JP5082099B2

JP5082099B2 - アミロイドβ蛋白凝集制御剤

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Publication number: JP5082099B2
Application number: JP2007501689A
Authority: JP
Inventors: 佳子三浦; 美穂子小池; 芳弘西田; 一清小林
Original assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2005-02-03
Filing date: 2006-02-02
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2026-02-02
Also published as: JPWO2006083019A1; WO2006083019A1

Description

本発明は、アルツハイマー型痴呆症などに関連するアミロイドβ蛋白と相互作用をもつ化合物を含有するアミロイドβ蛋白凝集制御剤、アミロイドβ蛋白異常診断薬及びアミロイドβ蛋白異常診断薬キットに関する。

アミロイドβ蛋白は、アルツハイマー型痴呆症患者の脳に見られる特異的病理変化の１つである、老人斑の、アミロイドコアを形成する主要構成成分で、３９−４３アミノ酸からなるペプチドであり、膜貫通型のアミロイド前駆体蛋白ＡＰＰ（ＡｍｙｌｏｉｄＰｒｏｔｅｉｎＰｒｅｃｕｒｓｏｒ）の酵素分解により生成する（例えば、Ｍｏｒｉ，Ｈ．ら（１９９２年）ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２６７巻１７０８２−１７０８６頁、Ｌａｎｓｂｕｒｙ，Ｐ．Ｔ．，Ｊｒ．（１９９２年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３１巻６８６５−６８７０頁、Ｓｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．ら（１９９０年）Ｓｃｉｃｎｃｅ第２４８巻４９２−４９５頁、Ｍｕｌｌａｎ，Ｍら（１９９３年）Ｔｒｅｎｄｓｉｎｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ第１６巻３９８−４０３頁など参照）。
化学合成したアミロイドβ蛋白を用いた実験から、アミロイドβ蛋白は凝集性が強く（例えば、Ｊａｒｒｅｔ，Ｊ．Ｔ．ら（１９９３年）Ｃｅｌｌ第７３巻１０５５−１０５８頁、Ｂｕｒｄｉｃｋ，Ｄ．ら（１９９２年）ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ第２６７巻５４６−５５４頁、Ｆｒａｓｅｒ，Ｐ．Ｅ．ら（１９９２年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３１巻１０７１６−１０７２３頁など参照）、また凝集したアミロイドβ蛋白は神経細胞に対し、直接細胞毒性を示しえることや興奮性アミノ酸などによる細胞傷害に対する感受性を高めることなどが報告されている（例えば、Ｐｉｋｅ，Ｃ．Ｊ．ら（１９９３年）ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ第１３巻１６７６−１６８７頁、Ｍａｔｔｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．ら（１９９３年）ＴｒｅｎｄｓｉｎＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ第１６巻４０９−４１４頁など参照）。
具体的には、アミロイドβ蛋白の部分ペプチドβ２５−３５（アミノ酸配列ＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭ）が神経細胞毒性を示すこと、及び、β２５−３５の作用点の一つは神経細胞のミトコンドリア電子伝達系であり、細胞のＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）還元能低下作用を測定することにより、細胞毒性の強度を知ることができることが既に報告されている（Ｙａｎｋｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５０，２７９−２８２，１９９０；金子ら、神経化学、３２、１４８−１４９、１９９３）。
さらにはアミロイドβ蛋白の脳内への沈着による老人斑の形成は、アルツハイマー型痴呆症患者脳のもう１つの特徴的病理変化である、神経源線変化よりも早期から出現する病理的変化であることが知られている（例えば、Ｓｅｉｋｏ，Ｄ．Ｊ．（１９９１年）Ｎｅｕｒｏｎ第６巻４８７−４９８頁、Ｒｕｍｂｌｅｒ，Ｂ．ら（１９９８年）ＴｈｅｎｅｗＥｎｇｌａｎｄｊｏｕｒｎａｌｏｆｍｅｄｉｃｉｎｅ第３２０巻１４４６−１４５２頁など参照）。
すなわち、アルツハイマー型痴呆症においてはアミロイドβ蛋白の脳組織中での凝集、沈着が引き金となり、老人斑が形成され、その結果、神経細胞死が惹起され、痴呆症となるとする発症機構が有力である。
従って、アミロイドβ蛋白の凝集および沈着を阻害する薬剤は、アルツハイマー型痴呆症の治療薬及び、予防薬として有用であることが期待される。かかる阻害活性を有する薬物として、リファマイシン類（国際公開第９５／１１２４８号パンフレット）、ハイドロキノン類（特開平８−１９３０２６号公報）、チオナフタレン誘導体類（特開平９−９５４４４号公報）、ピリジン誘導体類（特表２００４−５０６６３３号公報）に関する報告があるが、糖類に関してはアミロイドβ蛋白の凝集およびまたは沈着を阻害する活性を有することは報告されていない。
