JP5165567B2 - 組織細胞内への核酸の電気的導入 - Google Patents

Description

本発明は、組織細胞内、具体的には筋細胞又は腫瘍細胞内への、核酸の電気媒介型遺伝子導入に関する。

電気媒介型遺伝子導入（electrically mediated gene transfer）、別名ＤＮＡ電気的導入（DNA electrotransfer）又は電気遺伝子療法（electrogenetherapy）は、最も効果的なインビボ（in vivo）での非ウィルス遺伝子導入法の１つであることから、高い関心を集めている（Andre及びMir、2004）。この方法によれば、種々の組織へ有効にプラスミドＤＮＡを電気的導入し得ることが示されている。かかる組織としては、筋肉（Aihara及びMiyazaki、1998；Mir他、1998a；Mir他、1999）、肝臓（Heller他、1996；Suzuki他、1998）、皮膚（Titomirov他、1991；Zhang他、1996）、腫瘍（Heller他、2000；Wells他、2000；Heller及びCoppola、2002）、マウス精巣（Muramatsu他、1997；Muramatsu他、1998）など（Andre及びMir、2004）が挙げられる。

電気パルスが標的細胞内へのＤＮＡ導入を媒介するメカニズムは、十分には理解されていないものの、組織内へのＤＮＡ導入を改善するには、その組織内の細胞を透過化する必要があるという点では、意見が一致している。かかる透過化は、単に短方形波電気パルス（１００μ秒の範囲）を印加することで達成し得る（Mir他、1991b；Gehl他、1999；Miklavcic他、2000）。この種のパルスは「抗腫瘍電気化学療法」（Mir他、1991a；Glass他、1997；Sersa他、1998；Mir他、1998b；Rodriguez他、2002）と呼ばれる治療において、（ブレオマイシンやシスプラチン等の）非浸透性抗癌薬を局所送達するために広く使用されている。実際に、インビトロ（in vitro）でもインビボでも、例えば１３００Ｖ／ｃｍ及び１００μ秒のパルスを８回、腫瘍に送達すれば、過渡的な細胞膜の再配列を誘発することができ、これによって、ブレオマイシン等の非浸透性抗癌分子を拡散により細胞に進入させ、その細胞毒活性を十分に発揮させることが可能となる（Poddevin他、1991；Mir他、1991b；Gehl他、1998）。

これらの短透過化電気パルスは、幾つかの組織内へのプラスミドＤＮＡの導入を増大させることが示されている（Heller他、1996；Heller他、2000）。しかし、別のタイプの方形波電気パルスを筋肉（Aihara及びMiyazaki、1998；Mir他、1999）、腫瘍（Rols他、1998）、肝臓（Suzuki他、1998）、及び、その他の幾つかの組織（Andre及びMir、2004）に印加したところ、このパルスの方がＤＮＡ電気的導入に効果的であることが見いだされた（Mir他、1999；Heller他、2000）。このパルスは通常、電圧はより低いが、持続時間は著しく長い（数１０ミリ秒の範囲）（Aihara及びMiyazaki、1998；Rols他、1998；Mir他、1999；Bettan他、2000；Matsumoto他、2001）。このタイプのパルスによる細胞内へのＤＮＡ導入の媒介は、電場送達の際に（短パルスと同様の）細胞透過化と、ＤＮＡ電気泳動という２種の別個の効果が誘発されることによるものと推測される（klenchin他、1991；Sukharev他、1992；Neumann他、1996；Mir他、1999；Golzio他、2002）。

筋細胞内への効率的な電気的導入に関して、国際公開第９９／０１１５８号パンフレットには、１又は２以上（最大１００，０００）の単極性電気パルス刺激１〜８００ボルト／ｃｍを用いた例が記載されており、国際公開第９８／４３７０２号パンフレットには、５〜２００ボルト／ｃｍの電流刺激を用いた例と、かかる電流を２〜３０，０００の方形双極性パルスの形態としてもよい旨が記載されている。

インビボでのＤＮＡ電気的導入における電気パルスの二重の役割は、高電圧短パルス（又はＨＶ；例えば８００Ｖ／ｃｍ及び１００μ秒）と、それに続く低電圧長パルス（又はＬＶ；例えば８０Ｖ／ｃｍ及び１００ｍ秒）とからなる電気パルスの組み合わせを用いて実証された（Bureau他、2000；Satkauskas他、2002）。この最新の研究は、ＨＶとＬＶとの間に様々なラグをおいてこれらのＨＶ及びＬＶパルスを分離しても、トランスフェクション効率に目立った損失は生じないことを示している。これらのラグの範囲は、１つのＨＶ及び１つのＬＶについては最長３００秒、１つのＨＶと４つのＬＶとの組み合わせについては最長３０００秒であった（Satkauskas他、2002）。

本出願人は、特定のＨＶパルスとＬＶパルスとの組み合わせを用いることによって、電気的導入効率を更に改善することが可能であることを見出だした。

腫瘍及び/又は他の組織（例えば肝臓）のトランスフェクションを、同様の目的の対象としてもよい。好適なＨＶ及び／又はＬＶの電場強度（Ｖ／ｃｍ）は、組織に応じて異なる。

従って、本発明の第１の対象は、組織細胞内にインビボ（in vivo）で導入することを目的とする薬剤を調製するための核酸の使用であって、前記薬剤を組織細胞と接触させるとともに、
前記組織を第１に、２００〜２０００ボルト／ｃｍの高電圧場強度からなる少なくとも１のパルスで、第２に、５０〜２００ボルト／ｃｍの低電圧場強度及び３００〜２０００ｍ秒の持続時間からなる単一パルスで電気的に刺激する、使用である。

ここに使用される「組織」という用語は、動物（例えばヒト又はヒト以外の哺乳動物、例えば齧歯類（例えばマウス、ウサギ又はラット）、犬、猫、霊長類等）の腫瘍又は非腫瘍組織を意味する。非腫瘍組織としては、筋肉（特に骨格筋）又は肝臓が挙げられる。

一実施態様によれば、組織は筋肉である。この種の組織の場合（但し、これに限定されるものではないが）、まず、ＨＶ電場強度２００〜１４００ボルト／ｃｍからなる少なくとも１のパルスで、組織を電気的に刺激することが好ましい。

別の実施態様によれば、組織は腫瘍組織である。この種の組織の場合（但し、これに限定されるものではないが）、まず、ＨＶ電場強度４００〜２０００ボルト／ｃｍからなる少なくとも１のパルスで電気的に刺激されることが好ましい。

前記薬剤は、好ましくは単一ＬＶパルスの印加前、より好ましくはＨＶパルスの印加前に、組織細胞と接触させることを目的とするものである。核酸の注入と電気パルスとの間、特に注入とＨＶパルスとの間の時間はさほど重要ではない。通常は、薬剤を２秒から１０分間、例えば３秒から５分間に亘って組織細胞と接触させる。ＨＶパルスの印加前に５〜１０分間のインターバルを設けてもよい。薬剤の接触は、直接的な筋内注射で行なってもよく、全身投与（例えば静脈内又は動脈内ルート）で行なってもよく、局所又は皮下投与で行なってもよい。

