JP5150488B2 - Ｆｃ領域含有タンパク質を精製する方法 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２００５年６月１７日出願の米国仮特許出願第６０／６９１，８２１号「Ｆｃ領域を有するタンパク質を精製する方法（ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ Ｆｃ ＲＥＧＩＯＮ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＰＲＯＴＥＩＮＳ）」の優先権を主張するものである。この出願の内容全体は本明細書中に援用される。

（発明の背景）
抗体は、多くの動物、特にヒトの免疫系の有効な要素である。組換え技術における最近の進歩により、仮想的に任意の標的、例えば癌細胞、細菌、およびウイルスに対する抗体の産生が可能になっている。典型的には、抗体を高レベルに発現するように設計されている細胞株を用いて抗体が産生される。次いで、設計された細胞株は、糖類、アミノ酸、および成長因子の複合混合物、ならびに例えば血清タンパク質を含む様々なタンパク質を含む培養物中で成長される。しかし、完全抗体を細胞副産物および培養物成分から分離して研究用途にまたは治療薬として十分な純度に高めることは大変な課題をもたらす。もし抗体がヒトへの投与用の薬剤として用いられるものである場合、抗体分子の精製は特に重要である。

従来の抗体精製スキーム（または手順）は、様々な不純物の結合または保持と比較した、抗体分子における優先的な結合能またはクロマトグラフィーカラムの固相（または機能化された固相）によって保持される能力を探索するクロマトグラフィーステップを含むことが多い。抗体精製のためのスキームが提案または実施されており、ここでは、まずＣＨ２／ＣＨ３領域を含有するタンパク質の固相上に固定化されたプロテインＡへの結合後、固相に結合された不純物が疎水性電解質溶媒での固相の洗浄によって除去され、続いてＣＨ２／ＣＨ３領域を含有するタンパク質が固相から回収される。しかし、これらのスキームは、ＣＨ２／ＣＨ３領域を含有するタンパク質への優先的結合に用いられる条件が不純物（例えば、不完全なＣＨ２／ＣＨ３領域を有する抗体）に対する結合も促進するという点で限定的である。ヒト治療薬の開発においては、かかる不純物は極めて不都合なものである。

したがって、細胞培養物内で生成される、定常領域を有するタンパク質またはポリペプチド、特にＦｃ領域（例えば抗体）を有するタンパク質の精製における改善に対する必要性が存在する。

（発明の要旨）
様々な態様では、本発明は、Ｆｃ領域を有するタンパク質を、そのタンパク質および１種もしくは複数種の不純物を含有するソース液体から分離するための方法を特徴とする。本発明の方法では、Ｆｃ領域を有するタンパク質（標的タンパク質）はＦｃ結合剤に吸着され、次いでＦｃ結合剤を二価カチオン塩を含有する緩衝溶液で洗浄することで、１種もしくは複数種の不純物が除去される。次いで、タンパク質は溶出溶液中のＦｃ結合剤から回収される。本発明の方法は、イントロンリードスルー（ｉｎｔｒｏｎ ｒｅａｄ ｔｈｒｏｕｇｈ）変種（ＩＲＴ）、アンダージスルフィド結合種（ｕｎｄｅｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ）（ＵＤＢ）および／または低分子量変種（ＬＭＷ）などの不純物を除去するのに特に有用である。本発明の方法はまた、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡなどの不純物の除去において有効である。

本発明の方法は１つもしくは複数のクロマトグラフィー分離ステップを含み、さらに１つもしくは複数の濾過ステップを含みうる。クロマトグラフィー分離ステップは、連続または不連続（例えばバッチアプローチ）またはそれらの組み合わせでありうる。様々な実施形態では、例えば本方法に１つもしくは複数の濾過ステップが含まれることで、ウイルスが除去され、標的タンパク質を含有する溶液が濃縮、緩衝化され、かつ微生物汚染物質が除去される。

様々な実施形態では、Ｆｃ領域を有するタンパク質は、抗原結合ポリペプチド（例えば抗体またはその断片）またはイムノアドヘシン（例えばＴＮＦ受容体イムノアドヘシン）である。様々な実施形態では、Ｆｃ領域を有するタンパク質は、抗体融合体、マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である。好ましい実施形態では、Ｆｃ領域を有するタンパク質はヒトまたはヒト化抗−ＩＬ−１３抗体である。あるいは他の実施形態では、Ｆｃ領域を有するタンパク質は、Ａβ、ＣＤ３、ＣＤ５２、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＨＥＲ−２、ＴＮＦα、ＣＤ２５、ＲＳＶ、ＩｇＥ、ｇｐ Ｉｌｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ１１ａまたはα４インテグリンなどの抗原に結合しうる。

様々な実施形態では、Ｆｃ領域を有するタンパク質は組換え生成される。様々な実施形態では、Ｆｃ領域を有するタンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で組換え生成される。

様々な実施形態では、１種もしくは複数種の不純物は、１種もしくは複数種の宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、細胞培養タンパク質、Ｆｃ領域を有するタンパク質の望ましくない種、およびこれらの混合物を含む。例えば様々な実施形態では、Ｆｃ領域を有するタンパク質の望ましくない種は、イントロンリードスルー配列を有する１種もしくは複数種の抗体鎖またはその断片、不適切なジスルフィド結合を有する１種もしくは複数種の抗体鎖またはその断片、半抗体またはその断片、軽鎖二量体またはその断片、および重鎖二量体またはその断片を含む。

一態様では、本発明の方法は、Ｆｃ領域を有するタンパク質を、まずタンパク質をＦｃ結合剤に吸着させた後、Ｆｃ結合剤を二価カチオン塩を含有する緩衝溶液で洗浄して１種もしくは複数種の不純物を除去し、その後にタンパク質をＦｃ結合剤から回収することにより、タンパク質および１種もしくは複数種の不純物を含有するソース液体から精製するものである。様々な実施形態では、タンパク質をＦｃ結合剤に吸着させるステップとＦｃ結合剤を二価カチオン塩を含有する緩衝溶液で洗浄するステップは、約２℃〜約２４℃の範囲内の温度で行われる。様々な実施形態では、タンパク質をＦｃ結合剤から回収するステップは、約２．０〜約６．５の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液を用いてタンパク質を溶出するステップを含む。

様々な実施形態では、Ｆｃ領域結合剤はプロテインＡおよびプロテインＧのうちの１種もしくは複数種を含有する。好ましい実施形態では、Ｆｃ結合剤は固相上に固定化される。この固相は、例えばビーズ、アガロースマトリックス、シリカ、およびそれらの混合物の１種もしくは複数種を含有しうる。

Ｆｃ結合剤を洗浄するのに用いられる緩衝液中に存在する二価カチオン塩は、例えばカオトロピック塩を含みうる。洗浄緩衝溶液の調製に適する二価カチオン塩としては、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ニッケルおよびそれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。様々な実施形態では、洗浄緩衝溶液の調製に適する二価カチオン塩としては、二価グループＩＩ（ｄｉｖａｌｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ＩＩ）（例えば、マグネシウム、カルシウム、バリウムなど）カチオン、二価遷移金属（例えば、銅、ニッケル、マンガンなど）カチオンのチオシアン酸塩（ＳＣＮ^-）、過塩素酸塩（ＣｌＯ₄ ^-）、硝酸塩（ＮＯ₃ ^-）、塩化物塩および臭化物塩、ならびにこれらの塩の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。

様々な実施形態では、二価カチオン塩を含有する緩衝溶液は約４〜約９、一部の実施形態では約４〜約８、約４．５〜約７．５または約６〜約８の範囲内のｐＨ値を有する。本明細書に示される範囲内に含まれる値および範囲ならびに／または同範囲内の中間値もまた、本発明の範囲内にあるように意図されている。例えば、二価カチオン塩は約７．１〜約７．９、約７．２〜約７．９、約７．３〜約７．７、約７．４〜約７．６、約４〜約５、約５〜約６、約６〜約７、または約８〜約９のｐＨ値を有する。

さらに、本明細書で列挙される値を上限または下限として有する範囲は、本発明の範囲内にあるように意図されている。例えば、二価カチオン塩は、少なくとも約（または約）４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、または８のｐＨを有する。

様々な実施形態では、緩衝溶液は、約０．１Ｍ〜約５Ｍおよび一部の実施形態では約０．５Ｍ〜約３Ｍ、約１．０Ｍ〜約３Ｍまたは約０．６Ｍ〜約２．５Ｍの範囲内の二価カチオン塩濃度を有する。例えば、二価カチオン緩衝液は、少なくとも約０．６ＭのＣａＣｌ₂または少なくとも約２ＭのＭｇＣｌ₂または少なくとも約２ＭのＣａＣｌ₂を含有しうる。本明細書に示される範囲内に含まれる値および範囲ならびに／または同範囲内の中間値もまた、本発明の範囲内にあるように意図されている。例えば、緩衝溶液は、約０．５Ｍ〜約０．７５Ｍ、約０．５Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．５Ｍ〜１．０Ｍ、約０．５Ｍ〜２Ｍ、約１．５Ｍ〜約２．０Ｍ、約１．５Ｍ〜約２．５Ｍ、約１．５Ｍ〜約３．０Ｍ、または約２．５Ｍ〜約３Ｍの二価カチオン塩濃度を有する。

さらに、本明細書で列挙される値を上限または下限として有する範囲は、本発明の範囲内にあるように意図されている。例えば、緩衝溶液は、少なくとも約（または約）０．６Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍ、または３Ｍの二価カチオン塩濃度を有する。様々な実施形態では、二価カチオン塩を含有する緩衝溶液は約２℃〜約２４℃の範囲内の温度を有する。

様々な実施形態では、タンパク質をＦｃ結合剤から回収するステップは、約２．０〜約６．５の範囲内、好ましくは約２．０〜約４．０の範囲内、より好ましくは約２．５〜約３．５の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液を用いてタンパク質を溶出するステップを含む。本明細書に示される範囲内に含まれる値および範囲ならびに／または同範囲内の中間値もまた、本発明の範囲内にあるように意図されている。例えば、溶出緩衝液は約２〜約３または約３〜約４のｐＨを有する。

さらに、上限または下限として本明細書で列挙される値を有する範囲は、本発明の範囲内にあるように意図されている。例えば、溶出緩衝液は少なくとも約（または約）２、２．５、３、３．５または４のｐＨを有する。

様々な実施形態では、Ｆｃ結合剤のクロマトグラフィーステップに先立ちまたはその後に、回収されたタンパク質にさらなる精製ステップを施してもよい。例えば、典型的なさらなる精製ステップとしては、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、固定化金属親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、透析、親和性クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈降、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、クロマトフォーカシング、限界濾過、透析濾過（diafiltration）、精密濾過（microfiltration）、およびゲル濾過が挙げられるがこれらに限定されない。様々な実施形態では、Ｆｃ結合剤のクロマトグラフィーステップの後にアニオン交換クロマトグラフィーおよびＨＩＣステップが行われる。様々な実施形態では、クロマトグラフィーステップの後にさらに、ウイルス濾過ステップ、限界濾過／透析濾過ステップ、および／または微生物汚染物質濾過ステップが行われる。

一態様では、本発明は、抗体をその不純物を含有する溶液から精製するための方法を提供する。様々な実施形態では、方法は、まずタンパク質をＦｃ結合剤に吸着させるステップと、その後のＦｃ結合剤を二価カチオン塩を含有する緩衝溶液で洗浄することで１種もしくは複数種の不純物を除去するステップと、それに続くタンパク質をＦｃ結合剤から回収することで第１の溶離液プールを生成するステップとを含む。

様々な実施形態では、精製プロセスは、標的タンパク質が樹脂に吸着しないようにイオン交換樹脂と第１の溶離液プールとの接触により第１の溶離液プールにイオン交換クロマトグラフィーを施すステップと、貫流する標的タンパク質を回収して第２の溶離液プールを生成するステップにより継続する。様々な実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーステップは、イオン交換樹脂を緩衝化洗浄溶液で洗浄し、任意の吸着された標的タンパク質の少なくとも一部を回収するステップをさらに含む。

様々な実施形態では、精製プロセスは、標的タンパク質の疎水性相互作用樹脂（例えば、疎水性リガンド（配位子）で機能化（官能化）された固相）への吸着により第２の溶離液プールに疎水性相互作用クロマトグラフィーを施すステップと、標的タンパク質を実質的に溶出しないイオン強度を有する緩衝化洗浄溶液で疎水性相互作用樹脂を洗浄するステップと、精製された標的タンパク質を回収するステップ（典型的には標的タンパク質を疎水性相互作用樹脂から脱着するのに十分に低いイオン強度を有する溶出緩衝液を用いる）により継続する。

本発明の様々な態様の好ましい実施形態では、Ｆｃ結合剤は固相上に固定化され、それは好ましくはソース液体との接触に先立ち適切な緩衝液で平衡化される。固相は、好ましくはＦｃ結合剤を固定化するアガロースを含むカラムである。様々な実施形態では、カラムがグリセリンなどの試薬でコーティングされることで、カラムに対する非特異的付着性が低下するかまたは阻止される。

様々な実施形態では、本発明の方法により精製されるタンパク質を、医薬的に許容できる担体中に調合し、かつかかる分子において既知の様々な診断用途、治療用途または他の用途に用いることが可能である。

