JP5200216B2

JP5200216B2 - 新規安息香酸ベンジル誘導体及び医薬

Info

Publication number: JP5200216B2
Application number: JP2005366790A
Authority: JP
Inventors: 大輔上村; 将樹北; 漠松本; 智之諏佐; 薫山田; 一良矢澤; 宏二山口; 茂叶
Original assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2005-12-20
Filing date: 2005-12-20
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2025-12-20
Also published as: JP2007169188A

Description

本発明は、安息香酸ベンジル誘導体を含有し血圧降下作用に特徴を有する医薬に関する。

レニン−アンジオテンシン系は、生体内における血圧、水分量、体内電解質バランスなどの恒常性調節系として重要な役割を持つ。主要な生理活性物質はアンジオテンシンIIである。

腎臓（傍糸球体）から分泌されるレニン（１種のたんぱく質分解酵素）は肝臓で生成されるレニン基質からアンジオテンシンI（前駆体デカペプチド）を生成する。その後、アンジオテンシンIはアンジオテンシン変換酵素（ACE）により強力な昇圧作用を有するアンジオテンシンII（オクタペプチド）に変換される。

アンジオテンシンIIの昇圧機序は末梢血管平滑筋へ直接作用するとともに血管運動中枢を介して中枢性にも作用する。また、バソプレッシン分泌作用や、より低濃度におけるアルドステロン分泌作用も間接的に昇圧作用に結びつき、全身血圧の上昇をきたすと考えられる。

アンジオテンシンIIは細胞膜上のアンジオテンシンII受容体、特に１型（AT₁）を介して血管収縮作用を示す。従って、AT₁ 受容体を拮抗させることにより、血圧降下作用が期待できる。

レニン−アンジオテンシン系に作用する血圧降下剤としては、レニン阻害剤、ACE阻害剤（カプトプリル）、の他ペプチド性アンジオテンシンII拮抗剤（サララシン）、非ペプチド性アンジオテンシンII拮抗剤（ロサルタン）等が経口剤として臨床で用いられている。

カルシウムイオン（Ｃａ²⁺）はすべての細胞と細胞外液に分布し、細胞の刺激応答反応において最も重要な細胞内情報伝達物質として応答反応発現に働いており、神経細胞の興奮、筋肉の収縮、ホルモンや消化酵素の分泌、ステロイド合成、糖や脂質の代謝、細胞増殖及び分化等、多くの細胞機能に関与している。従って、細胞内のＣａ²⁺濃度調節に異常が起こると種々の疾病を引き起こし、また疾病の治療には細胞内のＣａ²⁺濃度を整えることが有効である。細胞は細胞内のＣａ²⁺濃度を厳密にコントロールするために、細胞膜に存在するカルシウムチャンネル、カルシウムポンプ、または小胞体表面に存在するイノシトール三リン酸受容体、カルシウムポンプ等、種々の調節機構を準備している。このような細胞内情報伝達過程は複数の連鎖経路からなる場合もあり、一般に細胞ごとに異なって多様である。カルシウムチャンネル（特にＬ型）に拮抗作用を有する化合物は血管を拡張することにより血圧降下作用を示し、高血圧症の治療薬として臨床で使用されている。

一方、血圧降下剤は対症療法剤であることから長期間にわたる反復投与が要求され、患者の煩わしさ軽減の見地から１日１回経口投与法が一般的であるが、これに伴い投与量と薬効継続の調節、目まい等の不快感の発現、他の薬剤との相互作用、服用中断による影響などの問題点が存在するのが現状である。

従って、治療の現場では、長期間服用しても安全であり、かつ確実な効果を奏する薬剤の開発が常に望まれている。

安息香酸ベンジルは各種植物の成分として知られ、香料、抗疥癬剤、殺ダニ・シラミ剤としての用途が知られている。また、それら植物をいわゆるハーブとして用いた場合の血圧降下作用に関与しているとされるが、医薬品を指向してさらに検討された例は報告されていない。

安息香酸ベンジル誘導体は種々知られているが血圧降下剤としての用途が報告された例はない。また、安息香酸の２−ブロモベンジルエステルはこれまでに文献への報告を見ない新規化合物である。