本発明の有利な態様によれば、特に筋肉の場合、単一ＬＶパルスの電場強度は、５０〜１４０ボルト／ｃｍ、特に８０〜１２０ボルト／ｃｍ、好ましくは９０〜１１０ボルト／ｃｍ、典型的には約１００ボルト／ｃｍである。

本発明の有利な態様によれば、特に腫瘍組織の場合、単一ＬＶパルスの電場強度は、１００〜２００ボルト／ｃｍ、好ましくは１２０〜１６０ボルト／ｃｍ、典型的には約１４０ボルト／ｃｍである。

本発明の別の有利な態様によれば、筋肉及び腫瘍組織に関して、単一ＬＶパルスの持続時間は、３００〜８００ｍ秒、好ましくは３５０〜６００ｍ秒、典型的には約４００ｍ秒である。

ＬＶパルスの極性は、ＨＶパルスと同じであってもよい。

但し、有利な態様によれば、ＬＶパルスの極性は、ＨＶパルスの極性とは反対である。

好ましくは、単一ＬＶパルスは方形波パルスである。単一ＬＶパルスは台形、又は不連続であってもよい。

理論に束縛されるものではないが、本発明に係る単一ＬＶパルスは、少なくとも核酸電気泳動を改善すると考えられる。

本明細書開示の仕様を有するＨＶパルスを数個、即ち２〜１０個用いてもよい。この場合は、同一のＨＶパルスとするのがより好都合である。

しかし、本明細書開示の仕様を有するＨＶパルスを１つ用いれば、細胞膜を透過化するには十分である。従って、好ましい実施態様によれば、単一のＨＶパルスが使用される。

本発明の別の有利な態様によれば、筋肉の場合（但し、これに限定されるものではないが）、ＨＶパルスの電場強度は、３００〜１３００ボルト／ｃｍ、好ましくは４００〜１２００ボルト／ｃｍ、より好ましくは５００〜９００ボルト／ｃｍ、更により好ましくは６００〜８００ボルト／ｃｍ、典型的には約７００ボルト／ｃｍである。

本発明の別の有利な態様によれば、腫瘍組織の場合（但し、これに限定されるものではないが）、ＨＶパルスの電場強度は、６００〜２０００ボルト／ｃｍ、好ましくは８００〜１６００ボルト／ｃｍ、より好ましくは９００〜１２００ボルト／ｃｍ、典型的には約１０００ボルト／ｃｍである。

本発明の更に別の有利な態様によれば、筋肉及び腫瘍組織の場合、ＨＶパルスの持続時間は、１０〜１０００μ秒、好ましくは５０〜２００μ秒、典型的には約１００μ秒である。

ＨＶパルスが単一の場合、方形波パルスであることが好ましい。ＨＶパルスが複数の場合、単極性又は双極性パルスを用いてもよく、異なる方向及び／又は極性を有するパルスを用いてもよいが、好ましくは方形波パルスである。

ＨＶパルスとＬＶパルスとの間を、ラグによって分断してもよい。このラグは、例えば３００ｍ秒〜３０００秒、好ましくは５００ｍ秒〜１０００秒、典型的には１０００ｍ秒とするのが有利である。

特定の実施態様によれば、ラグを設けず、或いはほんの僅かなラグ（例えば３００ｍ秒未満）のみを設けるととともに、ＨＶパルスの電場強度を、３００〜１０００ボルト／ｃｍ、好ましくは４００〜８００ボルト／ｃｍとする。

前記核酸による遺伝子療法への寄与は、所期の分子の発現によるものでもよく、治療効果を有する宿主内の遺伝子の調節又は遮断によるものでもよい。好ましくは、本発明に係るトランスフェクションの目的は：
筋肉を、免疫刺激効果又はワクチン効果等、直接又は間接的な治療効果を有する分子の分泌器官とすること、
組織細胞（特に筋細胞）の機能不全を補正することである。

好ましい態様によれば、核酸は、１又は２以上の治療活性分子、好ましくは１又は２以上の所期のタンパク質を、トランスフェクトされた組織細胞内において、インビボで発現させることが可能な核酸配列を含んでなる。この活性分子は、それ自体が治療活性を有していてもよく、間接的に（例えば前記分子の代謝産物を介して）活性であってもよい。本分子は、その組織自体の内部で作用してもよく、及び／又は、組織外部の別の体内部位で（例えば、発現された分子が腫瘍に活性である場合、任意の体内部位に存在する腫瘍に対して）作用してもよい。所期の治療分子の例としては、国際公開第９９／０１１５８号パンフレットに列記されたものを参照されたい。当然ながら、本発明に従って発現させることができる分子の種類に制限はなく、従って、所期の分子のコード配列と、最良の構成又は発現ベクターを選択する所定の実験法とに関する知識を有する当業者であれば、かかる分子を用いて本発明を実施することが可能である。

核酸としては、プラスミドＤＮＡ、線状ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡ等、任意のものを使用することができる。好ましい実施態様によれば、核酸は、当業者に周知の種類のＤＮＡ発現ベクターである。一般的に、発現ベクターは、所期のタンパク質をコード化するＤＮＡ配列に作動式に連結されたプロモーターと、これに続く終止信号、例えばポリアデニル化信号とを含有する。

当然ながら、本発明に係る使用には、インビボで各々異なる活性分子を発現させることが可能な２種又は３種以上の核酸を用いて薬剤を調製する場合が含まれる。これらの核酸は、状態の治療において補完し合うように、及び／又は、相乗的に作用するように選択することが好ましい。

また、インビボで少なくとも２種の活性分子を発現させることが可能な、少なくとも１種の核酸の使用も含まれる。これらの分子は、状態の治療において補完し合う、及び／又は、相乗的に作用することが好ましい。その場合、各々異なる分子をコード化するヌクレオチド配列は、同一のプロモーターの制御下に存在していてもよく、異なるプロモーターの制御下に存在していてもよい。

本発明の種々の態様によれば、前記核酸は：
薬剤が腫瘍血管形成を有効に低減、抑制又は逆行させ、
薬剤が腫瘍の成長を低減又は抑制し、
薬剤が転移を阻害し、
薬剤が抗癌性を示す
ように選択された、１種又は数種（少なくとも２種）の活性分子を発現させる。

一実施態様によれば、組織（特に筋肉）の細胞に、ＡＤＡＭ−１５遺伝子の組み換えヒト・デシンテグリン・ドメイン（ＲＤＤ遺伝子）を含むコンストラクトをトランスフェクトする。この遺伝子及びその配列、並びに有用なコンストラクト（例えば発現ベクターｐＢｉ−ＲＤＤ）は、当業者が参照可能な論文であるTrochon-Joseph V.他(2004)に、十分に記載されている。ＲＤＤの遺伝子配列を配列番号１に、タンパク質配列を配列番号２に示す。ＲＤＤは、抗癌剤として使用でき、腫瘍の成長を低減又は抑制可能であり、及び／又は、抗血管形成剤及び／又は抗転移剤として作用する。

即ち、本発明の特定の態様は、
ＲＤＤタンパク質又はその有効断片（有効（efficient）とは、断片によりコード化されたタンパク質が、ＲＤＤポリペプチド全体と同一又は類似の治療活性を誘発することを意味する）をコード化する核酸の、
インビボで組織細胞内に導入され、組織細胞内でＲＤＤポリペプチド又はその治療活性断片を生成することを目的とした薬剤の調製のための使用であって、
前記薬剤を組織内に注入し、
前記組織を、第１に２００〜２０００ボルト／ｃｍの高電圧（ＨＶ）場強度からなる少なくとも１のパルスで、第２に５０〜２００ボルト／ｃｍの低電圧（ＬＶ）場強度及び３００〜２０００ｍ秒の持続時間からなる単一パルスで電気的に刺激する、使用である。

一実施態様によれば、組織は筋肉である。この種の組織の場合（但し、これに限定されるものではないが）、組織をまず、２００〜１４００ボルト／ｃｍのＨＶ電場強度からなる少なくとも１のパルスで、電気的に刺激することが好ましい。

別の実施態様によれば、組織は腫瘍組織である。この種の組織の場合（但し、これに限定されるものではないが）、組織をまず、４００〜２０００ボルト／ｃｍのＨＶ電場強度からなる少なくとも１のパルスで、電気的に刺激することが好ましい。

上述の種々の特徴及び態様は、特に電気的導入の特徴や核酸の組成に関しては、この特定の使用においても同様に適用可能である。従って、この特定の使用の更なる特徴については、前記の点に関する上記記載が参照される。この薬剤は有利には、抗血管形成剤及び／又は抗転移剤として有用である。

別の興味深い態様によれば、前記核酸は治療活性分子として、宿主内の免疫応答を誘発し得る１種又は数種の免疫原（或いは、免疫原性ペプチド、ポリペプチド、又は糖タンパク質を含むタンパク質）をコード化する。一実施態様によれば、免疫応答は、宿主のための保護免疫応答である。本実施態様によれば、本発明は、微生物（例えばウィルス又は細菌）に対する、或いは癌に対する、免疫原性組成物又はワクチン又は治療用ワクチンを生産することに関する。あくまでも例であるが、前記核酸は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、エプスタイン−バー・ウィルス、仮性狂犬病ウィルス、シンシチウム形成ウィルスのうちの１種又は数種（少なくとも２種）の免疫原をコード化する。当業者ならば、選択した用途において最も興味深い分子（例えば、特定の疾患に最も有効な免疫原、或いは複数の免疫原の組み合わせ）をコード化する核酸を入手し得る。

別の実施態様によれば、免疫応答によって抗体（特にポリクローナル抗体）を産生する。これらの抗体は、得られた血清から回収し、常法で使用することを目的とする。

従って、本発明の別の目的は、ヒト又は動物を治療する方法であって、核酸を組織内に注入する工程と、前記組織を、第１に２００〜２０００ボルト／ｃｍの高電圧（ＨＶ）場強度からなる少なくとも１のパルスで、第２に５０〜２００ボルト／ｃｍの低電圧（ＬＶ）場強度及び３００〜２０００ｍ秒の持続時間からなる単一パルスで、電気的に刺激する工程とを含んでなり、前記の電気的刺激によって、前記核酸が前記組織細胞内に導入される方法である。

一実施態様によれば、前記組織は筋肉である。この種の組織の場合（但し、これに限定されるものではないが）、組織をまず２００〜１４００ボルト／ｃｍのＨＶ電場強度からなる少なくとも１のパルスで、電気的に刺激することが好ましい。

別の実施態様によれば、組織は腫瘍組織である。この種の組織の場合（但し、これに限定されるものではないが）、組織をまず、４００〜２０００ボルト／ｃｍのＨＶ電場強度からなる少なくとも１のパルスで、電気的に刺激することが好ましい。

上述のように、好ましい態様によれば、前記核酸は、組織細胞内にインビボで導入されると、前記組織細胞内で治療活性分子を生成することが可能である。かかる分子は、筋細胞内及び／又は別の身体部位、又は腫瘍組織細胞内で、治療作用を直接的又は間接的に発揮することを目的とするものである。

上述のように、前記核酸は、好ましくは単一ＬＶパルスの印加前に、より好ましくはＨＶパルスの印加前に注入される。

本発明に係る使用に関して上述した種々の特徴及び態様は、本治療方法にも同様に適用可能である。従って、本方法の更なる特徴については、上記記載が参照される。

一態様によれば、即ち、かかる方法において、先に開示のように、前記核酸がＲＤＤ遺伝子又はその有効断片をコード化するとともに、前記方法が、腫瘍の成長を低減又は抑制することを目的とし、及び／又は、抗血管形成剤及び／又は抗転移剤として作用する。

別の態様によれば、即ち、かかる方法において、先に開示のように、前記核酸が免疫原をコード化するとともに、前記方法が、ヒト又は動物に免疫性を付与すること、或いは回収を前提とした抗体を産生することを目的とする。

本発明の更に別の目的は、エレクトロポレーション法自体であって、核酸を間質的に含有する組織の近傍に電極を配置する工程と、前記組織を、第１に２００〜２０００ボルト／ｃｍの高電圧（ＨＶ）場強度からなる少なくとも１のパルスで、第２に５０〜２００ボルト／ｃｍの低電圧（ＬＶ）場強度及び３００〜２０００ｍ秒の持続時間からなる単一パルスで、電気的に刺激する工程とを含んでなり、この電気的刺激によって前記核酸を前記組織細胞内に導入する、エレクトロポレーション法である。

一実施態様の場合、組織は筋肉である。この種の組織の場合（但し、これに限定されるものではないが）、組織をまず２００〜１４００ボルト／ｃｍのＨＶ電場強度からなる少なくとも１のパルスで、電気的に刺激することが好ましい。

別の実施態様によれば、組織は腫瘍組織である。この種の組織の場合（但し、これに限定されるものではないが）、組織をまず４００〜２０００ボルト／ｃｍのＨＶ電場強度からなる少なくとも１のパルスで、電気的に刺激することが好ましい。

前記核酸は、対象の身体外に起因する、上述した種類の核酸である。中でも、トランスフェクトされた組織細胞又は腫瘍組織内で、１つ又は２つ以上の治療活性分子、好ましくは所期のタンパク質を、インビボで発現させることが可能な核酸配列を含む核酸が好ましい。

一態様によれば、電極を皮膚と接触した状態で、すなわち身体の外側に配置する。この場合、外科的処置は不要である。

別の態様によれば、電極を組織（特に筋肉又は腫瘍組織自体）と接触した状態で配置する。この場合、核酸注入及び電気的刺激の両方を行う装置に、電極を装着してもよい。また、電極が注入装置から分離されていてもよい。

