JP5076104B2 - アレルギー体質改善剤 - Google Patents

Description

本発明は、食品又は医薬として有用なアレルギー体質改善剤に関する。

従来、アレルギー疾患の予防あるいは治療には、ステロイド剤、抗ヒスタミン剤、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、免疫抑制剤等の薬剤が用いられてきた。また、加水分解されたグルコマンナンやガラクトマンナンが、腸内においてアレルゲンや微生物の取り込みを減少させる効果を有することが報告されている（特許文献１）。しかしながら、これらはいずれもアレルギー症状の発症を抑えるもの、あるいはアレルギー症状を緩和させるものであり、アレルギー体質を改善するものではなかった。

これに対して、ＩｇＥ抗体の産生を抑制するような薬剤は、アレルギー体質を改善するものとして期待され、トシル酸スプラタスト、ストリクチニン等の化合物が見出されている。しかしながら、トシル酸スプラタスト等の化合物には副作用等の問題がある。一方、グルコマンナンやこれの粉砕処理物に、ＩｇＥ産生抑制作用があることも報告されているが（特許文献２）、効果が不十分であり、微細加工に特殊な装置や技術を要し、かつ作用発現までに時間を要していた。これに鑑み、本願発明者らは、水溶性食物繊維の加水分解物にＩｇＥ産生抑制作用があることを報告している（特許文献３）。

一方、硫酸化多糖類には、保湿作用があること（特許文献４）、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質の産生を亢進する作用があること（特許文献５）等が報告されている。
しかしながら、グルコマンナン等の中性多糖類の硫酸化物に、ＩｇＥ産生抑制作用があることはこれまでに報告されていない。
特表２００３−５１３８９３号公報 特開２００３−０５５２３３号公報 特開２００５−１４５８３１号公報 特開平１１−１８０８２１号公報 特開２００２−２２６３８０号公報

本発明は、優れたアレルギー体質改善作用を有し、且つ安全で摂取しやすい、アレルギー体質改善剤を提供することに関する。

本発明者らは、ＩｇＥ産生抑制作用を有する素材に関して検討した結果、中性多糖類を多硫酸化した場合に優れたＩｇＥ産生抑制作用が発揮され、当該硫酸化物がアレルギー体質改善のための食品又は医薬として有用であることを見出した。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（４）を提供するものである。
（１）中性多糖類の硫酸化物又はその塩を有効成分とするアレルギー体質改善剤。
（２）中性多糖類の硫酸化物又はその塩を有効成分とするＩｇＥ産生抑制剤。
（３）中性多糖類がグルコマンナン又はセルロースである前記（１）のアレルギー体質改善剤又は（２）のＩｇＥ産生抑制剤。
（４）中性多糖類の硫酸化物又はその塩を含有するアレルギー体質改善食品。

本発明の中性多糖類の硫酸化物又はその塩は、ＩｇＥ産生抑制作用を有することから、Ｉ型アレルギーを発症しやすい人の体質改善に有効である。また、原料である中性多糖類は安価で入手しやすく日常的に食されていることから、本発明品も安全性が高く、高齢者から乳幼児に至るまで、安全で摂取しやすい食品又は医薬品となり得る。

本発明の中性多糖類の硫酸化物とは、中性多糖類を多硫酸化した硫酸化物を意味する。中性多糖類としては、例えばデンプン、セルロース、グアガム、アラビアガム（アラビノガラクタン）、キサンタンガム、グルコマンナン、寒天アガロース、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、プルラン、マンナン、グルカン等のＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロース等を構成単糖とする多糖類が挙げられ、このうち、ＩｇＥ産生抑制効果の点からグルコマンナン、セルロース、デンプン等が好ましく、コンニャクグルコマンナン、セルロースがより好ましい。
斯かる中性多糖類は、硫酸化されることにより水溶性が大幅に向上し、例えばセルロースのように、水に難溶性の中性多糖類であっても水溶性となり、優れたＩｇＥ産生抑制効果が得られる。

