニトリル、30%メタノール、50%TEAP緩衝液（0.3%Triethylamine-H₃PO₄（ｐH3.2））；
検出波長：UV２３８nm；
カラム：Waters社製逆相カラムSymmetry C18 3.5μm,φ4.6mm×15cm；
流量：1ml/min
Ｂ：移動相：メタノール：水：酢酸(100)：トリエチルアミン混液(600:400:1:1);
検出波長：UV２３８nm；
カラム：エルマ光学製カラムERC‐ODS‐1262 φ6mm×10cm；
カラム温度：30℃；
流量：1ml/min
Ｃ：移動相：メタノール：水：酢酸(100)：トリエチルアミン混液(450:550:1:1)；
検出波長：UV２３８nm；
カラム：ＢＥＣＫＭＡＮ社製カラムＵＬＴＲＡＳＰＨＥＲＥ ODS φ4．6mm×15cm 5μm；
カラム温度：25℃；
流量：1.3ml/min
である。
【００９０】
以下に、実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００９１】
【実施例】
実施例１ 培養濃縮液より酢酸 n- ブチルを用いた抽出
（１ａ）培養液の濃縮
変換培養を終えたプラバスタチン培養液10 Lを水酸化ナトリウムでpH12としたのち、50℃に加温し30分間撹拌した。培養液を室温に冷却後、ろ過助剤として500 gのセライト545（商標）（セライト コーポレーション社製）を加えてろ過した。分離した菌体に水を3 L加え、再度懸濁させた後ろ過した。得られた２つの濃縮液を合併し10 Lの培養濃縮液を得た。
（１ｂ）酢酸n-ブチルを用いた抽出
得られた培養濃縮液を25%硫酸でpH5.7とした後、5 Lの酢酸n-ブチルを加え撹拌してプラバスタチンを抽出した。分離した水層を75%硫酸でpH5.7とした後、5 Lの酢酸n-ブチルを加えて撹拌し抽出した。得られた２つの酢酸n-ブチル層を合併し、これに2 Lの飽和食塩水を加えて撹拌して洗浄した。上層を分離して得た8 Lの抽出液に1 Lの水を加え、撹拌しながら25%水酸化ナトリウムを加えてpH9.5とした後、水層を分離してプラバスタチンのナトリウム塩水溶液1 Lを得た。ＨＰＬＣ（条件Ａ）によるプラバスタチンナトリウムの純度は、90％以上であった。本実施例の結果より、酢酸n-ブチルを用いることにより、高純度のプラバスタチンナトリウムが得られていることが明らかである。
【００９２】
実施例２ 培養濃縮液より酢酸 n- プロピルを用いた抽出
酢酸n-ブチルのかわりに酢酸n-プロピルを用いて、実施例１と同様に処理をし、プラバスタチンのナトリウム塩水溶液を得た。ＨＰＬＣ（条件Ａ）によるプラバスタチンナトリウムの純度は、85％以上であった。本実施例の結果より、酢酸n-プロピルを用いることにより、高純度のプラバスタチンナトリウムが得られていることが明らかである。
【００９３】
実施例３ リン酸による不純物の分解
実施例１で得られた水溶液［ＨＰＬＣ（条件Ａ）による化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウムは9.3％］に350 mlのエタノールを加え、リン酸でpH3.0に調整した後50℃で10分間撹拌した。ＨＰＬＣ（条件Ａ）による化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウムは0.9％であった。本実施例の結果より、リン酸を用いることにより、化合物（Ｉ）が顕著に除去されていることが明らかである。
【００９４】
実施例４ 硫酸による不純物の分解
リン酸のかわりに硫酸を用いて、実施例３と同様に処理をした。ＨＰＬＣ（条件Ａ）による化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウムは3％であった。本実施例の結果より、硫酸を用いることにより、化合物（Ｉ）が顕著に除去されていることが明らかである。
【００９５】
実施例５ 水酸化ナトリウムによる不純物の分解、抽出及び結晶化
（５ａ）水酸化ナトリウムによる不純物の分解
プラバスタチンの培養濃縮液500ml［ＨＰＬＣ（条件Ｂ）による化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウムは12.1％］を100℃まで加熱した後、2当量分の水酸化ナトリウムを水溶液として添加した（ｐH11.3）。100℃で3時間攪拌後冷却し、室温にて20％硫酸水溶液でpH8.5に調整し、水酸化ナトリウムによるアルカリ処理液を得た(プラバスタチンナトリウムの含有量：56.6g)。ＨＰＬＣ（条件Ｂ）による化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウムは0.41％であった。本実施例の結果より、水酸化ナトリウムを用いることにより、化合物（Ｉ）が顕著に除去されていることが明らかである。
（５ｂ）水酸化ナトリウムによる不純物の分解後の抽出及び結晶化
（５ａ）で得られた水酸化ナトリウムによるアルカリ処理液260g(プラバスタチンナトリウムの含有量：19g)に酢酸n-ブチルを用いて、実施例（１ｂ）と同様にして水層を分離してプラバスタチンのナトリウム塩水溶液を得た。
【００９６】
得られたプラバスタチンのナトリウム塩水溶液を約1/2量まで減圧濃縮した後、水77mlを加え再び減圧濃縮した。濃縮液をプラバスタチンのフリー体に対して6倍量となるように水で液量を調整して0〜5℃まで冷却し、20％硫酸水溶液を滴下しpH4.6でプラバスタチンのフリー体結晶を析出し、1晩攪拌した後にろ過した。結晶を冷希硫酸(pH4)で洗浄し、プラバスタチンのフリー体湿品結晶を得た。
【００９７】
プラバスタチンのフリー体湿品に酢酸エチル63mlを加え室温で溶解した後、室温で攪拌しながら20％硫酸水溶液でpH4.5に調整し、攪拌抽出分液後酢酸エチル層に水21mlを加え抽出洗浄後分液した。抽出洗浄した酢酸エチル層にエタノール25mlを加えた後、室温で攪拌しながら6％水酸化ナトリウム・エタノール溶液でpH8.7に調整しナトリウム塩化液を得た。この後、常法に従って結晶化し、プラバスタチンナトリウム塩の結晶8.95gを得た。この方法で得られたプラバスタチンナトリウム塩のHPLC（条件Ｃ）による純度は99.67%であり、化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウム=0.1％であった。
【００９８】
本実施例の結果より、水酸化ナトリムによる不純物の分解工程及び酢酸n-ブチルを用いた抽出工程によって、化合物（Ｉ）が顕著に除去されていることが明らかである。
【００９９】
実施例６ 酢酸ｎ - ブチルによる抽出、リン酸による不純物の分解、及び結晶化
実施例３で得られた酸処理液に、25%水酸化ナトリウムを加えてpH12としさらに50℃で30分撹拌を続けた。溶液を減圧下ロータリーエバポレーターで1 Lまで濃縮し、プラバスタチンナトリウム塩を含有する濃縮液を得た。得られた濃縮液を硫酸でpH4.0に調整した後、プラバスタチンを0.5 Lの酢酸エチルで抽出し、抽出液を水0.2 Lで洗浄した。抽出液に5 gの活性炭を加え10分間放置した後、ろ紙でろ過し、ろ液を25%水酸化ナトリウムでpH8.7に調整したのち、減圧下ロータリーエバポレーターで乾固して50 gのプラバスタチンナトリウム塩を得た。常法に従って結晶化し、34 gのプラバスタチンナトリウム塩の粗結晶を得た。粗結晶を同じ組成の溶媒を用いて再結晶してプラバスタチンナトリウム塩の純粋な結晶 32 gを得た。
【０１００】
この方法で得られたプラバスタチンナトリウム塩のHPLC（条件Ａ）による純度は99.7%以上であり、化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウム=0.1％であった。
【０１０１】
本実施例より、酢酸ｎ-ブチルによる抽出及びリン酸による不純物の分解工程によって、化合物（Ｉ）が0.1％以下まで除去され、高純度のプラバスタチンナトリウムが得られたことが明らかである。
【０１０２】
更に、酢酸ｎ-ブチルによる抽出及びリン酸による不純物の分解工程に、水酸化ナトリウムによる不純物の分解工程を加えることにより、化合物（Ｉ）が更に除去され、高純度のプラバスタチンナトリウムが得られたことが明らかである。
【０１０３】
実施例７ 水酸化ナトリウムによる不純物の分解、硫酸による分解及び結晶化
実施例（５ａ）で得られた水酸化ナトリウムによるアルカリ処理液から、酢酸エチルを用いて、実施例（５ｂ）と同様にして抽出し、プラバスタチンのナトリウム塩水溶液を得た。得られた水溶液に350 mlのエタノールを加え、硫酸でpH1.5に調整した後20℃で1時間撹拌した。常法に従って結晶化し、プラバスタチンナトリウム塩の純粋な結晶を得た。ＨＰＬＣ（条件Ｃ）による化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウム=0.1％以下であった。
【０１０４】
本実施例より、硫酸による不純物の分解及び水酸化ナトリウムによる不純物の分解工程によって、化合物（Ｉ）が0.1％以下まで除去され、高純度のプラバスタチンナトリウムが得られた。
【０１０５】
比較例１
酢酸エチルによるプラバスタチンの抽出
酢酸n-ブチルのかわりに酢酸エチルを用いて、実施例（１ａ）と同様に処理をし、プラバスタチンのナトリウム塩水溶液を得た。ＨＰＬＣ（条件Ａ）によるプラバスタチンナトリウムの純度は、約70％であった。
【０１０６】
培養濃縮液から、プラバスタチン類を抽出する有機溶媒が、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、及び酢酸n-ブチルである場合の、化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウム（％）は、以下のとおりである。下記結果より、酢酸エチルで抽出するよりも、酢酸n-プロピル及び酢酸n-ブチルにより抽出することによって、高純度のプラバスタチンが得られていることが明らかである。
【０１０７】
【表１】