電極は、電極を通過する電流が注入部位、或いは注入時に注入液体が拡散した領域を貫通するように、注入部位の近傍に配置する必要がある。

上述した種々の特徴及び態様は、特に電気的導入の特徴及び核酸の組成に関しては、エレクトロポレーション法にも同様に適用される。従って、本方法の更なる特徴については、上述の記載が参照される。

また、本発明は、分子を発現し得る核酸を組織細胞、特に腫瘍又は非腫瘍組織細胞、例えば筋細胞に送達する方法に使用される薬剤又は薬物の製造における、前記核酸の使用であって、
ａ）前記核酸を前記組織内に注入し、
ｂ）前記組織を、第１に、２００〜２０００ボルト／ｃｍの高電圧（ＨＶ）場強度からなる少なくとも１のパルスで、第２に、５０〜２００ボルト／ｃｍの低電圧（ＬＶ）場強度及び３００〜２０００ｍ秒の持続時間からなる単一パルスで電気的に刺激する、使用として定義することもできる。

上記記載から明らかなように、この使用の目的としては、
宿主内の免疫応答を誘発するであろう免疫原をコード化する核酸を、宿主の筋細胞（特に骨格筋細胞）内にトランスフェクトすることによる、宿主への免疫性付与、又は、
筋細胞（特に骨格筋細胞）内又は腫瘍組織細胞内に核酸をトランスフェクトすることによる、宿主への治療活性分子の全身送達が挙げられる。

かかる使用は、先に定義された種々の特徴によって、特に電気的刺激条件、核酸投与条件、核酸の組成、宿主の性質などに関して、更に定義することが可能である。

本発明の更に別の目的は、抗体、特にポリクローナル抗体を製造する方法であって、
免疫原コード化核酸を、生きている動物の組織、特に筋肉内に注入する工程と、
前記組織を第１に、２００〜２０００ボルト／ｃｍの高電圧（ＨＶ）場強度からなる少なくとも１のパルスで、第２に、５０〜１４０ボルト／ｃｍの低電圧（ＬＶ）場強度及び３００〜２０００ｍ秒の持続時間からなる単一パルスで電気的に刺激し、前記の電気的刺激によって、前記核酸を前記組織の細胞内に導入し、宿主の免疫応答を誘発し得る免疫原を前記核酸に前記宿主内で発現させる工程と、
抗体を回収する工程とを含んでなる、方法である。

動物としては、マウス、ラット、又はウサギ、或いは任意の他の動物、特に抗体の生成のために通常使用される齧歯類が挙げられる。

血清及び抗体の回収、抗体の精製及び／又は濃縮は、当業者に公知の従来法を用いて行なうことが可能である。

かかる方法は、先に定義された種々の特徴によって、特に電気的刺激条件、核酸投与条件、核酸の組成、宿主の性質などに関して、更に定義することが可能である。

以下、非限定的な実験を示し、図面を参照しながら、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１
-材料及び方法
プラスミドＤＮＡ
蛍ルシフェラーゼ（Soubrier他、1999）をコード化する変性細胞質luc+遺伝子のコード配列の上流に挿入されたサイトメガロウィルス・プロモーター（ｐｃＤＮＡ３のヌクレオチド２２９〜８９０、Invitrogen）を含有するプラスミドpXL 3031（pCMV-Luc+）を使用した。常法によりプラスミドＤＮＡを調製した（Ausubel他、1994）。或いは、EndoFree Plasmid Giga Kit（QIAGEN、Courtabeuf、フランス）を用いてＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Gibco、Cergy-Pontoise、フランス）中で調製したpEGFP-N1プラスミド（BD Biosciences Clontech、Saint Quentin Yvelines、フランス）も使用した。このプラスミドは、ＣＭＶプロモーターの制御下にある緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を特徴とする。

動物
何れの実験処置においても、７〜９週齢の雌のC57Bl/6マウスに、麻酔薬としてケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ；Ketalar、Panpharma、フランス）及びキシラジン（４０ｍｇ／ｋｇ；Rompun、Bayer、フランス）を腹腔内投与し、麻酔を施した。実験前に電気かみそりで脚を剃毛した。ルシフェラーゼ測定用の実験群には、各群に少なくとも１０個の筋肉（マウス５匹）を含めた。ＧＦＰ定性データについては、各実験条件につき４つの筋肉を使用した。

ＤＮＡ注入
ルシフェラーゼ実験では、３０μｌの０．９％ＮａＣｌ中で調製したプラスミドＤＮＡ３μｇを注射した。殆どの実験では（図１〜５）、ＤＮＡ溶液に１２０ＩＵ／ｍｌのヘパリン（Laboratoires Leo、Saint Quentin en Yvelines、フランス）を追加した。ヘパリン（ＭＷ１０〜１２ｋＤａ）１ｍｇは、ほぼ１３７ＩＵに相当する。２６ゲージ針を有するハミルトン・シリンジを用いてＤＮＡを頭側脛骨筋内に注射した。ＧＦＰ実験については、２０μｌのＰＢＳ中４μｇを、何れもヘパリン不在下で、各処理脛骨筋内に注射した。

ＤＮＡ電気的導入
ＨＶ用方形波電気パルス発生器PS-15（Jouan、St Herblain、フランス）と、ＬＶ用マイクロプロセッサ駆動式スイッチ／関数発生器（リュブリャナ大学電気工学科（スロヴェニア）で作製）とからなる装置によって、ＨＶパルスとＬＶパルスとの組み合わせを発生させた。本装置によって、ＨＶ＋ＬＶ組み合わせパルスにおける各電気パラメータを、正確に制御することが可能であった（Satkauskas他、2002）。

筋内ＤＮＡ注射後まもなく（４０±１５秒）、ＨＶパルスとＬＶパルスとの組み合わせを送達した。何れの実験でも、ＨＶとＬＶとの間のラグは１秒に固定した。筋肉へのパルス送達には、４．４ｍｍ離隔したステンレス電極板を使用した。これら１−ｃｍの板によって、マウスの脚全体を包囲した。露出した脚の頭側脛骨筋と電極板とを確実に良接触させるために、導電性ゲルを用いた。電場値（Ｖ／ｃｍ）は常に、電極間隔（ｃｍ）に対する印加電圧（Ｖ）の比で表される。

ＧＦＰ実験では、CLINIPORATOR（登録商標）（IGEA、s.r.l. Carpi (MO)、イタリア）発生器と、５ｍｍ離隔した同社の電極とを用いて、組み合わせパルスを送達した。