一方、本来可溶である、アミロイドβ蛋白質が凝集するメカニズムについても研究がするめられている。近年、脳内に豊富に存在する酸性糖脂質のＧＭｌ（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，ＫらＮａｔｕｒｅＭｅｄ．第１巻１０６２−１０６６頁（１９９５年））や硫酸化多糖のヘパリンなど（Ｗａｔｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９７年）ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ第２７２巻３１６１７頁−３１６２４頁）が、アミロイドβ蛋白質の凝集を促進する働きを有することがわかってきた。

本発明者らは、アミロイドβ蛋白凝集の原因となる糖脂質や多糖との相互作用を抑えることでペプチドの凝集を抑制する化合物は、アルツハイマーアミロイドの凝集形成を大きく抑えるとの予測をたて、そのような化合物は病気の発症を抑えるのに有効であると推測した。
そこで、アミロイドβ蛋白の凝集を促す化合物である、糖脂質、多糖との相互作用や、アミロイドβ蛋白間での相互作用を抑制できる化合物を探索した結果、有望な化合物群を発見した。
本発明では、上記実情に鑑み完成されたものであり、糖鎖とアミロイドβ蛋白の相互作用に着目し、人工硫酸化糖鎖を製造し、その人工硫酸化糖鎖によるアミロイドβ蛋白凝集抑制剤の提供を解決すべき課題とする。

本発明者らはアミロイドβ蛋白の凝集及び沈着を阻害する薬剤の可能性を鋭意検討し、アミロイドβ蛋白と相互作用する酸性糖質を模倣した結果、アミロイドβ蛋白の凝集に影響を与える人工硫酸化糖を見出した。この糖（鎖）は、アミロイドβ蛋白と相互作用することで凝集抑制作用を有することを見出し本発明に到達した。
すなわち、本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤は、ＯＨ基のうちの一部乃至全部が、
（ｉ）―ＯＳＯ _３Ｈ又は―ＯＳＯ _３Ｈの塩、並びに、
（ｉｉ）疎水基、
にて置換されており、
残りのＯＨ基の一部乃至全部は、Ｈ、ＮＨ_２、−ＮＨＲ^６及び−ＮＲ^６Ｒ^７（Ｒ^６及びＲ^７はアルキル基及びアセチル基から独立して選択可能な基である。）からなる基により置換可能である、
単糖類又は２以上の単糖類が結合した糖鎖から構成される化学構造で表される化合物を含有することを特徴とする。
また、本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤は、ＯＨ基のうちの一部乃至全部が、−Ｏ−φ−ＮＯ_２（φはフェニレン基）にて置換されており、
残りのＯＨ基の一部乃至全部は、Ｈ、―ＯＳＯ _３Ｈ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^６及びＮＨＲ^６Ｒ^７（Ｒ^６及びＲ^７はアルキル基及びアセチル基から独立して選択可能な基である。）からなる基により置換可能である、
単糖類又は２以上の単糖類が結合した糖鎖から構成される化学構造で表される化合物を含有することを特徴とする。
ここで、本化合物は、化学構造中で含有・結合している単糖類の数により、アミロイドβ蛋白に対する挙動が変化する。化学構造中の単糖類の数が少ない場合にはアミロイドβ蛋白凝集抑制剤として作用する。反対に単糖類の数が多い場合にはアミロイドβ蛋白凝集促進剤として作用する。
本アミロイドβ蛋白凝集制御剤（特に凝集抑制剤）は、アルツハイマー型痴呆症などのアミロイドβ蛋白異常などに対抗して病的状態に移行することを抑制及び／又は治療すること、並びにアミロイドβ蛋白異常診断薬に応用することができると考えられる。そして、アミロイドβ蛋白に対し、凝集促進剤として作用する場合には、主に、アミロイドβ蛋白異常診断薬に好適に応用することができると考えられる。なお、抑制剤から促進剤に変化する単糖類の数は、置換基の種類、数などにより一義的には決定できない。
更に、本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤は、下記一般式（１）で表される化合物を含有することを特徴とする。そのなかで、好適な本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤としては、前記一般式（１）で表される化合物は下記一般式（２）で表される化合物である。本化合物は、置換基の種類、数によるものの、主に、アミロイドβ蛋白凝集抑制剤としての作用を発揮しやすい。
（式（１）中、Ｒ^１〜５は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、−ＮＨＲ^６及び−ＮＲ^６Ｒ^７から選択される基により、それぞれ独立して選択され；Ｒ^１〜５のうちの少なくとも１つは、―ＯＳＯ _３Ｈ、―ＯＳＯ _３Ｈの塩又は−Ｏ−φ−ＮＯ_２（φはフェニレン基）である。；Ｒ^６及びＲ^７はアルキル基及びアセチル基から独立して選択可能な基である。）
前記式（１）中、Ｒ^１〜５のうちの少なくとも１つは―ＯＳＯ _３Ｈ又は―ＯＳＯ _３Ｈの塩であり、Ｒ^１〜５のうちの少なくとも１つは疎水基であることが望ましい。
ここで、前記疎水基は−Ａ（Ｒ^８）_ｎ（ｎは１又は２；ｎ＝１のときＡは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−；ｎ＝２のときＡは−Ｎ；Ｒ^８は、一部水素がニトロ基、ＯＨ基、ビニル基及び／又は−ＮＨＣＯＣＨ_３にて置換可能な、アルキル基、フェニル基、ナフチル基から独立して選択可能な基である。）であることが望ましい。
そして、アミロイドβ蛋白凝集阻害剤として好適な本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤は、前記一般式（２）で表される化合物において、前記Ｒ^１が―ＯＳＯ _３Ｈ又は―ＯＳＯ _３Ｈの塩；前記Ｒ^２及びＲ^３がＯＨ基；前記Ｒ^４が−ＮＨＣＯＣＨ_３；前記ＡがＯである化合物である。
更に、これらのアミロイドβ蛋白凝集制御剤を有効成分とするアミロイドβ蛋白異常診断薬及び診断薬キットを提供することができる。アミロイドβ蛋白凝集促進剤として作用する場合は、凝集を促進することで凝集が速やかに発生するので、発生する凝集を観察などして検知することでアミロイドβ蛋白の異常（量の異常や質の異常）が診断できる。また、アミロイドβ蛋白凝集抑制剤として作用する場合は、凝集したアミロイドβ蛋白の変化を観察（顕微鏡下での観察など）することや、アミロイドβ蛋白との間での相互作用を利用したプローブとしての作用が期待できる。

本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤は新規な原理に基づいて導出された化合物であり、アミロイドβ蛋白凝集に対して新たな視点に基づいて制御することができるものである。

第１図は、実施例における、本発明のアミロイドβ蛋白質凝集抑制剤による、ペプチドの凝集抑制効果とその濃度依存性を示した図である。
第２図は、実施例における、本発明のアミロイドβ蛋白質凝集抑制剤による、ペプチドの凝集抑制効果の経時変化を示した図である。
第３図は、実施例における、本発明のアミロイドβ蛋白質凝集抑制剤による、ペプチドの二次構造の変化を表した図である。
第４図は、実施例における、本発明のアミロイドβ蛋白質凝集抑制剤による、ペプチドの凝集性の変化を示したＴＥＭ写真である。
第５図は、実施例における細胞毒性の評価の結果を示したグラフである。
第６図は、実施例における本発明のアミロイドβ蛋白質凝集抑制剤の効果とその置換基との関係を評価した結果を示したグラフである。

（化学構造）
本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤は単糖類又は２以上の単糖類が結合した糖鎖から構成される化学構造で表される化合物を含有する。単糖類及び糖鎖が有するＯＨ基は、そのうちの幾つかが置換されている。置換基としては、―ＯＳＯ _３Ｈ又はその塩（以下、「―ＯＳＯ _３Ｈなど」と称する）と、疎水基とのいずれか一方を有する。
まず、―ＯＳＯ _３Ｈなどにて１以上のＯＨ基が置換されている場合がある。―ＯＳＯ _３Ｈの塩としてはＮａ、Ｋなど通常の塩が例示でき、溶解性の調整などのために自由に選択することができる。全体のうち、１のＯＨ基を―ＯＳＯ _３Ｈなどにて置換することでも充分に作用を発揮できる。その他、単糖類の単位が１つ又は２つに対して１つずつＯＨ基を―ＯＳＯ _３Ｈなどにて置換することが好適な例として挙げられる。―ＯＳＯ _３Ｈなどにて置換する位置も限定しないが、単糖類又は糖鎖を構成する単糖類の６位のＯＨ基を置換することが合成反応の容易性などの観点から好ましい。
そして、疎水基にて１以上のＯＨ基が置換されている。ここで、疎水基とは一般的な意味で用いており全体として疎水性の基を表している。疎水基としては疎水性が高いものが望ましい。例えば、フェニル基、ナフチル基などの芳香族炭化水素基や、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基などの、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基や、それらが有する水素の一部を必要に応じて（疎水性の調節や、その他の生理活性の付与の目的など）ニトロ基、アミノ基、アシル基などの何らかの特性基にて置換された基でも良い。全体のうち、１のＯＨ基を疎水基にて置換することでも充分に作用を発揮できる。その他、単糖類の単位が１つ又は２つに対して１つずつ疎水基にて置換することが好適な例として挙げられる。疎水基にて置換する位置も限定しないが、単糖類又は糖鎖を構成する単糖類の１位のＯＨ基を置換することが合成反応の容易性などの観点から好ましい。疎水基としては特に−Ｏ−φ−ＮＯ_２（φはフェニレン基）が望ましい。この場合、ニトロ基はパラ位に置換されていることが望ましい。
更に、他のＯＨ基についても、必要に応じ、以下に示す特性基にて置換することができる。例えば、Ｈ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^６及びＮＨＲ^６Ｒ^７である。ここで、Ｒ^６及びＲ^７はアルキル基及びアセチル基から独立して選択可能な基である。これら他のＯＨ基を適正な基にて置換することで、必要な性能を付与することができる。ここで、単糖類のＯＨ基の一部がＮＨ_２にて置換されたものは、グルコサミン、ガラクトサミンなどのヘキソサミンとして、Ｎ−アセチル体（ＮＨＲ^６におけるＲ^６がアセチル記の化合物）として天然物中に含有されている。
以上説明した化合物のうち、特に好ましい化合物としては前述の一般式（１）及び（２）にて示した化合物である。特に、Ｒ^１が―ＯＳＯ_３Ｈ又は―ＯＳＯ_３Ｈの塩；Ｒ^２及びＲ^３がＯＨ基；Ｒ^４が−ＮＨＣＯＣＨ_３；ＡがＯである化合物が望ましい。Ｒ^８としては、アルキル基、フェニル基、ナフチル基並びにこれら基の一部水素がニトロ基、ＯＨ基、ビニル基及び／又は−ＮＨＣＯＣＨ_３にて置換されている基から独立して選択できる。
更に、上述した化合物が有効成分として体内などの作用部位で存在することができるものであれば、プロドラッグ化することが可能である。例えば、吸収性やバイオアベイラビリティーの向上、標的組織への選択的移行性の増強（血液−脳関門の透過性を向上するために脂溶化するなど）、代謝を阻害して作用の持続性を向上、などの目的で行われるプロドラッグ化が挙げられる。その場合、後述する使用態様に応じて、適正な化学構造が選択される。
（使用態様：アミロイドβ蛋白の凝集を抑制し、沈着、凝集の阻害薬としての使用）
本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤はアミロイドβ蛋白との親和性に優れた化合物であり、アミロイドβ蛋白の凝集を制御することができる。例えば、凝集を阻害乃至抑制する場合には、アミロイドβ蛋白との間で相互作用を生じ、凝集を抑制することができる。その結果、アミロイドβ蛋白に異常が有っても凝集が生成し難くなるとともに、生成している凝集についても再溶解させることができるので、症状の緩和乃至治癒も期待できる。
従って、本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤（特に凝集抑制・阻害剤）は、アミロイドβ蛋白の凝集及び／または沈着阻害剤として好適に使用できる。その場合に、製薬学的に許容される担体を配合することも可能である。
この場合の製薬学的に許容される担体としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤、安定剤、粘稠剤などが例示できる。また、本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤は軟カプセル剤、硬カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤などの経口剤、注射剤、坐剤または外用剤として提供できる。
添加剤を例示すると、植物油（例えば、トウモロコシ油、綿実油、ココナッツ油、アーモンド油、落花生油、オリーブ油など）、中鎖脂肪酸グリセライド油などの油状エステル、鉱物油、トリカプリリン、トリアセチンなどのグリセリンエステル類、エタノール、プロパノールなどのアルコール類、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、カカオ脂、動物油脂、セルロース誘導体（結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
（使用態様：アミロイドβ蛋白の凝集に関する診断薬及び診断薬キット）
本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤はアミロイドβ蛋白との親和性に優れた化合物である。従って、生体中などにてアミロイドβ蛋白に異常が発生した場合（濃度の異常、性状の異常など）に、そのアミロイドβ蛋白に対して相互作用を生じることで、その異常を検出することができる。例えば、本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤であって凝集を促進する化合物の場合に、血液、髄液などの生体サンプルに対し添加することで、アミロイドβ蛋白における異常発生時に凝集を生成し、その異常を速やかに検出することができる。
また、本アミロイドβ蛋白凝集制御剤が、アミロイドβ蛋白の凝集を抑制・阻害する場合には、本アミロイドβ蛋白凝集制御剤がアミロイドβ蛋白との間で相互作用を生じた際に発光が生じるように、本化合物に蛍光標識などを導入することで、アミロイドβ蛋白に異常が発生してアミロイドβ蛋白の沈着・凝集などが生起するおそれに対する、簡便な診断薬及びその診断薬を構成する主要成分を提供できる診断薬キットとして使用できるアミロイドβ蛋白凝集制御剤としての応用が期待できる。

以下に、本発明の実施例を示し、本発明を更に具体的に明らかにする。本発明が、そのような実施例の記載によって何等の制約をも受けるものでないことはいうまでもない。また、本発明には、以下の実施例の他にも更には上記した発明の実施の形態における記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱し得ない限りにおいて、当業者の知識に基づいて、種々なる変更、修正、改良等を加え得るものであることが理解されるべきである。
（使用した試料の合成）
（１−１）本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤の一例として、本実施例にて用いた硫酸化糖鎖（パラ−ニトロフェニル２−アセタミド−２−デオキシ−６−スルホネート−β−Ｄ−グルコピラノシド；下式（３））は下記反応式に従い、合成した。
１）クロロ２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシドの合成
アセチルグルコサミン（東京化成社製、４．９０ｇ，２０．９ｍｍｏｌ）に塩化酢酸（東京化成社製、３０ｍＬ）を加え、２４時間攪拌した、反応液に氷水を加え、反応を停止させ、クロロホルムで抽出し、その後、飽和ＮａＨＣＯ_３水で２回、氷水で１回洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝５０／１→クロロホルムのみ）で精製した。
収量は５６０ｍｇ、収率は６．９％であった。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ．）：ｄ６．１９（ｄ，Ｊ＝４．０，１Ｈ，Ｈ−１），５．７６（ｄ，Ｊ＝８．５，１Ｈ，ＣＯＮＨ），５．３２（ｄｄ，Ｊ＝９．１０，１Ｈ，Ｈ−３），５．２２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），４．５３（ｄｄｄ，Ｊ＝３．５，９．０，１０．５，１Ｈ，Ｈ−２），４．３０−４．２５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５，Ｈ−６ＰｒｏＲ），４．１６−４．１２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−６ｐｒｏＳ），２．０５（ｄｄ，１２Ｈ，Ａｃ）．
ＩＲ（ＫＢｒ）：１７４７（Ｃ＝Ｏ），１２２８（Ｃ−Ｏ），６０１（Ｃｌ）．
２）パラ−ニトロフェニル２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成
クロロ２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド（５６０ｍｇ，１．５３ｍｍｏｌ）をメチレンクロライド５ｍＬに溶解させ、１ＮＮａＯＨ５ｍＬ、Ｂｕ_４ＮＢｒ（東京化成社製、４９０ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）とｐ−ニトロフェノール（東京化成社製、４３０ｍｇ，３．１ｍｍｏｌ）を加え、１２時間攪拌した。その後、酢酸エチルで抽出し、１ＮＮａＯＨ、飽和食塩水、水で洗浄した。その後、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム：メタノール＝１００：１）で精製した。
収量は２９０ｍｇ，収率は４０％であった。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ）：ｄ８．２０（ｄｔ，２Ｈ，Ｐｈ），７．０７（ｄｔ，２Ｈ，Ｐｈ），５．６０（１Ｈ，ＮＨＣＯ），５．４７（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１），５．４６（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３），５．１５（ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），４．２９（ｄｄ，Ｊ＝５．５，１２．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６ｐｒｏＲ），４．２０（ｄｄ，Ｊ＝２．０，５．５，９．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５），４．１０（ｄｄｄ，Ｊ＝８．５，８．５，１０．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），３．９４（ｄｄｄ，Ｊ＝２．０，５．５，９．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５），２．０８，２．０６７（ｓｘｓ，ｓ，３Ｈ，ＯＡｃ），１．９７（ｓ，３Ｈ，ＮＨＡｃ）．ＩＲ（ＫＢｒ）：１７４５（Ｃ＝Ｏ），１５２３（ＮＯ_２），１３４４（ＮＯ_２），１２２８（Ｃ−Ｏ）．
３）パラ−ニトロフェニル２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成
パラ−ニトロフェニル２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（１３０ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍＬに溶解させ、ナトリウムメトキシド（東京化成社製、１０ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。陽イオン交換樹脂（アンバーリスト、オルガノ社製）で中和し、ろ過した。ろ液を濃縮し、再結晶により目的化合物を得た。
収量は１００ｍｇ，収率は１００％であった。^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，５００ＭＨｚ）：ｄ８．２６（ｄｔ，２Ｈ，Ｐｈ），７．２０（ｄｔ，２Ｈ，Ｐｈ），５．３２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１），４，０３（ｄｄ，Ｊ＝８．５，１０．５Ｈｚ，Ｈ１，Ｈ−２），３．９６（ｄｄ，Ｊ＝２．５，１２．５Ｈｚ，Ｈ−１，Ｈ−６ｐｒｏＳ），３．８０（ｄｄ，Ｊ＝５．５，１２．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６ｐｒｏＲ），３．６９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−５），３．３８（ｄｄ，Ｊ＝９．０，１０．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）．ＩＲ（ＫＢｒ）：３３０７（ＯＨ），１５２１（ＮＯ_２），１３４６（ＮＯ_２），１２５０（Ｃ−Ｏ）．
４）パラ−ニトロフェニル２−アセタミド−２−デオキシ−６−スルホネート−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成
３０ｍＬナスフラスコにパラ−ニトロフェニル２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド２００ｍｇを入れてＤＭＦ８ｍＬに溶かした。よく溶解させた後、４０℃のオイルバス中でＤＭＦ６ｍＬに溶かしたスルファトリオキシドトリメチルアミン錯体（Ｓｕｌｐｈｕｒｔｒｉｏｘｉｄｅ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｃｏｍｐｌｅｘ）Ｍｅ_３Ｎ・ＳＯ_３３ｅ．ｑ．（シグマアルドリッチ社製、２４０．５ｍｇ）を一滴ずつ加えて３時間攪拌した。その間ＴＬＣで反応を追跡していった（展開溶媒クロロホルム：メタノール＝２：１）。反応終了後、メタノールを１４ｍＬ加えて室温で３時間攪拌し、エバポレーターで濃縮して逆相カラムで分離精製を行った。その後、得られた化合物を陽イオン交換樹脂を２ｍＬ加えて３日間攪拌した。その後陽イオン交換樹脂をガラスフィルターでろ別し、得られた液体を濃縮し凍結乾燥させた。
収量は１２３．１ｍｇ、収率は４７．２％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ，３０℃）δ ８．０２（ｍ，２Ｈ，Ｈ_{ｍｅｔｈａ} ｏｆｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．００（ｍ，２Ｈ，Ｈ_{ｏｒｔｈｏ} ｏｆｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），５．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−１β），４．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０，１１．５Ｈｚ，Ｈ−６ｐｒｏｓ），４．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１１．５Ｈｚ，Ｈ−６ｐｒｏＲ），３．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５，１０．５Ｈｚ，Ｈ−２），３．８０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），３．５８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．５，９．０Ｈｚ，Ｈ−３），３．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０，１０．０Ｈｚ，Ｈ−４），２．７４（ｓ，９Ｈ，３×Ｍｅ），１．８９（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）．
（１−２）本発明のアミロイドβ蛋白凝集制御剤の一例として、下記化合物（Ａ）及び（Ｂ）を合成した。
上記（Ａ）の化合物（ｐＮＰＧｌｃＮＡｃ）は前述のパラニトロフェニル−６−スルフォニル−β−Ｄ−アセチルグルコサミン（ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃ）の合成中間体として得られる。（Ｂ）の化合物（Ａｌｌｙｌ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃ）は前述のｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃの合成において用いたｐ−ニトロフェノールに代えて、アリルアルコールを採用することで同様に合成できる。
（２）アミロイドβ１−４２及びアミロイドβ１−４０ペプチドの合成
以下の実施例において用いる、アミロイドβ蛋白質として、アミロイドβ１−４２ペプチドを合成した。
ペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を原料として、固相法により、ペプチドシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。合成終了後、ペプチドをレジンから切り出し、逆相カラム（Ｃ１８、昭和電工社製）を用いた、高速液体クロマトグラフィーによってこれを精製した。得られたアミロイドβ１−４２ペプチドが目的のアミノ酸配列を有していることを、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、Ｖｏｙａｇｅｒ、アプライドバイオシステムズ社製）によって確認した。このアミロイドβ１−４２を凍結乾燥し、以下の実施例に用いた。更に、アミロイドβ１−４０についても同様に合成した。以下、「アミロイドβ蛋白」と記載した場合、特に「アミロイドβ１−４０」に限定する記載がない場合にはアミロイドβ１−４２を意味する。
（３）アミロイドβ蛋白凝集阻害活性の試験方法
色素（チオフラビンＴ）を用いる方法によって実施した。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は、アミロイドβ蛋白などの凝集した蛋白のβシート構造に結合して、遊離の状態では示さなかった新たな蛍光（４８２ｎｍ）を発することが報告されている（ＨａｒｒｙＬｅｖｉｎｅＩＩＩ．１９９３、ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ２，４０４−４１０）。蛍光の強さは結合する蛋白の凝集の程度に比例する。薬剤を含むアミロイドβ蛋白の凝集の程度をそれに結合するＴｈＴの蛍光の強さで測定することにより、薬剤のアミロイドβ蛋白凝集阻害活性を調べることができる。
具体的には、ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃ（上記式（３））を含む０．０２％ＮＨ_４ＯＨ水溶液に溶かしたアミロイドβ蛋白質の溶液から５μＬを取り、これを５０ｍＭＧｌｙ−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０）に５μＭの濃度で溶かされたＴｈＴの溶液５００μＬに加え、攪拌する。攪拌後、速やかにスペクトルトロフルオロメーター（ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−７７７）で励起波長４１５ｎｍ、蛍光波長４８２ｎｍで溶液の蛍光を測定する。硫酸化糖質の量を変化させて、または、経時的に測定を行った。硫酸化糖質を含まない、アミロイドβ蛋白質のみの溶液と比較して、蛍光の上昇が抑えられれば、その薬剤はアミロイドβ蛋白質凝集阻害活性を有すると判定される。
第１図にアミロイドβ蛋白質とｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃをインキュベートして１日後の結果を示す。第１図は本実施例におけるｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃによる、ペプチドの凝集抑制効果とその濃度依存性を示している。１０μＭのアミロイドβ蛋白質水溶液にｐＮＰ６−ＳｕｌｆｏＧｌｃＮＡｃを１０−１０００μＭ加えて、一日間インキュベートした後に、ＴｈＴを加えて、蛍光を測定した。図中の棒グラフの表示は、０μＭがコントロールにあたり、その他は凝集抑制剤であるｐＮＰ６−ＳｕｌｆｏＧｌｃＮＡｃの濃度を表す。第１図より明らかなように、ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃを加えなかった場合はＴｈＴが強い蛍光を示したのに対して、１０μＭ以上のｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃを加えた場合は蛍光強度の減少が観測された。このことから、ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃはアミロイドβ蛋白質の凝集を阻害していることが明らかである。なお、ヘパリンを１００μＭ添加した場合には１日後で蛍光強度が２４５（ａ．ｕ）となることが判っている。つまり、アミロイドβに対して、ヘパリンは凝集する作用を発揮し、ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃは凝集を阻害する作用を発揮することが判った。
アミロイドβ蛋白をアミロイドβ１−４０に代えた以外、同様の条件で検討を行った結果、ヘパリンもｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃも添加しない系では蛍光強度が１５３（ａ．ｕ）であったのが、ヘパリンを１００μＭ添加すると蛍光強度が１８１（ａ．ｕ）、ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃを１００μＭ添加すると蛍光強度が１６０（ａ．ｕ．）であった。つまり、アミロイドβ１−４０に対して、ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃはヘパリンほどではないものの凝集を促進する作用を発揮することが判った。
第２図にアミロイドβ蛋白質と１００μＭの硫酸化糖質とを加え、インキュベートした後、１日から７日までの経時変化を測定した結果を示す。第２図は本実施例におけるｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃによる、ペプチドの凝集抑制効果の経時変化を示す。１０μＭのアミロイドβ蛋白質水溶液にｐＮＰ６−ＳｕｌｆｏＧｌｃＮＡｃを１００μＭ加えて、７日間インキュベートして、それぞれの経過時間後にＴｈＴを加えて測定した蛍光の値を示す。０日は１時間後である。図中のグラフの表示は、○がコントロールであるアミロイドβ蛋白のみにあたり、□は凝集抑制剤であるｐＮＰ６−ＳｕｌｆｏＧｌｃＮＡｃを１００μＭ加えた後の値を示す。第２図より明らかなように、ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃを加えていない場合は、インキュベーション後、高い蛍光発光を示し、凝集していることが分かった。一方、ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃを加えた場合には、７日までインキュベーションしても、蛍光強度は低く、凝集が抑えられていることがわかった。つまり、一週間の長きにわたって、凝集が抑制されることがわかった。
（４）アミロイドβ蛋白の構造の解析方法
円偏向二色性（ＣＤ）スペクトルによって測定した。具体的にはｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃを含むアミロイドβ蛋白の試料溶液１０μＭを取り、ＣＤスペクトロメーター（ＪＡＳＣＯ社製Ｊ−７２５）で、波長２６０ｎｍから１９０ｎｍまでのＣＤスペクトルを測定した。また、凝集促進剤である、天然多糖のヘパリンを加えた時との比較も行った。ＣＤスペクトルにおいては２１８ｎｍのβシート構造に基づくピークの比較をおこなった。ここで、βシート化したアミロイドβ蛋白質は、２１８ｎｍに極小値を有している。
第３図に１日インキュベートした後のＣＤスペクトルを示す。第３図より明らかなように、１０μＭのアミロイドβ蛋白質溶液をそのまま、ｐＮＰ６−ＳｕｌｆｏＧｌｃＮＡｃを１００μＭ加えたもの、ヘパリンを１００μＭ加えたものについて、それぞれ１日インキュベートした後の変化を見ると、ｐＮＰ６−ＳｕｌｆｏＧｌｃＮＡｃを加えたときは２１８ｎｍのピークは小さいが、何も加えないとき及び凝集促進剤である、酸性多糖（ヘパリン）を加えたときには強いピークを示すことが分かった。従って、ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃを加えた、アミロイドβ蛋白質溶液では、βシート性が抑制されていることがわかった。
（５）アミロイドβ蛋白質の凝集の観察
透過型電子顕微鏡を用いて、アミロイドβ蛋白質の凝集の観察を行った。具体的にはｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃ１００μＭとアミロイドβ蛋白質１０μＭを１日間インキュベートし、カーボングリッド膜に写し取り、２％リンタングステン酸水溶液でネガティブ染色した。この試料を透過型電子顕微鏡（日立社製Ｈ−８００）によって形態の観察を行った。
第４図に１日インキュベートした後のＴＥＭの観察結果を示す。（ａ）はアミロイドβ蛋白にヘパリンを添加してインキュベートしたもの、（ｂ）はアミロイドβ蛋白をそのままインキュベートしたものであり、はっきりとした繊維状のアミロイド凝集体が観察される。一方、（ｃ）はペプチドに凝集抑制剤としてのｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃを加えたもので、小さな凝集体がわずかに観察されるだけであり、繊維状のアミロイド蛋白質凝集体は全く観察されなかった。
（６）細胞毒性の評価
アミロイドβの濃度を０Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−７Ｍそして１０^−６Ｍと３段階とし、１００μＭヘパリン、０．４ｍＭＨＣｌ、１００ｍＭＨＥＰＥＳ、そして０．１ＭＮａＣｌの存在下、３７℃で２日間Ｈｅｌａ細胞を培養した後の細胞数をカウントした。更に、ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃを１００μＭ添加した場合についても評価を行った。そして、アミロイドβを添加していない場合を１００％とした生存率を算出した。評価の結果を第５図に示す。図より明らかなように、ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃを添加することで、アミロイドβの毒性が低減されることが明らかになった。特に、アミロイドβの濃度が１０^−６Ｍ未満（よく詳しくは１０^−７Ｍ以下）の場合にはアミロイドβを添加しない場合よりも高い生存率を示すことが明らかになった。
（７）置換基の評価
ｐＮＰＧｌｃＮＡｃ（化合物（Ａ））及びＡｌｌｙｌ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃ（化合物（Ｂ））について、ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃと同様にアミロイドβ凝集阻害作用を上記（３）アミロイドβ蛋白凝集阻害活性の試験方法と同様の方法にて検討した。
１０μＭのアミロイドβ蛋白質水溶液に、ｐＮＰＧｌｃＮＡｃ、Ａｌｌｙｌ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃ、そしてｐＮＰ６−ＳｕｌｆｏＧｌｃＮＡｃをそれぞれ１００μＭ加えて、一日間インキュベートした後に、ＴｈＴを加えて、蛍光を測定した。結果を第６図に示す。
第６図より明らかなように、ｐＮＰＧｌｃＮＡｃ、Ａｌｌｙｌ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃ、そしてｐＮＰ６−ＳｕｌｆｏＧｌｃＮＡｃのいずれにおいても凝集阻害能を発揮することが明らかになった。特に、ｐＮＰ６−Ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃを加えた場合が、一番高い凝集阻害能を発揮することが判った。従って、凝集阻害能には―ＯＳＯ_３Ｈと疎水基（本評価ではｐ−ニトロフェノール基）とが双方共に重要な役割を果たしていることが示唆された。
（８）凝集体の解離作用の評価
凝集したアミロイドβについての作用を検討した。上記（３）アミロイドβ蛋白凝集阻害活性の試験方法と同様の方法にて、１０μＭのアミロイドβについて、そのままのものとヘパリンを１００μＭ添加したものとについて、３７℃で１日間放置することで、凝集させた。その後、ｐＮＰ６−ＳｕｌｆｏＧｌｃＮＡｃを１００μＭ添加し、３７℃で１日間放置した後に、上記（３）アミロイドβ蛋白凝集阻害活性の試験方法と同様の方法にて、凝集の程度を評価した。
その結果、ヘパリンを添加した系では蛍光強度が２１９（ａ．ｕ．）であったものがｐＮＰ６−ＳｕｌｆｏＧｌｃＮＡｃを添加することで１８４（ａ．ｕ．）（元の状態の８４％）にまで減少した。また、アミロイドβだけの系では蛍光強度が１８３（ａ．ｕ．）であったものがｐＮＰ６−ＳｕｌｆｏＧｌｃＮＡｃを添加することで１６６（ａ．ｕ）（元の状態の９１％）にまで減少した。従って、一度、凝集が進行したアミロイドβであっても、凝集体を解離することができることが明らかになった。つまり、生体内でのアミロイドβの凝集を減少できる可能性があることが判った。

Claims

下記一般式（２）で表される化合物を含有することを特徴とするアミロイドβ蛋白凝集制御剤。
（一般式（２）中、Ｒ ^１はＯＨ、ＮＨ _２、ＮＨＲ ^６、ＮＲ ^６Ｒ ^７、ＯＳＯ _３Ｈ、またはＯＳＯ _３Ｈの塩、Ｒ ^６及びＲ ^７はアルキル基又はアセチル基、Ｒ ^２及びＲ ^３はＯＨ、Ｒ ^４がＮＨＡｃ、ＡはＯまたはＳ、Ｒ ^８はニトロ、ＯＨ、ビニル基もしくは−ＮＨＣＯＣＨ _３で置換されていてもよいフェニル基もしくはナフチル基、またはビニル基で置換されたアルキル基である。）