本発明の中性多糖類の硫酸化物の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩、アミン塩等が挙げられる。

本発明の中性多糖類の硫酸化物が含有する硫酸基の数としては、繰り返し糖単位当たり平均０．１〜３．０個、好ましくは平均０．２〜２．０個である。

本発明の中性多糖類の硫酸化物又はその塩の平均分子量は、０．５万〜３００万程度であることが望ましく、好ましくは、０．５万〜１０万程度であることが望ましい。

中性多糖類に硫酸基を導入する方法としては、公知の方法、例えば中性多糖類と硫酸化剤を適当な溶媒（例えば、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）中、加温下で反応させる方法が挙げられる。硫酸化剤としては、例えば、三酸化イオウ−ＤＭＦ錯体、三酸化硫黄−ピリジン錯体、三酸化硫黄−トリメチルアミン錯体、クロルスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−硫酸、無水硫酸−ジメチルホルムアミド錯体等が挙げられる。中性多糖類の硫酸化率は、硫酸化剤の使用割合及び反応条件を適宜選択することにより調整することができる。一般に、多糖類１重量部に対して硫酸化剤が０．５〜３質量部となるような割合で使用するのが好ましい。

得られた中性多糖類の硫酸化物又はその塩の精製は、例えば、透析による脱塩、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの分子サイズによる分画、有機溶媒を添加して沈殿させることによる回収操作、凍結乾燥による回収操作等を用いて行えばよい。

斯くして得られた中性多糖類の硫酸化物又はその塩は、水溶性が高く、後記実施例に示すようにＩｇＥ産生抑制作用を有することから、ＩｇＥ産生抑制剤として、またアトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎等のＩ型アレルギーを発症しやすい人の当該アレルギー体質を改善するためのアレルギー体質改善剤として、食品、医薬品等の形態で使用できる。

本発明のアレルギー体質改善剤、ＩｇＥ産生抑制剤を医薬品として用いる場合、経口投与剤、非経口投与剤のいずれの製剤にもすることができ、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末剤等の固形製剤、シロップ剤、エリキシル剤等の液状製剤の他、注射剤、坐剤、吸入剤（スプレー）、点眼、外用剤とすることができる。

斯かる製剤は、中性多糖類の硫酸化物又はその塩を常法に従って薬学的に許容される担体と共に種々の剤型とすればよい。例えば、経口用固形製剤を調製する場合には、中性多糖類の硫酸化物又はその塩に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。また、注射剤とする場合は、担体として、例えば水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール等の各種希釈剤、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、更に溶解補助剤、無痛化剤、局所麻酔剤等を適宜添加し、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤とすればよい。

本発明のアレルギー体質改善剤、ＩｇＥ産生抑制剤を健康食品、保健機能食品等の食品とする場合には、ビスケット類、チョコレート類、キャンデー類、チューインガム類、スナック菓子類、油菓類、アイスクリーム類、ゼリー菓子等の菓子、パン類、めん類、豆腐等の大豆加工品、ヨーグルト、バター等の乳製品、ソース、ドレッシング、マヨネーズ、ふりかけ等の調味料、発酵乳、果汁飲料、スポーツドリンク、スープ等の飲料の形態とすることができる。
尚、斯かる食品には、さらに、一般にアレルギーに効果があるとされる、茶、紫蘇、甜茶、月見草、タンポポ、柿葉、よもぎ、柑橘類等を配合しても良い。