【０１０８】
【発明の効果】
本発明の精製方法は、カラムクロマトグラフィーのような煩雑かつ生産性の低く、工業的生産に向かない方法を使用することなく、従って、工程生産性及びプラバスタチンの純度を損なうことなく、高純度のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩を得ることができた。
【０１０９】
また、本発明の単離・精製方法により上記化合物（Ｉ）をプラバスタチンに対して０．１％以下の量まで除去された。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
In the process of extracting pravastatin from a culture concentrate containing pravastatin produced by a fungus using an organic solvent,
Formula CH_ThreeCO₂The present invention relates to a process for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof using a solvent having R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms).
[0002]
The present invention also relates to a method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, characterized by performing a step of decomposing impurities using an inorganic acid.
[0003]
Furthermore, the present invention relates to a method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, which comprises performing a step of decomposing impurities using an inorganic base.
[0004]
The present invention also relates to a method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, comprising two or more steps selected from the above three steps.
[0005]
Furthermore, the present invention provides compounds of formula (I)
[0006]
[Chemical 2]

[0007]
It relates to an invention relating to the removal of compounds having an amount of 0.1% by weight or less, relative to industrially produced pravastatin sodium.
[0008]
[Prior art]
Pravastatin is a compound disclosed as an HMG-CoA reductase inhibitor in JP-A-57-2240 (USP 4346227), and has the following formula (II)
[0009]
[Chemical Formula 3]

[0010]
Currently, pravastatin sodium is on the market as a therapeutic agent for hyperlipidemia.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
Many compounds other than pravastatin are known as HMG-CoA reductase inhibitors. For example, atorvastatin, fluvastatin, itavastatin and the like are all compounds produced by synthesis.
[0012]
On the other hand, although lovastatin and simvastatin are produced by fermentation in the same manner as pravastatin, they are produced by one-stage fermentation, which is different from pravastatin two-stage fermentation. That is, pravastatin sodium is produced by conversion culture with bacteria over two stages as shown in the following formula.
[0013]
[Formula 4]

