JP5157901B2 - 観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、観察対象を観察するための観察装置、および観察方法に関する。

次のような蛍光顕微鏡を使用した蛍光法による細胞の観察方法が非特許文献１によって知られている。この方法によれば、細胞に励起光を照射し、細胞から放出される蛍光を観察する。そして、観察前に観察位置の設定を行うが、この際、細胞へ励起光を照射し、蛍光画像から観察位置の設定を行っている。

バイオイメージングがわかる Ｐ２２〜２４（２００５年９月 羊土社発行）

しかしながら、従来の観察方法においては、細胞に励起光を照射する時間が長くなるにつれて、光退色によって蛍光が弱まったり、光毒性により細胞にダメージを与えてしまうことになる。このため、観察対象とする細胞を選択し、観察位置を設定する際、細胞の選択作業に時間を要すると、選択段階で細胞に光退色や光毒性による悪影響を及ぼしてしまい、実際の観察時には正確な観察が行えない可能性がある。

請求項１の発明による観察装置は、低倍率の光学系を使用して位相差観察または明視野観察または微分干渉観察または偏光観察または暗視野観察によりマクロ画像を取得し、高倍率の光学系を使用して蛍光観察により蛍光画像を取得する撮影部と、前記マクロ画像を表示する表示手段と、前記マクロ画像内で前記蛍光観察を行うべき観察対象が存在している複数の蛍光観察領域を自動認識し、自動認識した前記複数の蛍光観察領域のそれぞれを示す第１のマークを前記表示手段の前記マクロ画像上に表示させる自動認識手段と、前記表示手段に表示された前記第１のマークが示す前記複数の蛍光観察領域から１つの蛍光観察領域を選択し、選択した前記１つの蛍光観察領域を示す、前記第１のマークとは異なる第２のマークを前記表示手段の前記マクロ画像上に表示させる蛍光観察領域選択手段と、前記撮影部による蛍光画像取得時のみ、前記蛍光観察領域選択手段によって選択された前記蛍光観察領域に対し励起光を照射する励起光照明手段を備えることを特徴とする。

本発明によれば、光を照射することによる細胞への悪影響を軽減することができる。

細胞観察装置の構成を模式的に示す図である。 生育領域確認用画面の具体例を示す図である。 マクロ位相差画像の作成手順を模式的に示した図である。 マクロ蛍光画像の作成手順を模式的に示した図である。 観察対象選択用画面の具体例を示す図である。 マクロ位相差画とマクロ蛍光画像とを重ね合わせた場合の具体例を示す図である。 制御装置１０５の処理を示すフローチャート図である。 ＰＣ１０９の処理を示すフローチャート図である。 ＰＣ１０９にプログラムを提供する様子を示す図である。

図1は、本実施の形態における細胞観察装置の構成を模式的に示した図である。細胞観察装置１００は、ステージ１０１と、チャンバー１０２と、対物レンズ１０３と、カメラ１０４と、制御装置１０５と、透過光照明装置１０６と、シャッター１０７と、励起用光源装置１０８と、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）１０９と、モニタ１１０と、環境制御装置１１１とを備えている。なお、ステージ１０１と、チャンバー１０２と、対物レンズ１０３と、カメラ（撮影装置）１０４と、制御装置１０５と、透過光照明装置１０６と、シャッター１０７と、励起用光源装置１０８は顕微鏡を構成する。

この細胞観察装置１００においては、使用者はＰＣ１０９を操作することによって、細胞観察装置１００に対する種々の指示を出すことができ、ＰＣ１０９は、使用者からの指示に応じた制御信号を制御装置１０５へ出力する。制御装置１０５は、ＰＣ１０９からの制御信号に基づいて使用者からの指示に応じた種々の処理を実行する。本実施の形態では、使用者がステージ１０１上のチャンバー１０２内にセットされた細胞培養容器Ａ内の細胞を観察する場合の処理について説明する。

なお、細胞培養容器Ａは、例えば３５ｍｍディッシュが使用される。また、チャンバー１０２内は密閉されており、その内部環境は、環境制御装置１１１によって細胞の培養に適した環境に維持されている。例えば、チャンバー１０２内のＣＯ_２濃度はＣＯ_２混合機１１１ａによって５％に維持され、湿度は湿度調整機１１１ｂによって１００％に維持され、温度は温度調整機１１１ｃによって３７℃に維持されている。

励起用光源装置１０８は、細胞を蛍光染色している色素を励起する波長の励起光をチャンバー１０２内の細胞培養容器Ａに照射する。なお、励起用光源装置１０８から出力される励起光は、シャッター１０７により遮断することが可能である。透過光照明装置１０６は、光源としてＬＥＤを備えており、シャッター１０７により励起光が遮断されているときに、ＬＥＤを発光させて、チャンバー１０２内の細胞培養容器Ａに透過光（照明光）を照射することもできる。シャッター１０７による励起光の遮断、および透過光照明装置１０６からのＬＥＤの発光は、全て制御装置１０５によって制御される。

顕微鏡は、位相差観察モードと蛍光観察モードとを備え、透過光照明装置１０６からチャンバー１０２内の細胞培養容器Ａに透過光を照射して細胞を位相差観察することができ、また、励起用光源装置１０８からチャンバー１０２内の細胞培養容器Ａに励起光を照射して、蛍光試薬で染色した細胞を蛍光観察することもできる。カメラ１０４は、ＣＣＤなどの撮像素子を備えており、対物レンズ１０３を通して入力される細胞の像（拡大像）を撮像して顕微鏡画像、すなわち位相差画像と蛍光画像とを得ることができる。また、顕微鏡は、細胞を観察するための高倍率の対物レンズと４倍などの広視野で観察できる低倍率の対物レンズとを切り替えて使用することができる。

なお、顕微鏡は、複数の蛍光フィルタを切り替えて蛍光観察を行うことができる。例えば、複数の蛍光試薬で染色した多重染色の場合には、複数の蛍光フィルタを切り替えて蛍光観察を行うことによって、複数の蛍光色を観察することができる。これにより、カメラ１０４は、蛍光フィルタごとの複数の蛍光画像を撮像することができる。