ルシフェラーゼ活性測定
ＤＮＡ電気的導入から２日後にマウスを屠殺した。筋肉（正味重量ほぼ６０ｍｇ）を取り出して１ｍｌ細胞培養溶解試薬溶液（１０ｍｌの細胞培養溶解試薬（Promega、Charbonnieres、フランス））中でホモジナイズし、４０ｍｌの蒸留水で希釈し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Boehringer Mannheim、マンハイム、ドイツから入手）１錠を追加した。４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、１０μｌの上澄みを用いてルシフェラーゼ活性を評価した。この評価は、５０μｌのルシフェラーゼ・アッセイ基質（Promega）を筋肉溶解物に加えた後から、Walac Victor² 照度計を使用して、１秒間に生成された光を積算することによって行なった。結果は照度計から相対光単位（ＲＬＵ）で収集した。精製蛍ルシフェラーゼ・タンパク質を用いた較正により、１０⁶のＲＬＵが、発現されたルシフェラーゼほぼ７０ｎｇに相当することが示された。最終結果は、筋肉１つ当たりのルシフェラーゼのｐｇとして表わした。

GFP蛍光の観察
pEGFP-N1プラスミド注射から３日後にマウスを屠殺し、Leica GFP Plusフィルターセット（品番10446143：励起フィルター４８０／４０ｎｍ、二色性ミラー５０５ｎｍ ＬＰ、バリヤフィルター５１０ｎｍ ＬＰ）（Leica、Rueil-Malmaison、フランス）を備えたLeica Mz12蛍光立体顕微鏡を用いて、トランスフェクトされた組織を観察した。デジタル冷却カラーカメラ（AxioCam HRc、Zeiss、Le Pecq、フランス）を用いて写真を撮影し、カメラによって検出された光をソフトウェア（AxioVision Light Edition Release 4.1.1.0）で積算することにより、GFP発現の定量化を行った。

統計分析
数群の統計的な比較には、不対値用の両側スチューデントｔ−検定を用いた。図面ではルシフェラーゼ発現データを平均±ＳＤで示した。

結果
ルシフェラーゼ実験の場合は測定感度が高いため、少量のヘパリン（１２０ＩＵ／ｍｌ）を追加したプラスミドＤＮＡ溶液を注射した。この投与量のヘパリンは、筋肉による自然のＤＮＡ取り込みを大幅に減少させるが、筋線維内へのＤＮＡ電気的導入の効果を著しく損なうことはない（Satkaukas他、2001）。従って、ヘパリン存在下でも、ＤＮＡ電気的導入効率に対するＨＶパルス及びＬＶパルスの各々の関与を、より正確に分析することができる。加えて、ＨＶパルスとＬＶパルスとの間のラグを、１秒に固定した。

ＨＶパルスの持続時間及び数の影響
電気的透過化用（ＨＶ）パルスの役割の分析には、過去のデータ（Satkaukas他、2002）で最良の遺伝子発現レベルを与えたＬＶパルスを使用した。この教示に従い、本実験ではＬＶ成分パラメータを８０Ｖ／ｃｍ、持続時間１００ｍ秒の４つのＬＶに固定し、パルス間の遅延は１秒とした。

筋肉透過化の改善を試みるべく、ＨＶパルスの数（１つから８つまで）、或いはＨＶの持続時間（１００μ秒から５００μ秒まで）を増加させた。図１に示すように、ＨＶ持続時間の延長によっても、ＨＶ数の増加によっても、筋肉トランスフェクションの有意な増強は生じなかった。

パルス数の影響
図１に示す結果が得られたことから、ＬＶ成分の役割を分析するために、８００Ｖ／ｃｍ及び１００μ秒からなる単一のＨＶを使用した。まずＬＶ数の影響について実験を行なった。ＬＶパルス強度は８０Ｖ／ｃｍに、持続時間は１００ｍ秒に、ＬＶ間の遅延は１秒に固定した。ＬＶ数を１から４に増やすと、ルシフェラーゼ発現は著しく増大した（図２）。過去のデータ（Satkaukas他、2002）と一致して、ＬＶ数４の場合には、ＬＶ数１の場合と比較して、１０倍のルシフェラーゼ発現が見られた。ＬＶパルス数を更に増加させても（６又は８）、更なる有意な増大は観察されなかった。

引き続き、持続時間５０ｍ秒のＬＶを用いて、パルス数が遺伝子導入効果に与える影響に関する実験を行なった（図３）。持続時間１００ｍ秒のＬＶ（図２）の場合と同じ傾向が観察された。何れの場合も、ルシフェラーゼ遺伝子発現が頭打ちとなるのは、総パルス持続時間４００ｍ秒からであった。ＬＶパルス数を更に増加させても（１２又は１６）、更なる有意な増大は観察されなかった。

何れも低電圧パルスの総持続時間が４００ｍ秒になるよう、ＬＶの数と持続時間との組み合わせを変えて、更に４通りの組み合わせを用いて比較を行なった（図４）。個々のパルス持続時間を減少させるとともにパルス数を増大させると、ルシフェラーゼ遺伝子発現が漸減する傾向が見られた（図４）。驚くべきことに、そして予期せぬことに、４００ｍ秒の単一ＬＶを用いたＨＶとＬＶとの組み合わせによって、ルシフェラーゼ遺伝子発現は更に向上し、最良となった。この場合の発現は、例えば５０ｍ秒のＬＶを８つ用いた場合の約２倍であった（ｐ＜０．００１）。

ＧＦＰ蛍光観察
１００μ秒、８００Ｖ／ｃｍの単一のＨＶと、これに続く１秒間の遅延後の、６０、８０、又は１００Ｖ／ｃｍからなる４００ｍ秒の単一のＬＶパルスとを使用して、ＧＦＰ遺伝子の電気的導入を行なった後、筋肉内部の蛍光の分布及び強度を、蛍光立体顕微鏡を使用して定性的及び半定量的に測定した。写真の撮影は、一定の露光時間（１００ｍ秒、パネルＡ、Ｂ及びＣ）で行なうか、或いは可変露光時間で、即ち、各写真の光量を等量とするカメラの自動露光時間調節を有効にして行なった（パネルＤ、Ｅ及びＦ）。得られた写真は、実験条件毎に４つの筋肉で観察された画像を表わすものである。二連で写真を作製したところ、結果の再現性とともに、ＬＶパルスの電場強度の増大に伴う蛍光の大幅な増大が示された（パネルＡ、Ｂ及びＣ）。これらの画像における平均緑色濃度の定量分析は、定性データを支持している。すなわち、強度レベル２５６の相対強度において、６０Ｖ／ｃｍではレベル４１（左側の筋肉）及び３３（右側の筋肉）に達した（パネルＡ）のに対し、８０Ｖ／ｃｍではレベル１１１及び８９に（パネルＢ）、そして１００Ｖ／ｃｍではレベル１３８及び１２７に達した（パネルＣ）。また、これらの写真は、ＬＶ電場強度によらず蛍光「光学面」が同一であることも示している（パネルＤ、Ｅ及びＦ）。蛍光の増大は、各線維の蛍光の増大によるものであるが、電気的導入の作用を受ける組織の体積は同じであった。線維内に電気的導入されたプラスミド数は、個々の線維について観察された蛍光増大を説明している。

