JP5204986B2 - 植物系乳酸菌の使用方法及びその植物系乳酸菌を含む医薬品及び食品及びそれらの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体の免疫能昂進作用及び抗腫瘍作用を有する食品又は医薬品を製造するための植物系乳酸菌の使用、その植物系乳酸菌を含む医薬品及び食品に関する。詳細には市販の漬け物より分離され、その安全性が既に認められている乳酸菌ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０の生菌体及び／或いは死菌体を経口的に摂取することができる医薬品や健康食品に関する。

生体に於ける免疫系は、微妙なバランスの上に成立し、このバランスの乱れは様々な疾病の引き金となる。具体的に述べると、免疫細胞の中でもヘルパーＴ細胞は、産生するサイトカインの種類によってヘルパー１型と２型に分けられ、１型は細胞性免疫に、２型は液性免疫に関与し、この両者のバランスが保たれて初めて健康的な生活をおくることが可能となる。

しかしながら近年、我が国の生活環境は昔に比べて大きく変化し、特に衛生面並びに栄養面での格段の進歩の結果、細胞性免疫の活性によって抑制される疾病の典型で、かつては国民病とまで言われた結核等が激減した。これが原因の一つともなって上記１型と２型のバランスが崩れ、現代の日本人に於いては２型が優位なタイプが増加し、その結果、現代を特徴づけるいくつかの疾病、例えば杉花粉症やアトピー疾患等の増加に結びついている、と考える研究者も数多い。

さらに、細胞性免疫は、癌の抑制にも大きく関与しているため、ヘルパー１型の劣勢を回復し、寧ろこれを優位に保つことによって、上記アトピー等の疾病の改善のみならず、現代日本人の死亡原因の第一位である癌に対しても、予防効果を期待することが出来る。

上述したように、癌等の疾病の予防にはヘルパー１型の活性化が必要であるが、ヘルパー１型が増加するためにはインターロイキン１２（ＩＬ−１２）が生体内で産生される必要がある。インターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、マクロファージ等によって産生され、これが引き金となってヘルパー１型細胞の増加と活性化をもたらす。ヘルパー１型細胞は、その後インターロイキン２（ＩＬ−２）やガンマーインターフェロン等を産生し、これらがＮＫ細胞等の効果細胞を活性化させ、最終的に癌細胞をたたく、と考えられている。従って、生体内のインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の産生を促すことによって、癌に対する抑制が期待出来る。

インターロイキン１２（ＩＬ−１２）の産生を高めることにより、生体の免疫能を昂進し、その結果抗腫瘍効果が期待される物質としては、医薬品の分野ではレンチナンやＰＳＫ等のキノコ由来製剤や、ＢＣＧやＯＫ−４３２等の細菌製剤が知られ、これらは一括してＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ、略してＢＲＭと総称されている。食品分野ではアガリクスがよく知られ、健康食品として販売されている。また、ある種の乳酸菌にも同様の作用があることが知られており、ラクトバシラス・カゼイ・シロタ株や、エンテロコッカス・フェカーリスＮＦ−１０１１株（特開平８−２７０１０号公報）等が知られている。
特開平８−２７０１０号公報（従来技術１）

上述のように、生体の免疫を活性化することにより抗腫瘍効果を期待する物質は多いが、一般的に、これらの物質は日常的に少量ずつでも毎日摂取して初めて効果が期待されるものである。この観点から言うと、レンチナンやＰＳＫは医薬品であるため手軽に入手、使用するのに困難性がある。

また、アガリクス類は健康食品として市販されているので入手は容易であるが、一般的に高額であるため、金銭的な面で負担が大きい課題がある。

乳酸菌の場合は、医薬品ではないため日常的な摂取が容易で、しかも培養によって大量に生産出来るため、比較的安価に供給出来る。しかしながら、上述したような免疫賦活能と抗腫瘍作用を有すると認められている乳酸菌株の種類は多いとは言えず、このため、産業上の利用において制約があった。