様々な態様では、本発明は、Ｆｃ領域含有タンパク質を同タンパク質とそのイントロンリードスルー変異体（ＩＲＴ）を含有する溶液から精製するための方法を提供する。特徴的な態様では、本発明の方法を用いることで、タンパク質調製物中、例えば抗体調製物中の１種もしくは複数種のイントロンリードスルー変種のレベルが低下する。様々な実施形態では、Ｆｃ結合剤から回収されたタンパク質のイントロンリードスルー変異体のレベルがソース液体中のイントロンリードスルー変異体のレベルの少なくとも１／５未満であり、一部の実施形態ではソース液体中のイントロンリードスルー変異体のレベルの少なくとも１／１０未満である。様々な実施形態では、イントロンリードスルー変異体は、Ｆｃ結合剤から回収された前記タンパク質を含有する溶液中で前記タンパク質の種の約１．０％未満、約０．８％未満、約０．５％未満、約０．２％未満または約０．１％未満を構成する。

様々な態様では、本発明は、Ｆｃ領域含有タンパク質を同タンパク質とその低分子量変異体（ＬＭＷ）を含有する溶液から精製するための方法を提供する。特徴的な態様では、本発明の方法を用いることで、タンパク質調製物中、例えば抗体調製物中の１種もしくは複数種の低分子量変種のレベルが低下する。様々な実施形態では、Ｆｃ結合剤から回収されたタンパク質が有する低分子量変異体のレベルがソース液体中の低分子量変異体のレベルの少なくとも１／５未満であり、一部の実施形態ではソース液体中の低分子量変異体のレベルの少なくとも１／１０未満である。様々な実施形態では、低分子量変異体は、Ｆｃ結合剤から回収された前記タンパク質を含有する溶液中での前記タンパク質の種の約１．０％未満、約０．８％未満、約０．５％未満、約０．２％未満または約０．１％未満を構成する。

様々な態様では、本発明は、Ｆｃ領域含有タンパク質をタンパク質とそのアンダージスルフィド結合変異体（ＵＤＢ）を含有する溶液から精製するための方法を提供する。特徴的な態様では、本発明の方法を用いることで、タンパク質調製物中、例えば抗体調製物中の１種もしくは複数種のアンダージスルフィド結合変種のレベルが低下する。様々な実施形態では、Ｆｃ結合剤から回収されたタンパク質が有するアンダージスルフィド結合変異体のレベルがソース液体中のアンダージスルフィド結合変異体のレベルの少なくとも１／５未満であり、一部の実施形態ではソース液体中のアンダージスルフィド結合変異体のレベルの少なくとも１／１０未満である。様々な実施形態では、アンダージスルフィド結合変異体は、Ｆｃ結合剤から回収された前記タンパク質を含有する溶液中での前記タンパク質の種の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満または約１％未満を構成する。

別の態様では、本発明は、本発明の方法に従って精製される、Ｆｃ領域を有するタンパク質に関する。

別の態様では、本発明は、最初にタンパク質をＦｃ結合剤に吸着させるステップと、その後のＦｃ結合剤を二価カチオン塩を含有する緩衝溶液で洗浄して１種もしくは複数種の不純物を除去するステップと、その後のタンパク質をＦｃ結合剤から回収するステップとを少なくとも含む方法のいずれかを実施するのに適する系を提供する。

別の態様では、本発明は、最初にタンパク質をＦｃ結合剤に吸着させるステップと、その後のＦｃ結合剤を二価カチオン塩を含有する緩衝溶液で洗浄して１種もしくは複数種の不純物を除去するステップと、その後のタンパク質をＦｃ結合剤から回収するステップとを少なくとも含む方法のいずれかを実施するための精製順序（train）を提供する。

本発明はまた、様々な態様では、１つもしくは複数の本発明の方法を実施するのに用いられるキットを特徴とする。様々な実施形態では、キットは少なくとも１種の試薬およびキットの使用説明書を含む。例えばキットは、Ｆｃ結合剤、二価カチオン塩および二価カチオン塩を含有する緩衝化洗浄溶液を調製するための試薬などの１種もしくは複数種の試薬をキットの使用説明書とともに含みうる。

（発明の詳細な説明）
本発明のさらなる説明に先立ち、本明細書で用いられる特定の用語の定義を示すことは、その理解に役立つものでありうる。本明細書で示される定義は分類されているものであり、これはあくまで参照を容易にするためであって限定を目的とするものではない。

（タンパク質に関連する定義）
様々な態様では、本発明は、Ｆｃ領域含有タンパク質を、タンパク質およびその１種もしくは複数種のリードスルー変異体、例えばイントロンリードスルー変異体などを含有する溶液から精製するための方法を提供する。特徴的な態様では、本発明の方法を用いることで、タンパク質調製物中、例えば抗体調製物中での１種もしくは複数種のイントロンリードスルー（ＩＲＴ）変種のレベルが低下する。「イントロンリードスルー変異体」および「イントロンリードスルー変種」という用語は、本明細書で同義的に用いられ、目的とするＦｃ領域含有タンパク質（例えば、標的タンパク質）の合成においてポリペプチド鎖伸長がコーディング領域上流のイントロン内の停止コドンによってコーディング領域の転写の上流で終結する場合のプロセスの産物を示す。この産物は、１つもしくは複数の不完全なドメインを有するかまたはそのドメインを欠いた目的タンパク質の変異体（すなわちイントロンリードスルー変異体）である。かかるイントロンは、数種の異なるイントロンリードスルー変異体を生成する可能性をもたらす２つ以上の停止コドンを有しうる。

「アンダージスルフィド結合変異体」または「ＵＤＢ」という用語は、少なくとも１つのジスルフィド結合が欠けている場合の任意の種を示す。欠けているジスルフィド結合は、鎖間ジスルフィド結合または鎖内ジスルフィド結合またはその２つの組み合わせでありうる。

「低分子量種」または「ＬＭＷ」種という用語は、遊離重鎖、遊離軽鎖、ＩＲＴ種、半分子、および３／４（ｔｈｒｅｅ−ｑｕａｒｔｅｒｓ）分子、またはそれらの混合物からなるタンパク質種が挙げられる、Ｆｃ領域含有タンパク質の変異体を示す。

プロテインＡは、抗体のＦｃ領域に高親和性（ヒトＩｇＧに対して約１０^-8Ｍ）結合する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ）の大部分の株内に見出される約４２ｋＤの細胞壁タンパク質である。本明細書で用いられる「プロテインＡ」という用語は、ＣＨ２／ＣＨ３領域を有するタンパク質に対する結合能を保持する、その天然ソースから回収されたプロテインＡ、（例えば、ペプチド合成、組換え技術などにより）合成的に生成されたプロテインＡ、およびそれらの変異体を包含する。

プロテインＧは、グループＧの連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）由来の細胞壁タンパク質である。プロテインＧは、抗体、特にＩｇＧ抗体のＦｃ領域に高親和性結合するタイプＩＩＩのＦｃ受容体である。本明細書で用いられる「プロテインＧ」という用語は、Ｆｃ領域を有するタンパク質に対する結合能を保持する、その天然ソースから回収されたプロテインＧ、（例えば、ペプチド合成、組換え技術などにより）合成的に生成されたプロテインＧ、およびそれらの変異体を包含する。

（本明細書で同義的に用いられる）「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、２つの重鎖と２つの軽鎖からなる基本的な４つのポリペプチド鎖構造を有する抗原結合タンパク質を示し、前記鎖は例えば鎖間ジスルフィド結合によって安定化され、このタンパク質は抗原に対する特異的な結合能を有する。重鎖と軽鎖の双方はドメイン内に折り畳まれる。

「ドメイン」という用語は、例えばβ−プリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合により安定化されたペプチドループを含む（例えば３〜４つのペプチドループを含む）重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を示す。ドメインは本明細書では「定常」または「可変」とも称され、それは、「定常」ドメインの場合には、様々なクラスメンバーのドメイン内部の配列変異の相対的欠如に基づいている一方、「可変」ドメインの場合には、様々なクラスメンバーのドメイン内部の有意な変異に基づいている。軽鎖上の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと同義的に称される。重鎖上の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと同義的に称される。軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと同義的に称される。重鎖上の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと同義的に称される。

「断片」という用語は、無傷の（intact）あるいは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部を示す。断片は、無傷のあるいは完全な抗体または抗体鎖の化学処理または酵素処理を介して取得可能である。断片は組換え手段によっても取得可能である。典型的な断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂｃ断片および／またはＦｖ断片が挙げられる。「抗原結合断片」という用語は、抗原に結合するかまたは特異的な抗原結合のためのそれら断片の誘導源である無傷の抗体と競合する、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片を示す。

「抗体融合タンパク質」および「抗体融合体」という用語は、少なくとも１種の非抗体タンパク質部分またはポリペプチドに融合される抗体の全部または一部を含む融合タンパク質を示す。融合は、一般に前記タンパク質をコードする遺伝子に関する遺伝子工学によって行われる。さらなる典型的な抗体融合タンパク質は、別の可溶性または細胞性の生物学的タンパク質の全部または一部、例えば受容体（細胞性または可溶性）またはその一部、サイトカインまたはその一部、酵素またはその一部などに融合される（Ｆｃ領域を含む）抗体の細胞受容体結合部分を含む。別のタンパク質に融合される抗体のＦｃ領域を含むかかる抗体融合タンパク質は、当該技術分野ではＦｃ融合タンパク質としても称される。

「Ｆｃ結合剤」という用語は、抗体のＦｃ領域に高親和性を有する、補体タンパク質、Ｆｃ受容体または細菌由来タンパク質、例えばプロテインＡまたはプロテインＧなどを含むがこれらに限定されない、抗体（例えばＩｇＧ抗体）のＦｃ領域に結合可能な分子を示す。

「Ｆｃ領域」という用語は、ＩｇＧ抗体のＣ−末端領域、特に前記ＩｇＧ抗体の重鎖のＣ−末端領域を示す。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はやや変化しうるが、Ｆｃ領域は典型的にはおよそアミノ酸残基Ｃｙｓ２２６からＩｇＧ重鎖のカルボキシル末端までの範囲として定義される。

（クロマトグラフィーに関連した定義）
本明細書で用いられる「ソース液体」という用語は、少なくとも１種の標的物質を含有する液体を示し、同物質は共存する他の物質から精製されることが求められる。ソース液体は、例えば水溶液、有機溶媒系、または水／有機溶媒混合物もしくは溶液でありうる。ソース液体は、多種の生体分子（タンパク質、抗体、ホルモン、およびウイルスなど）、小分子（塩、糖類、脂質など）、および微粒子物質までも含有する複合混合物または溶液である場合が多い。典型的な生物学的起源を有するソース液体が水溶液または懸濁液として出発しうる一方、それは溶媒沈殿、抽出などの初期分離ステップで用いられる有機溶媒も含有しうる。本発明の様々な実施形態による精製に準じた貴重な生体物質を含有しうるソース液体の例として、バイオリアクターからの培養上清、均質化された細胞懸濁液、血漿、血漿画分、および乳液（ミルク）が挙げられるがこれらに限定されない。

「標的物質」または「標的タンパク質」という用語は、本明細書ではソース液体から精製されるべき１種もしくは複数種の所望のＦｃ領域含有タンパク質を示す。標的物質は、懸濁液としてのソース液体中または溶液中に存在しうる。

「不純物」という用語は、標的物質と異なる、望ましくは最終標的物質生成物から除去される、ソース液体中の物質を示す。典型的な不純物としては、核酸、（イントロン−リードスルー種、低分子量種およびアンダージスルフィド結合種を含む）タンパク質、ペプチド、内毒素、ウイルスならびに小分子が挙げられる。

本明細書で用いられる「固相」は、標的物質が精製の間に相互作用する相手であるかまたはＦｃ結合剤が付着しうる対象である非水性マトリックスを示す。適切な固相物質としては、ガラス、シリカ（例えばシリカゲル）、アガロースおよびセルロースなどの多糖類（例えば多糖類マトリックス）、ポリアクリルアミド、メチルメタクリレート、およびポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体など、例えばアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）（商標）樹脂（ローム・アンド・ハース・ケミカル（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）、ペンシルバニア州から市販）などの有機高分子が挙げられるがこれらに限定されない。固相を、親和性樹脂、イオン交換樹脂およびイオン捕捉樹脂として一般に記載されている樹脂の群のいずれかから選択可能である。固相は、例えば精製カラム、分離した粒子の不連続相、またはそれらの組み合わせでありうる。固相は、多孔質または非孔質の特徴を有しかつ圧縮性または非圧縮性でありうる。様々な実施形態では、固相は高分子マトリックスまたはアガロースの粒子またはビーズである。様々な実施形態では、固相を試薬（グリセリンなど）でコーティングすることで、例えば不純物の固相への非特異的付着性を阻止することが可能である。Ｆｃを結合する固相は、Ｆｃ結合剤が固相の表面に付着することを可能にする化学物質または会合性リガンドのみを有する必要がある。好ましい固相物質は、ポンプ輸送および交差流濾過を含む精製プロセスにて用いられる条件、ならびに用いられる液体における温度、ｐＨ、および他の態様に対して物理的および化学的に回復性がある（resilient）。