上記アレルギー体質改善剤又はＩｇＥ産生抑制剤の１日当たりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、中性多糖類の硫酸化物又はその塩として通常成人１日当たり約３０ｍｇ〜３０ｇ、好ましくは約１００ｍｇ〜３ｇとすれば良く、これを１日１回又は２〜４回程度に分けて投与するのが好ましい。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１：硫酸化コンニャクグルコマンナンのＩｇＥ産生抑制効果
（１）コンニャクグルコマンナン加水分解物の調製
コンニャクグルコマンナン（清水化学（株）製）２００ｍｇを蒸留水１７．５ｍＬに懸濁し、室温で１時間振盪してゲルを調製した。これに塩酸を終濃度０．２５Ｎとなるように加えて７５℃の水浴中で１時間振盪した。室温に戻し水酸化ナトリウムを添加して塩酸を中和し、さらに０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を０．５ｍＬ添加して溶液のｐＨを６．５に調整した。得られた加水分解物を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して不溶物を除き、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００ (ＧＥヘルスケアサイエンス社)カラム（２．５×７０ｃｍ）にかけて純水で分画溶出した。得られた画分の全糖をフェノール硫酸法によって測定したところ、溶出液量１７９〜２６０ｍＬの位置にコンニャクグルコマンナンの加水分解物が溶出されることが分かった（図１）。この画分を減圧濃縮器によって濃縮し、この加水分解物の中性糖としての濃度をフェノール硫酸法によって測定した。

（２）コンニャクグルコマンナンの硫酸化
コンニャクグルコマンナン（清水化学（株）製）１００ｍｇ分（１０ｍＬ）に対して１６ｍＬのエタノールを添加し沈殿を得た。これをエタノールで４回、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で４回洗浄した。得られた沈渣にＤＭＦ８００μＬを添加した後、ＤＭＦ１．２ｍＬ中に溶解した三酸化イオウ−ＤＭＦ錯体（ＤＭＦ−ＳＯ₃）（Ｓｉｇｍａ）１９２ｍｇを加え４℃で１晩撹拌して硫酸化した。これに、ＮａＣｌ飽和アセトン６ｍＬを加えて生じた沈殿を回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液２ｍＬに溶かした後、ｐＨを６．５に調整した。図２にＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００カラム（２．５×７０ｃｍ）で分析した場合のクロマトグラムを示す。溶出位置（１４３ｍＬ〜２３３ｍＬ）を回収し、凍結乾燥しコンニャクグルコマンナンの硫酸化物２８ｍｇを得た。このようにして得られた硫酸化コンニャクグルコマンナンの硫酸基の測定は、硫酸カリウム（Ｋ₂ＳＯ₄）を標準として、Ｄｏｄｇｓｏｎ−Ｐｒｉｃｅ比濁法によって行った。フェノール硫酸法による全糖１ｍｇ当たり０．８ｍｇの硫酸基が結合していると見積もられた。

（３）硫酸化コンニャクグルコマンナンのインビトロ抗体産生系におけるＩｇＥ産生抑制効果
Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢、♂）の脾臓をＩＳＣＯＶ培地中でほぐして細胞懸濁液を調製し、さらにＬｙｍｐｈｏｌｉｔｅ−Ｍ（ＣｅｄａｒＬａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた比重遠心分離法によりリンパ球分画を回収した。調製したリンパ球をＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ社、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ−４０抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ社、最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）、及び２−メルカプトエタノール（最終濃度５０ｎＭ）を含むＩＳＣＯＶ培地で２×１０⁶細胞／ｍＬの濃度になるように調整し、９６−ウェルマイクロプレートの各ウェルに１９０μＬずつ分注した。これにＰＢＳ（−）１０μＬ及び硫酸化コンニャクグルコマンナン（１．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ） １０μＬを添加し、炭酸ガス培養器中で７日間培養した。ウェルの培養上清を回収し、培養液中に産生された抗体濃度を測定した。ＩｇＥ濃度の測定は、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＥ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ社）を用い、製品付属の取扱説明書の方法に従って行った。

図３に示すとおり、この条件でのインビトロ 抗体産生系におけるＩｇＥの産生は、（１）に記載した方法で調製したコンニャクグルコマンナン加水分解物を最終濃度で７５、１５０μｇ／ｍＬの濃度で添加した培養では、濃度依存的に抑制された。次いで、上記（１）で調製した硫酸化コンニャクグルコマンナンを同じ濃度で添加した場合には、さらにＩｇＥ産生を強く抑制した。