[0014]
In the first place, when a fungus is fermented, many unpredictable impurities are generated rather than synthesis by chemical reaction. Even if purification is performed for each step, impurities cannot be completely removed, especially for the products of each step in mass culture for the purpose of industrial production.
[0015]
On the other hand, “One of the important factors for producing a safe and effective medicine is to obtain a high-purity product. Chemical substances are synthesized from raw materials and synthesized by living organisms. It is obtained by a method such as isolation / purification of the substance produced by separation / purification or production using genetically modified cells, etc. In general, any production method including genetic recombination method will be adopted. In many cases, it is difficult to obtain a chemical substance having a purity of 100% due to the purity of raw materials, incomplete reaction, decomposition during the isolation / purification process, etc. It is clear that the diagnostic and therapeutic agents cannot be denied the possibility of adverse effects on diagnosis and treatment if they contain impurities, and it is clear that they belong to the technical common sense in the technical field to which the present invention belongs. As high as pure Of being it is important to obtain the product. "It's (Tokyo High Court 1997 (Gyoke) No. 302 No. case (12 February 17 judgment)).
[0016]
And since an HMG-CoA reductase inhibitor is a chemical | medical agent with a long administration period in order to reduce blood cholesterol effectively, it is required to be especially highly purified.
[0017]
Therefore, as described above, pravastatin produced by two-stage fermentation contains more impurities than simvastatin and lovastatin produced by one-stage fermentation, so the purification process is particularly important and removes impurities. However, research has continued to find a method for isolating and purifying high-purity pravastatin.
[0018]
In particular, when the present inventors produce pravastatin by two-stage fermentation, the following general formula (I)
[0019]
[Chemical formula 5]