カメラ１０４によって撮影された顕微鏡画像は制御装置１０５へ出力され、さらにＰＣ１０９に出力された後にモニタ１１０に表示される。これによって、使用者は顕微鏡画像をモニタ１１０上で確認することができる。

本実施の形態における細胞観察装置１００においては、使用者は、ＰＣ１０９を操作して観察対象の細胞の種類に応じた蛍光画像の撮影条件を指示することができる。例えば撮影条件として励起光量、カメラゲイン、露光時間、焦点面、フィルタ種類を指示する。この撮影条件は、細胞の種類ごとにあらかじめ設定してＰＣ１０９が備えるメモリ内に記憶しておき、使用者が観察対象の細胞の種類に応じて設定内容を選択するようにしてもよく、観察の都度、撮影条件を設定するようにしてもよい。

一般的に、細胞を蛍光観察する場合には、細胞に励起光を照射する時間が長くなるにつれて、光退色によって蛍光が弱まったり、光毒性により細胞にダメージを与えてしまう。このため、実際の蛍光観察（本蛍光観察）を行う前段階として観察対象とする細胞を選ぶための蛍光観察（準備蛍光観察）を行った場合に、準備蛍光観察に時間をかけてしまうと、準備蛍光観察の段階で細胞に光退色や光毒性による悪影響を及ぼしてしまい、本蛍光観察で正確な実験データが得られないなど、期待通りの観察結果が得られない可能性が生じる。

本実施の形態では、準備観察段階で細胞に及ぼす悪影響を最小限に抑えるために、準備観察段階における励起光の照射時間を極力抑える方法について説明する。

制御装置１０５は、まず、４倍などの広視野で観察できる対物レンズを使用して、対物レンズを移動させながら観察可能領域内の全範囲の位相差観察による位相差画像を撮影する。ここで観察可能領域内とは、細胞培養容器Ａの内側をいう。そして、対物レンズを移動させながら撮影した複数枚の画像をつなぎ合わせて（タイリングして）１枚の画像を生成する。以下、ここで生成した画像をマクロ画像と呼ぶ。制御装置１０５は、生成したマクロ画像をＰＣ１０９に出力する。

ＰＣ１０９が有するＣＰＵは、入力されたマクロ画像を公知のテクスチャ解析等の画像解析の手法を用いて解析して、マクロ画像内で細胞が生育している領域（細胞生育領域）を認識する。そして、ＣＰＵは、マクロ画像上に認識した細胞生育領域を明示（マーク）してモニタ１１０に表示する。これによって、使用者（実験者）は、観察可能範囲内でどの位置に細胞生育領域が存在するかを確認することができる。

ＣＰＵは、例えば、図２に示すようにマクロ画像を表示したＧＵＩ画面（生育領域確認用画面）をモニタ１１０に表示する。この生育領域確認用画面においては、マクロ画像表示領域２ａ内に細胞生育領域１〜７が明示されたマクロ画像が表示されている。そして、使用者は、細胞生育領域１〜７の中から後述するナビゲーションの実行対象とする領域を１つ以上選択する。ナビゲーションの実行とは、指定された領域において、予め指定された方法、予め指定された撮影条件などで自動的に顕微鏡画像を取得することを言う。なお、図２においては、細胞生育領域は円または楕円で模式的に表されているが、実際には細胞が生育している領域の形状が表示される。

具体的には、使用者は、生育領域確認用画面上の移動ボタン２ｂをＰＣ１０９が有するマウスを使用して操作し、細胞生育領域１〜７の選択状況を変更する。例えば、現在選択されている細胞生育領域は太枠表示（ハイライト表示）され、移動ボタン２ｂの操作状況に応じて太枠を移動させることによって細胞生育領域１〜７の選択状況を変更する。図２に示す例では、移動ボタン２ｂは円形状のボタンであり、マウスでクリックされたボタン上の位置に応じて細胞生育領域の選択状況が変化するものとする。

使用者は、ナビゲーションの実行対象としたい細胞生育領域が太枠表示された状態で選択ボタン２ｃをクリックすることによって、ナビゲーションの実行対象とする細胞生育領域を選択する。使用者によって細胞生育領域が選択されると、ＣＰＵは、マクロ画像表示領域２ａ内における選択された細胞生育領域の位置を特定する情報を選択情報表示領域２ｄ内に登録する。なお、ナビゲーションの実行対象としたい細胞生育領域が複数ある場合には、使用者は上述した処理を繰り返し行って、選択情報表示領域２ｄ内に複数の細胞生育領域に関する情報を登録する。

さらに使用者は、選択した細胞生育領域に対して実行するナビゲーションの方法としてタイリングモードとランダムモードのいずれかを選択する。本実施の形態では、使用者は、生育領域確認用画面でタイリングモードボタン２ｅまたはランダムモードボタン２ｆのいずれかをマウスでクリックすることによって、ナビゲーション方法を選択し、選択した方法でのナビゲーションの実行を指示する。なお、タイリングモードとランダムモードのそれぞれのナビゲーション方法については後述する。

使用者によってナビゲーションの実行が指示されると、ＣＰＵは、選択されたナビゲーション方法に応じて、マクロ画像表示領域２ａ内におけるナビゲーションを実行する範囲（ナビゲーション範囲）または地点（ナビゲーション地点）、ナビゲーションの方法、および上述した撮影条件のそれぞれに関する情報を格納したレシピを作成して、当該レシピを制御装置１０５へ出力する。制御装置１０５は、ＰＣ１０９からレシピが入力されると、レシピに格納されている各情報に基づいて、後述するようにナビゲーションを実行する。

以下、使用者によって選択されたナビゲーション方法がタイリングモードである場合とランダムモードである場合とに分けて、各モードごとのナビゲーション方法について説明する。なお、以下の説明では、ナビゲーション対象の細胞生育領域（ナビゲーション対象領域）として１つの細胞生育領域が選択されている場合について説明するが、ナビゲーション対象領域が選択された場合には、以下に説明する処理を複数のナビゲーション対象領域に対してそれぞれ実行すればよい。

