JP5210166B2

JP5210166B2 - Ｅｇｌｎ２変異体、並びに血栓塞栓性及び冠状動脈性心疾患の予防又は治療におけるその使用

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Description

本発明は、アミノ酸配列の５８位にセリン又はロイシンを有するヒトＥＧＬＮ２変異体及び血栓塞栓性又は冠状動脈性心疾患、特に脳卒中、遷延性可逆性虚血性神経欠損（ＰＲＩＮＤ）、一過性脳虚血性発作（ＴＩＡ）、心筋梗塞及び／又は早期心筋梗塞の予防又は治療におけるそれらの使用に関する。

ＥＧＬＮ２は、そのＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性によりプロリルヒドロキシラーゼドメイン含有蛋白質１（ＰＨＤ１）としても知られており、５つのコーディングエキソンからなる保存ゲノム構造を有する、Ｅｇｌ−Ｎｉｎｅ遺伝子ファミリーの近縁の蛋白質の１グループに属する。ＨＩＦ（低酸素誘導因子）は、酸素のホメオスタシスの様々な局面において重要な役割を果たす転写制御因子であるが、ＥＧＬＮアイソフォームである、ＥