JP5080407B2 - 細胞培養担体 - Google Patents

Description

本発明は、３次元的な細胞の培養が可能な細胞培養担体に関する。

近年、細胞培養技術の向上に伴って、細胞が産生するアミノ酸やタンパク質などを用いた医薬品の開発、更には、細胞自身を患部に移植する再生医療などが行われるようになり、状態が良い細胞が大量に必要とされるようになってきた。このため、様々な細胞を生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で効率的に培養する方法が検討されている。しかし、これらの研究の多くは、ゼラチンなどをコーティングしたシャーレやフラスコ上などの２次元的な環境で行われている。

近年、３次元構造を持たせたバイオマテリアルで細胞を培養すると、細胞の生存率や物質生産効率が向上する傾向があることが示されつつある。このため、３次元培養法が注目を集めている。以上のような現状から、今後は、より生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）環境に酷似した３次元構造を備えたバイオマテリアルの開発が重要になると考えられる。

このようなバイオマテリアルとしては、ガラス等の無機材料、ステンレス綱等の金属材料、合成樹脂、ゴム等からなる基板表面上に、細胞を凝集化させて保持するための、アレイ状やハニカム状に規則的に配列された細胞培養セル（本願でいう凹部）を備えた細胞培養チップが開示されている（例えば、特許文献１）。

また、細胞培養担体に１より大きい比重を有する比重調整物質を含めることによって、細胞培養中に細胞培養担体が浮くことがなく、かつ、細胞を良好に培養することが可能な細胞培養担体が開示されている（例えば、特許文献２）。
特開２００５−２７５９８号公報 特開２００７−１７４９８９号公報

しかしながら、特許文献１に記載されているように、細胞培養担体の素材として高分子や金属材料等を用いると、細胞培養担体全域にわたって緻密質構造になるため、撒種した細胞が凹部内に接着されずに浮いてしまうため、細胞が凹部内に安定して接着されないという課題を有していた。

また、特許文献２に記載の技術はこのような課題を解決するものであるが、これによって、細胞が細胞培養担体表面に接着されてしまうため、細胞の成長方向が上方のみとなってしまい、３次元的な培養としては限界があるものであった。

本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、凹部内で細胞を安定して接着させることができ、かつ、より３次元的に細胞を培養することができる細胞培養担体を提供することを目的とする。

本発明に係る細胞培養担体は、緻密体で構成された第１の基材と、前記第１の基材上に積層され、前記積層された積層方向に開口部を備える凹部が前記第１の基材の表面と平行な方向に複数設けられた第２の基材と、を備え、前記凹部は、前記第１の基材で構成された底部と、前記第２の基材で構成され、少なくともその表面が多孔体である側部と、で構成されていることを特徴とする。

このような細胞培養担体を用いることで、凹部内で細胞を安定して接着させることができ、かつ、より３次元的に細胞を培養することができる。

前記凹部の幅が１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、深さが１０μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。

通常、細胞のサイズは１０〜２０μｍであることから、凹部（マイクロウェル部）で細胞が選択的に接着・増殖することを考慮すると、径・深さともに１０μｍ以上であることが好ましい。

前記第２の基材は、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、ハイドロキシアパタイトおよびβ−リン酸三カルシウムのうちのいずれか１種のセラミックスで構成されていることが好ましい。

このような構成を備えることで、細胞に害がなく、細胞を培養することができる。

前記第１の基材は、セラミックス、ガラス、有機物のうちいずれか１種の透明部材で構成されていることが好ましい。

このような構成を備えることで、第１の基材の裏面側から凹部内で細胞が培養される様子を逐次観察することができるため好ましい。

本発明は、凹部内で細胞を安定して接着させることができ、かつ、より３次元的に細胞を培養することができる細胞培養担体が提供される。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。

図１は、本発明の実施形態に係る細胞培養担体の外観構成の一例を示す上面図であり、図２は、図１のＡ−Ａ線における断面図である。

本実施形態に係る細胞培養担体１は、図１及び図２に示すように、緻密体で構成された第１の基材２と、第１の基材２上に積層された第２の基材３とを備えている。

第２の基材３には、前記積層された積層方向（図２中、α）に開口部４を備える凹部５が設けられ、凹部５は第１の基材２の表面２Ａと平行な方向（図２中、β）に複数設けられている。

また、凹部５は、第２の基材３の開口部４から、第１の基材２の表面２Ａまで積層方向αと反対の方向に貫通した構成を備えており、第１の基材２で構成された底部５Ａと、前記第２の基材３で構成された側部５Ｂとを備えている。また、側部５Ｂの少なくともその表面は多孔体で構成されている。

本実施形態に係る細胞培養担体１は、上述したような構成を備えているため、凹部５内に投入された細胞は、緻密体で構成された底部５Ａには接着されず浮いた状態となり、一方、少なくとも表面が多孔体で構成された側部５Ｂに前記細胞が接着される形となるため、結果として、凹部５内に投入された細胞は、凹部５内で浮いた状態で側部５Ｂに保持されることになる。

そのため、本実施形態に係る細胞培養担体１は、凹部５内で細胞を安定して接着させることができると共に、凹部５内で接着された細胞の下方は浮いた状態となっているため、前記下方にも空間の余地が存在する。従って、底部に接着させる従来の細胞培養担体よりも、より３次元的に細胞を培養することができる。

前記第２の基材３全体が３次元的に連通した開気孔を有する多孔体で構成されていることが好ましい。

このような構成とすることで、第２の基材３の側面３Ａから前記開気孔を通じて前記凹部５内に栄養素を供給することが可能となるため、好ましい。

なお、ここでいう多孔体の開気孔の気孔径、気孔同士を連通する連通部の口径及び気孔率は、第２の基材３がその形態を保つことができる程度に十分な強度を有していれば、特に限定されない。

このような場合の気孔径としては、例えば、１００μｍ以上６００μｍ以下であり、連通部の口径としては、例えば、１０μｍ以上６０μｍ以下であり、気孔率としては、例えば、５５％以上８５％以下である。なお、ここでいう開気孔の気孔径は、顕微鏡による観察により測定した平均値である。また、連通部の口径は、水銀圧法で測定した平均値である。気孔率は、多孔体の密度と多孔体の骨格部の密度との理論密度から算出した値である。

前記凹部５の幅が１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、深さが１０μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。

通常、細胞のサイズは１０〜２０μｍであることから、凹部（マイクロウェル部）５で細胞が選択的に接着・増殖することを考慮すると、径・深さともに１０μｍ以上であることが好ましい。

前記第２の基材３は、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、ハイドロキシアパタイトおよびβ−リン酸三カルシウムのうちのいずれか１種のセラミックスで構成されていることが好ましい。

このような構成を備えることで、細胞に害がなく、細胞を培養することができる。

より好ましくは、ハイドロキシアパタイトを用いた方が生体適合性の観点から更に好ましい。

前記第１の基材２は、セラミックス、ガラス、有機物のうちいずれか１種の透明部材で構成されていることが好ましい。

このような構成を備えることで、第１の基材２の裏面側から凹部５内で細胞が培養される状況を逐次観察することができるため好ましい。上述したような細胞培養担体１は、例えば、下記のような方法で製造することができる。第１の基材２を周知の方法によって作製すると共に、第２の基材３を、例えば、下記のような方法にて作製する。すなわち、所望のセラミックス原料粉に、分散媒として、例えば、ポリエチレンイミン水溶液を加え、ボールミルで攪拌混合して原料スラリーを調整し、この原料スラリーに、起泡材として、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテルを添加して攪拌して泡沫状スラリーを調整する。さらに、架橋剤としてソルビトールポリグリシジルエーテルを添加し、混合後、型に鋳込み、ゲル化体を作製する。その後、得られたゲル化体を減圧し、硬化後、型から取り出し、例えば、３０℃、湿度９０％の加湿乾燥器内で一昼夜乾燥させ、成形体（乾燥体）とする。次に、この成形体を、例えば、１２００℃で１時間焼成して、焼結体とした後、得られた焼結体に、凹部５となる複数の貫通孔を形成することによって、第２の基材３を作製する。

最後に、前記作製した第１の基材２と、第２の基材３とを図２に示すような構造となるように積層して接合することによって本実施形態に係る細胞培養担体１を製造することができる。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により限定されるものではない。
（実施例１）
第１の基材２を緻密体の透明ガラスとして、第２の基材３を気孔率５０％〜６０％を有するハイドロキシアパタイト多孔体の焼結体として、それぞれ構成し、幅が４０μｍ、深さが４０μｍである凹部５が複数形成された図１に示すような細胞培養担体１を作製した。

次に、この細胞培養担体１を２４ウェルプレートの穴に入れ、Ｈｅｐ−Ｇ２（ヒト肝ガン細胞）を１．０×１０⁴個撒種し、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum；ウシ胎児血清）を混合したＤＭＥＭを用いて、５％ＣＯ₂インキュベータ内で、３７℃で培養した。

７日間経過後、培養担体上で増殖したＨｅｐ−Ｇ２を、トリプシン処理により剥離し、血球計算板により、細胞数を計測したところ、５．０×１０⁵個であった。また、増殖した細胞を、グルタルアルデヒドで固定処理し、ＳＥＭ観察したところ、凹部５内で、Ｈｅｐ−Ｇ２が細胞凝集体を形成していることが認められた。

さらに、上記において増殖したＨｅｐ−Ｇ２について、免疫測定法により、細胞１．０×１０⁶個当たりのアルブミン量を算出したところ、４００μｇ／日であり、ゼラチンコートディッシュにおいて増殖したＨｅｐ−Ｇ２と比較して、約６倍の物質生産能力を有していることが認められた。
（比較例１）
第１の基材２を気孔率５０％〜６０％を有するハイドロキシアパタイト多孔体の焼結体として構成した以外は、実施例１と同様な細胞培養担体を作製した。

次に、この細胞培養担体を２４ウェルプレートの穴に入れ、Ｈｅｐ−Ｇ２（ヒト肝ガン細胞）を１．０×１０⁴個撒種し、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum；ウシ胎児血清）を混合したＤＭＥＭを用いて、５％ＣＯ₂インキュベータ内で、３７℃で培養した。

７日間経過後、培養担体上で増殖したＨｅｐ−Ｇ２を、トリプシン処理により剥離し、血球計算板により、細胞数を計測したところ、１．０×１０⁵個であった。また、増殖した細胞を、グルタルアルデヒドで固定処理し、ＳＥＭ観察したところ、凹部５内で、Ｈｅｐ−Ｇ２が細胞凝集体を形成していることが認められた。

さらに、上記において増殖したＨｅｐ−Ｇ２について、免疫測定法により、細胞１．０×１０⁶個当たりのアルブミン量を算出したところ、４０μｇ／日であり、ゼラチンコートディッシュにおいて増殖したＨｅｐ−Ｇ２と比較して、物質生産能力は同等程度であることが認められた。

本発明の実施形態に係る細胞培養担体の外観構成の一例を示す上面図である。 図１のＡ−Ａ線における断面図である。

符号の説明

１…細胞培養担体、２…第１の基材、３…第２の基材、４…開口部、５…凹部、５Ａ…底部、５Ｂ…側部。

Claims (4)

1. 緻密体で構成された第１の基材と、
   前記第１の基材上に積層され、前記積層された積層方向に開口部を備える凹部が前記第１の基材の表面と平行な方向に複数設けられた第２の基材と、を備え、
   前記凹部は、前記第１の基材で構成された底部と、前記第２の基材で構成され、少なくともその表面が多孔体である側部と、で構成されていることを特徴とする細胞培養担体。
2. 前記凹部の幅が１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、深さが１０μｍ以上１０００μｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養担体。
3. 前記第２の基材は、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、ハイドロキシアパタイトおよびβ−リン酸三カルシウムのうちのいずれか１種のセラミックスで構成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養担体。
4. 前記第１の基材は、セラミックス、ガラス、有機物のうちいずれか１種の透明部材で構成されていることを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項に記載の細胞培養担体。

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