[0020]
It has been found that the compound having the above is always produced, and that the production amount of the compound (I) is the largest among the impurities produced in the conversion culture to pravastatin. However, in order to obtain high-purity pravastatin as described above, it was found that it is an important issue to surely remove the compound (I) among the compounds regarded as impurities in the production of a medicine. However, since the compound (I) is an optical isomer related to the hydroxyl group on one asymmetric carbon of pravastatin, it was very difficult to remove as compared with other impurities.
[0021]
Therefore, a method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof at a high purity that is not complicated as in chromatography, without impairing process productivity and purified by chromatography, Furthermore, there has been a demand for a simple isolation / purification method capable of removing the compound (I) and obtaining high-purity pravastatin.
[0022]
On the other hand, the following is known as a purification method of an HMG-CoA reductase inhibitor.
(1) WO92 / 16276 (Tokuheihei 6-506210)
This publication relates to “a method for purifying an HMG-CoA reductase inhibitor characterized by using high performance liquid chromatography and an HMG-CoA reductase inhibitor obtained by the purification method”.
[0023]
The purification method of this publication is characterized by using high performance liquid chromatography in the purification step of the HMG-CoA reductase inhibitor. On the other hand, the isolation / purification method of the present invention has the formula CH such as n-propyl acetate and n-butyl acetate._ThreeCO₂By using a solvent having R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms), impurities of pravastatin are removed and / or using an inorganic acid and / or an inorganic base It is different from the purification method of this publication in that impurities are removed by decomposition and high-quality pravastatin can be obtained without using high-performance liquid chromatography.
[0024]
Further, there is no description or suggestion of the isolation / purification method “characterized by removing the compound (I) to 0.1% by weight or less with respect to pravastatin sodium” of the present invention.
[0025]
By the way, high performance liquid chromatography becomes more serious in the case of large-scale production because it requires a large amount of solvent and can contain a small amount of non-volatile impurities. Upon removal of the solvent, these impurities are mixed into the sample. In addition, the use of such a large amount of solvent causes serious environmental pollution and a large amount of distillation costs.
[0026]
Therefore, high performance liquid chromatography is complicated and cannot be considered as an operation used for industrial isolation and purification of pravastatin.
[0027]
In the industrial production of pravastatin, even if high performance liquid chromatography is used, it is difficult to obtain pravastatin having a desired purity by removing the compound (I), which is an optical isomer of pravastatin.
(2) WO99 / 42601
This publication states that “the HMG-CoA reductase inhibitor concentrated culture solution was adjusted to pH 4.5 to 7.5 with acid, and then the HMG-CoA reductase inhibitor was extracted with ethyl acetate and optionally lactonized. The present invention relates to an “isolation / purification method for obtaining an HMG-CoA reductase inhibitor having a purity of 99.6% or more by post-crystallization”.
[0028]
The purification method of this publication uses ethyl acetate in the step of extracting pravastatin using an organic solvent from a culture concentrate containing pravastatin produced by a bacterium. The purification method is represented by the formula CH such as n-propyl acetate, n-butyl acetate._ThreeCO₂The method is different from the isolation / purification method of the present invention in that a solvent having R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms) is used.
[0029]
Furthermore, the isolation / purification method of the present invention is characterized in that pravastatin having high purity is obtained by performing a step of decomposing pravastatin impurities using an inorganic acid and / or an inorganic base. There is no description or suggestion of a step of decomposing impurities of the HMG-CoA reductase inhibitor using an inorganic acid and / or an inorganic base.
[0030]
Further, there is no description or suggestion of the isolation / purification method “characterized by removing the compound (I) to 0.1% by weight or less with respect to pravastatin sodium” of the present invention.
[0031]
Certainly, in Example 3 of this publication, a method for isolating and purifying pravastatin is described, but in this example, the purity of pravastatin extracted with ethyl acetate remains less than 70.3%, Thereafter, although there is a description of purification using chromatography different from the isolation / purification method of the present invention, there is no description about the purity of pravastatin finally obtained. Therefore, it is unclear whether or not pravastatin of high purity is finally obtained, and in addition, whether or not the compound (I) is purified to 0.1% by weight or less with respect to pravastatin. Is neither described nor suggested.
[0032]
In the examples of this publication, even lovastatin, which is said to be obtained with a high purity of 99.6% or more, has a purity of 99.6% as far as the HPLC chart of the final product (Fig. 4) is seen. It is unlikely that the above lovastatin has been obtained, and there is no credibility.
(3) WO00 / 17182
This publication relates to “a method for purifying an HMG-CoA reductase inhibitor characterized by using displacement chromatography, and an HMG-CoA reductase inhibitor obtained by the purification method”.
[0033]
The purification method of this publication is characterized by using displacement chromatography in the purification step of the HMG-CoA reductase inhibitor. On the other hand, the isolation / purification method of the present invention has the formula CH such as n-propyl acetate and n-butyl acetate._ThreeCO₂Using a solvent having R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms), impurities of pravastatin are removed and / or decomposed with an inorganic acid and / or an inorganic base. Thus, it is different from the purification method of this publication in that impurities are removed and high purity pravastatin can be obtained without using any chromatography including substitution chromatography.
[0034]
Further, there is no description or suggestion of the isolation / purification method “characterized by removing the compound (I) to 0.1% by weight or less with respect to pravastatin sodium” of the present invention.
[0035]
And even if substitution chromatography is used in the industrial production of pravastatin, it is complicated and it is difficult to remove the compound (I), which is an optical isomer of pravastatin.
[0036]
In addition to the purification methods described above, the isolation / purification methods usually employed by those skilled in the art include, for example, analytical high pressure liquid chromatography (HPLC). Analytical HPLC is a simple substance of pravastatin. It is not a practical means as a separation / purification method. Analytical HPLC uses a very thin straight packed column (diameter: 4.6 mm x length: 25 cm). About 10 μg (1 x 10^-2mg) of sample is added, and one analysis takes about 30 minutes. Although the sample will flow out of the column, it is in the form of an extremely diluted solution, and component detection is possible in the analytical system, but collection is not practical. Furthermore, the analytical HPLC does not come with a collection system, and even if it is installed, if a solid sample is to be obtained, solvent removal is required. If analytical HPLC is used for the isolation and purification of pravastatin, it takes 500 analyzes and 250 hours to isolate and purify pravastatin, which is necessary for making only one 5 mg tablet. It is clear that HPLC is an unrealistic operation for the purpose of isolation and purification of pravastatin.
[0037]
Preparative HPLC is also not a suitable technique for the isolation and purification of commercial-scale pravastatin for the reasons described above.
[0038]
Silica gel chromatography can be broadly divided into column chromatography and flash chromatography based on the size of silica gel particles, but was not expected to be a technique suitable for commercial scale isolation and purification.
[0039]
Actually, separation of the compound (I) and other impurities was attempted using various chromatographies. However, since the compound (I) is a stereoisomer of pravastatin, the compound could not be separated from pravastatin. .
[0040]
Recrystallization is an isolation / purification operation widely used in the pharmaceutical field. However, the use of recrystallization is effective in selectively separating the compound (I) structurally similar to pravastatin from pravastatin and improving the purity of pravastatin in the composition to a desired level. There wasn't.
[0041]
Although other isolation / purification methods such as gas chromatography and distillation were considered, both are based on separation based on the difference in size of sample molecules, and both require heating of the sample. However, since pravastatin tends to decompose at its melting point, it cannot be used as an isolation / purification method.
[0042]
Moreover, even if any one of the isolation / purification methods is repeated to remove the compound (I), the yield of pravastatin is also decreased.
[0043]
Furthermore, even when any conventionally known isolation / purification method as described above is combined, the compound (I) is removed to an amount of 0.1% or less and applied to the industrial production of pravastatin. I couldn't.
[0044]
Therefore, it is possible to obtain pravastatin having high purity by removing pravastatin having high purity, particularly a compound having the above general formula (I), which is a related substance of pravastatin, without impairing process productivity. -The purification method is not known at all until now.
[0045]
As a result of intensive studies on a pharmaceutical composition containing pravastatin, the present inventors have found an isolation / purification method for obtaining high-purity pravastatin, and impurities including the compound (I), which is a related substance of pravastatin. An isolation / purification method for removing from the pharmaceutical composition, in particular, an isolation / purification method for removing the compound (I) to an amount of 0.1% or less with respect to the total amount of the pharmaceutical composition containing pravastatin. Completed the invention.
[0046]
[Means for Solving the Problems]
The present invention
(1) In the step of extracting pravastatin using an organic solvent from a culture concentrate containing pravastatin produced by a fungus,
Formula CH_ThreeCO₂R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms)
A method of isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, characterized by using a solvent having
(2) In the step of isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, a step of decomposing impurities using an inorganic acid is performed, wherein pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof is characterized by Isolation / purification method,
(3) In the step of isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, a step of decomposing impurities using an inorganic base is carried out. Isolation / purification method
About.
[0047]
Preferably,
(4) The method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof according to (1), wherein R is an n-propyl group or an n-butyl group,
(5) The method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof according to (2), wherein the inorganic acid is phosphoric acid,
(6) The method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof according to (2) or (5), wherein the pH of the step of decomposing using an inorganic acid is 2 to 5.
Can be mentioned.
[0048]
Furthermore, the present invention provides
(7) In the step of extracting pravastatin from a culture concentrate containing pravastatin produced by a fungus using an organic solvent,
Formula CH_ThreeCO₂R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms)
A method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, characterized by performing a step of decomposing impurities using an inorganic acid, using a solvent having
(8) In the step of isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, a step of decomposing impurities using an inorganic acid and a step of decomposing impurities using an inorganic base A method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof,
(9) In the step of extracting pravastatin using an organic solvent from a culture concentrate containing pravastatin produced by a fungus,
Formula CH_ThreeCO₂R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms)
A pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, characterized by performing a step of decomposing impurities using an inorganic acid, and a step of decomposing impurities using an inorganic base Regarding the isolation / purification method, preferably,
(10) A method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof according to (7) or (9), wherein R is an n-propyl group or an n-butyl group,
(11) The method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof according to any one of (7) to (10), wherein the inorganic acid is phosphoric acid,
(12) The pravastatin or pharmacologically acceptable salt thereof according to any one of (7) to (11), wherein the pH in the step of decomposing with an inorganic acid is 2 to 5; Separation and purification method
Can be mentioned.
The present invention also provides:
(13) In the step of extracting pravastatin using an organic solvent from a culture concentrate containing pravastatin produced by a fungus,
Formula CH_ThreeCO₂R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms)
And a method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, wherein the step of decomposing impurities using an inorganic base is performed.
(14) The method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof according to (13), wherein R is an n-propyl group or an n-butyl group.
Can be mentioned.
[0049]
The present invention also provides:
(15) In the step of extracting pravastatin using an organic solvent from a culture concentrate containing pravastatin produced by a fungus,
Formula CH_ThreeCO₂R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms)
And a step of decomposing the impurities with an inorganic acid to produce a compound of general formula (I)
[0050]
[Chemical 6]