実施例２
本実験に使用された発現ベクターを、Trochon-Joseph V.他、2004に従って調製した。

pBi（対照）又はpBi-RDD（実験処理）各２０μｇを、１０μｇのTet-tTS及び２０μｇのTet-Onプラスミドとともに、滅菌０．９％ＮａＣｌ（最終容積３０μｌ）中、頭側脛骨筋内に注射した。動物１匹当たり脚２本に電気的導入を施した。
電気的導入は下記のように行った。

電気的導入前日に、C57BL/6マウスの脚を電気かみそりで剃毛した。電気的導入処置前に、ケタミン（１００ｍｇ／体重ｋｇ）とキシラジン（４０ｍｇ／ｋｇ）との混合物を腹腔内注射して、動物に麻酔を施した。

ハミルトン・シリンジを用いてプラスミド混合物を注射した。脚の皮膚と２枚のステンレス鋼板電極（電極間の間隔：５ｍｍ）とを確実に良接触させるために、導電性ゲルを塗布した。続いて、膜を透過化するために、まず７００Ｖ／ｃｍ、１００μ秒（１Ｈｚ）の単一の方形波電気ＨＶパルスを経皮的に印加した。１０００ｍ秒の休止後、電極を動かすことなく、電気泳動による細胞内へのＤＮＡ進入を可能にするために、１００Ｖ／ｃｍ、４００ｍ秒の単一の方形波電気ＬＶパルスを経皮的に印加した。電気的導入は、電気パルス発生器Cliniporator（IGEA、イタリア）を用いて行なった。各動物群及び各脚に対して同じ処置を施した。各群１０匹のマウスを使用した。

腫瘍移植の３日前に、動物用飲料水にドキシサイクリンを加えて、電気的導入を行なった筋肉からＲＤＤの生成を誘発した。ドキシサイクリン誘発は実験を通じて継続した。

指数的成長相で培養されたB16F10メラノーマ細胞を０．０２％ＥＤＴＡで剥離し、滅菌０．９％ＮａＣｌ中の最終濃度が４×１０⁶／ｍｌとなるように再懸濁した。懸濁液１００μｌをマウスの眼窩後方に静脈注射した。細胞注射から７日後にマウスを屠殺し、肺を切除し、解剖顕微鏡下で転移節をカウントした。

図５に示すように、ＲＤＤの存在下、実験群中で検出された転移節は、対照群よりも７０．５％少なかった。ＲＤＤはB16F10メラノーマの発達を阻害した。

実施例３
図６及び図７は、各々異なるＨＶパルス（２００〜１８００Ｖ／ｃｍ、１００μ秒）と、それに続くＨＶから１秒後（図６）又はＨＶ直後（図７）のＬＶパルス１つ（８０Ｖ／ｃｍ；４００ｍ秒）との組み合わせを用いて、マウス脛骨筋内にＤＮＡ電気的導入を行なった後のルシフェラーゼ発現を示す。これらの実験は、ルシフェラーゼ・プロトコルについては実施例１と同様に行ない、各群６匹のマウスを用い、パルス刺激の送達にはCLINIPORATOR（登録商標）を用い、ルシフェラーゼ活性は筋肉１ｍｇ当たりのｐｇで表わした。

実施例４
腫瘍実験：従来の手順を用い、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び８％のウシ胎仔血清を追加したＭＥＭ培地を使用して、B16 F10メラノーマ細胞をインビトロで培養した。若い（６〜８週齢）C57Bl/6雌マウスの左脇腹に、１×１０⁶個の同系B16細胞（ＭＥＭ培地１００μｌ中）を皮下接種した。腫瘍が平均直径６〜７ｍｍに達したら（接種から７〜８日後）、腫瘍を処理した。

タイプ４、２６ゲージ、１６ｍｍ長の針を装着したＲＮ型ハミルトン・シリンジを用いて、５０μｌ中５０μｇのＤＮＡ（プラスミドpCMV-Luc+）を腫瘍内に局所注射した。注射は１５〜２５秒で実施した。１ｃｍ幅、１ｍｍ厚の外部ステンレス鋼板電極（IGEA、Carpi、イタリア）２枚を５ｍｍ間隔で、腫瘍の各側の皮膚上に配置し、腫瘍全体を包囲した。超音波検査用導電性ゲル（EKO-GEL、Egna、イタリア）を用いて電気的接触を確保した。

固定ＬＶ成分を使用した場合（１４０Ｖ／ｃｍ、４００ｍ秒の1 ＬＶ）、得られたＨＶ電場強度関数の結果は、最適発現の平坦域に達するまでにより高い電場強度の印加が必要であったことを除けば、骨格筋上で得られた結果と同様であった。図８を参照のこと。

固定ＨＶ成分を使用した場合（８００Ｖ／ｃｍ、１００μ秒の１ＨＶ）、得られたＬＶ電場強度関数の結果は、やはり最適発現の平坦域に達するまでにより高い電場強度の印加が必要であったことを除けば、骨格筋上で得られた結果と同様であった。

最適なＨＶ＋ＬＶパルスによる最大効力は、過去に発表された最適条件における同一のパルス列（同一の方形波からなる列）の効力と比べて、１０倍高いことが判った。

実施例５：ポリクローナル抗体の生成
−材料及び方法
プラスミドＤＮＡ
マウス・ウロキナーゼ分泌信号の制御下にあるヒトＲＤＤ遺伝子を、pVAX-RDDプラスミドを発生させるために、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターと、ウシ成長ホルモンポリアデニル化信号を含有するpVAX1プラスミド（Invitrogen、V260-20）内に挿入した。空のベクターpVAX１を陰性対照として使用した。プラスミドは、EndoFree NucleoSpin Plasmid Kit（Macherey Nagel）を使用して、滅菌０．９％ＮａＣｌ中で調製した。

動物
雌Wistarラットに、麻酔薬ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔を施した。雌New Zealandウサギを、まずカルミヴェット（１ｍｌ／ｌｇ）の皮下注射で処理し、次いでペントバルビタールを静脈内注射して麻酔を施した。実験前に電気かみそりで脚を剃毛した。

ＤＮＡ注入及び電気的導入
穿刺性針電極を、ウサギについては薄筋内に、ラットについては臀筋内に導入した。１００μｌの０．９％ＮａＣｌ中で調製した１００μｇの各プラスミドＤＮＡを、電極線間に３回で注入した。筋内ＤＮＡ注射の直後に、CLINIPORATOR（登録商標）による筋肉電気的導入を前述のように、すなわち７００Ｖ／ｃｍ、１００μ秒（１Ｈｚ）の電気パルス１つ、１０００ｍ秒の休止、そして電極を動かさずに１００Ｖ／ｃｍ、４００ｍ秒の電気パルス１つを加えて実施した。この処置を各動物の両脚に対して、ウサギについては１筋肉当たり２回（すなわち動物１匹当たり４回の注射）、ラットについては１筋肉当たり１回（すなわち動物１匹当たり注射２回）実施した。０週目、６週目、及び１２週目に、動物に免疫性付与を行なった。