（１）ナビゲーション方法がタイリングモードの場合
ＣＰＵは、使用者によってタイリングモードボタン２ｅがクリックされ、タイリングモードによるナビゲーションの実行が指示された場合には、選択された細胞生育領域の周囲のＸＹ座標群をナビゲーション範囲の情報（ナビゲーション範囲情報）として設定して上述したレシピを作成する。このレシピを制御装置１０５へ出力することによって、ＰＣ１０９から制御装置１０５に対してナビゲーションの実行が指示される。制御装置１０５は、ＰＣ１０９からのナビゲーションの実行指示に応答して、ナビゲーション対象領域に対して次のようにナビゲーションを実行する。

制御装置１０５は、まず、レシピに格納されているナビゲーション範囲情報と撮影条件に関する情報を読み込む。そして、ナビゲーション範囲情報に基づいてナビゲーション範囲の開始点の座標値（Ｘ，Ｙ）を特定する。例えば、ナビゲーション範囲の左上の端点の座標値をナビゲーション範囲の開始点の座標値（Ｘ，Ｙ）として特定する。

そして、顕微鏡を位相差観察モードにセットして、特定したナビゲーション範囲の開始点に対物レンズ１０３を移動させ、シャッター１０７を閉じて励起光を遮断した後、透過光照明装置１０６を制御して位相差画像の撮影に必要な時間だけ、例えばカメラ１０４の露光時間だけＬＥＤを発光させる。そして、対物レンズ１０３を高倍率にセットし、このときに対物レンズ１０３を通して入力される像をカメラ１０４を制御して撮影し、記憶する。これによって、ナビゲーション範囲の開始点における位相差画像を撮影することができる。

さらに、制御装置１０５は、顕微鏡を蛍光観察モードにセットして、透過光照明装置１０６を制御してＬＥＤを消灯し、蛍光画像の撮影に必要な時間、例えばカメラ１０４の露光時間だけシャッター１０７を開けて励起光を照射する。そして、対物レンズ１０３を高倍率にセットし、カメラ１０４を制御して対物レンズ１０３を通して入力される像を撮影し、記憶する。これによって、ナビゲーション範囲の開始点における蛍光画像を撮影することができる。なお、このとき、撮影条件として複数の蛍光フィルタの種類が指定されている場合には、蛍光フィルタを切り替えて、各蛍光フィルタごとに蛍光画像をそれぞれ撮影する。

その後、制御装置１０５は、ナビゲーション範囲内の次の領域を撮影するように対物レンズ１０３を移動させる。すなわち、制御装置１０５は、移動後の対物レンズ位置におけるカメラ１０４の撮影範囲が移動前の対物レンズ位置におけるカメラ１０４の撮影範囲と隣接し、かつ両範囲が重複しないように、対物レンズ１０３の移動量を制御する。そして、移動後の対物レンズ位置において上述した処理を実行し、移動後の対物レンズ位置における位相差画像と蛍光画像を撮影し、記憶する。この処理をナビゲーション範囲の全範囲に対して実行することによって、ナビゲーション範囲内において複数の小領域ごとに位相差画像と、蛍光フィルタの種類分の複数枚の蛍光画像を撮影することができる。

そして、制御装置１０５は、ナビゲーションを実行して撮影された各小領域に対応する位相差画像をつなぎ合わせて（タイリングして）、ナビゲーション範囲全体を撮影した１枚の結合画像（マクロ位相差画像）を生成する。さらに、制御装置１０５は、各蛍光フィルタの蛍光画像ごとに、同様にして各小領域に対応する蛍光画像をタイリングして蛍光フィルタごとの結合画像（マクロ蛍光画像）を生成する。

図３を用いて、マクロ位相差画像の生成方法を具体的に説明する。この図３は、４つの小領域に対してナビゲーションを実行した場合に撮影される位相差画像に基づいてマクロ位相差画像を生成する手順を模式的に示した図である。ここでは、４つの小領域を対象としてナビゲーションが実行された結果、図３（ａ）に示す４枚の位相差画像３ａ〜３ｄが撮影されている。制御装置１０５は、この４枚の位相差画像をナビゲーション範囲内におけるそれぞれの小領域の位置関係を保持したまま図３（ｂ）のように並べて結合することによってタイリングを行う。これによって図３（ｃ）に示すようなマクロ位相差画像３ｅが生成される。

次に、図４を用いて、マクロ蛍光画像の生成方法を具体的に説明する。この図４は、４つの小領域に対して２種類の蛍光フィルタを使用してナビゲーションを実行した場合に撮影される蛍光画像に基づいてマクロ蛍光画像を生成する手順を模式的に示した図である。ここでは、第１の蛍光フィルタを使用して４つの小領域を対象としてナビゲーションが実行された結果、図４（ａ）に示す４枚の蛍光画像４ａ〜４ｄが撮影されている。また、第２の蛍光フィルタを使用して４つの小領域を対象としてナビゲーションが実行された結果、図４（ｄ）に示す４枚の蛍光画像４ｆ〜４ｉが撮影されている。

制御装置１０５は、まず、図４（ａ）に示す４枚の蛍光画像４ａ〜４ｄを、ナビゲーション範囲内におけるそれぞれの小領域の位置関係を保持したまま図４（ｂ）のように並べて結合することによってタイリングを行う。これによって図４（ｃ）に示すような第１の蛍光フィルタのマクロ位相差画像４ｅが生成される。次に、図４（ｄ）に示す４枚の蛍光画像４ｆ〜４ｉを、ナビゲーション範囲内におけるそれぞれの小領域の位置関係を保持したまま、図４（ｅ）のように並べて結合することによってタイリングを行う。これによって図４（ｆ）に示すような第２の蛍光フィルタのマクロ位相差画像４ｊが生成される。

制御装置１０５は、このように生成したマクロ位相差画像と蛍光フィルタごとのマクロ蛍光画像とをＰＣ１０９へ出力する。

（２）ナビゲーション方法がランダムモードの場合
ＣＰＵは、使用者によってランダムモードボタン２ｆがクリックされ、ランダムモードによるナビゲーションの実行が指示された場合には、使用者に対してナビゲーション地点として設定する地点数の入力を促す。これに応じて使用者がＰＣ１０９が備えるキーボードを操作して１以上の地点数を入力すると、ＣＰＵは、ナビゲーション対象領域内から使用者によって入力された数の地点をランダムに選択する。