[0051]
A method for isolating and purifying pravastatin sodium, wherein the compound is removed to an amount of 0.1% by weight or less with respect to pravastatin sodium,
(16) In the step of isolating and purifying pravastatin sodium, by performing a step of decomposing impurities using an inorganic acid and a step of decomposing impurities using an inorganic base,
Formula (I)
[0052]
[Chemical 7]

[0053]
A method for isolating and purifying pravastatin sodium, wherein the compound is removed to an amount of 0.1% by weight or less with respect to pravastatin sodium,
(17) In the step of extracting pravastatin from a culture concentrate containing pravastatin produced by a fungus using an organic solvent,
Formula CH_ThreeCO₂R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms)
And a step of decomposing impurities using an inorganic acid, and a step of decomposing impurities using an inorganic base,
Formula (I)
[0054]
[Chemical 8]

[0055]
A method for isolating and purifying pravastatin sodium, which comprises removing a compound having an amount of 0.1% by weight or less with respect to pravastatin sodium
Preferably,
(18) The method for isolating and purifying pravastatin sodium according to (15) or (17), wherein R is an n-propyl group or an n-butyl group,
(19) The method for isolating and purifying pravastatin sodium according to any one of (15) to (18), wherein the inorganic acid is phosphoric acid,
(20) The method for isolating and purifying pravastatin sodium according to any one of (15) to (19), wherein the pH in the step of decomposing with an inorganic acid is 2 to 5
Can be mentioned.
[0056]
Furthermore, the present invention provides
(21) In the step of extracting pravastatin using an organic solvent from a culture concentrate containing pravastatin produced by a fungus,
Formula CH_ThreeCO₂R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms)
And performing a step of decomposing impurities using an inorganic base,
Formula (I)
[0057]
[Chemical 9]

[0058]
In the method for isolating and purifying pravastatin sodium, which is characterized in that the compound having a thiophene is removed to an amount of 0.1% by weight or less with respect to pravastatin sodium,
(22) General formula (I)
[0059]
Embedded image

[0060]
A composition containing pravastatin sodium produced industrially, characterized in that it contains a compound having an amount of 0.1% by weight or less with respect to pravastatin sodium,
(23) The method for isolating and purifying pravastatin sodium according to (21), wherein R is an n-propyl group or an n-butyl group.
Can be mentioned.
[0061]
The present invention also provides:
(24) Obtained by the isolation / purification method according to any one of (1) to (23), and having the general formula (I)
[0062]
Embedded image

[0063]
It is related with the composition containing pravastatin sodium characterized by containing the compound which has this in the quantity of 0.1 weight% or less with respect to pravastatin sodium.
[0064]
In the present invention, “pravastatin” means the following formula (II)
[0065]
Embedded image