抗体応答の測定
初回の免疫性付与前に、その後は４週目、９週目（ウサギの屠殺時）、及び１６週目（ラットの屠殺時）に、血液を採取した。遠心分離で血清を回収した。下記の手順でＥＬＩＳＡにより抗ＲＤＤ抗体（ＩｇＧ）を測定した。９６ウェル・マイクロタイタープレート（Nunc Maxisorb、Roskilde、デンマーク）の各ウェルに、Ｅ．ｃｏｌｉによって産生された組み換えＲＤＤ１００ｎｇを塗布した。４℃で一晩インキュベーションした後、ウェルをＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水ＴＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０）で６回洗浄し、次いで震盪条件下で３時間、室温でＴＢＳＴ−５％ミルクと一緒にインキュベートした。上述のように洗浄したら、ＴＢＳＴ−５％ミルク中の血清の連続希釈液１００μｌ（１：１２５から１：８０００）と一緒にウェルをインキュベートした。ペプチド免疫性付与によって生成された抗ＲＤＤウサギ・ポリクローナル血清（Neosystem）を陽性対照として使用した。震盪させながら２時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、そしてＴＢＳＴ−５％ミルク中１：５０００に希釈した１００μｌのペルオキシダーゼ抱合抗体と一緒に１時間インキュベートし、結合されたウサギ抗体をペルオキシダーゼ抱合抗ウサギＩｇＧ（照会番号ＮＡ９３４、Amersham）で検出し、結合されたラット抗体を、ヤギＦ（ａｂ’）２断片ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼ（照会番号ＩＭ０８２５、Beckman Immunotech）で検出した。上述のように洗浄した後、ウェルを２００μｌの基質０−フェニレンジアミン二塩酸塩（Sigma Fast OPDペルオキシダーゼ基質錠剤セット）と一緒に３０分間にわたってインキュベートした。３Ｎ ＨＣＬ５０μｌを加えて反応を停止させ、４９０ｎｍで分光光度測定値を得た。

陽性対照として用いる抗ＲＤＤウサギ・ポリクローナル血清は、標準的なペプチド免疫性付与に従って生成した（Neosystem SA、Strasbourg、フランス）。選択したペプチドはGluta-KLH（キーホール・リンペット・ヘモシアニン、小ペプチドの免疫原性を増強するためのキャリヤタンパク質）に接合されたＲＤＤ配列（配列番号２）由来のアミノ酸残基５７〜６８を含むものであった。このペプチド２ｍｇを、０週目、２週目、４週目、及び８週目にウサギに皮下注射した。第１の注射前、次いで６週目、１０週目、及び１２週目（屠殺時）に、血液を採取した。１２週目に採取された血清を陽性対照として使用した。

−結果
図１０に示すように、筋肉への電気的導入によってウサギ及びラットに免疫性を付与した後、９週目に抗ＲＤＤＩｇＧ抗体が生成された。電気的導入によるこの免疫性付与は、ウサギへのペプチド注射による従来の免疫性付与（対照ウサギ曲線参照）よりも効率的に抗ＲＤＤ抗体生成を誘発した。同じ結果が１６週目のラットに関しても得られた。

更に、ウサギ及びラットにおいて得られたこれらのポリクローナル抗ＲＤＤ血清は、ウェスタンブロット実験で組み換えＲＤＤを特異的に検出することができた。

１つ又は８つのＨＶパルス（８００Ｖ／ｃｍ；０．１、０．２又は０．５ｍ秒）と４つのＬＶパルス（８０Ｖ／ｃｍ；１００ｍ秒）との組み合わせ（ｘＨＶ＋４ＬＶ組み合わせパルス）を用いたＤＮＡ電気的導入後のルシフェラーゼ発現を示す図である。データは平均±ＳＤとして示す。ｘＨＶ＋４ＬＶ群間の統計的な差はｔ−検定によって計算した。ＮＳ−有意でない。 １つのＨＶパルス（８００Ｖ／ｃｍ；１００μ秒）と種々の数のＬＶパルス（１００ｍ秒；８０Ｖ／ｃｍ）との組み合わせ（ＨＶ＋ｘＬＶ組み合わせパルス）を用いたＤＮＡ電気的導入後のルシフェラーゼ発現を示す図である。データは平均±ＳＤとして示す。図に示す隣接群間の統計的な差はｔ−検定によって計算し、アスタリスクによって示す（^**Ｐ＜０．０１；^***Ｐ＜０．００１；ＮＳ−有意でない）。 １つのＨＶパルス（８００Ｖ／ｃｍ；１００μ秒）と種々の数のＬＶパルス（５０ｍ秒；８０Ｖ／ｃｍ）との組み合わせ（ＨＶ＋ｘＬＶ組み合わせパルス）を用いたＤＮＡ電気的導入後のルシフェラーゼ発現を示す図である。データは平均±ＳＤとして示す。図に示す隣接群間の統計的な差はｔ−検定によって計算し、アスタリスクによって示す（^*Ｐ＜０．０５；^**Ｐ＜０．０１；ＮＳ−有意でない）。 １つのＨＶパルス（８００Ｖ／ｃｍ；１００μ秒）と、ＬＶの総持続時間を一定としたパルス数及びパルス持続時間の関数によるＬＶパルスとの組み合わせを用いたＤＮＡ電気的導入後のルシフェラーゼ発現を示す図である。データは平均±ＳＤとして示す。１ＨＶ＋１ＬＶ（４００ｍ秒）群と他の群の間の統計的な差はｔ−検定によって計算し、アスタリスクによって示す（^*Ｐ＜０．０５；^**Ｐ＜０．０１；^***Ｐ＜０．００１）。 ｐＢｉ（対照）又はｐＢｉ−ＲＤＤの電気的導入後のマウスにおける転移数を示す図である。 各々異なるＨＶパルス（２００−１８００Ｖ／ｃｍ、１００μ秒）と、これに続く、ＨＶから１秒後の１つのＬＶパルス（８０Ｖ／ｃｍ；４００ｍ秒）との組み合わせを用いて、脛骨筋内にＤＮＡ電気的導入を行った後のルシフェラーゼ発現を示す。データは平均±ＳＤとして示す。 各々異なるＨＶパルス（２００−１８００Ｖ／ｃｍ、１００μ秒）と、これに続くＨＶ直後の１つのＬＶパルス（８０Ｖ／ｃｍ；４００ｍ秒）との組み合わせを用いて、脛骨筋内にＤＮＡ電気的導入を行った後のルシフェラーゼ発現を示す。データは平均±ＳＤとして示す。 各々異なるＨＶパルス（４００〜２０００Ｖ／ｃｍ、１００μ秒）と、これに続く１つのＬＶパルス（８０Ｖ／ｃｍ；４００ｍ秒）との組み合わせを用いて、腫瘍内にＤＮＡ電気的導入を行った後のルシフェラーゼ発現を示す。データは平均±ＳＤとして示す。 １つのＨＶパルス（８００Ｖ／ｃｍ、１００μ秒）単独、又はこのＨＶパルスと、これに続く１つのＬＶパルス（６０、８０、１００、１２０又は１４０Ｖ／ｃｍ；４００ｍ秒）との組み合わせを用いて、腫瘍内にＤＮＡ電気的導入を行った後のルシフェラーゼ発現を示す。データは平均±ＳＤとして示す。 ウサギ及びラットで生成された抗ＲＤＤＩｇＧ抗体の測定値である。