そして、ＣＰＵは、ランダムに選択したナビゲーション対象領域内の各地点のＸＹ座標値をナビゲーション地点の情報（ナビゲーション地点情報）に設定してレシピを作成する。このレシピを制御装置１０５へ出力することによって、ＰＣ１０９から制御装置１０５に対してナビゲーションの実行が指示される。制御装置１０５は、ＰＣ１０９からのナビゲーションの実行指示に応答して、ナビゲーション対象領域に対して次のようにナビゲーションを実行する。

制御装置１０５は、まず、レシピに格納されているナビゲーション地点情報と撮影条件に関する情報を読み込む。そして、ナビゲーション地点情報に基づいて各ナビゲーション地点の座標値（Ｘ，Ｙ）を特定する。そして、顕微鏡を位相差観察モードにセットして、特定したナビゲーション地点の中のいずれかの地点に対物レンズ１０３を移動させ、シャッター１０７を閉じて励起光を遮断した後、透過光照明装置１０６を制御して位相差画像の撮影に必要な時間だけ、例えばカメラ１０４の露光時間だけＬＥＤを発光させる。そして、対物レンズ１０３を高倍率にセットし、このときに対物レンズ１０３を通して入力される像をカメラ１０４を制御して撮影する。これによって、ナビゲーション地点を中心とした小領域の位相差画像を撮影することができる。

さらに、制御装置１０５は、顕微鏡を蛍光観察モードにセットして、透過光照明装置１０６を制御してＬＥＤを消灯し、蛍光画像の撮影に必要な時間、例えばカメラ１０４の露光時間だけシャッター１０７を開けて励起光を照射する。そして、対物レンズ１０３を高倍率にセットし、カメラ１０４を制御して対物レンズ１０３を通して入力される像を撮影する。これによって、ナビゲーション地点を中心とした小領域の蛍光画像を撮影することができる。なお、このとき、撮影条件として複数の蛍光フィルタの種類が指定されている場合には、蛍光フィルタを切り替えて、各蛍光フィルタごとに蛍光画像をそれぞれ撮影する。

その後、制御装置１０５は、画像の撮影を行っていないナビゲーション地点に対物レンズ１０３を移動させる。そして、移動後の対物レンズ位置において上述した処理を実行し、このナビゲーション地点を中心とした小領域の位相差画像と蛍光画像を撮影する。この処理をレシピに格納されている全てのナビゲーション地点に対して実行することによって、ナビゲーション対象領域内からランダムに選択された各ナビゲーション地点を中心とした各小領域ごとの位相差画像（地点位相差画像）と、蛍光フィルタの種類分の複数枚の蛍光画像（地点蛍光画像）とを撮影することができる。

例えば、ナビゲーション地点として４点が指定された場合には、図３（ａ）に示した４枚の位相差画像３ａ〜３ｄが撮影され、同様に図４（ａ）に示した４枚の蛍光画像４ａ〜４ｄや図４（ｄ）に示した４枚の蛍光画像４ｆ〜４ｉが撮影される。制御装置１０５は、このようにして撮影した各ナビゲーション地点の地点位相差画像と蛍光フィルタごとの地点蛍光画像とをＰＣ１０９へ出力する。

ＰＣ１０９においてＣＰＵは、例えば図５に示すようなＧＵＩ画面（観察対象選択用画面）をモニタ１１０に表示する。使用者は、モニタ１１０上でこの観察対象選択用画面を操作することにより、それぞれのナビゲーション方法に応じて制御装置１０５から入力される画像に基づいて、次のように観察対象の細胞を選択する。なお、使用者はＰＣ１０９が備えているマウスを操作することによって図５に示す観察対象選択用画面を操作する。また、図５の観察対象選択用画面については、本実施の形態に関連する項目についてのみ説明し、それ以外の項目については説明を省略する。

以下の説明においては、ナビゲーション方法としてタイリングモードが選択されており、制御装置１０５から上述したマクロ位相差画像と蛍光フィルタごとのマクロ蛍光画像が入力された場合の処理について詳細に説明する。ナビゲーション方法としてランダムモードが選択された場合の処理については、以下の説明におけるマクロ位相差画像を地点位相差画像に、マクロ蛍光画像を地点蛍光画像にそれぞれ置き換えて処理することによって同様に処理できる。このとき、マクロ画像がタイリングを行ったナビゲーション範囲内の１枚の画像であるのに対して地点画像は各ナビゲーション地点に対応する複数の小領域ごとの地点画像であることから、使用者は各ナビゲーション地点ごとの地点画像を切り替えて各画像ごとに操作を行う必要がある。

まず使用者は、観察対象選択用画面上で位相差画像表示ボタン５ａを選択して、観察対象選択用画面上の画像表示領域５ｄ内にマクロ位相差画像を表示する。使用者はこのマクロ位相差画像によって細胞の形状を確認することができる。そして、このマクロ位相差画像をベースとして、その上に任意の蛍光フィルタで撮影したマクロ蛍光画像（フィルタ画像）を重ね合わせて（重畳して）表示することができる。例えば、蛍光観察によって赤色に発光した画像を撮影したフィルタ画像をマクロ位相差画像に重ね合わせて表示する場合には、使用者は観察対象選択用画面上で赤色フィルタ画像表示ボタン５ｂを選択する。すなわち、位相差画像表示ボタン５ａと赤色フィルタ画像表示ボタン５ｂとがいずれも選択された状態にすることで、画像表示領域５ｄ内にベースとなるマクロ位相差画像上に赤色フィルタ画像を重ね合わせて表示することができる。

同様に、蛍光観察によって青色に発光した画像を撮影したフィルタ画像をマクロ位相差画像に重ね合わせて表示する場合には、使用者は観察対象選択用画面上で位相差画像表示ボタン５ａと共に青色フィルタ画像表示ボタン５ｃを選択する。また、マクロ位相差画像に赤色フィルタ画像と青色フィルタ画像のいずれも重ね合わせて表示したい場合には、位相差画像表示ボタン５ａ、赤色フィルタ画像表示ボタン５ｂ、および青色フィルタ画像表示ボタン５ｃを全て選択すればよい。