上記課題を解決するため、植物系乳酸菌ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３５）の生菌体及び／或いは死菌体の、生体の免疫能昂進作用及び抗腫瘍作用を有する食品又は医薬品を製造するための使用を提案する。なお、この明細書に記載された乳酸菌ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ＫＮ−４０）は、この出願の願書に添付した発明者の一人である寄託者中山雅晴宛の独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターの受託証（通知年月日２００７年３月２０日、通知番号０６−１７６）のコピーに記載の通り、２００７年３月１３日付で寄託した受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−３３５に基づく受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３５により寄託されたものである。

また、植物系乳酸菌ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３５）の生菌体及び／或いは死菌体を含むことを特徴とする食品及びその製造方法を提案する。更に、植物系乳酸菌ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３５）の生菌体及び／或いは死菌体を含むことを特徴とする医薬品及びその製造方法を提案する。

この発明によれば以下に記すような多様な効果を有する。この発明の医薬品又は健康食品に使用される乳酸菌ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０株は、平成１２年１１月から平成１３年６月にかけて市販の漬け物や糠床等から分離された１３３種に及ぶ乳酸菌の中から、マクロファージのＩＬ−１２産生促進試験、マウスＮＫ細胞活性化試験、さらにＢ１６−Ｆ１０黒色細胞腫肺転移抑制試験を行って、いずれの試験に於いても高い成績を示した菌株として選別されたものであるため、これを日常的に摂取することにより免疫能が活性化し、その結果、抗腫瘍効果が期待出来る。

また、植物系乳酸菌であるため、大豆粉や豆乳等の植物由来のペプチドを窒素源とした培地に良く生えると同時に、一般的な乳酸菌用の培地に於いても良好な発育を示すため、健康食品等の素材として比較的安価に提供できるという効果がある。

しかも市販の漬け物由来（メロンの醤油漬け）であるため、安全性にも問題がない。さらに、この培養液を高圧滅菌して得られた死菌体でも上記活性が衰える事が無いため、生きたまま腸に到達させる必要が無い。従って、培養液を加熱滅菌して販売することが可能となり、製品の品質保持並びに流通に於いて、極めて有利となる。さらに、死菌体のみを回収して他の諸形態の食品等に添加して使用することが可能となるため、製品形態の幅が広がる。すなわち、当該菌株は健康食品等の原材料の一つとして比較的容易に用いることが出来るため、これを提供することは、健康食品産業上の選択の幅が広がる事を意味する。

次に、この発明の実施形態について説明する。

最初に植物系乳酸菌ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３５）の生菌体及び／或いは死菌体の選別法を具体的に述べる。市販の漬け物並びに自家製糠床から、１３３種類の乳酸菌株を分離した。分離法は、基本的に岡田らの方法（乳酸菌の科学と技術：学会出版センター）に従った。具体的には、ＧＹＰ寒天培地に上記試料のホモジネートを適量接種し、３０℃で４８時間好気的に培養した。培地の透明環の発現を指標として集落を釣菌し、これをさらに同培地に接種し、単集落を形成させた。単集落を釣菌し、これをＭＲＳ液体培地に接種し、３０℃、２４時間培養した。同培地で２回継代した後、３，５００回転で２０分遠心し、菌体を回収。新鮮滅菌ＭＲＳ液体培地に再浮遊させ、これを１ｍｌずつ滅菌バイアルに分注し、−８０℃の冷凍庫に保存した。試験に於いてはこれを解凍し、適宜ＢＬ寒天培地或いはＭＲＳ液体培地に接種し、上記条件で培養後、試験に供した。尚、当該菌株は、平成１３年６月８日に、市販のメロンの醤油漬けより分離されたものの一つである。

次に、この発明の植物系乳酸菌ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３５）の生菌体及び／或いは死菌体の菌学的特徴を以下に述べる。

乳酸菌菌属の同定において要求される一般的性状は以下の通りである。
ＧＹＰ寒天培地に於いて透明環を形成する白色円形光沢のある菌集落、通性嫌気性、湾曲性形態を示すグラム（＋）桿菌。ＭＲＳ寒天培地、或いはＢＬ寒天培地において、３０℃での４８時間培養により、上記特徴を示す明瞭な菌集落を形成する。運動性（±）、芽胞（−）、カタラーゼ（−）、ガスの産生（−）、産生乳酸の型（ＤＬ）。

乳酸菌菌種の同定に於いて要求される糖分解試験の結果は、以下の通りである。

（ＡＰＩ ５０ＣＨによる：日本ビオメリュー社）：
グリセロール（−）、エリスリトール（−）、Ｄアラビノース（−）、Ｌアラビノース（−）、リボース（＋）、Ｄキシロース（−）、Ｌキシロース（−）、アドニトール（−）、ベータメチルＤキシロシド（−）、ガラクトース（＋）、グルコース（＋）、フラクトース（＋）、マンノース（＋）、ソルボース（−）、ラムノース（−）、ズルシトール（−）、イノシトール（−）、マンニトール（−）、ソルビトール（−）、アルファーメチルＤマンノシド（−）、アルファーメチルＤグルコシド（＋）、Ｎアセチルグルコサミン（＋）、アミダグリン（−）、アルブチン（−）、エスクリン（＋）、サリシン（＋）、セロビオース（−）、マルトース（＋）、ラクトース（−）、メリビオース（−）、スクロース（−）、トレハロース（−）、イヌリン（−）、メレジトース（−）、ラフィノース（−）、スターチ（−）、グリコーゲン（−）、キシリトール（−）、ゲンチオビオース（−）、Ｄチュラノース（−）、Ｄリクソース（−）、Ｄタガトース（−）、Ｄフコース（−）、Ｄアラビトール（−）、Ｌアラビトール（−）、グルコネート（−）、２ケトグルコネート（−）、５ケトグルコネート（−）

以上の結果を基にしてアピラボソフト（日本ビオメリュー社）で解析したところ、９９．９％の確率をもってラクトバシラス・クルバータスであると同定され、ＥＸＣＥＬＬＥＮＴ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ の評価が得られた。

１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列約５００ｂｐの解析結果：
ＴＧＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＧＡＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＣＡＣＴＣＴＣＧＴＴＡＧＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＧＡＴＡＡＣＡＴＴＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＡＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＡＡＡＡＣＣＴＡＧＣＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＧＣＡＡＧＧＴＴＧＡＡＡＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＣＡＣＴＴＴＡＧＧＡＴＧＧＡＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴＡＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＡＧＧＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＡＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＧＡＣＧＡＡＡＧＴＣＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＴＴＣＧＧＡＴＣＧＴＡＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＴＡＡＣＴＧＡＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＴＣＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴ

以上の配列を細菌基準株データベースのＢＬＡＳＴを用いて基準菌株との相同性を検索したところ、１００％の確率でラクトバシラス・クルバータス・サブスピーシーズ・クルバータスＪＣＭ−１０９６株と一致した。

以上の結果から、当該菌株はラクトバシラス・クルバータスと同定した。さらに、ラクトバシラス・クルバータスの基準菌株（タイプストレイン）であるラクトバシラス・クルバータスＪＣＭ−１０９６株と糖分解の性状を比較した。その結果、アルファーメチルＤグルコシド、セロビオース、ラクトースの３点で分解性状に違いが見られた。この結果から、当該菌株はラクトバシラス・クルバータス種に属する新株であると考えられ、ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０と命名し、２００７年３月１３日付でＮＩＴＥ特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３５）。

市販の漬け物並びに自家製糠床から分離した１３３種類の乳酸菌株から、マクロファージのＩＬ−１２産生を促進する株を選別した。マクロファージとしては細胞株のＪ７７４Ａ−１株を用い（東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターより分与） 、分離乳酸菌１３３株に対照としてその他３０株を加え、総計１６３の菌株を試験した。Ｊ７７４Ａ−１株を１０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬株式会社）に懸濁し、５％二酸化炭素ガス下で３７℃、４８時間培養後、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに５×１０^４個／ｗｅｌｌに接種した。乳酸菌試料として、各菌株をＭＲＳ培地で３０℃、１８￣２４時間培養後、１１５℃、２０分間高圧滅菌したものを用いた。これを３，５００回転、２０分間遠心し、死菌体を回収した。ＰＢＳ（−）で死菌体を２回洗浄後、１０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地に最終濁度０．００８（６５０ｎｍ）に調整し、各１００μｌ／ｗｅｌｌに加えた。プレートを５％炭酸ガス孵卵器内で２４時間培養し、ｗｅｌｌ中のＩＬ−１２量をＧｅｎｚｙｍｅ社製のマウスＩＬ−１２用ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。その後、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｌａｂｓｃａｎ ＭＳ）により４５０ｎｍの吸光度を測定し、ＩＬ−１２の検量線に従ってＩＬ−１２量に換算し、ｐｇ／ｍｌとして表した。顕著にＩＬ−１２の産生を促した数株のうち、同定が確実であったラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０（以下ＫＮ−４０と表示する）を選び、さらなる試験を行った。

図１は、ＫＮ−４０並びに他の菌株数株を代表して選び、加熱死菌体のマクロファージ細胞株Ｊ７７４Ａ−１に対するＩＬ−１２量（ＩＬ−１２産生刺激能）を比較したグラフである。図１では、ＫＮ−４０の陽性対照として大腸菌由来ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社）、陰性対照としてコンカナバリンＡ（和光純薬工業株式会社）を用いた。図１に示すグラフには試験を行なった１６３菌株のうち、代表例を選んで示した。図１に示すグラフから解るようにＫＮ−４０の加熱死菌体は、極めて低濃度でマクロファージ細胞株であるＪ７７４Ａ−１をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激し、ＩＬ−１２の産生を顕著に促した。

（実験例１） 次に本発明者らは、ＫＮ−４０のマウスへの経口摂取がマウス脾臓ＮＫ細胞を活性化するか否かを調べた。ＮＫ細胞はＩＬ−１２の刺激によって活性化し、感染防御のみならず、癌細胞の抑制に於いても効果細胞として働くと考えられている免疫細胞群である。ＫＮ−４０の加熱死菌体をマウス用の餌である粉体ＭＦ（オリエンタル酵母工業株式会社）に混ぜ、ビスケット状に形を整えて乾燥させたものを作り、これを試料とした。死菌体の濃度は、０％、０．００２５％、０．００５％、０．０１％、０．０２％（重量％）の５種類用意した。動物にはＣ５７ＢＬ／６マウスの雄（日本チャールズリバー社）を用い、各試料につき８匹をもって一群とした。試料は解剖日までの３週間与え、飲水と共に自由採餌とした。採餌期間の終了後、マウスを解剖し、脾臓を摘出した。脾臓細胞を採取後、０．８３％塩化アンモニウム溶液で溶血し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。洗浄後、１０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、２５ｃｍ^２の平底フラスコ（Ｎｕｎｃ社）に播種し、５％炭酸ガス孵卵器で３０分間放置した。その後、フラスコ内の浮遊細胞群を回収し、これのＹＡＣ−１細胞に対する細胞傷害性を測定して、ＮＫ活性とした。ＹＡＣ−１細胞は−８０℃で保存しておいたものを解凍し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、１０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、５％炭酸ガス孵卵器で培養した。対数増殖期にあるＹＡＣ−１細胞を回収し、脾臓細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ：Ｅ）とＹＡＣ−１細胞（Ｔａｒｇｅｔ：Ｔ）とをＥＴ比５０：１、乃至は２５：１となるように各々５０μｌ／ｗｅｌｌずつ混じ、Ｕ字型の９６ｗｅｌマイクロプレート（Ｎｕｎｃ社）に接種した。同時にＭＴＳ（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ化合物、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を２０μｌ／ｗｅｌｌに加え、５％炭酸ガス孵卵器内で４時間培養した。４時間後、プレートの４９２ｎｍに於ける吸光度をＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒで測定した。結果は、ＫＮ−４０は容量依存的にマウス脾臓細胞のＮＫ活性を増強した。最大値は０．０１％濃度に於いて見られ、この時０％対照に比較して５９％の活性の増加を見た。一方で０．０２％では活性の低下が見られた。以上の結果から、ＫＮ−４０株の経口摂取はマウス脾臓ＮＫ活性を、容量依存的かつ一峰性に増強することが明らかとなった。図２に結果を示す。

（実験例２） ＫＮ−４０の経口摂取がＮＫ細胞を活性化することが明らかとなったことから、同菌の摂取が腫瘍の抑制に繋がる事が期待された。マウスを用いた癌の実験系には多くの種類があるが、中でもマウス黒色細胞腫を用いた転移抑制実験は、免疫系との関連が明らかとなっているモデルである。本発明者らはこれを用いて、ＫＮ−４０のマウスへの経口摂取が腫瘍細胞の転移を抑制するか否かを調べた。試料には、実施例−２と同じく、０．１％、０．０１％にＫＮ−４０の加熱死菌体を混じたＭＦビスケットを用いた。これをＣ５７ＢＬ／６雄マウス５週齢に４週間与えた。試料は飲水と共に自由採餌とした。対照には、菌体無添加ＭＦビスケットを与えた。−８０℃で凍結保存してあった黒色細胞腫の一つであるＢ１６−Ｆ１０細胞（東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターより分与）を解凍し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄後１０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、５％炭酸ガス孵卵器内で培養した。対数増殖期に収穫し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、同液に４×１０^５個／０．２ｍｌ／匹に浮遊し、試料給餌開始２週目に尾静脈より接種した。細胞接種２週後にマウスを解剖し、肺を採取して、Ｂｏｕｉｎ液にて固定した。固定終了後、転移したＢ１６−Ｆ１０細胞の転移結節数を実体顕微鏡下で数えた。結果は、ＫＮ−４０の経口摂取は容量依存的に転移を抑制し、０．０１％で５１％、０．１％で７７％の抑制率を示した。図３に結果を示す。

市販の漬け物から分離された乳酸菌株であるラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０株は、その菌体を食することによって、免疫賦活効果並びに腫瘍抑制効果を期待する事が出来る。市販の漬け物由来であるため安全性も高い。しかも加熱死菌体においても上記の効果を示すため、加熱滅菌した培養液をそのまま飲用として用いることはもちろん、菌体を分離して医薬品として用いたり、健康食品に添加して使用することが可能である。

ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０とその他の代表菌株のマクロファージＪ７７４Ａ−１株に対するＩＬ−１２量（ＩＬ−１２産生刺激能）の比較を示すグラフ ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０の加熱死菌体の経口投与によるＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓ＮＫ細胞活性化試験の結果を示す比較グラフ ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０の加熱死菌体の経口投与によるＣ５７ＢＬ／６マウスのＢ１６−Ｆ１０黒色細胞腫肺転移抑制試験の結果を示す比較グラフ

Claims (3)

1. 生体の免疫能昂進作用及び抗腫瘍作用を有する食品又は医薬品を製造するための、植物系乳酸菌ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３５）の生菌体及び／或いは死菌体の使用。
2. 植物系乳酸菌ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３５）の生菌体及び／或いは死菌体を含むことを特徴とする食品。
3. 植物系乳酸菌ラクトバシラス・クルバータスＫＮ−４０（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３５）の生菌体及び／或いは死菌体を含むことを特徴とする医薬品。

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