[0066]
Or a pharmacologically acceptable salt thereof, and a compound having a structure similar to that of the above formula (II), that is, a related substance of pravastatin (for example, the above compound (I) can be mentioned).
[0067]
Isolation / purification of pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof is usually achieved by the isolation / purification method described below.
[0068]
First, a culture solution containing pravastatin after conversion culture is separated by filtration and / or centrifugation according to a conventional method, and then concentrated to obtain a culture concentrate.
[0069]
The obtained culture concentrate is adjusted with an acid if necessary, and then pravastatins are extracted with an organic solvent that is not miscible with water, such as ethyl acetate. For example, in WO99 / 42601, the pH of a culture concentrate containing an HMG-CoA reductase inhibitor is adjusted to 4.5 to 7.5 (preferably 5.5 to 7.5) using an acid. Thereafter, extraction is performed using ethyl acetate.
[0070]
The pravastatin thus obtained is collected from the above extract according to a conventional method. For example, after washing the extract with water, saturated saline, etc., sodium hydroxide is added and extracted and separated to obtain an aqueous solution of pravastatin salt as a back-extracted aqueous layer. The obtained pravastatin salt can be crystallized if desired.
[0071]
The crystallization performed as desired is generally performed by a method known in the art of organic synthetic chemistry, for example, the method described in Ullmann's, Encyclopedia of Industrial Chemistry "Vol. A24, 5th edition (1993), pp. 437-505. Can be done as follows.
[0072]
As a method of crystallization, for example, pravastatin is obtained as a crystal by adding an organic solvent and water to a composition of the obtained pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, dissolving by heating, and inoculating. Can do.
[0073]
Examples of the organic solvent used for crystallization include aliphatic hydrocarbons such as hexane and heptane; aromatic hydrocarbons such as toluene and xylene; methyl acetate, ethyl acetate, n-propyl acetate, and n Esters such as butyl; organic acids such as acetic acid; methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, t-butanol, isoamyl Alcohols such as alcohol, diethylene glycol, glycerin and octanol; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; ethers such as diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, dimethoxyethane and diethylene glycol dimethyl ether; formamide , Dimethylformamide, dimethylacetate Amides, amides such as hexamethylphosphoric triamide; sulfoxides such as dimethyl sulfoxide; mixed solvents of water and one or more of the above organic solvents; preferably water and one or more of the above organic A solvent mixture with a solvent, more preferably a mixed solvent of water and one or more organic solvents selected from alcohols, esters and ketones, most preferably water, It is a mixed solvent of alcohols and esters.
[0074]
In the isolation / purification method of the present invention, a culture concentrate is obtained according to a conventional method as described above, and then the formula CH is used instead of ethyl acetate._ThreeCO₂Extraction is performed using an organic solvent having R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms).
[0075]
In the above formula, “alkyl group having 3 or more carbon atoms” in the definition of R is, for example, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, s-butyl, t-butyl, pentyl, isopentyl, 2-methylbutyl, neopentyl. 1-ethylpropyl, hexyl, isohexyl, 4-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-methylpentyl, 1-methylpentyl, 3,3-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 1,1-dimethylbutyl 1,2-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl groups, preferably a straight chain having 3 to 6 carbon atoms Or a branched alkyl group, preferably C_Three-C_FourAn alkyl group, most preferably an n-propyl or n-butyl group.
[0076]
Further, the isolation / purification method of the present invention is a method for decomposing pravastatin impurities using an inorganic acid and / or decomposing impurities using an inorganic base in the pravastatin isolation / purification method as described above. It is characterized by performing the process to do.
[0077]
When performing the step of decomposing the impurities of pravastatin using an inorganic acid and the step of decomposing the impurities using an inorganic base, the desired steps can be performed in any order in the isolation / purification method. Specific examples of such isolation / purification methods include, for example,
(A) In the step of extracting pravastatin from a culture concentrate containing pravastatin produced by a fungus using an organic solvent, as an organic solvent,
Formula CH_ThreeCO₂R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms)
A method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, characterized by performing a step of decomposing impurities using an inorganic acid, using a solvent having
(B) In the step of extracting pravastatin using an organic solvent from a culture concentrate containing pravastatin produced by a fungus,
Formula CH_ThreeCO₂R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms)
A method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, characterized by performing a step of decomposing impurities using an inorganic base, using a solvent having
(C) In the step of isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, the step of decomposing impurities using an inorganic acid and the step of decomposing impurities using an inorganic base are performed in any order. A method for isolating and purifying pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof,
(D) In the step of extracting pravastatin using an organic solvent from a culture concentrate containing pravastatin produced by a fungus,
Formula CH_ThreeCO₂R (wherein R represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms)
A pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof, characterized by performing a step of decomposing impurities using an inorganic acid, and a step of decomposing impurities using an inorganic base Isolation / purification method
Can be mentioned.
[0078]
The step of decomposing the impurities of pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof with an inorganic acid is carried out in the presence or absence (preferably in the presence of an inert solvent) of pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof. The reaction is performed under conditions for imparting pH 2 to 5 (preferably pH 3 to 4).
[0079]
The “inorganic acid” used in the inorganic acid decomposition of impurities is not particularly limited as long as it is an inorganic substance usually used as an acid. For example, hydrobromic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, perchloric acid, phosphoric acid Inorganic acids such as nitric acid can be mentioned, and phosphoric acid or sulfuric acid is preferred.
[0080]
Although the reaction temperature and the reaction time depend on the pH value, basically, the reaction time needs to be increased if the reaction temperature is low, and the reaction time needs to be shortened if the reaction temperature is high. The treatment is carried out at 20 to 80 ° C. (preferably 40 to 60 ° C.) for 1 minute to 6 hours (preferably 5 to 20 minutes).
[0081]
The “inert solvent” used in the inorganic acid decomposition of impurities is not particularly limited as long as it is usually used as a solvent. For example, methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol Alcohols such as alcohol, n-butanol, isobutanol, t-butanol, isoamyl alcohol, diethylene glycol, glycerin, octanol, cyclohexanol, methyl cellosolve; water; water and the above organic solvents A mixed solvent of water or water and the above organic solvent, and most preferably a mixed solvent of water or water and ethanol.
[0082]
After completion of the reaction, the target compound pravastatin is collected from the reaction solution according to a conventional method. For example, it can be obtained by adding an organic solvent immiscible with water, such as ethyl acetate, separating the organic layer containing the target compound, washing with water or the like, and distilling off the solvent. If necessary, add activated carbon to remove the color, filter to remove the activated carbon, add a reagent that forms a salt such as sodium hydroxide, sodium methoxide, or sodium ethoxide, and concentrate under reduced pressure using a rotary evaporator. Thus, pravastatin salt can be obtained.
[0083]
The step of decomposing the impurities of pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof with an inorganic base is carried out by subjecting pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof in the presence or absence (preferably in the presence) of an inert solvent. , Under conditions for imparting pH 10-14 (preferably, pH 11-13).
[0084]
The “inorganic base” used in the inorganic base decomposition of impurities is not particularly limited as long as it is an inorganic substance used as a base in a normal reaction. For example, an alkali such as lithium carbonate, sodium carbonate, or potassium carbonate is used. Metal carbonates; alkali metal bicarbonates such as lithium hydrogen carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate; alkali metal hydrides such as lithium hydride, sodium hydride, potassium hydride; lithium hydroxide, hydroxide Examples include alkali metal hydroxides such as sodium and potassium hydroxide; alkali metal alkoxides such as lithium methoxide, sodium methoxide, sodium ethoxide, and potassium t-butoxide. Hydroxides, most preferably sodium hydroxide.
[0085]
Although the reaction temperature and the reaction time depend on the pH value, basically, the reaction time needs to be increased if the reaction temperature is low, and the reaction time needs to be shortened if the reaction temperature is high. , And -10 ° C to 110 ° C (preferably 0 ° C to 100 ° C) for 15 minutes to 60 hours (preferably 30 minutes to 72 hours). It is around 30 hours at around 0 ° C.
[0086]
The “inert solvent” used in the inorganic base decomposition of impurities is not particularly limited as long as it is inert to this reaction, but the same inert solvents used in the inorganic acid decomposition of impurities can be exemplified. be able to.
[0087]
After completion of the reaction, the target compound pravastatin is collected from the reaction solution according to a conventional method. For example, it can be obtained by adding an acid such as an aqueous sulfuric acid solution, adding an organic solvent immiscible with water such as ethyl acetate, separating the organic layer containing the target compound, washing with water, and distilling off the solvent. It is done. If necessary, add activated carbon to remove the color, filter to remove the activated carbon, add a reagent that forms a salt such as sodium methoxide, sodium ethoxide, or sodium hydroxide, and concentrate under reduced pressure using a rotary evaporator. Thus, pravastatin salt can be obtained.
[0088]
Furthermore, the isolation / purification method of the present invention may include a step of crystallizing the obtained pravastatin salt, and the method of crystallizing can be performed according to a conventional method as described above.
[0089]
The analysis of the degree of purification of the present invention can be performed via high performance liquid chromatography (HPLC). HPLC measurement conditions are:
A: Mobile phase: 20% acetonitrile, 30% methanol, 50% TEAP buffer (0.3% Triethylamine-H_ThreePO_Four(PH 3.2));
Detection wavelength: UV 238 nm;
Column: Waters reverse phase column Symmetry C18 3.5 μm, φ4.6 mm × 15 cm;
Flow rate: 1ml / min
B: Mobile phase: Methanol: Water: Acetic acid (100): Triethylamine mixture (600: 400: 1: 1);
Detection wavelength: UV 238 nm;
Column: Elma Optics column ERC-ODS-1262 φ6mm × 10cm;
Column temperature: 30 ° C;
Flow rate: 1ml / min
C: mobile phase: methanol: water: acetic acid (100): triethylamine mixed solution (450: 550: 1: 1);
Detection wavelength: UV 238 nm;
Column: BECKMAN column ULTRASPHERE ODS φ4.6 mm × 15 cm 5 μm;
Column temperature: 25 ° C;
Flow rate: 1.3ml / min
It is.
[0090]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.
[0091]
【Example】
Example 1 Acetic acid from culture concentrate n- Extraction with butyl
(1a) Concentration of culture solution
After completing the conversion culture, 10 L of pravastatin culture solution was adjusted to pH 12 with sodium hydroxide, then heated to 50 ° C. and stirred for 30 minutes. After cooling the culture solution to room temperature, 500 g of Celite 545 (trademark) (manufactured by Celite Corporation) was added as a filter aid and filtered. 3 L of water was added to the separated cells, suspended again and filtered. The obtained two concentrates were merged to obtain 10 L of culture concentrate.
(1b) Extraction with n-butyl acetate
The obtained culture concentrate was adjusted to pH 5.7 with 25% sulfuric acid, and 5 L of n-butyl acetate was added and stirred to extract pravastatin. The separated aqueous layer was adjusted to pH 5.7 with 75% sulfuric acid, 5 L of n-butyl acetate was added, and the mixture was stirred and extracted. The obtained two n-butyl acetate layers were combined, and 2 L of saturated brine was added to this and stirred and washed. Add 1 L of water to the 8 L extract obtained by separating the upper layer, add 25% sodium hydroxide to pH 9.5 with stirring, and then separate the aqueous layer to remove pravastatin sodium salt aqueous solution 1 L was obtained. The purity of pravastatin sodium by HPLC (condition A) was 90% or more. From the results of this Example, it is clear that pravastatin sodium of high purity is obtained by using n-butyl acetate.
[0092]
Example 2 Acetic acid from culture concentrate n- Extraction with propyl
The same treatment as in Example 1 was carried out using n-propyl acetate instead of n-butyl acetate to obtain an aqueous sodium salt solution of pravastatin. The purity of pravastatin sodium by HPLC (condition A) was 85% or more. From the results of this Example, it is clear that pravastatin sodium with high purity is obtained by using n-propyl acetate.
[0093]
Example 3 Decomposition of impurities with phosphoric acid
350 ml of ethanol was added to the aqueous solution obtained in Example 1 [compound (I) by HPLC (condition A) / pravastatin sodium was 9.3%], adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid, and stirred at 50 ° C. for 10 minutes. did. Compound (I) / pravastatin sodium was 0.9% by HPLC (condition A). From the results of this Example, it is clear that Compound (I) is remarkably removed by using phosphoric acid.
[0094]
Example 4 Decomposition of impurities with sulfuric acid
The same treatment as in Example 3 was carried out using sulfuric acid instead of phosphoric acid. Compound (I) / pravastatin sodium was 3% by HPLC (condition A). From the results of this Example, it is clear that Compound (I) is remarkably removed by using sulfuric acid.
[0095]
Example 5 Decomposition, extraction and crystallization of impurities with sodium hydroxide
(5a) Decomposition of impurities by sodium hydroxide
Pravastatin culture concentrate 500 ml [compound (I) by HPLC (condition B) / pravastatin sodium 12.1%] was heated to 100 ° C., and then 2 equivalents of sodium hydroxide was added as an aqueous solution (pH 11.3). The mixture was stirred at 100 ° C. for 3 hours, cooled, and adjusted to pH 8.5 with a 20% aqueous sulfuric acid solution at room temperature to obtain an alkali treatment solution with sodium hydroxide (content of pravastatin sodium: 56.6 g). Compound (I) / pravastatin sodium was 0.41% by HPLC (condition B). From the results of this Example, it is clear that Compound (I) is remarkably removed by using sodium hydroxide.
(5b) Extraction and crystallization after decomposition of impurities with sodium hydroxide
The aqueous layer was separated in the same manner as in Example (1b) using n-butyl acetate in 260 g of the alkali treatment solution obtained in (5a) with sodium hydroxide (content of pravastatin sodium: 19 g). A sodium salt aqueous solution was obtained.
[0096]
The obtained aqueous sodium salt solution of pravastatin was concentrated to about 1/2 volume under reduced pressure, 77 ml of water was added, and the mixture was concentrated again under reduced pressure. Adjust the volume of the concentrate to 6 times that of pravastatin free body, adjust the volume with water, cool to 0-5 ° C, add 20% aqueous sulfuric acid dropwise to form pravastatin free body crystals at pH 4.6. It precipitated and it filtered, after stirring overnight. The crystals were washed with cold dilute sulfuric acid (pH 4) to obtain pravastatin free body wet crystals.
[0097]
63 ml of ethyl acetate was added to pravastatin free-humidity product, dissolved at room temperature, adjusted to pH 4.5 with 20% sulfuric acid aqueous solution while stirring at room temperature, and after extraction with stirring, 21 ml of water was added to the ethyl acetate layer and washed. After liquid separation. After adding 25 ml of ethanol to the extracted and washed ethyl acetate layer, the solution was adjusted to pH 8.7 with 6% sodium hydroxide / ethanol solution while stirring at room temperature to obtain a sodium chloride solution. Thereafter, crystallization was carried out according to a conventional method to obtain 8.95 g of pravastatin sodium salt crystals. The purity of pravastatin sodium salt obtained by this method by HPLC (condition C) was 99.67%, and Compound (I) / pravastatin sodium = 0.1%.
[0098]
From the results of this example, it is clear that the compound (I) is remarkably removed by the impurity decomposition step using sodium hydroxide and the extraction step using n-butyl acetate.
[0099]
Example 6 Acetic acid n - Extraction with butyl, decomposition of impurities with phosphoric acid, and crystallization
To the acid treatment solution obtained in Example 3, 25% sodium hydroxide was added to adjust the pH to 12, and stirring was continued at 50 ° C. for 30 minutes. The solution was concentrated to 1 L with a rotary evaporator under reduced pressure to obtain a concentrated solution containing pravastatin sodium salt. After adjusting the obtained concentrated solution to pH 4.0 with sulfuric acid, pravastatin was extracted with 0.5 L of ethyl acetate, and the extract was washed with 0.2 L of water. Add 5 g of activated carbon to the extract, leave it for 10 minutes, filter with filter paper, adjust the filtrate to pH 8.7 with 25% sodium hydroxide, and dry to dryness with a rotary evaporator under reduced pressure to 50 g of pravastatin. The sodium salt was obtained. Crystallization was conducted according to a conventional method to obtain 34 g of crude crystals of pravastatin sodium salt. The crude crystals were recrystallized using a solvent having the same composition to obtain 32 g of pure crystals of pravastatin sodium salt.
[0100]
The purity of pravastatin sodium salt obtained by this method by HPLC (condition A) was 99.7% or more, and Compound (I) / pravastatin sodium = 0.1%.
[0101]
From this example, it is clear that compound (I) was removed to 0.1% or less by extraction with n-butyl acetate and decomposition of impurities with phosphoric acid to obtain pravastatin sodium of high purity.
[0102]
Furthermore, compound (I) was further removed by adding an impurity decomposition step with sodium hydroxide to the extraction step with n-butyl acetate and the impurity decomposition step with phosphoric acid, and high purity pravastatin sodium was obtained. Is clear.
[0103]
Example 7 Decomposition of impurities with sodium hydroxide, decomposition with sulfuric acid and crystallization
Extraction was performed from the alkali-treated solution with sodium hydroxide obtained in Example (5a) using ethyl acetate in the same manner as in Example (5b) to obtain an aqueous sodium salt solution of pravastatin. 350 ml of ethanol was added to the obtained aqueous solution, adjusted to pH 1.5 with sulfuric acid, and stirred at 20 ° C. for 1 hour. Crystallization was performed according to a conventional method to obtain pure crystals of pravastatin sodium salt. According to HPLC (condition C), compound (I) / pravastatin sodium was 0.1% or less.
[0104]
From this example, the compound (I) was removed to 0.1% or less by the decomposition of impurities with sulfuric acid and the decomposition of impurities with sodium hydroxide, and high-purity pravastatin sodium was obtained.
[0105]
Comparative Example 1
Extraction of pravastatin with ethyl acetate
The same treatment as in Example (1a) was carried out using ethyl acetate instead of n-butyl acetate to obtain an aqueous sodium salt solution of pravastatin. The purity of pravastatin sodium by HPLC (condition A) was about 70%.
[0106]
Compound (I) / pravastatin sodium (%) in the case where the organic solvent for extracting pravastatin from the culture concentrate is ethyl acetate, n-propyl acetate, and n-butyl acetate is as follows. From the following results, it is clear that pravastatin with high purity is obtained by extraction with n-propyl acetate and n-butyl acetate rather than extraction with ethyl acetate.
[0107]
[Table 1]

[0108]
【The invention's effect】
The purification method of the present invention does not use a complicated and low-productivity method such as column chromatography, and is not suitable for industrial production. Pravastatin or a pharmacologically acceptable salt thereof could be obtained.
[0109]
Further, the compound (I) was removed to an amount of 0.1% or less with respect to pravastatin by the isolation / purification method of the present invention.

Claims (4)

Extracting pravastatin from a culture concentrate containing pravastatin produced by a fungus using an organic solvent having the formula CH ₃ CO ₂ R (wherein R represents an alkyl group having 3 or 4 carbon atoms) The general formula (I) which is an impurity

Step the compound is treated with an inorganic acid having a step of treating a compound having the general formula is a impurity (I) with an inorganic base, and, by performing the step of performing crystallization of pravastatin sodium salt, formula (I ) Is removed to an amount of 0.1% by weight or less with respect to pravastatin sodium, wherein pravastatin sodium is isolated and purified [provided that the ammonium salt of pravastatin (amine salt and ammonia And a method for isolating and purifying pravastatin sodium including a step of purifying the ammonium salt . ] The method for isolating and purifying pravastatin sodium according to claim 1 , wherein the inorganic acid is phosphoric acid. The method for isolating and purifying pravastatin sodium according to claim 1 or 2 , wherein the pH of the step of treating with an inorganic acid is 2 to 5. The method for isolating and purifying pravastatin sodium according to any one of claims 1 to 3 , wherein R is an n-propyl group or an n-butyl group.