例えば、図３に示したマクロ位相差画像３ｅに、図４に示した第１の蛍光フィルタ画像４ｅと第２のフィルタ画像４ｊを重ね合わせて表示した場合には、図６に示すような合成画像（重畳画像）が画像表示領域６ｄ内に表示される。

このように合成されたマクロ位相差画像と合成されたマクロ蛍光画像（フィルタ画像）とを重ね合わせて表示することによって、使用者は細胞の形状とともに蛍光試薬による蛍光状態を確認しながら、観察対象とする細胞の選択を行うことができる。具体的には、使用者は、画像表示領域５ｄ内のマクロ画像上に表示されたカーソル５ｅを移動ボタン５ｆをマウスで操作して移動させ、本観察の観察対象とする細胞に当てた後、選択ボタン５ｇをマウスでクリックすることによって、本観察の観察対象とする細胞を選択する。使用者は、本観察の観察対象として複数の細胞を選択したい場合には、この処理を繰り返し行う。

なお、観察対象選択用画面においても、図２で上述したナビゲーション位置指定用画面と同様に、移動ボタン５ｆは円形状のボタンである。そして、マウスでクリックされたボタン上の位置に応じてカーソル５ｅの画面上での移動方向が決定され、マウスによる押下回数、または押下時間に応じてカーソル５ｅの画面上での移動量が決定される。

使用者によって本観察の観察対象とする細胞が選択されると、ＣＰＵは、選択ボタン５ｇがクリックされた時点におけるカーソル５ｅの位置を特定する情報を本観察対象表示領域５ｈ内に追加する。

これによって、使用者はモニタ１１０に表示されたマクロ画像を見ながら本観察前の準備段階として観察対象の細胞を選択することができ、細胞を選択するために透過光や励起光を細胞に照射し続けなくても済むことになる。すなわち、励起光の照射時間も蛍光画像の撮影に必要な時間だけで済むことから、準備段階での細胞の光退色や光毒性によるダメージを最小限に抑えることができる。また、透過光の照射時間は位相差画像の撮影に必要な時間だけで済むことから、細胞が透過光によっても悪影響を受ける場合でも、この悪影響を最小限に抑えることができる。

その後、使用者がＰＣ１０９を操作して本観察の開始を指示すると、ＣＰＵは、本観察対象表示領域５ｈ内に表示された情報とともに本観察の実行指示信号を制御装置１０５へ出力する。例えば、使用者は、図５に示すタイムラプス実行ボタン５ｉをクリックすることによって、本観察対象表示領域５ｈ内に表示されている選択済みの細胞に対する本観察の開始を指示する。本観察時に観察した画像を取得する場合、選択された細胞について、選択された領域内において小領域ごと撮影位置をずらし、撮影した画像をタイリングしてもよい。

制御装置１０５は本観察の実行指示信号が入力されると、観察対象の細胞に対して、例えばタイムラプス処理を実行して細胞の観察、すなわち本観察を行う。本観察の結果は制御装置１０５を介してＰＣ１０９に出力され、観察データ（試験データ）がＰＣ１０９内のハードディスクに記録され、同時にモニタ１１０に表示される。

図７は、本実施の形態における制御装置１０５の処理を示すフローチャートである。図７に示す処理は、使用者によってＰＣ１０９が操作されて試験準備の開始が指示され、ＰＣ１０９から試験開始信号を受信すると起動するプログラムとして制御装置１０５によって実行される。

ステップＳ１０において、顕微鏡を位相差観察モードにセットし、４倍などの広視野で観察できる低倍率の対物レンズを使用して、対物レンズを移動させながら観察可能領域内の全範囲の位相差画像を低倍率で撮影し、撮影した複数枚画像をつなぎ合わせて上述したマクロ画像を生成する。その後、ステップＳ２０へ進み、生成したマクロ画像をＰＣ１０９に出力して、ステップＳ３０へ進む。

ステップＳ３０では、ＰＣ１０９から上述したレシピが入力されたか否かを判断する。レシピが入力されたと判断した場合には、ステップＳ４０へ進む。ステップＳ４０では、レシピに格納されているナビゲーション方法の情報に基づいて、ＰＣ１０９で使用者によって選択されたナビゲーション方法がタイリングモードであるかランダムモードであるかを判断する。ナビゲーション方法がタイリングモードであると判断した場合には、ステップＳ５０へ進む。

ステップＳ５０では、レシピに格納されているナビゲーション範囲情報と撮影条件に関する情報を読み込んで、ステップＳ５１へ進む。ステップＳ５１では、ナビゲーション範囲情報に基づいてナビゲーション範囲の開始点の座標値（Ｘ，Ｙ）を特定し、特定したナビゲーション範囲の開始点に対物レンズ１０３を移動させる。

その後、ステップＳ５２へ進み、顕微鏡の位相差観察モードと蛍光観察モードとを切替ながら、上述したように対物レンズ１０３、カメラ１０４、透過光照明装置１０６、およびシャッター１０７を制御してナビゲーションを実行し、小領域ごとに位相差画像および蛍光画像を撮影する。このとき、撮影条件として複数の蛍光フィルタの種類が指定されている場合には、複数の蛍光フィルタを切り替えて、そのフィルタの種類ごとに蛍光画像を撮影する。その後、ステップＳ５３へ進む。

ステップＳ５３では、読み込んだナビゲーション範囲の全範囲についてナビゲーションの実行が完了したか否かを判断する。ナビゲーションの実行が完了していないと判断した場合には、ステップＳ５１へ戻って隣接する小領域を撮影するために対物レンズ１０３を移動させて処理を繰り返す。これに対してナビゲーションの実行が完了したと判断した場合には、ステップＳ５４へ進む。

ステップＳ５４では、ナビゲーションを実行して撮影した小領域ごとの位相差画像、および少なくとも１種類の蛍光フィルタで撮影した蛍光画像のそれぞれをタイリングして、上述したマクロ位相差画像およびマクロ蛍光画像を作成する。その後、ステップＳ５５へ進み、作成したマクロ位相差画像およびマクロ蛍光画像をＰＣ１０９へ出力して、後述するステップＳ７０へ進む。