実施例２：硫酸化セルロースのＩｇＥ産生抑制効果
（１）硫酸化セルロースの調製
濾紙粉末（東洋濾紙（株）製；濾紙粉末Ｃ）１００ｍｇを１０ｍＬのエタノールで１回、１０ｍＬのＤＭＦで４回洗浄し沈渣を回収した。これにＤＭＦ８００μＬを添加した後、ＤＭＦ１．２ｍＬ中に溶解した三酸化イオウ−ＤＭＦ（ＤＭＦ−ＳＯ₃）（Ｓｉｇｍａ）１９２ｍｇを加え４℃で１晩撹拌して硫酸化した。これに、ＮａＣｌ飽和アセトン６ｍＬを加えて生じた沈殿を回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液２ｍＬに溶かした後、ｐＨを６．５に調整した。図４にＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００カラム（２．５×１００ｃｍ）で分析した場合のクロマトグラムを示す。溶出位置（３１３ｍＬ〜４２１ｍＬ）を回収し、凍結乾燥してセルロースの硫酸化物８６ｍｇを得た。このようにして得られた硫酸化セルロースの硫酸基の測定は、硫酸カリウム（Ｋ₂ＳＯ₄）を標準として、Ｄｏｄｇｓｏｎ−Ｐｒｉｃｅ比濁法によって行った。フェノール硫酸法による全糖１ｍｇ当たり０．２６ｍｇの硫酸基が結合していると見積もられた。

（２）硫酸化セルロースのインビトロ 抗体産生系におけるＩｇＥ産生抑制効果
Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢、♂）の脾臓をＩＳＣＯＶ培地中でほぐして細胞懸濁液を調製し、さらにＬｙｍｐｈｏｌｉｔｅ−Ｍ（ＣｅｄａｒＬａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた比重遠心分離法によりリンパ球分画を回収した。調製したリンパ球をＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ社、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ−４０抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ社、最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）、及び２−メルカプトエタノール（最終濃度５０ｎＭ）を含むＩＳＣＯＶ培地で２×１０⁶細胞／ｍＬの濃度になるように調整し、９６−ウェルマイクロプレートの各ウェルに１９５μＬずつ分注した。これにＰＢＳ（−）１０μＬ及び硫酸化セルロース（０．４ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ/ｍＬ） ５μＬを添加し、炭酸ガス培養器中で７日間培養した。培養後、ウェルの培養上清を回収し産生された抗体濃度を測定した。ＩｇＥ濃度の測定は、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＥ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ社）を用い、製品付属の取扱説明書の方法に従って行った。上記（１）で調製した硫酸化セルロースを最終濃度で１０及び１００μｇ／ｍＬの濃度で添加した培養では、培地中に産生されたＩｇＥはコントロールに比べ有意に低下していた（図５）。元々のセルロース粉末は水溶性ではなく、ＩｇＥ産生抑制効果も認められない。このことは、セルロースを硫酸化することによって、原料のセルロースには存在しないＩｇＥ産生抑制効果を付与することができることを示している。
図６には、実施例１及び実施例２と同様の方法で調製した硫酸化コンニャクグルコマンナン、硫酸化セルロースを用いて、同様にインビトロ抗体産生系におけるＩｇＥ産生抑制効果を調べた結果を示す。ここでは、インビトロ抗体産生系に添加したコンニャクグルコマンナン加水分解物、硫酸化コンニャクグルコマンナン、硫酸化セルロースの最終濃度は、それぞれ１０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬとした。図５に示す結果同様に、これらの硫酸化物はインビトロでＩｇＥ産生を抑制することが確認できた。