本発明は、アンジオテンシンII１型受容体拮抗剤、カルシウムチャンネル拮抗剤、血圧降下剤などとして作用する医薬を提供することを解決すべき課題とする。

本発明者らは、上記課題解決のため鋭意研究を重ねた結果、種々の安息香酸ベンジル誘導体のうち、新規化合物である２−ブロモベンジル安息香酸がインビトロでアンジオテンシンII１型受容体拮抗作用及びカルシウムチャンネル拮抗作用を示すこと、またグアニジノ関連構造を有するベンジルオキシカルボニル化合物がインビトロでの作用に加えてマウスを用いた動物試験において有意の血圧降下作用を示すことを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の医薬は、下記一般式（２）の安息香酸ベンジル誘導体及び一般式（３）のカルボン酸ベンジル誘導体から選択される１以上の化合物である。特に、これら化合物は血圧降下剤として適用される。

（式（２）中、Ｒ^1〜10は、水素、ハロゲン、保護基を有していても良い水酸基、アミノ基、保護基を有していても良いチオール基、ニトロ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、スルホ基並びに炭化水素基（一部水素が、ハロゲン、保護基を有していても良い水酸基、アミノ基、保護基を有していても良いチオール基、ニトロ基、アシル基、アルコキシカルボニル基及びスルホ基から選択される１以上の基で置換されても良い）から選択される置換基からそれぞれ独立して選択される。但し、全てが水素原子である場合は除く。）

（式（３）中、Ｒ^1〜5は、水素、ハロゲン、保護基を有していても良い水酸基、アミノ基、保護基を有していても良いチオール基、ニトロ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、スルホ基並びに炭化水素基（一部水素が、ハロゲン、保護基を有していても良い水酸基、アミノ基、保護基を有していても良いチオール基、ニトロ基、アシル基、アルコキシカルボニル基及びスルホ基から選択される１以上の基で置換されても良い）から選択される置換基からそれぞれ独立して選択される。；Ｘは

である。ｎは１以上；Ｘは＊の部分に式（３）のＣ¹で示す炭素原子が位置する。）
上記医薬を探索する過程で、下記式（１）で表される有用な新規安息香酸ベンジル誘導体（２−ブロモベンジル安息香酸）を発見した。この化合物は式（２）中に含まれる１の化合物であり、血圧降下剤として適用可能な化合物である。

・一般式（２）の安息香酸ベンジル誘導体について
式中、Ｒ^1〜10のうちの少なくとも１つは水素以外の置換基を有する。水素以外の置換基としては、ハロゲン、保護基を有していても良い水酸基、保護基を有しても良いアミノ基、保護基を有していても良いチオール基、ニトロ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、スルホ基並びに炭化水素基から選択できる。特に、ハロゲン、例えば臭素が挙げられる。

水酸基、アミノ基、チオール基の保護基である置換基としては特に限定しない。一般的な有機化学分野における反応が進行しないようにする本来の意味での保護基の他、プロドラッグ化のために導入する置換基が挙げられる。例えば、アセチル基、プロピオニル基、ピバロイル基、ベンゾイル基等のアシル基；メトキシカルボニル基、t-ブトキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル基等のアラルキルオキシカルボニル基；ベンジル基、ナフチルメチル基等のアリールメチル基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ベンジルジメチルシリル基、t-ブチルジフェニルシリル基等のシリル基；アセトニド基；ヒドロキシメチル基、メトキシメチル基、エトキシエチル基等の低級アルコキシアルキル基が挙げられる。

アシル基は特に限定しないが、炭素数１〜５程度のものが挙げられる。アルコキシカルボニル基も特に限定しないが、炭素数１〜５程度のアルコールとのエステルが挙げられる。炭化水素基も特に限定しない。例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基などが挙げられる。これらの炭化水素基は炭素数が１〜５程度であり、水素原子の一部乃至全部が置換されていても良い。フェニル基（一部水素が置換されたものも含む）を採用することもできる。

これら安息香酸ベンジル誘導体は対応する安息香酸誘導体及びベンジルアルコール誘導体をエステル化することで容易に合成できる。また、前駆体となる置換基を導入後、後反応により目的の置換基に変換することでも合成できる。

・一般式（３）のカルボン酸ベンジル誘導体について
式中Ｒ⁶〜¹⁰が存在しない以外は一般式（２）における説明がすべて妥当する。更に、Ｘとしては上記（ａ）又は（ｂ）に記載の置換基が採用される。ここで、置換基（ａ）におけるｎは１以上であるが、好ましくはｎ＝１〜３、より好ましくはｎ＝１である。

以下に一般式（３）で表されるカルボン酸ベンジル誘導体のうち好ましいものを挙げる。下記式（４）はＸが（ａ）、ｎが１、Ｒ^1〜5が水素である４−オキソ−アゼチジン−２−カルボン酸ベンジルエステル（4-Oxo-azetidine-2-carboxylic acid benzyl ester）である。下記式（５）はＸが（ｂ）、Ｒ^1〜5が水素である（イミノ−ピラゾール−１−イル−メチル）−カルバミン酸ベンジルエステル（(Imino-pyrazol-1-yl-methyl)-carbamic acid benzyl ester）である。

これらカルボン酸ベンジル誘導体は対応するカルボン酸誘導体及びベンジルアルコール誘導体をエステル化することで容易に合成できる。また、前駆体となる置換基を導入後、後反応により目的の置換基に変換することでも合成できる。

（試料の調製）
・Ｒ^1〜10の各置換基を表１に示すものに変化させた安息香酸ベンジル誘導体を被検化合物とした。市販品のあるものは市販品を用い、ないものは合成した。合成方法は下記方法又は下記方法類似の方法にて行った。また、式（４）及び（５）の化合物も被検化合物とした（式（４）の化合物：ベンジル（Ｓ）-（-）-４−オキソ-２-アゼチジンカルボキシラート(Benzyl (S)-(-)-4-oxo-2-azetidine carboxylate)、式（５）の化合物：Ｎ−(ベンジルオキシカルボニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン (N-(Benzyloxycarbonyl)-1H-pyrazole-1-carboxamidine)）。

・２−ブロモベンジル安息香酸（一般式（２）におけるＲ¹がＢｒ、Ｒ^2〜10が水素）の合成：
ナス型フラスコに２−ブロモベンジルアルコール（２３８ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を採り、系内を窒素雰囲気下とした後、ピリジン（６．４ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。これに塩化ベンゾイル（１６５μL、１．４１ｍｍｏｌ）を加え、５０分間撹拌した。反応液に蒸留水１０ｍＬを加え、５分後室温に戻した。これを１０ｍＬのｎ−ヘキサンで３回抽出し、有機層を合わせて飽和塩化ナトリウム水溶液１０ｍＬで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｇ、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝５０／１から２５／１）により精製して２−ブロモベンジル安息香酸３４５．１ｍｇ（回収率９２．６％）を白色固体として得た。

なお、出発物質としての２−ブロモベンジルアルコールに代えて、対応する構造をもつ化合物を採用することで目的の化合物が合成できる（例えば、３−ブロモベンジルアルコールを採用すると、２−ブロモベンジル安息香酸が合成できる）。

分子式：Ｃ₁₄Ｈ₁₁Ｏ₂Ｂｒ（ｍｗ＝２９１）、¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）及び¹³Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）のそれぞれについて測定したスペクトルを図１及び２に示す。

・３−アミノベンジル安息香酸（トリフルオロ酢酸塩）、（一般式（２）におけるＲ²がアミノ基、Ｒ^1、3〜10が水素）の合成：
ナス型フラスコに３−アミノベンジルアルコール（２０１．１ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）を採り、系内を窒素雰囲気下とした後、１，４−ジオキサン（１．５ｍＬ）、蒸留水１．５ｍＬ、及び１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１．６ｍＬの混合液に溶解した。これにジ−ｔ−ブチルジカルボネート（(Boc)₂O、５２９．２ｍｇ、２．４３ｍｍｏｌ）を加え、６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮して溶媒をできるだけ留去し、６ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。有機層を合わせて飽和塩化ナトリウム水溶液１０ｍＬで洗浄し、溶媒を留去した後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｇ、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝５／１から１／１）により精製して、アミノ基が保護された３−アミノベンジルアルコール（４２２．５ｍｇ）を得た。

ナス型フラスコに上記のアミノ基が保護された３−アミノベンジルアルコール（２５８．５ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を採り、系内を窒素雰囲気下とした後、ピリジン（５．８ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。これに塩化ベンゾイル（１５０μL、１．２８ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。反応液に蒸留水１０ｍＬを加え、３分後室温に戻した。これを１０ｍＬの酢酸エチルで３回抽出し、有機層を合わせて飽和塩化ナトリウム水溶液１０ｍＬで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｇ、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２５／１から０／１）により精製してアミノ基が保護された３−アミノベンジル安息香酸（１９９．６ｍｇ）を白色固体として得た。

ナス型フラスコに上記のアミノ基が保護された３−アミノベンジル安息香酸（４０．８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を採り、系内を窒素雰囲気下とした後、ジクロロメタン（０．３ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。これにトリフルオロ酢酸０．３ｍLを加え、１５分間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、３−アミノベンジル安息香酸（トリフルオロ酢酸塩）を５１．４ｍｇ、褐色固体として得た。

（アンジオテンシンII１型受容体への作用評価試験）
アンジオテンシンII１型受容体発現遺伝子を導入したヒト胎児腎細胞（ｍＡＴ１ａ（ＨＡ）／２９３―Ｔ）を用いて試験を行った。試験は、アンジオテンシンII添加による細胞内カルシウムイオン濃度の変化（被検化合物を２００μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ添加した場合の応答率を試料を添加しない場合を１００％として表す）を測定し、被験化合物のアンジオテンシンII１型受容体への作用を評価した。

具体的には、１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ（０．１ｍｇ／ｍＬ相当のＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ添加）培地で培養した上記細胞を遠心分離操作により集め、蛍光試薬であるＦｕｒａ―２ＡＭの１ｍＭ（ＤＭＳＯ）溶液４０μＬを加えたＨＥＰＥＳ／Ｈａｎｋｓ緩衝液（０．１％ＢＳＡ添加）１０ｍＬに懸濁した後、３７℃で１時間静置して細胞内に蛍光試薬（Ｆｕｒａ―２ＡＭ）を吸収させ、続いて細胞内で加水分解により遊離のＦｕｒａ―２へと変換させた。遠心分離操作により集めた細胞を再び０．１％ＢＳＡ添加ＨＥＰＥＳ／Ｈａｎｋｓ緩衝液に約１００万〜２００万個／ｍLの濃度で懸濁させた。

この懸濁液を０．５ｍＬキュベットにとり、蛍光光度計にセットして、被験化合物（接触濃度の１００倍濃度のＭｅＯＨ溶液）を５μＬ添加した。その後、１０^-5〜１０^-7ＭのアンジオテンシンII／ＨＥＰＥＳ／Ｈａｎｋｓ緩衝液（０．１％ＢＳＡ添加）を５μｌ添加した。この時、励起波長３４０ｎｍ及び３８０ｎｍでの５００ｎｍの蛍光を測定し、その蛍光強度比（３４０／３８０）を求めた。何も添加しないときの蛍光強度比（３４０／３８０）をＡ0、次いでアンジオテンシンIIのみ添加後の最高蛍光強度比（３４０／３８０）をＢとし、（Ｂ−Ａ₀）を対照とした（応答率１００％）。試料を添加する前の蛍光強度比（３４０／３８０）をＡ₁、被験化合物、次いでアンジオテンシンII添加後の最高蛍光強度比（３４０／３８０）をＤとし、（Ｄ−Ａ₁）の（Ｂ−Ａ₀）に対する割合を被験化合物の応答率（％）としてアンジオテンシンII１型受容体に対する拮抗作用を評価した。即ち、被験化合物の応答率が小さいほど同拮抗作用が強いことを示した。尚、被験化合物のみ添加したときの蛍光強度比（３４０／３８０）をＣとした場合、（Ｃ−Ａ₁）の（Ｂ−Ａ₀）に対する割合を被験化合物の変化率（％）とした。

また、本試験条件下では、血圧降下剤として臨床で用いられている非ペプチド性アンジオテンシンII拮抗剤、ニューロタン錠の有効成分であるロサルタンは接触濃度０．０１μｇ／ｍＬで約２４．３％の応答率を示した。なお、応答率が５０％以下であれば、細胞内へのカルシウムイオンの流入が阻害されており、アンジオテンシンII１型受容体拮抗作用が生じていると考えられる。結果を表１に示す。

表１に示した化合物はすべて、応答率を低下させていることが明らかになった。特に、化合物１〜１１及び式（５）の化合物が応答率低下作用が大きかった。接触濃度２００μｇ／ｍＬにおける結果から、化合物１〜５及び７〜１１の応答率低下作用が特に大きいことが明らかになった。そのなかでも化合物１〜４、７及び８が、更には化合物１〜３が大きな応答率低下作用を示すことが明らかになった。また、接触濃度２０μｇ／ｍＬの結果からは化合物１、３及び１１並びに式（５）の化合物が大きな応答率低下作用を示すことが明らかになった。特に化合物１１は、０．２μｇ／ｍＬにおいても有意の阻害活性が見られた。

また、Ｒ²がＢｒである安息香酸ベンジル誘導体についてアンジオテンシンII１型受容体（210020 Angiotensin AT1）及びアンジオテンシンII２型受容体（210110 Angiotensin AT2）の阻害活性測定を外部機関（ＭＤＳＰＳ）に依頼した。その結果、アンジオテンシンII１型受容体の阻害活性が３００μＭで７２％、１００μＭで５０％、アンジオテンシンII２型受容体の阻害活性が３００μＭで２３％、１００μＭで１０％であり、アンジオテンシンII１型受容体を選択的に阻害していることが明らかとなった。

（経口投与動物試験）
被験化合物の血圧降下作用を経口投与による動物試験で検証した。被検化合物としては式（５）に記載の化合物を採用した。６週齢のｄｄＹマウスをコントロール群とサンプル投与群の４群に分けた（１群５匹）。被験化合物５０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇを経口投与した３０分後に１回目の収縮期血圧を測定した。その直後にアンジオテンシンII１００μｇ／ｋｇ腹腔内投与して、４分後に２回目の収縮期血圧を測定した。結果を図３に示す。

被験試料を経口投与しないコントロール群においては、アンジオテンシンIIを腹腔内投与することにより有意に血圧が上昇した。一方、被検化合物を経口投与した群においては、投与量の増加に伴い血圧上昇の抑制効果が大きくなった。この結果より、被検化合物の優れた血圧降下作用が確認された。

本発明の医薬及び式（１）で表される新規安息香酸ベンジル誘導体は血圧降下剤として有用である。

式（１）に示す化合物の¹Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。式（１）に示す化合物の¹³Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。動物試験において被検化合物が血圧上昇を抑制する効果を示したグラフである。

Claims

下記一般式（２）又は（３）で表される安息香酸ベンジル誘導体を有効成分として含有するアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤。

（式（２）中、Ｒ^１〜３は水素、ハロゲン、ニトロ基、ＯＭｅから選択される。但し、Ｒ^１〜３全てが水素原子である場合は除く。Ｒ^４〜１０は水素である。）

（式（３）中、Ｒ^１〜５は、水素、ハロゲン、保護基を有していても良い水酸基、アミノ基、保護基を有していても良いチオール基、ニトロ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、スルホ基並びに炭化水素基（一部水素が、ハロゲン、保護基を有していても良い水酸基、アミノ基、保護基を有していても良いチオール基、ニトロ基、アシル基、アルコキシカルボニル基及びスルホ基から選択される１以上の基で置換されても良い）から選択される置換基からそれぞれ独立して選択される。ここで、上記保護基はアシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールメチル基、シリル基、アセトニド基、低級アルコキシアルキル基からそれぞれ独立して選択される。；Ｘは

である。ｎは１である。；Ｘは＊の部分に式（３）のＣ^１で示す炭素原子が位置する。）