これに対して、ＰＣ１０９で使用者によって選択されたナビゲーション方法がランダムモードであると判断した場合には、ステップＳ６０へ進む。ステップＳ６０では、レシピに格納されている撮影条件とナビゲーション地点情報とを読み込んでステップＳ６１へ進む。ステップＳ６１では、ナビゲーション地点の座標値を特定し、特定したナビゲーション地点の中のいずれかの地点に対物レンズ１０３を移動させる。

その後、ステップＳ６２へ進み、上述したように対物レンズ１０３、カメラ１０４、透過光照明装置１０６、およびシャッター１０７を制御してナビゲーション地点を中心とした小領域の位相差画像および蛍光画像を撮影する。このとき、撮影条件として複数の蛍光フィルタの種類が指定されている場合には、複数の蛍光フィルタを切り替えて、そのフィルタの種類ごとに蛍光画像を撮影する。その後、ステップＳ６３へ進む。

ステップＳ６３では、全てのナビゲーション地点について位相差画像と蛍光画像の撮影が完了したか否かを判断する。撮影が完了していないと判断した場合には、ステップＳ６１へ戻って画像の撮影を行っていないナビゲーション地点に対物レンズ１０３を移動させて処理を繰り返す。これに対してナビゲーションの実行が完了したと判断した場合には、ステップＳ６４へ進む。ステップＳ６４では、各ナビゲーション地点に対応した小領域の地点位相差画像と蛍光フィルタごとの地点蛍光画像とをＰＣ１０９へ出力して、ステップＳ７０へ進む。

ステップＳ７０では、ＰＣ１０９から本観察の実行指示信号を受信したか否かを判断する。本観察の実行指示信号を受信したと判断した場合にはステップＳ８０へ進み、ＰＣ１０９上で使用者によって選択された観察対象の細胞に対してタイムラプス処理を実行する。その後、ステップＳ９０へ進み、タイムラプス処理の結果をＰＣ１０９へ出力して、処理を終了する。

図８は、本実施の形態におけるＰＣ１０９の処理を示すフローチャートである。図８に示す処理は、制御装置１０５から上述したマクロ画像が入力されると起動するプログラムとしてＰＣ１０９が有するＣＰＵによって実行される。

ステップＳ２００において、入力されたマクロ画像を公知のテクスチャ解析等の画像解析の手法を用いて解析して、マクロ画像内で細胞が生育している細胞生育領域を認識してステップＳ２１０へ進む。ステップＳ２１０では、図２で上述した生育領域確認用画面をモニタ１１０に表示し、細胞生育領域を明示したマクロ画像をマクロ画像表示領域２ａ内に表示する。その後、ステップＳ２２０へ進む。

ステップＳ２２０では、使用者によって移動ボタン２ｂが操作され、ナビゲーションの実行対象とする細胞生育領域が選択されたか否かを判断する。細胞生育領域が選択されたと判断した場合にはステップＳ２３０へ進み、選択した細胞生育領域に対して実行するナビゲーションの方法としてタイリングモードとランダムモードのいずれかが選択されたか否かを判断する。いずれかのナビゲーション方法が選択されたと判断した場合には、ステップＳ２４０へ進む。

ステップＳ２４０では、選択されたナビゲーション方法に応じたナビゲーション範囲情報またはナビゲーション地点情報、ナビゲーション方法の情報、および撮影条件の情報を格納したレシピを作成して、このレシピを制御装置１０５へ出力する。その後、ステップＳ２５０へ進む。

ステップＳ２５０では、ナビゲーション方法に応じた画像、すなわちタイリングモードの場合にはマクロ位相差画像およびマクロ蛍光画像が、またランダムモードの場合には地点位相差画像および地点蛍光画像が制御装置１０５から入力されたか否かを判断する。画像が入力されたと判断した場合には、ステップＳ２６０へ進む。ステップＳ２６０では、図５に示した観察対象選択用画面をモニタ１１０に表示してステップＳ２７０へ進む。

ステップＳ２７０では、使用者によって観察対象選択用画面上で位相差画像表示ボタン５ａが選択されることにより、マクロ位相差画像または地点位相差画像の表示が指示されたか否かを判断する。マクロ位相差画像または地点位相差画像の表示が指示されたと判断した場合には、ステップＳ２８０へ進み、観察対象選択用画面上の画像表示領域５ｄ内にナビゲーション方法に応じてマクロ位相差画像または地点位相差画像を表示する。その後、ステップＳ２９０へ進む。

ステップＳ２９０では、使用者によって観察対象選択用画面上で蛍光フィルタの種類に応じた蛍光画像表示ボタンが選択されることにより、マクロ蛍光画像または地点蛍光画像の表示が指示されたか否かを判断する。マクロ蛍光画像または地点蛍光画像の表示が指示されていないと判断した場合には、後述するステップＳ３１０へ進む。これに対して、クロ蛍光画像または地点蛍光画像の表示が指示されたと判断した場合には、ステップＳ３００へ進み、画像表示領域５ｄ内に表示されている位相差画像上に指示された蛍光フィルタの蛍光画像を重ね合わせて表示する。その後、ステップＳ３１０へ進む。

ステップＳ３１０では、使用者によって観察対象の細胞が選択されたか否かを判断する。観察対象の細胞が選択されていないと判断した場合には、ステップＳ２９０へ戻って処理を繰り返す。これに対して観察対象の細胞が選択されたと判断した場合には、ステップＳ３２０へ進む。ステップＳ３２０では、使用者によって本観察の実行が指示されたか否かを判断する。本観察の実行が指示されたと判断した場合には、ステップＳ３３０へ進み、本観察の実行指示信号を制御装置１０５へ出力して処理を終了する。