Claims (45)

1. 核酸を含む薬剤を組織細胞内にインビボ（in vivo）で導入するための電気パルス発生器の作動方法であって、前記薬剤と接触された組織細胞を刺激するための電気パルスとして、電極間に、第１に、２００〜２０００ボルト／ｃｍの高電圧場強度からなる少なくとも１のパルスを発生し、第２に、５０〜２００ボルト／ｃｍの低電圧場強度及び３００〜２０００ｍ秒の持続時間からなる単一パルスを発生することを含む方法。
2. 核酸を組織細胞内へエレクトロポレーションで導入するための電気パルス発生器の作動方法であって、前記核酸を間質的に含有する組織を刺激するための電気パルスとして、前記組織の近傍に皮膚と接触した状態で配置される電極間に、第１に、２００〜２０００ボルト／ｃｍの高電圧（ＨＶ）場強度からなる少なくとも１のパルスを発生し、第２に、５０〜１４０ボルト／ｃｍの低電圧（ＬＶ）場強度及び３００〜２０００ｍ秒の持続時間からなる単一パルスを発生することを含む方法。
3. 分子を発現し得る核酸を組織細胞に送達するための電気パルス発生器の作動方法であって、前記核酸を注入された前記組織を刺激するための電気パルスとして、電極間に、第１に、２００〜２０００ボルト／ｃｍの高電圧（ＨＶ）場強度からなる少なくとも１のパルスを発生し、第２に、５０〜２００ボルト／ｃｍの低電圧（ＬＶ）場強度及び３００〜２０００ｍ秒の持続時間からなる単一パルスを発生することを含む方法。
4. 前記の低電圧単一パルスの電場強度が５０〜１４０ボルト／ｃｍである、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
5. 前記の低電圧単一パルスの電場強度が８０〜１２０ボルト／ｃｍである、請求項４に記載の方法。
6. 前記の低電圧単一パルスの電場強度が９０〜１１０ボルト／ｃｍである、請求項５に記載の方法。
7. 前記の低電圧単一パルスの電場強度が１００ボルト／ｃｍである、請求項６に記載の方法。
8. ２００〜１４００ボルト／ｃｍの高電圧場強度が使用される、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
9. ４００〜１２００ボルト／ｃｍの高電圧場強度が使用される、請求項８に記載の方法。
10. ６００〜８００ボルト／ｃｍの高電圧場強度が使用される、請求項９に記載の方法。
11. ７００ボルト／ｃｍの高電圧場強度が使用される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記組織が筋肉である、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
13. 前記の低電圧単一パルスの電場強度が１００〜２００ボルト／ｃｍである、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
14. 前記の低電圧単一パルスの電場強度が１２０〜１６０ボルト／ｃｍである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記の低電圧単一パルスの電場強度が１４０ボルト／ｃｍである、請求項１４に記載の方法。
16. ４００〜２０００ボルト／ｃｍの高電圧場強度が使用される、請求項１〜３及び１３〜１５の何れか１項に記載の方法。
17. ８００〜１６００ボルト／ｃｍの高電圧場強度が使用される、請求項１６に記載の方法。
18. ９００〜１２００ボルト／ｃｍの高電圧場強度が使用される、請求項１７に記載の方法。
19. １０００ボルト／ｃｍの高電圧場強度が使用される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記組織が腫瘍組織である、請求項１〜３及び１３〜１９の何れか１項に記載の方法。
21. 前記の低電圧単一パルスの持続時間が３００〜８００ｍ秒である、請求項１〜２０の何れか１項に記載の方法。
22. 前記の低電圧単一パルスの持続時間が３５０〜６００ｍ秒である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記の低電圧単一パルスの持続時間が４００ｍ秒である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記の低電圧単一パルスが、前記の高電圧パルスの極性とは反対の極性を有している、請求項１〜２３の何れか１項に記載の方法。
25. 単一の高電圧パルスが使用される、請求項１〜２４の何れか１項に記載の方法。
26. 持続時間が１０〜１０００μ秒の高電圧場パルスが使用される、請求項１〜２５の何れか１項に記載の方法。
27. 持続時間が５０〜２００μ秒の高電圧場パルスが使用される、請求項２６に記載の方法。
28. 持続時間が１００μ秒の高電圧場パルスが使用される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記の高電圧パルスと前記の低電圧パルスとが、ラグによって分離されている、請求項１〜２８の何れか１項に記載の方法。
30. 前記ラグが３００ｍ秒〜３０００秒である、請求項２９に記載の方法。
31. 前記ラグが５００ｍ秒〜１０００秒である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記ラグが１０００ｍ秒である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記核酸が、組織細胞内で１又は複数の治療活性分子を生成し得る、請求項１〜３２の何れか１項に記載の方法。
34. それぞれ異なる治療活性分子を組織細胞内で生成し得る、２種又は３種以上の核酸が使用される、請求項１〜３３の何れか１項に記載の方法。
35. 前記核酸がＲＤＤタンパク質又はその有効断片をコード化する、請求項１〜３４の何れか１項に記載の方法。
36. 前記治療活性分子が腫瘍血管形成を有効に低減又は抑制する、請求項３３に記載の方法。
37. 前記治療活性分子が腫瘍の成長を低減又は抑制する、請求項３３に記載の方法。
38. 前記治療活性分子が転移を阻害する、請求項３３に記載の方法。
39. 前記治療活性分子が抗癌性である、請求項３３に記載の方法。
40. 前記組織が筋肉であり、前記核酸が１種又は数種の免疫原をコード化する、請求項１〜１２及び請求項２１〜３４の何れか１項に記載の方法。
41. 前記免疫原がＨＩＶ免疫原である、請求項４０に記載の方法。
42. 前記組織が筋肉である、請求項１〜１２及び２１〜３９の何れか１項に記載の方法。
43. 抗体を製造する方法であって、
    免疫原コード化核酸を、生きている非ヒト動物の組織に注入する工程と、
    前記組織を第１に、２００〜２０００ボルト／ｃｍの高電圧（ＨＶ）場強度からなる少なくとも１のパルスで、第２に、５０〜１４０ボルト／ｃｍの低電圧（ＬＶ）場強度及び３００〜２０００ｍ秒の持続時間からなる単一パルスで電気的に刺激し、前記の電気的刺激によって、前記核酸を前記組織の細胞内に導入し、宿主の免疫応答を誘発し得る免疫原を前記核酸に前記宿主内で発現させる工程と、
    抗体を回収する工程とを含んでなる、方法。
44. 抗体がポリクローナル抗体である、請求項４３に記載の方法。
45. 前記組織が筋肉である、請求項４３又は４４に記載の方法。

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