実施例３ ケラチノサイト抽出物によるＩｇＥ産生系に対する硫酸化コンニャクグルコマンナンの効果
アトピー性皮膚炎に伴い肌のかゆみがおこり、それを掻くことにより症状が悪化し、またかゆみが増大するという悪循環が見られる。この現象から、皮膚を掻くことによって、破壊された角化細胞（ケラチノサイト）が症状の悪化の原因であることが考えられる。ケラチノサイト（ＰＡＭ−２１２細胞）の抽出物をＢａｌｂ/ｃマウスに投与することによって、血中ＩｇＥ産生が刺激されることが明らかにされている。また、Ｂａｌｂ/ｃマウスの脾臓細胞を用いたインビトロＩｇＥ産生系にＰＡＭ−２１２細胞抽出物を添加することによって顕著にＩｇＥ産生が亢進することが明らかにされている（Yamamoto T, Kaneko S et al, (2002) Increase in serum IgE levels following injection of syngeneic keratinocyte extracts in BALB/c mice. Arch Dermatol Res 294: 117-23、森本謙一、他．マウス角化細胞株由来IgE産生増強因子のIgEクラススイッチに及ぼす影響．アレルギー51(9・10), 992(抄), 2002）。そこで、ケラチノサイト抽出物によるインビトロＩｇＥ産生系を用いて、ＩｇＥ産生亢進に対する硫酸化コンニャクグルコマンナンのＩｇＥ産生抑制効果を調べた。

（１）硫酸化コンニャクグルコマンナンのインビトロ 抗体産生系におけるＩｇＥ産生抑制効果
Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢、♂）の脾臓をＩＳＣＯＶ培地中でほぐして細胞懸濁液を調製し、さらにＬｙｍｐｈｏｌｉｔｅ−Ｍ（ＣｅｄａｒＬａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた比重遠心分離法によりリンパ球分画を回収した。調製したリンパ球をＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ社、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ−４０抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ社、最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）、及び２−メルカプトエタノール（最終濃度５０ｎＭ）を含むＩＳＣＯＶ培地で２×１０⁶細胞／ｍＬの濃度になるように調整し、９６−ウェルマイクロプレートの各ウェルに１８０μＬずつ分注した。これにケラチノサイト抽出物１０μＬ及びコンニャクグルコマンナン加水分解物１０μＬを添加し、炭酸ガス培養器中で7日間培養した。硫酸化コンニャクグルコマンナンは実施例１（２）と同様にして調製した。培養後、各ウェルの培養上清を回収し、産生されたＩｇＥ抗体の濃度を測定した。ケラチノサイト抽出物の添加によりインビトロＩｇＥ産生量は増加した。これにコンニャクグルコマンナン加水分解物を最終濃度で７５、１５０μｇ／ｍＬの濃度で添加した培養では、有意なＩｇＥ産生抑制が認められなかったのに対し、硫酸化コンニャクグルコマンナンでは同濃度において強いＩｇＥ産生抑制効果を示した（図７）。

コンニャクグルコマンナン加水分解物の分子量分布図。 硫酸化コンニャクグルコマンナンの分子量分布図。 硫酸化コンニャクグルコマンナンのＩｇＥ産生抑制効果を示したグラフ。KGM：コンニャクグルコマンナン加水分解物、KGM-SO4：硫酸化コンニャクグルコマンナン。 硫酸化セルロースの分子量分布図。 硫酸化セルロースのＩｇＥ産生抑制効果を示したグラフ。celllose-SO4:硫酸化セルロース。 硫酸化コンニャクグルコマンナン、硫酸化セルロースのＩｇＥ産生抑制効果を示したグラフ。KGM：コンニャクグルコマンナン加水分解物、KGM-SO4：硫酸化コンニャクグルコマンナン、celllose-SO4:硫酸化セルロース。 マウス表皮細胞抽出物により誘起されるＩｇＥ産生に対する硫酸化コンニャクグルコマンナンの抑制効果を示したグラフ。KGM：コンニャクグルコマンナン加水分解物、KGM-SO4：硫酸化コンニャクグルコマンナン。

Claims (2)

1. グルコマンナン及びセルロースから選ばれる中性多糖類の硫酸化物又はその塩を有効成分とするアレルギー体質改善剤。
2. グルコマンナン及びセルロースから選ばれる中性多糖類の硫酸化物又はその塩を有効成分とするＩｇＥ産生抑制剤。