以上説明した本実施の形態によれば、以下のような作用効果を得ることができる。
（１）マクロ画像を公知のテクスチャ解析等の画像解析の手法を用いて解析して、マクロ画像内における細胞生育領域を認識し、マクロ画像上に認識した細胞生育領域を明示してモニタ１１０に表示するようにした。これによって、使用者は、観察可能範囲内でどの位置に細胞生育領域が存在するかを視覚的に確認することができる。また、細胞生育領域を自動認識した後に、その領域を表示するので、細胞生育領域のみを確実に把握することができる。

（２）マクロ画像に明示した細胞生育領域の中から少なくとも１つを選択してナビゲーションの実行対象とすることができ、使用者によって選択された細胞生育領域に対してナビゲーションを実行するようにした。これによって、ナビゲーションの実行対象を細胞が生育している領域のみに限定することができ、処理の負荷を低減することができる。

（３）ナビゲーション範囲内の小領域ごとに、画像を撮影するために必要な時間だけ励起光を細胞に照射して蛍光画像を撮影し、撮影した小領域ごとの蛍光画像をタイリングしたマクロ蛍光画像を使用者に提供するようにした。これによって準備段階での細胞の光退色や光毒性によるダメージを最小限に抑えることができる。また、使用者は、励起光を照射し続けることによる細胞への悪影響を気にせずに、マクロ位相差画像上で時間をかけて観察対象の細胞を選択することができる。

（４）ナビゲーション範囲内の小領域ごとに、画像を撮影するために必要な時間だけ透過光を細胞に照射して位相差画像を撮影し、撮影した小領域ごとの位相差画像をタイリングしたマクロ位相差画像を使用者に提供するようにした。これによって、励起光だけではなく透過光を照射することによっても悪影響を受ける可能性がある細胞を観察する場合にも、透過光の照射による細胞への悪影響を最小限に抑えて位相差画像を撮影することができる。すなわち、本観察の観察対象の特定を撮影画像上で行うようにしたので、画像を取得（撮影）するときのみ細胞に励起光や透過光が照射されるので、励起光や透過光の照射による細胞への悪影響を最小限にすることができる。

（５）対物レンズ１０３は、複数の蛍光フィルタを切り替えて蛍光観察を行えるようにし、カメラ１０４は、各蛍光フィルタごとに蛍光画像を撮影するようにした。これによって、複数の蛍光試薬で染色した多重染色の場合でも、蛍光色ごとの蛍光画像を撮影することができる。

（６）ナビゲーション方法としてタイリングモードが選択された場合には、ナビゲーションを実行して小領域ごとに撮影したナビゲーション範囲内の位相差画像および蛍光画像をそれぞれタイリングしてナビゲーション範囲内を撮影した１枚のマクロ画像を生成し、このタイリング画像をモニタ１１０に表示するようにした。これによって、使用者はナビゲーション範囲全体から観察対象の細胞を選択することができる。

（７）ナビゲーション方法としてランダムモードが選択された場合には、ナビゲーション地点をランダムに選択し、各ナビゲーション地点における位相差画像および蛍光画像をモニタ１１０に表示するようにした。これによって、使用者はその都度ナビゲーション地点を指定しなくても自動的に選択されたナビゲーション地点を中心とした小領域ごとの位相差画像および蛍光画像を得ることができ。使用者の利便性が向上する。

（８）使用者は、モニタ１１０に表示された観察対象選択用画面上の画像表示領域５ｄ内に位相差画像と、蛍光フィルタごとの蛍光画像を重ね合わせて表示して細胞を選択できるようにした。これによって、使用者は細胞の形状とともに蛍光試薬による蛍光状態を確認しながら、観察対象とする細胞の選択を行うことができる。

―変形例―
なお、上述した実施の形態の細胞観察装置は、以下のように変形することもできる。
（１）上述した実施の形態では、モニタ１１０に表示された観察対象選択用画面上の画像表示領域５ｄ内に位相差画像の上に複数の蛍光画像の少なくとも１つを重ね合わせて表示して細胞を選択できるようにした。しかしこれに限定されず、複数の蛍光画像のうち２枚以上を重ね合わせるようにしてもよい。また、画像表示領域５ｄ内に表示したマクロ画像を拡大できるようにしてもよい。これによって、使用者はマクロ画像をさらに拡大して観察対象の細胞を容易に選択できるようになる。

（２）上述した実施の形態では、ナビゲーション範囲に対してナビゲーション処理を実行して得た小領域ごとの位相差画像と蛍光画像とをそれぞれ合成してマクロ位相差画像とマクロ蛍光画像を生成する例について説明した。しかしながら、位相差画像または蛍光画像のいずれか一方のみを撮影するようにしてもよい。この場合、使用者は観察対象選択用画面上でマクロ位相差画像またはマクロ蛍光画像のいずれか一方のみを確認しながら本観察対象の細胞を選択すればよい。

（３）上述した実施の形態では、使用者は図２に示す生育領域確認用画面上で観察対象の細胞を選択する例について説明したが、生育領域確認用画面のレイアウトは図２に示すものに限られない。

（４）上述した実施の形態では、使用者は図５に示す観察対象選択用画面上で観察対象の細胞を選択する例について説明したが、観察対象選択用画面のレイアウトも図５に示すものに限られない。

（５）上述した実施の形態では、制御装置１０５が図７に示した処理を実行し、ＰＣ１０９が図８に示した処理を実行する例について説明した。しかしながら、制御装置１０５またはＰＣ１０９のいずれか一方が図７および図８の処理を全て行うようにしてもよい。

（６）上述した実施の形態では、本観察として観察対象の細胞に対してタイムラプス処理を実行する例について説明したが、本発明は、その他の観察方法による観察や試験を行う場合の前準備として対象の細胞を選択する場合にも適用可能である。

（７）上述した実施の形態では、細胞を観察対象とする場合について説明したが、本発明は、光を照射することによって観察することができ、かつ光を照射することによって悪影響が生じる可能性があるその他の観察対象、例えば鉱物などにも適用可能である。

（８）上述した実施の形態では、広視野で観察できる４倍の低倍率の対物レンズを使用してマクロ画像を取得する例について説明した。しかし、マクロ画像を取得する際の倍率としては、約１倍〜約２００倍であってもよい。ただし、好ましくは、約２倍〜約１００倍、最も好ましくは、約２倍〜約５０倍である。マクロ画像取得の目的の１つとして、取得したマクロ画像から、より詳細に観察する領域を探すためのｍａｐの機能を備える目的がある。従って、あまり高倍率、例えば５００倍で画像を取得すると、観察試料全体の領域の内の狭い領域しか画像を得ることができなくなり、つまり小範囲のｍａｐしか作成できなくなり、その後の詳細な観察領域を探す領域が狭くなってしまう。また、観察する試料によっては、１倍でマクロ画像を取得してもよい。さらには、例えば観察試料がシャーレに入っているような場合、表示装置にシャーレ全体が表示されるように画像取得をしてもよい。この場合の倍率としては、１倍よりも低倍率、例えば０．５倍での画像取得をしてもよい。

（９）なお、上記のような倍率でマクロ画像を取得する場合、観察対象領域の細胞を撮影する際の倍率は、マクロ画像を形成する際の倍率よりも高倍率であることが好ましい。この観察対象領域の細胞を撮影する際の倍率は、観察する試料の形態や種類、観察目的などにより異なるものである。従って、例えば２倍のマクロ画像を取得する場合は、観察対象領域の細胞の画像を取得する際の倍率を３倍としてもよい。また、マクロ画像を形成する倍率と観察対象領域の細胞の画像を取得する際の倍率は等倍率でもよい。例えば、２００倍でマクロ画像を取得した場合、ユーザの判断で、観察対象領域の細胞の画像を取得する際の倍率として満足のいく倍率であれば、２００倍で観察対象領域の細胞の画像を取得してもよい。

（１０）上述した実施の形態では、４倍などの広視野で観察できる低倍率の対物レンズを使用して、対物レンズを移動させながら観察可能領域内の全領域の位相差画像を撮影し、撮影した複数枚の画像をタイリングして１枚のマクロ画像を生成する例について説明した。しかしこれに限定されず、微分干渉コントラスト法などの蛍光以外の他のコントラスト生成方法により観察可能領域内の全領域を撮影した画像をタイリングしてマクロ画像を生成するようにしてもよい。

（１１）上述した実施の形態では、ナビゲーション方法としてランダムモードが選択された場合には、使用者に対してナビゲーション地点として設定する地点数の入力を促し、これに応じて使用者が入力した数の地点をナビゲーション地点としてランダムに選択するようにした。しかし、ナビゲーション地点数は使用者があらかじめ設定した固定値を使用してもよく、あるいはあらかじめ設定した初期値を表示して使用者が任意に変更できるようにしてもよい。

（１２）上述した実施の形態では、マクロ画像やマクロ位相差画像の生成において、位相差観察による画像の生成を行う例を示した。しかし、位相差観察に限らず、明視野観察または微分干渉観察または偏光観察または暗視野観察等のいずれかによる観察画像であってもよい。このような場合であっても、励起用光源装置１０８から出力される励起光はシャッター１０７により遮断され、それぞれの観察用の照明光を照射して観察を行う。

（１３）上述した実施の形態の制御装置１０５はパーソナルコンピュータなどのコンピュータに置き換えることができる。このように制御装置１０５をコンピュータで置き換えた場合、上述した制御装置１０５の処理プログラムは、ＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体やインターネットなどのデータ信号を通じて提供することができる。また、上述したＰＣ１０９の処理プログラムも同様にＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体やインターネットなどのデータ信号を通じて提供することができる。図９はＰＣ１０９を例にプログラムの提供の様子を示す図である。ＰＣ１０９は、ＣＤ−ＲＯＭ２０４を介してプログラムの提供を受ける。また、ＰＣ１０９は通信回線２０１との接続機能を有する。コンピュータ２０２は上記プログラムを提供するサーバーコンピュータであり、ハードディスク２０３などの記録媒体にプログラムを格納する。通信回線２０１は、インターネットなどの通信回線、あるいは専用通信回線などである。コンピュータ２０２はハードディスク２０３を使用してプログラムを読み出し、通信回線２０１を介してプログラムをＰＣ１０９に送信する。すなわち、プログラムをデータ信号として搬送波にのせて、通信回線４０１を介して送信する。このように、プログラムは、記録媒体や搬送波などの種々の形態のコンピュータ読み込み可能なコンピュータプログラム製品として供給できる。

なお、本発明の特徴的な機能を損なわない限り、本発明は、上述した実施の形態における構成に何ら限定されない。

次の優先権基礎出願の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
日本国特許出願２００６年第１５９２７１号（２００６年６月８日出願）

Claims (3)

1. 低倍率の光学系を使用して位相差観察または明視野観察または微分干渉観察または偏光観察または暗視野観察によりマクロ画像を取得し、高倍率の光学系を使用して蛍光観察により蛍光画像を取得する撮影部と、
   前記マクロ画像を表示する表示手段と、
   前記マクロ画像内で前記蛍光観察を行うべき観察対象が存在している複数の蛍光観察領域を自動認識し、自動認識した前記複数の蛍光観察領域のそれぞれを示す第１のマークを前記表示手段の前記マクロ画像上に表示させる自動認識手段と、
   前記表示手段に表示された前記第１のマークが示す前記複数の蛍光観察領域から１つの蛍光観察領域を選択し、選択した前記１つの蛍光観察領域を示す、前記第１のマークとは異なる第２のマークを前記表示手段の前記マクロ画像上に表示させる蛍光観察領域選択手段と、
   前記撮影部による蛍光画像取得時のみ、前記蛍光観察領域選択手段によって選択された前記蛍光観察領域に対し励起光を照射する励起光照明手段を備えることを特徴とする観察装置。
2. 請求項１に記載の観察装置において、
   前記蛍光観察領域選択手段で選択された前記蛍光観察領域について観察する予め定めた観察条件を格納する記憶部と、
   前記記憶部に格納された前記観察条件に基づき、前記蛍光観察領域の観察を行わせる制御部とを更に有することを特徴とする観察装置。
3. 請求項１又は２に記載の観察装置において、
   前記蛍光観察領域選択手段で選択された前記蛍光観察領域に対して、蛍光観察が行われる前に位相差観察が行われることを特徴とする観察装置。

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