「親和性リガンド」は、ソース液体の成分の結合部位との特異的相互作用により、その成分に選択的または優先的に結合する部分を示す。本発明では、親和性リガンド（例えばＦｃ結合剤）は、典型的には樹脂などの固相に固定化される。樹脂支持体に結合することで本発明のプロセスにて有用なクロマトグラフィー樹脂を提供可能な親和性リガンドの例として、選択的にタンパク質のＦｃ領域に結合するプロテインＡ、プロテインＧ、およびそれらの類似体が挙げられるがこれらに限定されない。親和性リガンドの固体支持体物質への結合方法は精製技術分野で周知である。例えば、参照テキストであるＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）、ポール・マテチューク（Ｐａｕｌ Ｍａｔｅｊｔｓｃｈｕｋ）（編集者）、アイアールエル・プレス（Ｉｒｌ Ｐｒ）：１９９７年；およびＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ヘルベルト・ショット（Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｓｃｈｏｔｔ）、マーセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）：１９９７年を参照のこと。

「親和性クロマトグラフィー樹脂」または「親和性樹脂」は、固相または基材とその表面に結合される親和性リガンドを備えるクロマトグラフィー樹脂を示す。

「イオン交換クロマトグラフィー樹脂」または「イオン交換樹脂」は、正または負の電荷を担持する共有結合性リガンドを有し、それ故、イオン交換樹脂の接触相手である溶液中のイオンとの交換に使用可能な遊離対イオンを有する固体支持体を示す。

「カチオン交換樹脂」は、負に帯電した共有結合性リガンドを有するイオン交換樹脂を示し、それ故、樹脂の接触相手である溶液中のカチオンとの交換において遊離カチオンを有する。多種多様のカチオン交換樹脂、例えば共有結合基がカルボン酸またはスルホン酸であるものが当該技術分野で既知である。市販のカチオン交換樹脂として、ＣＭＣ−セルロース、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）およびＦａｓｔ Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）が挙げられる（後の２種はファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手可能）。

「アニオン交換樹脂」は、４級アミノ基などの正に帯電した共有結合基を有するイオン交換樹脂を示す。市販のアニオン交換樹脂として、ＤＥＡＥセルロース、ＴＭＡＥ、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）、およびＦａｓｔ Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）が挙げられる（後の２種はファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手可能）。

本明細書で用いられる「カオトロピック塩」という用語は、タンパク質水和殻に浸透しかつそれら表面に直接結合しうる分離指向性（lyotropic）系列のうち低位の１種もしくは複数種のイオン成分を含有する塩を示す。これは共水和会合（ｃｏｈｙｄｒａｔｉｖｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を破壊し、タンパク質の可溶化を促進する。カオトロピック塩の例として、グループＩＩ元素のハロゲン化物塩（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化バリウム、臭化カルシウム、臭化マグネシウム、臭化バリウム、ヨウ化カルシウム、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化バリウム）が挙げられるがこれらに限定されない。

適切な二価カチオン塩の例として、Ｍｎ²⁺、Ｎｉ²⁺またはＣｕ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺およびＢａ²⁺のチオシアネート（ＳＣＮ^-）、過塩素酸塩（ＣｌＯ₄ ^-）、硝酸塩（ＮＯ₃ ^-）、塩化物（Ｃｌ^-）、および臭化物（Ｂｒ^-）との塩およびそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。

特定の実施形態では、二価カチオン塩は二価カチオン（例えば、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｎｉ²⁺またはＢａ²⁺）を含む。特徴的なプロセスでの使用に好ましいカオトロピック塩はＭｇＣｌ₂、ＮｉＣｌ₂およびＣａＣｌ₂である。二価カチオン塩の洗浄ステップ後、標的タンパク質は親和性クロマトグラフィーマトリックスから溶出される。

「緩衝液」は、溶液中に存在することにより、ｐＨにおける単位変化を誘起するために添加されなければならない酸またはアルカリの量を増加させる物質である。緩衝溶液は、その酸−塩基抱合体成分の作用によりｐＨの変化に抵抗性を示す。生物学的試薬とともに用いられる緩衝溶液は、一般に溶液のｐＨが生理的範囲内にあるように水素イオンの一定濃度を維持することが可能である。「生理的ｐＨ」という用語は、哺乳類血液のｐＨ（すなわち７．３８または約７．４）を示す。したがって、生理的ｐＨ範囲は約７．２〜７．６である。従来の緩衝液成分としては、有機および無機の塩、酸および塩基が挙げられるがこれらに限定されない。生体分子（例えばタンパク質分子）の精製にて用いられる典型的な緩衝液は両性イオンまたは「グッド（Ｇｏｏｄ）」緩衝液であり、例えばグッド（Ｇｏｏｄ）ら（１９６６年） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：４６７頁およびグッド（Ｇｏｏｄ）およびイザワ（Ｉｚａｗａ）（１９７２年） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４：６２頁を参照のこと。典型的な緩衝液としては、ＴＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）およびビシン（ＢＩＣＩＮＥ）が挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書における「平衡化緩衝液」は、標的タンパク質を含有するソース液体のロードのためのＦｃ結合試薬、固相、またはそれら双方を調製するために用いられる緩衝液である。平衡化緩衝液は、好ましくは等張性であり、一般に約６〜約８の範囲内のｐＨを有する。「ローディング緩衝液」は、Ｆｃ領域含有タンパク質および不純物を含有するソース液体を、Ｆｃ結合剤が固定化された固相上にロードするのに用いられる緩衝液である。平衡化およびローディング緩衝液は同一であることが多い。「溶出緩衝液」は、Ｆｃ領域含有タンパク質を固定化Ｆｃ結合剤から溶出するのに用いられる。好ましくは、溶出緩衝液は、低いｐＨを有することからＦｃ結合剤と目的タンパク質の間の相互作用を破壊する。好ましくは、低いｐＨの溶出緩衝液は約２〜約５の範囲内、最も好ましくは約３〜約４の範囲内のｐＨを有する。ｐＨをこの範囲内に調節する緩衝液の例として、グリシン緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液およびアンモニウム緩衝液、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。好ましいかかる緩衝液は、クエン酸緩衝液および酢酸緩衝液、最も好ましくはクエン酸ナトリウム緩衝液または酢酸ナトリウム緩衝液である。高ｐＨ緩衝液（例えば９以上のｐＨを有するもの）あるいは目的タンパク質の溶出用として、ＭｇＣｌ₂（２ｍＭ）などの化合物または組成物を含有する緩衝液を含む他の溶出緩衝液が検討されている。

本明細書で用いられる「洗浄液体」または「洗浄緩衝液」はいずれも本明細書中で、標的物質の結合対象のクロマトグラフィー樹脂から不純物を除去するのに用いられる液体を示す。２種以上の洗浄液体を、クロマトグラフィー樹脂に非特異的会合性の多種多様な不純物の解離および除去のために設計された、例えばｐＨ、電導度、溶媒濃度などの様々な特性を有する洗浄液体を連続させることにより連続的に用いてもよい。

本明細書における「溶出液体」または「溶出緩衝液」は、クロマトグラフィー樹脂を１種もしくは複数種の洗浄液体での洗浄後にこのクロマトグラフィー樹脂から標的物質を解離するのに用いられる液体を示す。溶出液体が作用することで、標的物質が不可逆的な変性を伴うことなく解離される。典型的な溶出液体は、クロマトグラフィー技術において周知であり、より高濃度の塩、遊離性親和性リガンドまたは類似体、あるいは標的物質のクロマトグラフィー樹脂からの解離を促進する他の物質を有しうる。「溶出条件」は、標的物質を結合したクロマトグラフィー樹脂とかかる解離をもたらす溶出液体または溶出緩衝液との接触など、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から解離させる、標的物質を結合したクロマトグラフィー樹脂上にロードされるプロセス条件を示す。

本明細書における「洗浄液体」または「洗浄緩衝液」は、精製プロセスの完了後にクロマトグラフィー樹脂の洗浄に用いられる液体を示す。洗浄液体は、界面活性剤（洗剤）、ウイルス不活化剤または比較的高濃度の塩を含有する場合があり、かつ精製プロセスの間に用いられる液体よりも高いｐＨまたは低いｐＨを有しうる。その目的は、クロマトグラフィー樹脂を浄化することでその再使用のための準備することである。典型的な洗浄液体は、クロマトグラフィーの技術分野において周知である。

本明細書における「保存液体」または「保存緩衝液」は、クロマトグラフィー樹脂が使用の間で懸濁される場合の液体を示す。保存液体は、イオンの緩衝化に加え、殺菌剤または他の保存剤も含有しうる。かかる保存液体はクロマトグラフィー技術分野で周知である。

様々な態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むタンパク質を、同タンパク質をＦｃ結合剤に吸着した後、Ｆｃ結合剤を二価カチオン塩を含有する緩衝溶液で洗浄して１種もしくは複数種の不純物を除去し、次いでタンパク質をＦｃ結合剤から回収することにより、タンパク質および１種もしくは複数種の不純物を含有するソース液体から精製するための方法を特徴とする。適切なＦｃ結合剤としては、プロテインＡおよびプロテインＧが挙げられるがこれらに限定されない。

本発明は、Ｆｃ領域含有タンパク質、例えば抗体を精製するためのプロセスを特徴とする。典型的な精製プロセスとしては親和性クロマトグラフィーステップが挙げられる。親和性クロマトグラフィーステップは、連続、不連続、またはそれらの組み合わせであってもよい。例えば、親和性クロマトグラフィーステップを例えばバッチプロセスなどの不連続プロセスとして実施してもよい。親和性クロマトグラフィーは、バイオセレクティブ（ｂｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）吸着および続く標的化合物の固定化リガンドからの回収のプロセスである。このプロセスは、標的化合物の高度に特異的かつ効率的な精製を可能にする。このプロセスは、穏やかな条件下での回収を可能にしつつ、一般に１０^-4〜１０^-8の範囲内の解離定数を有する標的化合物（例えばＦｃ領域含有タンパク質）に結合する適度に選択的なリガンド（例えばＦｃ結合剤）の使用を必要とする。リガンドは、一般に、カラムパッキングまたはバッチ式吸着媒体の形態でありうるビーズ状の多孔質マトリックス上に固定化される。

好ましい結合剤はプロテインＡである。プロテインＡは免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する。プロテインＡは６つの領域からなり、その内の５つはＩｇＧに結合する。それはヒトＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂およびＩｇＧ₄、ならびにマウスＩｇＧ_2a、ＩｇＧ_2bおよびＩｇＧ₃に対して高い親和性で結合する。プロテインＡは、ヒトＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥならびにマウスＩｇＧ₁に対して中程度の親和性で結合する。親和性リガンドとして、プロテインＡはマトリックスにこれらの領域が自由に結合するように固定化される。固定化プロテインＡの１分子がＩｇＧの少なくとも２種の分子に結合しうる。プロテインＡの天然および組換え変異体は、ＩｇＧのＦｃ領域に対して類似した特異性を共有する。組換えプロテインＡ（ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ）を、例えばＣ−末端システインを含むように設計し、かつ固相マトリックスに対するチオエステルカップリング（結合）を介して固定化することが可能である。かかるカップリングの結果、プロテインＡの結合能が高められる。

別の結合剤がプロテインＧである。プロテインＧはＩｇＧに特異的であり、それは高い親和性でヒトＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃およびＩｇＧ₄、ならびにマウスＩｇＧ₁およびＩｇＧ₃に対して結合する。プロテインＧ ＰＬＵＳは、ヒトＩｇＧ₄ならびにマウスＩｇＧ_2a、ＩｇＧ_2bおよびＩｇＧ₃に対して中程度の親和性を有する。組換えプロテインＧ（ｒＰｒｏｔｅｉｎＧ）において天然タンパク質のアルブミン−結合領域を削除するように設計可能である。組換えプロテインＧは２つのＦｃ結合領域を有する。

別の結合剤としてプロテインＡ／Ｇが挙げられる。プロテインＡ／Ｇは、プロテインＡとプロテインＧの双方のＩｇＧ結合特性を組み合わせた、遺伝子操作されたタンパク質である。それは非病原性形態のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から分泌される遺伝子融合産物である。プロテインＡ／Ｇは、プロテインＡ由来の４つおよびプロテインＧ由来の２つのＦｃ結合ドメインを有する。プロテインＡ／ＧはプロテインＡとしてのｐＨ依存性を示さないが、それ以外はプロテインＡおよびＧの相加的特性を有する。

プロテインＡ／ＧはすべてのヒトＩｇＧサブクラスに結合し、サブクラスが決定されていないポリクローナルまたはモノクローナルＩｇＧ抗体の精製に特に適する。さらに、それはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよび（より少ない程度に）ＩｇＤに結合する。プロテインＡ／ＧはすべてのマウスＩｇＧサブクラスにも十分に結合し、マウスモノクローナル抗体のＩｇＧサブクラスからの精製に特に適し、ここではＩｇＡ、ＩｇＭおよびマウス血清アルブミンからの干渉を伴うことはない（例えば、シッキマ（Ｓｉｋｋｅｍａ）（１９８９年） Ａｍｅｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌａｂ ７、４２頁を参照）。マウスモノクローナルの個々のサブクラスは、プロテインＡまたはプロテインＧのいずれかよりもキメラプロテインＡ／Ｇに対してより強い親和性を有しうる（例えばエリアッソン（Ｅｌｉａｓｓｏｎ）ら（１９８８年） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、４３２３〜４３２７頁を参照）。

本発明では、固定化されたＦｃ結合剤（例えばプロテインＡ）を二価カチオン塩の溶液で洗浄することで不純物が除去される。特に、組換え抗体発現技術の結果として生成される望ましくない不純物が二価カチオン塩での洗浄ステップを用いて除去可能であることが発見されている。

本発明の方法は、場合により、親和性クロマトグラフィーおよび二価カチオン洗浄ステップ後に精製ステップを含みうる。次の精製ステップは、イオン交換クロマトグラフィーステップおよび／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ステップを含みうる。次のクロマトグラフィーステップは、連続、不連続（例えばバッチプロセスなど）、またはそれらの組み合わせであってもよい。イオン交換クロマトグラフィーでは、タンパク質の総電荷間の相違に基づき分子が分離される。標的タンパク質は、結合目的に樹脂に付着された官能基の電荷の逆電荷を有する必要がある。例えば、一般に全体として正電荷を有する抗体は、負に帯電した官能基を有するカチオン交換体に十分に結合することになる。この相互作用がイオン性であることから、低イオン性条件下で結合が生じる必要がある。溶出は、イオン強度を高めてイオン相互作用を破壊するかまたはタンパク質のｐＨを変化させることによってなされる。

イオン交換クロマトグラフィーがタンパク質の電荷に依存することでタンパク質が単離される一方、疎水性相互作用クロマトグラフィーでは一部のタンパク質の疎水特性が用いられる。タンパク質上の疎水基はカラム上の親水基に結合する。タンパク質の疎水性が高まると、そのカラムへの結合が強まることになる。ＨＩＣステップでは、例えば宿主細胞由来の不純物（例えばＤＮＡや他の高分子量および低分子量生成物の関連種）が除去される。さらなる精製ステップは、本明細書に記載のように、ウイルス除去ステップならびに限界濾過および／または透析濾過ステップを含みうる。

様々な実施形態では、Ｆｃ領域を有するタンパク質は、Ｆｃ領域を有する抗体または抗体融合タンパク質であり、これはＦｃ結合剤のＦｃ受容体に結合する。二価カチオン塩を含有する緩衝溶液を用いてＦｃ結合剤を洗浄することで、例えば目的タンパク質（例えばソース液体中の標的物質）におけるリードスルー変異体および（ＬＭＷおよびＵＤＢ種を含む）定常領域を含有する断片などの不純物の大幅な除去が可能になる。

本発明の方法は、１つもしくは複数のクロマトグラフィー分離ステップを含むことに加え、Ｆｃ領域を有するタンパク質（「標的タンパク質」）をソース液体中の不純物から分離するための１つもしくは複数の濾過ステップを含みうる。例えば、ソース液体を濾過するか、遠心分離するか、またはそれ以外の処理を行うことで、ソース液体とＦｃ結合剤との接触前に微粒子残渣などを除去することが可能である。例えば、組換え技術を用い、タンパク質を細胞内、ペリプラスム空間内で生成するか、または培地内に直接分泌してもよい。もしタンパク質が細胞内で生成される場合、宿主細胞または溶解断片といった微粒子残渣を、例えば遠心分離または限界濾過によって除去してもよい。タンパク質が培地内に分泌される場合、組換え宿主細胞を、例えばタンジェンシャルフロー濾過（tangential flow filtration）により細胞培地から分離してもよい。

様々な実施形態では、標的タンパク質を含有するソース液体は、標的タンパク質がＦｃ結合剤（例えば固定化Ｆｃ結合剤）に吸着するようにＦｃ結合剤と接触される（好ましくは固相上に固定化されかつ適切な緩衝液で平衡化される）。ソース液体は、平衡化緩衝液と同一でありうるローディング緩衝液中のＦｃ結合剤（例えば固定化Ｆｃ結合剤）と接触される。不純物を含有するソース液体が固相を貫流すると、標的タンパク質はＦｃ結合剤に吸着され、様々な他の不純物（標的タンパク質が組換え宿主細胞内で生成される場合の宿主細胞タンパク質または他のプロセス由来の不純物など）が貫流するかまたは固相に非特異的に結合する。様々な実施形態では、Ｆｃ結合剤はプロテインＡであり、平衡化緩衝液は２０ｍＭトリス（Tris）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５でありうる。他の適切な平衡化緩衝液としては、生理的濃度、例えば約０．５ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲内の濃度（例えば、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭなど）、生理的塩濃度（例えば約０．１５ｍＭ ＮａＣｌ）、および５．０〜９．０のｐＨにて、例えばＢＩＳ、ヘペスなどが挙げられる。

固相は、好ましくはＦｃ結合剤を固定化するためのアガロース（例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズまたは粒子である。様々な実施形態では、カラムをグリセリンなどの試薬でコーティングすることで、カラムへの非特異的付着性が低下するかまたは阻止される。様々な実施形態では、Ｆｃ結合剤はプロテインＡである。アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から市販されているｒｍｐプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＦＦ）カラムは、特徴的方法での使用に適するプロテインＡカラムの一例である。

次いで、Ｆｃ結合剤を二価カチオン塩を含有する緩衝化洗浄溶液で洗浄することで、固相またはＦｃ結合剤に結合したタンパク質変種が除去される。特に、二価カチオン塩洗浄ステップを用い、大量の望ましくない不純物の除去が可能であることが発見されている。具体的には、二価カチオン塩洗浄を用い、標的タンパク質のイントロンリードスルー変異体、低分子量変異体およびアンダージスルフィド結合変異体の除去が可能であることが発見されている。さらに、二価カチオン塩洗浄を用い、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡも除去可能である。様々な実施形態では、洗浄溶液中の二価カチオン塩はカオトロピック塩を含有する。適切なカオトロピック塩の例として、塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）、ニッケル塩化物（ＮｉＣｌ₂）および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ₂）が挙げられるがこれらに限定されない。単一の二価カチオン塩が洗浄溶液中に存在しうる一方、様々な実施形態では２種類以上の二価カチオン塩を用いることが可能である。

様々な実施形態では、二価カチオン塩を含有する洗浄溶液に加えて洗浄溶液を用いることで不純物が除去される。例えば、様々な実施形態では、二価カチオン塩を含有する洗浄溶液でのＦｃ結合剤の洗浄前、洗浄後、または洗浄前と洗浄後の双方において、２０〜５０ｍＭトリス、０．７５〜２．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０〜９．０溶液、および／または１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５溶液を用いてＦｃ結合剤が洗浄される。

様々な実施形態では、約０．５Ｍ〜約２．５Ｍの濃度の二価カチオン塩は、好ましくは約５〜約９の範囲内のｐＨおよび好ましくは約７〜約８の範囲内のｐＨを有するｐＨ緩衝溶液に添加される。二価カチオン塩の好ましい濃度としては、０．６Ｍ、２．０Ｍおよび２．５Ｍが挙げられるがこれらに限定されない。この目的に適する緩衝液としては、２０〜５０ｍＭの濃度内のトリスまたは酢酸塩緩衝液が挙げられるがこれらに限定されない。

洗浄ステップ後、標的タンパク質はＦｃ結合剤から回収される。これは通常、適切な溶出緩衝液を用いて行われる。標的タンパク質を、例えば低いｐＨ、例えば約２〜約６．５の範囲内、および好ましくは約２．５〜約３．５の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液を用いてカラムから溶出させてもよい。

様々な実施形態では、このようにして回収された標的タンパク質を医薬的に許容できる担体中で調合し、かかる分子における既知の様々な診断用途、治療用途または他の用途として用いてもよい。

様々な実施形態では、Ｆｃ結合剤のクロマトグラフィーステップ後、溶出された標的タンパク質調製物に追加の精製ステップを施してもよい。例えば、典型的なさらなる精製ステップとしては、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、透析、親和性クロマトグラフィー（固定化金属親和性クロマトグラフィーを含む）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、クロマトフォーカシング、限界濾過、透析濾過、およびゲル濾過が挙げられるがこれらに限定されない。様々な実施形態では、Ｆｃ結合剤クロマトグラフィーステップ後にアニオン交換クロマトグラフィーおよびＨＩＣステップが行われる。様々な実施形態では、クロマトグラフィーステップ後、さらにウイルス濾過ステップ、限界濾過／透析濾過ステップ、および微生物汚染物質濾過ステップが行われる。様々な実施形態では、これらの追加の精製ステップは、Ｆｃ結合剤クロマトグラフィーステップに先立ち実施可能である。様々な態様では、本明細書の方法は、プロテインＡクロマトグラフィーにより不純物からＦｃ領域含有タンパク質を精製することを含む。

様々な実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質（標的タンパク質）を精製するための方法では、標的タンパク質を固相上に固定化されたプロテインＡを含有するＦｃ結合剤に吸着させるステップに始まり、その後、Ｆｃ結合剤を二価カチオン塩を含有する緩衝溶液で洗浄して１種もしくは複数種の不純物を除去するステップ、次いでタンパク質をプロテインＡから回収して第１の溶離液プールを生成するステップが行われる。

様々な実施形態では、精製プロセスでは、アニオン交換樹脂と第１の溶離液プールとを、不純物が樹脂に吸着しても標的タンパク質が樹脂に吸着しないように接触させることにより、第１の溶離液プールにアニオン交換クロマトグラフィーを施すステップが続行される。したがって、標的タンパク質をフロースルーから回収することで第２の溶離液プールを生成してもよい。様々な実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーステップは、アニオン交換樹脂を緩衝化洗浄溶液で洗浄して吸着された標的タンパク質の少なくとも一部を回収するステップをさらに含み、次いでそれは第２の溶離液プールと結合される。あるいは、第１の溶離液プールは抗体が吸着するようにアニオン交換樹脂と接触可能であり、それにより任意の不純物のフロースルーが可能であり、場合により吸着された抗体の洗浄および溶出が続く。

様々な実施形態では、精製プロセスでは、標的タンパク質を疎水性相互作用樹脂（例えば、疎水性リガンドで機能化された固相）に吸着させることにより、第２の溶離液プールにＨＩＣを施すステップが続行され、疎水性相互作用樹脂を標的タンパク質を実質的に溶出しないイオン強度を有する緩衝化洗浄溶液で洗浄し、かつ（典型的には標的タンパク質をこの疎水性相互作用樹脂から脱着するのに十分に低いイオン強度を有する溶出緩衝液を用いて）第３の溶離液プールに標的タンパク質を回収する。あるいは、第２の溶離液プールは標的タンパク質が吸着しないようにＨＩＣカラムと接触可能であり、それによりフロースルーの標的タンパク質が第３の溶離液プールとして回収される。

様々な実施形態では、精製プロセスは、例えば、ウイルスを除去し、標的タンパク質を含有する溶液を濃縮、緩衝化し、かつ微生物汚染物質を除去するための１つもしくは複数の濾過ステップを含む。

様々な実施形態では、本発明は、Ｆｃ領域を有するタンパク質を、タンパク質および１種もしくは複数種の不純物（ここで、この不純物は１種もしくは複数種のＩＲＴ変異体を含有する）を含有するソース液体から精製するための方法を提供する。一実施形態では、この方法はソース液体中でのＩＲＴ変異体レベルから約１／２〜約１／２０への低下をもたらす。好ましくは、ＩＲＴ変異体レベルは少なくとも１／５に低下し、かつより好ましくはＩＲＴ変異体レベルは少なくとも１／１０に低下する。例えば、（ソース液体中の種全体における百分率として）約３〜５％のＩＲＴ抗体変異体を有するソース液体（出発試料）中で、ＩＲＴ抗体変種は約０．３〜約０．５％にまで低下しうる。様々な実施形態では、ＩＲＴ変種は１％未満、０．８％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、および／または０．１％未満に低下する。好ましくは、タンパク質を調製するためのソース液体の精製において、ＩＲＴ変異体はソース液体中の種全体における百分率として１％未満、０．８％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、および／または０．１％未満に低下する。

様々な実施形態では、本発明は、Ｆｃ領域を有するタンパク質を、タンパク質および１種もしくは複数種の不純物（ここで、この不純物は１種もしくは複数種のＬＭＷ変異体を含有する）を含有するソース液体から精製するための方法を提供する。一実施形態では、この方法はソース液体中でのＬＭＷ変異体レベルから約１／２〜約１／２０の低下をもたらす。好ましくは、ＬＭＷ変異体レベルは少なくとも１／５に低下し、かつより好ましくはＬＭＷ変異体レベルは少なくとも１／１０に低下する。

例えば、（ソース液体中の種全体の百分率として）約２０％のＵＤＢ抗体変異体を有するソース液体（出発試料）中で、ＵＤＢ抗体変種が約１０％〜約２％に低下しうる。様々な実施形態では、ＵＤＢ変種は２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、または１％未満に低下する。好ましくは、タンパク質の調製におけるソース液体の精製物中のＵＤＢ変異体は、ソース液体中の種全体の百分率として２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、または１％未満に低下する。

例えば、（ソース液体中の種全体における百分率として）約３〜５％のＬＭＷ抗体変異体を有するソース液体（出発試料）中で、ＬＭＷ抗体変種は約０．３〜約０．５％にまで低下しうる。様々な実施形態では、ＬＭＷ変種は１％未満、０．８％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、および／または０．１％未満に低下する。好ましくは、タンパク質を調製するためのソース液体の精製において、ＬＭＷ変異体はソース液体中の種全体における百分率として１％未満、０．８％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、および／または０．１％未満に低下する。

様々な実施形態では、本発明は、Ｆｃ領域を有するタンパク質を、タンパク質および１種もしくは複数種の不純物（ここで、この不純物は１種もしくは複数種のＵＤＢ変異体を含有する）を含有するソース液体から精製するための方法を提供する。一実施形態では、この方法はソース液体中でのＵＤＢ変異体レベルから約１／２〜約１／２０の低下をもたらす。好ましくは、ＵＤＢ変異体レベルは少なくとも１／５に低下し、かつより好ましくはＵＤＢ変異体レベルは少なくとも１／１０に低下する。

例えば、（ソース液体中の種全体における百分率として）約２０％のＵＤＢ抗体変異体を有するソース液体（出発試料）中で、ＵＤＢ抗体変種は約１０％〜約２％にまで低下しうる。様々な実施形態では、ＵＤＢ変種は２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、または１％未満に低下する。好ましくは、タンパク質を調製するためのソース液体の精製において、ＵＤＢ変異体はソース液体中の種全体における百分率として２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、または１％未満に低下する。

さらに、例えば（ソース液体中の種全体における百分率として）約３〜５％のＵＤＢ抗体変異体を有するソース液体（出発試料）中で、ＵＤＢ抗体変種は約０．３〜約０．５％にまで低下しうる。様々な実施形態では、ＵＤＢ変種は１％未満、０．８％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、および／または０．１％未満に低下する。好ましくは、タンパク質を調製するためのソース液体の精製において、ＵＤＢ変異体はソース液体中の種全体における百分率として１％未満、０．８％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、および／または０．１％未満に低下する。

（本発明の精製方法において用いられるタンパク質）
本明細書に記載の本発明に従って精製されるべきＦｃ領域を有するタンパク質は、当該技術分野で十分に確立されており、例えば合成技術（組換え技術およびペプチド合成またはこれらの技術の組み合わせなど）を含む技術を用いて調製されるか、またはタンパク質の内因性ソースから単離されうる。本発明の特定の実施形態では、Ｆｃ領域を有するタンパク質は、抗原結合ポリペプチド、より好ましくは抗体である。抗体は、例えばポリクローナル抗体調製物、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。抗原結合ポリペプチド、および特に抗体を産生するための技術は以下に記載される。あるいは、Ｆｃ領域を有するタンパク質は、二重特異的抗体（bispecific antibody）、抗体結合体または抗体融合タンパク質（例えばＦｃ融合タンパク質）などの修飾形態の抗体であってもよい。かかる修飾形態の抗体および抗体融合タンパク質を産生するための技術もまた以下に記載される。

（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体を、免疫原で適切な被験体を免疫することにより調製してもよい。免疫された被験体における抗体力価を、例えば固定化された標的抗原を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いた標準技術により経時的に長期にわたり監視してもよい。標的抗原に特異的な抗体分子を、必要に応じて哺乳動物から（例えば血液から）単離し、さらにプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーなどの周知の技術により精製して抗体、例えばＩｇＧの画分を取得してもよい。免疫後の適切な時間、例えば抗−抗原抗体力価が最大である場合、抗体産生細胞を被験体から取得し、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５年） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７頁）に最初に記載されたハイブリドーマ技術など（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら（１９８１年） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９〜４６頁；ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら（１９８０年） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０〜８３頁；イェー（Ｙｅｈ）ら（１９７６年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：２９２７〜３１頁；およびイェー（Ｙｅｈ）ら（１９８２年） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９：２６９〜７５頁も参照）の標準技術によりモノクローナル抗体を調製するのに用いてもよい。キメラポリクローナル抗体の調製においては、ベクラー（Ｂｕｅｃｈｌｅｒ）ら、米国特許第６，４２０，１１３号明細書を参照のこと。

（モノクローナル抗体）
リンパ球と不死化細胞株を融合させるために用いられる多数の周知のプロトコルのうちのいずれかを、モノクローナル抗体を産生する目的で適用してもよい（例えば、Ｇ．ガルフレ（Ｇ．Ｇａｌｆｒｅ）ら（１９７７年） Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０５２頁；ゲフター（Ｇｅｆｔｅｒ）ら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ、上記；レーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）、Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、上記；ケネス（Ｋｅｎｎｅｔｈ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、上記を参照）。さらに、当業者は、かかる方法には多数のバリエーションがあり、これらもまた有用であることを理解するであろう。典型的には、不死化細胞株（例えば骨髄腫細胞株）はリンパ球と同じ哺乳類種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマを本発明の免疫原性調製物で免疫されたマウス由来のリンパ球と不死化マウス細胞株との融合により作製してもよい。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性を示すマウス骨髄腫細胞株である。多数の骨髄腫細胞株（例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）のいずれかを、標準技術に従い融合パートナーとして用いてもよい。これらの骨髄腫株はＡＴＣＣから入手可能である。典型的には、ＨＡＴ−感受性のマウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞に融合される。次いで、融合物から得られるハイブリドーマ細胞がＨＡＴ培地を用いて選択され、それは未融合骨髄腫細胞および非生産的に融合された骨髄腫細胞を死滅させる（未融合脾細胞は形質転換されていなため数日後に死滅する）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いた、ハイブリドーマ培養上清を標的抗原に結合する抗体についてスクリーニングすることにより検出される。

（組換え抗体）
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製に代わり、モノクローナル抗体を、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）を標的抗原によりスクリーニングすることによって標的抗原に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより、同定し、単離してもよい。ファージディスプレイライブラリの生成およびスクリーニングのためのキットは市販されている（例えば、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；およびストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。さらに、特に抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングでの使用に準じた方法および試薬の例が、例えば、ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）ら、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；カン（Ｋａｎｇ）ら、ＰＣＴ国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；ダウワー（Ｄｏｗｅｒ）ら、ＰＣＴ国際公開第９１／１７２７１号パンフレット；ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら、ＰＣＴ国際公開第９２／２０７９１号パンフレット；マークランド（Ｍａｒｋｌａｎｄ）ら、ＰＣＴ国際公開第９２／１５６７９号パンフレット；ブレイトリング（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ）ら、ＰＣＴ国際公開第９３／０１２８８号パンフレット；マッカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、ＰＣＴ国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；ガラード（Ｇａｒｒａｒｄ）ら、ＰＣＴ国際公開第９２／０９６９０号パンフレット；ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）ら、ＰＣＴ国際公開第９０／０２８０９号パンフレット；フックス（Ｆｕｃｈｓ）ら（１９９１年） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０〜１３７２頁；ヘイ（Ｈａｙ）ら（１９９２年） Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１〜８５頁；フセ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１頁；グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）ら（１９９３年） ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５〜７３４頁；ホーキンス（Ｈａｗｋｉｎｓ）ら（１９９２年） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９〜８９６頁；クラークソン（Ｃｌａｒｋｓｏｎ）ら（１９９１年） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８頁；グラム（Ｇｒａｍ）ら（１９９２年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３５７６〜３５８０頁；ガラッド（Ｇａｒｒａｄ）ら（１９９１年） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３〜１３７７頁；フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら（１９９１年） Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：４１３３〜４１３７頁；バーバス（Ｂａｒｂａｓ）ら（１９９１年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８〜７９８２頁；およびマッカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ （１９９０年）３４８：５５２〜５５４頁にて見出されうる。

（キメラおよびヒト化抗体）
さらに、標準の組換えＤＮＡ技術を用いて作製可能な、ヒト部分と非ヒト部分の双方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体は、本発明の範囲内にある。

「ヒト化免疫グロブリン」または「ヒト化抗体」という用語は、少なくとも１種のヒト化免疫グロブリンまたは抗体鎖（すなわち、少なくとも１種のヒト化軽鎖または重鎖）を含む免疫グロブリンまたは抗体を示す。「ヒト化免疫グロブリン鎖」または「ヒト化抗体鎖」（すなわち「ヒト化免疫グロブリン軽鎖」または「ヒト化免疫グロブリン重鎖」）という用語は、実質的にヒト免疫グロブリンまたは抗体に由来する可変フレームワーク領域と実質的に非ヒト免疫グロブリンまたは抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは２つのＣＤＲ、より好ましくは３つのＣＤＲ）とを含む可変領域を有する免疫グロブリンまたは抗体鎖（すなわち各々、軽鎖または重鎖）を示し、さらに定常領域（例えば、軽鎖の場合に少なくとも１つの定常領域またはその一部、および重鎖の場合に３つの定常領域）を含む。「ヒト化可変領域」（例えば「ヒト化軽鎖可変領域」または「ヒト化重鎖可変領域」）という用語は、実質的にヒト免疫グロブリンまたは抗体に由来する可変フレームワーク領域と実質的に非ヒト免疫グロブリンまたは抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む可変領域を示す。

「実質的にヒト免疫グロブリンまたは抗体に由来する」または「実質的にヒト」という表現は、同領域が、比較目的でヒト免疫グロブリンまたは抗体のアミノ配列に整列される場合、ヒトフレームワークまたは定常領域配列と少なくとも８０〜９０％、９０〜９５％、または９５〜９９％の同一性（すなわち局所的配列の同一性）を共有することから、例えば保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換、逆突然変異などが可能になることを意味する。保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換、逆突然変異などの導入は、ヒト化抗体または鎖の「最適化」と称される場合が多い。「実質的に非ヒト免疫グロブリンまたは抗体に由来する」または「実質的に非ヒト」という表現は、非ヒト生物、例えば非ヒト哺乳動物の免疫グロブリンまたは抗体の配列に対して少なくとも８０〜９５％、好ましくは少なくとも９０〜９５％、より好ましくは９６％、９７％、９８％、または９９％同一である同配列を有することを意味する。

したがって、ヒト化免疫グロブリンまたは抗体、あるいはヒト化免疫グロブリンまたは抗体鎖のすべての領域または残基が、ＣＤＲを除き、１つもしくは複数の天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する領域または残基に実質的に同一である。「対応する領域」または「対応する残基」という用語は、第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列上の領域または残基と同じ（すなわち等価な）位置を占める第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列上の領域または残基を示し、これは第１および第２の配列が比較目的で最適に整列される場合である。

「有意な同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列が、例えばデフォルトギャップ重み（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔｓ）を用いてプログラムのＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列される場合、少なくとも５０〜６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０〜７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０〜８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０〜９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、およびさらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性またはそれを超える配列同一性（例えば、９９％もしくはそれを超える配列同一性）を共有することを意味する。「実質的な同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列が、例えばデフォルトギャップ重みを用いてプログラムのＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列される場合、少なくとも８０〜９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、およびより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性またはそれを超える配列同一性（例えば、９９％もしくはそれを超える配列同一性）を共有することを意味する。配列比較において、典型的には１つの配列が参照配列としての機能を果たし、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列コーディネート（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）が指定され、かつ配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定のプログラムパラメータに基づいて試験配列における参照配列に対する配列同一性の百分率を計算する。

比較目的の配列の最適なアラインメントを、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁（１９８１年）の局所ホモロジーアルゴリズム、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁（１９７０年）のホモロジーアラインメントアルゴリズム、パールソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４頁（１９８８年）の類似性に対する検索の方法、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実行（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ワイオミング州におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査（一般にオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）により行ってもよい。配列同一性および配列類似性の百分率における判定に適するアルゴリズムの一例としてＢＬＡＳＴアルゴリズムが挙げられ、これはアルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３頁（１９９０年）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公的に入手可能（ナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のＮＣＢＩインターネットサーバーを通して公的に入手可能）である。典型的には、デフォルトプログラムパラメータを用いて配列比較を実行可能であるが、カスタマイズされたパラメータを用いてもよい。ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、アミノ酸配列において、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスが用いられる（ヘニコッフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコッフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５頁（１９８９年）を参照）。

好ましくは、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換の分だけ異なる。アミノ酸置換を保存的または非保存的として分類する目的で、以下のようにグループ分けした：アミノ酸をグループＩ（疎水性側鎖）：ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性の親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖方向に作用する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族性側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラス内のアミノ酸間の置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスのある１つのメンバーと別のメンバーとの交換となる。

好ましくは、ヒト化免疫グロブリンまたは抗体は、対応する非ヒト化抗体の親和性の３倍、４倍または５倍以内の親和性で抗原に結合する。例えば、もし非ヒト化抗体が１０^-9Ｍの結合親和性を有する場合、ヒト化抗体は少なくとも３×１０^-8Ｍ、４×１０^-8Ｍ、５×１０^-8Ｍ、または１０^-9Ｍの結合親和性を有することになる。免疫グロブリン鎖は、無傷免疫グロブリンまたは抗体（またはその抗原結合断片）に対して特異的な結合特性または結合親和性を与える場合、「抗原結合を指示する」と言われる。突然変異（例えば逆突然変異）は、もしそれが重鎖または軽鎖を含む無傷免疫グロブリンまたは抗体（またはその抗原結合断片）の結合親和性に、前記変異のないものに相当する鎖を含む抗体（またはその抗原結合断片）の結合親和性と比べて少なくとも一桁分だけ作用する（例えばそれを低下させる）場合、前記鎖が抗原結合を指示する能力に実質的に作用するといわれる。突然変異は、もし突然変異による鎖を含む無傷免疫グロブリンまたは抗体（またはその抗原結合断片）の結合親和性に対して、前記変異のないものに相当する鎖を含む抗体（またはその抗原結合断片）の結合親和性の２倍、３倍または４倍だけ影響する（例えば低下させる）にすぎない場合、「前記鎖における抗原結合を指示する能力に実質的に影響する（例えば低下させる）ことはない」といわれる。

「キメラ免疫グロブリン」またはキメラ抗体という用語は、可変領域が第１の種に由来しかつ定常領域が第２の種に由来する免疫グロブリンまたは抗体を示す。キメラ免疫グロブリンまたは抗体を、例えば遺伝子工学により、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構成してもよい。「ヒト化免疫グロブリン」または「ヒト化抗体」という用語は、以下に定義されるように、キメラ免疫グロブリンまたは抗体を包含するように意図されていない。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体は、それらの構成においてキメラ的である（すなわち２種以上のタンパク質の種に由来する領域を含む）が、本明細書で定義されるようにキメラ免疫グロブリンまたは抗体において見出されていない追加的な特徴（すなわち、ドナーＣＤＲ残基およびアクセプターフレームワーク残基を含む可変領域）を含む。

かかるキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体を、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術により、例えば、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号明細書；アキラ（Ａｋｉｒａ）ら、欧州特許出願第１８４，１８７号明細書；タニグチ Ｍ．（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｍ．）、欧州特許出願第１７１，４９６号明細書；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、欧州特許出願第１７３，４９４号明細書；ノイバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ら、ＰＣＴ国際公報、国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；キャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；キャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら、欧州特許出願第１２５，０２３号明細書；ベッター（Ｂｅｔｔｅｒ）ら（１９８８年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１〜１０４３頁；リウ（Ｌｉｕ）ら（１９８７年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９〜３４４３頁；リウ（Ｌｉｕ）ら（１９８７年） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１〜３５２６頁；サン（Ｓｕｎ）ら（１９８７年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：２１４〜２１８頁；ニシムラ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）ら（１９８７年） Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９〜１００５頁；ウッド（Ｗｏｏｄ）ら（１９８５年） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６〜４４９頁；およびショー（Ｓｈａｗ）ら（１９８８年） Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３〜１５５９頁）；モリソン Ｓ．Ｌ．（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ．）（１９８５年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２〜１２０７頁；オイ（Ｏｉ）ら（１９８６年） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４頁；ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら（１９８６年） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２〜５２５頁；フェアホーヤン（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ）ら（１９８８年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４頁；およびバイドラー（Ｂｅｉｄｌｅｒ）ら（１９８８年） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３〜４０６０頁にて記載の方法を用いて産生してもよい。

（トランスジェニック動物およびファージディスプレイに由来するヒト抗体）
あるいは、今では免疫時、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全レパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することは可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体の重鎖結合領域（Ｊ_H）遺伝子のホモ接合性欠失が内因性抗体産生の完全な阻害を招くことが記載されている。かかる生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列の免疫グロブリン遺伝子アレイの移入が、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、米国特許第６，１５０，５８４号明細書；米国特許第６，１１４，５９８号明細書；および米国特許第５，７７０，４２９号明細書を参照のこと。

完全ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリから誘導可能である（フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１頁（１９９１年）；マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２２：５８１〜５９７頁（１９９１年））。キメラポリクローナル抗体もまた、ファージディスプレイライブラリから取得してもよい（ビュークラー（Ｂｕｅｃｈｌｅｒ）ら、米国特許第６，４２０，１１３号明細書）。

（二重特異性抗体および抗体結合体）
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。かかる抗体は、完全長の抗体または抗体断片（例えばＦ（ａｂ）’２二重特異性抗体）から誘導可能である。二重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野で既知である。従来からの完全長二重特異性抗体の産生は２つの免疫グロブリンの重鎖−軽鎖ペアの共発現に基づくものであり、この場合、２つの鎖は異なる特異性を有する（ミルスタイン（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７〜５３９頁（１９８３年））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖がランダムに分かれることから、これらのハイブリドーマ（クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａｓ））は異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生する（国際公開第９３／０８８２９号パンフレットおよびトラウネッカー（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：３６５５〜３６５９頁（１９９１年）を参照）。

二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロ結合体」抗体も含む。例えば、ヘテロ結合体内の抗体の一方はアビジンに結合体化され、他方はビオチンまたは他のペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）に結合体化されうる。ヘテロ結合体抗体は、任意の便利な架橋方法を用いて作製可能である。適切な架橋剤は当該技術分野で周知であり、多数の架橋技術とともに米国特許第４，６７６，９８０号明細書中に開示されている。

さらに別の実施形態では、抗体を化学的または遺伝的に反応部分、検出可能部分、または機能部分などのペイロード、例えば免疫毒素に結合体化することで、抗体結合体の生成が可能である。かかるペイロードとしては、例えば免疫毒素、化学療法剤、および放射性同位体が挙げられ、それらのすべては当該技術分野で周知である。

（抗体融合タンパク質）
本発明で用いられるＦｃ領域を有するタンパク質は、非抗体タンパク質またはポリペプチドに融合される抗体の少なくともＦｃ部分を有する融合タンパク質でありうる。例えば、Ｆｃ領域を、受容体に結合可能でありかつＦｃに関連した機能（血清安定性、Ｆｃ受容体結合など）を有する可溶性融合タンパク質が生成されるように、受容体に対するリガンドに融合してもよい。あるいは、Ｆｃ領域を、受容体に対するリガンドに結合（それにより天然受容体と競合）可能でありかつＦｃに関連した機能を有する可溶性融合タンパク質が生成されるように、受容体の細胞外ドメインに融合してもよい。かかるＦｃ融合タンパク質の限定されない例としてエタネルセプト（Ｅｍｂｒｅｌ（登録商標））が挙げられ、それはヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合されるヒトＴＮＦα受容体の細胞外リガンド−結合ドメインを含む。抗体融合タンパク質（当該技術分野ではＦｃ融合タンパク質またはＩｇ融合タンパク質とも称される）は、標準の組換えＤＮＡ技術を用いて調製可能なものであり、当該技術分野で記載されており、例えば米国特許第５，１１６，９６４号明細書、米国特許第５，２２５，５３８号明細書、米国特許第５，３３６，６０３号明細書および米国特許第５，４２８，１３０号明細書（すべてカポン（Ｃａｐｏｎ）らによる）を参照のこと。

（抗ＩＬ−１３抗体）
好ましい実施形態では、本発明に従って精製されるべきＦｃ領域を有するタンパク質は抗−ＩＬ−１３抗体である。抗−ＩＬ−１３抗体は、２００４年６月９日出願の米国仮特許出願第６０／５７８，４７３号明細書および２００４年６月２２日出願の米国仮特許出願第６０／５８１，３７５号明細書（いずれの表題も「ヒトＩＬ−１３に対する抗体およびその使用（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ＩＬ−１３ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）」）に記載されている。これらの出願の内容は参照により援用される。好ましい抗−ＩＬ−１３抗体は、本明細書で様々な場合に「ＩＭＡ」と称されうる。

１つもしくは複数のＩＬ−１３に関連した活性、特にＩＬ−１３のシグナル伝達活性に結合し、中和しかつ／または阻害することが可能な抗体は、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、および喘息関連疾患（例えば線維症、好酸球増多症および粘液産生など）などのＩＬ−１３介在性疾患の治療に有用である。

ＩＬ−１３アンタゴニストであるＩＬ−１３結合物質として、高親和性および高特異性でＩＬ−１３、特にヒトＩＬ−１３に結合する抗体およびその抗原結合断片が挙げられる。本開示の抗体およびその抗原結合断片は、本明細書ではそれぞれ「抗−ＩＬ−１３抗体」および「その断片」とも称される。一実施形態では、抗−ＩＬ−１３抗体またはその断片は、少なくとも１つのＩＬ−１３に関連した活性を低下させ、中和し、かつ／またはそれに拮抗する。例えば、抗−ＩＬ−１３抗体またはその断片は、ＩＬ−１３、例えばＩＬ−１３のエピトープに結合し、ＩＬ−１３とＩＬ−１３受容体複合体（「ＩＬ−１３Ｒ」）、例えばＩＬ−１３受容体（「ＩＬ−１３Ｒαｌ」）およびインターロイキン−４受容体α鎖（「ＩＬ−４Ｒα」）またはそれらのサブユニット（例えば、それぞれＩＬ−１３Ｒα１またはＩＬ−４Ｒα）を含む複合体の間の相互作用（例えば結合）を妨げる。したがって、本明細書に記載の抗体およびその断片を用いることで、ＩＬ−１３とＩＬ−１３受容体複合体またはそのサブユニットの間の相互作用（例えば結合）を妨げ（例えば、阻害するか、遮断するか、そうでなければ低下させる）、それにより機能シグナル伝達複合体の形成を妨げる。

（他の好ましいＦｃ領域含有タンパク質）
別の好ましい実施形態では、本発明に従って精製されるべきＦｃ領域を有するタンパク質は抗−Ａβ抗体である。抗−Ａβ抗体は、ＰＣＴ国際公開第２００２／４６２３７号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００５／０１１８６５１号明細書（表題は双方とも「βアミロイドペプチドを認識するヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｂｅｔａ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）」）に記載されている。これらの出願の内容は参照により援用される。好ましい抗−Ａβ抗体は、本明細書で様々な場合に「ＡＡＢ」および「１２Ａ１１」と称されうる。

他の好ましいＦｃ領域含有タンパク質としては、ヒトにおける治療用途として認められている抗体が挙げられる。かかる抗体としては、腫瘍細胞抗原に結合する抗体、サイトカインに結合する抗体、サイトカイン受容体に結合する抗体および接着タンパク質に結合する抗体が挙げられる。したがって、様々な実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質は、以下からなる群から選択される抗原に結合する抗体またはＦｃ融合タンパク質であってもよい：ＣＤ３（例えばＯＫＴ３）、ＣＤ５２（例えば、アレムツズマブ；Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ；Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ；Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ＣＤ３３（例えば、ゲムツズマブ；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ；Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）；トシツモマブ；Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）；イブリツモマブ；Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、ＨＥＲ−２（例えば、トラツズマブ；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ＴＮＦα（例えば、アダリムマブ；Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、インフリキシマブ；Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）；エタネルセプト；Ｅｍｂｒｅｌ（登録商標））、ＣＤ２５（例えば、ダクリズマブ；Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）；バシリキシマブ；Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、ＲＳＶ（例えば、パリビズマブ；Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、ＩｇＥ（例えば、オマリズマブ；Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））、ｇｐ Ｉｌｂ／ＩＩＩａ（例えば、アブシキシマブ；Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標））、ＣＤ１１ａ（例えば、エファリズマブ；Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標））およびα４インテグリン（例えば、ナタリズマブ；Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））。

先のポリペプチド分子のいずれかの単独使用または併用が、本発明に従うＦｃ領域を有するタンパク質としての調製に適すると理解されている。

本発明の様々な態様および実施形態は、以下の実施例によりさらに説明される。実施例は、例示目的であって限定目的で提供されるものではない。

以下の実施例はあくまでも例示目的で提供される。実施例は３つの異なるモノクローナル抗体（ＡＡＢ、１２Ａ１１およびＩＭＡと称される）を用いて提供する。８つの別々の実験について記載し、各々は抗体および不純物の除去の組み合わせを示している。

（材料および方法）
一般に、本発明の実行には、他に指示がない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば免疫グロブリン技術）、および電気泳動における標準技術に関する従来技術が用いられる。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッツ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）（１９８９年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５１０、ポール Ｓ．（Ｐａｕｌ Ｓ．）、ヒュマーナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ）（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、１６９）、マッカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）編、アイアールエル・プレス（Ｉｒｌ Ｐｒ）（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）ら、シーエスエイチエル・プレス（Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ）発行（１９９９年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）（１９９２年）；ブセ（Ｂｏｕｓｓｅ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｚｉｎｇ ｏｎ ａ Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３、１２０７〜１２１２頁（２００１年）；ナップ（Ｋｎａｐｐ）ら、Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ μＴＡＳ ２００１ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、ラムゼイ Ｊ．Ｍ．（Ｒａｍｓｅｙ Ｊ．Ｍ．）およびファンデンベルグ Ａ．（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ Ａ．）、７〜１０頁（２００１年）；およびムハトル（Ｍｈａｔｒｅ）ら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｌｏｃａｔｉｎｇ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｉｎ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖｉａ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、１３（２４）２５０３〜２５１０頁（１９９９年）を参照のこと。

（標的タンパク質の生成）
標的のＦｃ含有タンパク質を、標準の発現方法により、例えば懸濁培養物中で増殖された組換え哺乳類細胞株を用いて生成してもよい。目的のＦｃ含有タンパク質を含有する馴化培地が生成バイオリアクター内で生成される。得られた生成物を、回収し、例えば精密濾過および０．２２μｍの濾過、または遠心分離、パッド濾過および０．２２μｍの濾過などの任意の適切な清澄化ステップを用いて清澄化することが可能である。

（標的タンパク質の精製）
本明細書で例示される標的モノクローナル抗体（ＡＡＢ、１２Ａ１１およびＩＭＡ）の精製は、プロテインＡの親和性クロマトグラフィー上での標的分子の捕捉からなる。これを、ｒｍｐプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、またはＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡから構成してもよい。次いで各実験に記載のように樹脂を洗浄し、生成物を溶出させ、かつ不純物レベルについて試験する。

（標的タンパク質の分析）
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いてＡＡＢモノクローナル抗体試料中に存在するＩＲＴの量を定量する一方、Ｐｒｏ ＡのＨＰＬＣ方法を用いてＩＭＡモノクローナル抗体に対するＩＲＴレベルを測定した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を用い、単量体タンパク質（単量体ＩｇＧ）種、高分子量（ＨＭＷ）種、および低分子量（ＬＭＷ）種の百分率を測定した。変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を行い、試料中のアンダージスルフィド結合（ＵＤＢ）種の相対量を測定した。試験試料中のＨＣＰのレベルを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。

（分析アッセイ：ＩＲＴおよびＵＤＢ）
（逆相ＨＰＬＣ（ＡＡＢ ＩＲＴ分析））
ＲＰ−ＨＰＬＣを以下のように行った。各試料のジスルフィド還元を、２．５ｍＭ ＤＴＴの存在下、４０℃で６０分間のインキュベーションにより行った。アルキル化を５．５ｍＭヨード酢酸の存在下、室温でのインキュベーションにより行った。還元およびアルキル化を行ってから、全試料を１Ｍ ＤＴＴ５μｌでクエンチした。このアッセイでの定量限界は０．５％である。還元しアルキル化した試料各々約４０μｇをＰＯＲＯＳ Ｒ１／Ｈ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに注入し、以下の条件下で７０分間実験した。
カラム：Ｐｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ ＲＰ−ＨＰＬＣ
カラム温度：５０℃；
移動相Ａ：水中、０．１％ＴＦＡ（ｗ／ｖ）；
移動相Ｂ：９５％アセトニトリル中、０．１％ＴＦＡ（ｗ／ｖ）；
流速：１．０ｍＬ／分
検出：２１７ｎｍ
運転時間：７０分
注入：各々、約４０μｇで３連
勾配時間を表１に列挙する。

（プロテインＡ ＨＰＬＣ（ＩＭＡ ＩＲＴ分析））
タンパク質Ａ−ＨＰＬＣを以下のように実施した。ＰＯＲＯＳ Ｐｒｏ Ａカラム上で１注入当たり全体１００μｇを以下の条件下で室温で３５分間実施した。
カラム：Ｐｏｒｏｓ Ｐｒｏ Ａ ４．６×５０ｍｍ
カラム温度：周囲温度
移動相Ａ：５０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ６．０
移動相Ｂ：１０ｍＭギ酸アンモニウム、０．８％ギ酸
流速：２．０ｍｌ／分
検出：２８０ｎｍ
運転時間：３５分
注入：各々、１００μｇで３連勾配時間を表２に列挙する。

（ｄＳＥＣ−ＨＰＬＣ（ＡＡＢ ＵＤＢ分析））
変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを以下のように行った。変性ＳＥＣアッセイ用の試料の前処理として、２００μｇ／ｍＬのタンパク質、３ＭグアニジンＨＣｌ、および１００ｍＭトリス（ｐＨ７．４）の最終濃度での試薬／試料混合物が含まれる。試料を反転により混合しながら８０℃で２０分間加熱した。このアッセイにおいては、２種の対照を用いてＵＤＢレベルの限度設定（ｂｒａｃｋｅｔｉｎｇ）を可能にした。低レベルのＵＤＢおよび高レベルのＵＤＢを伴う内部参照を対照として用いた。

クロマトグラフィー／アッセイ条件は以下の通りであった。
カラム：Ｔｏｓｏｈ ＢｉｏＳｅｐ Ｇ３０００ ＳＷｘｌ
カラム温度：周囲温度
移動相：３ＭグアニジンＨＣｌ、２５ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ６．８
勾配：アイソクラティック
流速：０．５ｍＬ／分
検出：２８０ｎｍ
運転時間：５０分
注入：５０μＬ（１０μｇ）で３連

（実施例１：ＩＲＴ除去（ＡＡＢ）における洗浄緩衝液の比較）
この実施例では、モノクローナル抗体ＡＡＢを含有する不純溶液をプロテインＡカラム上への吸着により精製した後、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂、ＮａＣｌまたはプロピレングリコールのいずれかを含有する洗浄緩衝液を用いて１回目の洗浄を行った。

モノクローナル抗体を含有する培養物を、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）製ＡＥＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステムに接続されたｒｍｐプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦカラム（８．９ｍＬ）を用いて小規模精製した。実験１に記載のすべてのｒｍｐプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦクロマトグラフィーステップにおいては、以下の条件を用いた（個々の実験仕様において例外が認められる）。
カラム寸法−１．０ｃｍ×１１．４ｃｍ
運転流速−１５０ｃｍ／時
平衡化１−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
フラッシュ−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（１カラム容量）
洗浄１−洗浄１を含まない実験＃１を除き一定でない（表３参照）
洗浄２−２０ｍＭトリス、１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
洗浄３−１０ｍＭトリス、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（７カラム容量）
溶出−５０ｍＭグリシン、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．１（６カラム容量）
剥離１−２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．７（５カラム容量）
剥離２−６ＭグアニジンＨＣｌ（２カラム容量）
剥離洗浄−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
保存−１６％エタノール（５カラム容量）
運転温度：２〜８℃

ｒｍｐプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦカラム実験を５カラム容量の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した。約１０ｍｇ生成物／ｍＬ樹脂でカラムにロードした。ロードに続き、１カラム容量を平衡化緩衝液および５カラム容量の洗浄１溶液でフラッシュした。試験したすべての洗浄１溶液の概略を表３に示す。実験＃１を除くすべての実験で洗浄１を含めた。洗浄１の後、５カラム容量の２０ｍＭトリス、１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５および７カラム容量の１０ｍＭトリス、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を続けた。モノクローナル抗体を５０ｍＭグリシン、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．１を用いてカラムから溶出させた。次いで、生成物プールを２Ｍトリス、ｐＨ８．５を用いて７．９〜８．１に中和した。次いで、カラムから剥離し、洗浄し、保存した。表３は、様々な実験から得た生成物プール中に存在するＩＲＴ種およびＬＭＷのレベルを列挙する。

これらの結果は、塩化マグネシウム洗浄および塩化カルシウム洗浄によりＩＲＴおよびＬＭＷ種のレベルが低下する一方、塩化ナトリウム洗浄およびプロピレングリコール洗浄によりＩＲＴまたはＬＭＷ種が低下しないことを示した。

（実施例２：ＩＲＴを除去するためのＣａＣｌ₂洗浄を伴うプロテインＡのクロマトグラフィー）
この実施例では、大規模な抗体精製を、ＩＲＴ種を除去するためのＣａＣｌ₂洗浄を伴うプロテインＡのクロマトグラフィーを用いて行った。

モノクローナル抗体を含有する培養物を、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製Ｋ−Ｐｒｉｍｅ４００クロマトグラフィーシステムに接続されたＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラム（２．４Ｌ）を用いてパイロット規模で精製した。２つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ実験を下記のように行った。
カラム寸法−１３ｃｍ×１８ｃｍ
運転流速−１５０ｃｍ／時、３００ｃｍ／時
平衡化１−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
フラッシュ−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（２カラム容量）
洗浄１−実験＃１では５０ｍＭトリス、２Ｍ ＣａＣｌ₂、ｐＨ７．５、実験＃２では洗浄１を行わない
洗浄２−２０ｍＭトリス、１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
洗浄３−１０ｍＭトリス、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
溶出−５０ｍＭグリシン、２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．１（６カラム容量）
剥離１−５０ｍＭグリシン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．７（５カラム容量）
剥離２−６ＭグアニジンＨＣｌ（２カラム容量）
剥離洗浄−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
保存−１６％エタノール（５カラム容量）
運転温度：２〜８℃

ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラムを５カラム容量の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した。次いで、約１０ｍｇの生成物／ｍＬ樹脂でカラムにロードした。この次に２カラム容量の平衡化緩衝液でフラッシュし、５カラム容量の洗浄１溶液を続けた。実験１ではこの洗浄１溶液が５０ｍＭトリス、２．０Ｍ ＣａＣｌ₂、ｐＨ７．５からなる一方、実験２ではそれをそのまま放置した。次いで、洗浄１は５カラム容量の５０ｍＭトリス、１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５および５カラム容量の１０ｍＭトリス、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を続けた。モノクローナル抗体を、５０ｍＭグリシン、２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．１を用いてＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラムから溶出させた。次いで、生成物プールを２Ｍトリス、ｐＨ８．５を用いて７．８〜８．２に中和した。次いで、カラムを剥離し、洗浄し、保存した。結果を表４に示す。

これらの結果は、パイロット規模での塩化カルシウム洗浄によりＩＲＴが生成物プールから除去されることを示した。

（実施例３：ＩＲＴの除去（ＩＭＡ））
この実施例では、ＣａＣｌ₂洗浄を用いた小規模精製にて、実施例１で用いたモノクローナル抗体（ＩＭＡ）とは異なるものを用いた。

異なるモノクローナル抗体（ＩＭＡ）を含有する培養物を、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）製ＡＥＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒクロマトグラフィーシステムに接続されたＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラム（１７．３ｍｌ）を用いて小規模精製した。以下のように実験を行った。
カラム寸法−１．１ｃｍ×１８．２ｃｍ（１７．３ｍｌ）
運転流速−３００ｃｍ／時
平衡化１−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５．１カラム容量）
洗浄１−２０ｍＭトリス、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
洗浄２−５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．６Ｍ ＣａＣｌ₂、ｐＨ５．０（５カラム容量）
洗浄３−５０ｍＭトリス、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（３カラム容量）
洗浄４−１０ｍＭトリス、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
溶出−５０ｍＭグリシン、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０（５カラム容量）
剥離−６ＭグアニジンＨＣｌ（５カラム容量）
剥離洗浄−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（６カラム容量）
保存−１６％エタノール（５カラム容量）
運転温度：１８〜２４℃

ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラムを５カラム容量の２０ｍＭトリス、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した。約４５ｍｇの生成物／ｍｌ樹脂でカラムにロードした。次いでカラムを以下のとおりに洗浄した：５カラム容量の２０ｍＭトリス、１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、５カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．６Ｍ ＣａＣｌ₂、ｐＨ５．０、３カラム容量の５０ｍＭトリス、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、および５カラム容量の１０ｍＭトリス、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５。生成物を５０ｍＭグリシン、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０を用いてＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラムから溶出させた。次いで、生成物プールを２Ｍトリス、ｐＨ８．０を用いて７．７に中和した。次いで、カラムを剥離し、洗浄し、保存した。結果を表５に示す。この表はロードおよびピークにおけるＩＲＴ種のレベルを提供する。

これらの結果は、０．６Ｍ ＣａＣｌ₂洗浄によりＩＲＴについて１／５への減少がもたらされることを示した。

（実施例４：宿主細胞タンパク質の除去（ＩＭＡ））
この実施例では、ＣａＣｌ₂洗浄がＩＭＡモノクローナル抗体を含有する調製物に由来する宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去する能力について試験した。

モノクローナル抗体を含有する培養物を、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）製ＡＥＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステムに接続されたＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラム（１９ｍｌ）を用いて小規模精製した。以下のように２つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ実験を行った。
カラム寸法−１．１ｃｍ×２０．０ｃｍ（１９ｍｌ）
運転流速−３００ｃｍ／時
平衡化１−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５．０カラム容量）
洗浄１−２０ｍＭトリス、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
洗浄２−５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．６Ｍ ＣａＣｌ₂、ｐＨ５．０（実験２においてのみ５カラム容量）
洗浄３−５０ｍＭトリス、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（２カラム容量）
洗浄４−１０ｍＭトリス、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
溶出−５０ｍＭグリシン、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０（５カラム容量）
剥離−６ＭグアニジンＨＣｌ（５カラム容量）
剥離洗浄−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（６カラム容量）
保存−１６％エタノール（５カラム容量）
運転温度：１８〜２４℃

ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラムを５カラム容量の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した。約４５ｍｇの生成物／ｍｌ樹脂でカラムにロードした。次いで、カラムを５カラム容量の２０ｍＭトリス、１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄し、実験２では５カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．６Ｍ ＣａＣｌ₂、ｐＨ５．０で追加洗浄を用いた。次いでカラムを、溶出に先立ち、５カラム容量の５０ｍＭトリス、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５および５カラム容量の１０ｍＭトリス、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄した。生成物を５０ｍＭグリシン、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０を用いてＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラムから溶出させた。次いで、生成物プールを２Ｍトリス、ｐＨ８．０を用いて７．７に中和した。次いで、カラムを剥離し、洗浄し、保存した。結果を表６に示す。この表は対照実験およびＣａＣｌ₂で洗浄を行った実験において存在するＨＣＰ種のレベルを提供する。

これらの結果は、ＣａＣｌ₂洗浄により対照実験と比較して、ＨＣＰ除去において３倍の増大をもたらすことを示した。

（実施例５：ＤＮＡ除去（ＡＡＢ））
この実施例では、ＣａＣｌ₂洗浄がＡＡＢモノクローナル抗体を含有する調製物から宿主細胞ＤＮＡを除去する能力について試験した。

モノクローナル抗体を含有する培養物をＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）製ＡＥＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステムに接続されたＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラム（１９ｍＬ）を用いて小規模精製した。３つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ実験を下記のように行った。
カラム寸法−１．１ｃｍ×２０ｃｍ
運転流速−３００ｃｍ／時
平衡化１−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
フラッシュ−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（２カラム容量）
洗浄１−５０ｍＭトリス、２．０Ｍ ＣａＣｌ₂、ｐＨ７．５（５カラム容量）（実験２および３のみ）
洗浄２−２０ｍＭトリス、１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）（実験１および３のみ）
洗浄３−１０ｍＭトリス、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（７カラム容量）
溶出−５０ｍＭグリシン、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０（６カラム容量）
剥離−５０ｍＭグリシン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．７（５カラム容量）
剥離洗浄−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
保存−１６％エタノール（５カラム容量）
運転温度：１８〜２４℃

ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラム実験を５カラム容量の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した。次いで、約４０ｍｇの生成物／ｍＬ樹脂のロード量でカラムにロードした。この次に２カラム容量の平衡化緩衝液でフラッシュした。実験２および３においては、このステップに５カラム容量の洗浄１溶液を続けた。実験１および３においては、５カラム容量の洗浄２溶液を用いた。すべての３つの実験においては、７カラム容量の洗浄３溶液を用いた。モノクローナル抗体を、５０ｍＭグリシン、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０を用いてＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラムから溶出させた。次いで、生成物プールを２Ｍトリス、ｐＨ８．５を用いて７．５〜８．０に中和した。次いで、カラムを剥離し、洗浄し、保存した。結果を表７に示す。

これらの結果は、５０ｍＭトリス、２．０Ｍ塩化カルシウム、ｐＨ７．５の添加により、洗浄溶液中のＮａＣｌを用いる場合よりもＤＮＡの１０倍大きい低下がもたらされることを示した。

（実施例６：宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の除去（１２Ａ１１））
この実施例では、ＨＣＰの除去能について様々な洗浄条件を試験した精製実験において第３のモノクローナル抗体１２Ａｌ１を用いた。

９６ウェルフィルタープレート形式でハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を行い、ＭａｂＳｅｌｅｃｔステップにおけるＨＣＰなどの不純物の除去にとって最良の洗浄条件を同定した。このスクリーニングで洗浄用賦形剤、賦形剤濃度、およびｐＨを変化させることで、ＨＣＰなどのプロセスに関連する不純物に対するそれらの作用を測定した。

ＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂を５ｍＭトリス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３を用いて平衡化し、それにカラム内の生成物をロードした。次いで、樹脂を取り出し、混合し、５０μＬの樹脂を９６ウェルフィルタープレートの各ウェルに分配した。各ウェル内の樹脂を５ｍＭトリス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３の溶液中で平衡化し、次いで３段階で、様々な賦形剤の洗浄溶液の各々（各々３００μＬの洗浄緩衝液）で洗浄した。賦形剤の洗浄を行った後、５ｍＭトリス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３の緩衝液で第２の洗浄を、４段階、各３００μＬで行った。次いで、生成物を樹脂から３段階、各３００μＬで溶出させた。溶出段階１および２を組み合わせ、ＨＣＰレベルについて試験した。
樹脂容量−５０μＬ
洗浄用賦形剤−塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム
賦形剤濃度−１００、２５０、５００、１０００、１５００、および２０００ｍＭ
賦形剤ｐＨ−６．０および７．５
溶出緩衝液−２５ｍＭヘペス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０、２５ｍＭヘペス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０、５０ｍＭグリシン、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０、５０ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０および１００ｍＭアルギニン、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０、１００ｍＭアルギニン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０
運転温度：１８〜２４℃

結果を表８および表９に示す。

これらの結果は、塩化カルシウムと塩化マグネシウムの双方により全て添加濃度でｐＨ６．０（表８）およびｐＨ７．５（表９）において、塩化ナトリウムと比べてＭａｂＳｅｌｅｃｔのピークのプール中でのＨＣＰのレベルが低下することを示した。

（実施例７：アンダージスルフィド結合種（ＵＤＢ）の除去）
この実施例では、ＣａＣｌ₂洗浄におけるアンダージスルフィド結合種（ＵＤＢ）を除去する能力について試験した。

実施例１に本質的に記載のように、２つのｒｍｐプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ実験を行った。
カラム寸法−１．０ｃｍ×１１．４ｃｍ
運転流速−１５０ｃｍ／時
平衡化１−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
フラッシュ−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（１カラム容量）
洗浄１−実験１では５０ｍＭ酢酸塩、２．０Ｍ ＣａＣｌ₂、ｐＨ５．０、実験２ではなし
洗浄２−２０ｍＭトリス、１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
洗浄３−１０ｍＭトリス、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（７カラム容量）
溶出−５０ｍＭグリシン、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．１（６カラム容量）
剥離１−２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．７（５カラム容量）
剥離２−６ＭグアニジンＨＣｌ（２カラム容量）
剥離洗浄−２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
保存−１６％エタノール（５カラム容量）
運転温度：２〜８℃

ｒｍｐプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムを５カラム容量の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した。次いで、約１０ｍｇの生成物／ｍＬ樹脂のロード量でカラムにロードした。この次に１カラム容量の平衡化緩衝液でフラッシュし、次いで５カラム容量の洗浄１溶液を用いた。実験１ではこの洗浄１溶液が５０ｍＭ酢酸塩、２．０Ｍ ＣａＣｌ₂、ｐＨ５．０からなる一方、実験２ではそれをそのまま放置した。次いで、洗浄１は５カラム容量の２０ｍＭトリス、１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５および７カラム容量の１０ｍＭトリス、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を続けた。モノクローナル抗体を、５０ｍＭグリシン、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．１を用いてｒｍｐプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦカラムから溶出させた。次いで、生成物プールを２Ｍトリス、ｐＨ８．５を用いて７．８〜８．２に中和した。次いで、カラムを剥離し、洗浄し、保存した。結果を表１０に示す。

５０ｍＭ酢酸塩、２．０Ｍ ＣａＣｌ₂、ｐＨ５．０での追加洗浄を含む実験において、ＵＤＢレベルの１／２への低下が観察された。

（実施例８：他の二価カチオン塩で洗浄される場合のＨＣＰおよびＩＲＴの除去（ＡＡＢ））
この実施例では、ＭｎＣｌ₂またはＮｉＣｌ₂のいずれかを含有する洗浄が、ＡＡＢモノクローナル抗体を含有する調製物から不純物を除去する能力について試験した。

２つの実験を行い、ＭｎＣｌ₂およびＮｉＣｌ₂などの他の二価カチオン塩を含有する洗浄剤の効果を評価した。２つの対照実験も行った。ここで一方では５０ｍＭトリス、１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の洗浄を用い（想定されたＩＲＴまたはＨＣＰの除去はなし）、もう一方では５０ｍＭトリス、２．０Ｍ ＣａＣｌ₂、ｐＨ７．５の洗浄を用いた。

モノクローナル抗体を含有する培養物を、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）製ＡＥＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステムに接続されたＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラム（９ｍＬ）を用いて小規模精製した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ実験を下記のように行った。下記のように、すべての運転パラメータは４つの実験において同一であり、洗浄１は例外で変動させた（表１１）。
カラム寸法−１．０ｃｍ×１１．５ｃｍ（９ｍＬ）
運転流速−３００ｃｍ／時（平衡化、洗浄２、溶出、再生、保存）
運転流速−２３０ｃｍ／時（ロード、フラッシュ、洗浄１）
平衡化１−５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５．０カラム容量）
洗浄１−変動（組成については表１１を参照）
洗浄２−５０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
溶出−５０ｍＭグリシン、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０（３カラム容量）
再生−５０ｍＭ ＮａＯＨ、０．５Ｍ Ｎａ₂ＳＯ₄（５カラム容量）
保存−１６％エタノール、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
運転温度：１８〜２４℃

ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラムを５カラム容量の５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した。約４０ｍｇの生成物／ｍＬ樹脂でカラムにロードした。残存するロードを５カラム容量の５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いてカラムからフラッシュした。次いで、カラムを表１１に記載の溶液の１種で洗浄した。溶出に先立ち、カラムを５カラム容量の５０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄した。生成物を、５０ｍＭグリシン、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０を用いてＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラムから溶出させた。次いで、生成物プールを２Ｍトリス、ｐＨ９．０を用いてｐＨ８．０に中和した。カラムを５カラム容量の５０ｍＭ ＮａＯＨ、０．５Ｍ Ｎａ₂ＳＯ₄で剥離し、次いで５カラム容量の１６％エタノール、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いて保存した。結果を表１１（ＨＣＰ除去）および表１２（ＩＲＴ除去）に示す。

＊ＭｎＣｌ₂およびＮｉＣｌ₂の溶解度によりｐＨ５．０を選択した。

＊ＭｎＣｌ₂およびＮｉＣｌ₂の溶解度によりｐＨ５．０を選択した。

表１１は、二価カチオンを含有する溶液で洗浄した実験において存在するＨＣＰのレベルが対照（１．０Ｍ ＮａＣｌ洗浄）よりも１．５〜３．５倍少ないことを示す。表１２は、二価カチオン塩溶液を有する洗浄を含む実験が、１．０Ｍ ＮａＣｌを含有する洗浄溶液を用いた実験と比べて３．５倍を超えるＩＲＴの除去ももたらすことを示す。したがって、これらの結果は、ＣａＣｌ₂以外の他の二価カチオンを有する（例えば、ＭｎＣｌ₂またはＮｉＣｌ₂を有する）塩洗浄が不純物の除去にも有効であることを示した。

（等価物）
当業者は、単なる通常の実験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多数の等価物について理解するかまたは確認できるであろう。かかる等価物は、添付の特許請求の範囲にて包含されるように意図されている。

Claims (23)

1. Ｆｃ領域を有する抗体を、前記抗体および１種もしくは複数種の不純物を含有するソース液体から精製するための方法であって、
   前記抗体を、プロテインＡおよびプロテインＧのうちの１種もしくは複数種を含有するＦｃ結合剤に吸着させるステップと、
   前記Ｆｃ結合剤を０．５Ｍ〜３Ｍの濃度及び５〜６、６〜８又は８〜９のｐＨを有するＣａＣｌ₂を含有する緩衝溶液で洗浄し、１種もしくは複数種の不純物を除去するステップであって、前記１種もしくは複数種の不純物がイントロンリードスルー変種（ＩＲＴ）、アンダージスルフィド結合種（ＵＤＢ）、低分子量種（ＬＭＷ）、宿主細胞ＤＮＡ及び宿主細胞タンパク質からなる群から選択されるステップと、
   前記抗体を２〜４のｐＨを有する溶出緩衝溶液中に溶出させることによって前記Ｆｃ結合剤から回収するステップと、
   を含む、方法。
2. 前記１種もしくは複数種の不純物がＩＲＴである請求項１に記載の方法。
3. 前記抗体が、抗体融合体、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
4. 前記抗体が抗−ＩＬ−１３抗体である請求項１に記載の方法。
5. 前記抗体がＣＤ３、ＣＤ５２、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＨＥＲ−２、ＴＮＦα、ＣＤ２５、ＲＳＶ、ＩｇＥ、ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ１１ａおよびα４インテグリンからなる群から選択される抗原に結合する請求項１に記載の方法。
6. 前記抗体が組換え生成される請求項１に記載の方法。
7. 前記抗体がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で組換え生成される請求項６に記載の方法。
8. 前記Ｆｃ結合剤がプロテインＡを含む請求項１に記載の方法。
9. 前記Ｆｃ結合剤が固相上に固定化される請求項１に記載の方法。
10. 前記固相がビーズ、ゲル、樹脂、および粒子のうちの１つもしくは複数を含有する請求項９に記載の方法。
11. 前記ＣａＣｌ₂を含有する前記緩衝溶液が７．３〜７．７の範囲内のｐＨ値を有する請求項１に記載の方法。
12. 前記緩衝溶液が少なくとも１．５Ｍ〜２Ｍの濃度のＣａＣｌ₂を含有する請求項１に記載の方法。
13. 前記緩衝溶液が２ＭのＣａＣｌ₂を含有する請求項１に記載の方法。
14. 前記抗体をＦｃ結合剤に吸着させるステップと前記Ｆｃ結合剤を洗浄するステップとが２℃〜２４℃の範囲内の温度で行われる請求項１に記載の方法。
15. 前記１種もしくは複数種の不純物が宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡおよびこれらの混合物のうちの１種もしくは複数種を含む請求項１に記載の方法。
16. 前記抗体を前記Ｆｃ結合剤から回収するステップが、２．５〜３．５の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液を用いて前記抗体を溶出させるステップを含む請求項１に記載の方法。
17. 前記方法が、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、固定化金属親和性クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）からなる群から選択されるクロマトグラフィーステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
18. 前記方法が、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、透析、親和性クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、およびクロマトフォーカシングからなる群から選択されるさらなる精製ステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
19. 前記１種もしくは複数種の不純物が前記抗体の１種もしくは複数種のイントロンリードスルー変異体を含み、かつ回収された前記抗体を含有する溶出溶液中のイントロンリードスルー変異体のレベルが前記ソース液体中のイントロンリードスルー変異体のレベルの少なくとも１／５未満である請求項１に記載の方法。
20. 前記回収された前記抗体を含有する溶出溶液のイントロンリードスルー変異体のレベルが前記ソース液体中のイントロンリードスルー変異体のレベルの少なくとも１／１０未満である請求項１９に記載の方法。
21. 前記１種もしくは複数種の不純物が前記抗体の１種もしくは複数種のイントロンリードスルー変異体を含み、かつ前記イントロンリードスルー変異体が、回収された前記抗体を含有する溶出溶液中で前記抗体の種の１％未満、０．８％未満、０．５％未満または０．２％未満を構成する請求項１に記載の方法。
22. 前記１種もしくは複数種の不純物が前記抗体の１種もしくは複数種の低分子量種を含み、かつ前記低分子量種が、回収された前記抗体を含有する溶出溶液中で前記抗体の種の１％未満、０．８％未満、０．５％未満または０．２％未満を構成する請求項１に記載の方法。
23. 前記１種もしくは複数種の不純物が前記抗体の１種もしくは複数種のアンダージスルフィド結合変異体を含み、かつ前記アンダージスルフィド結合変異体が、回収された前記抗体を含有する前記溶出溶液中で前記抗体の種の１５％未満、１０％未満、５％未満または２％未満を構成する請求項１に記載の方法。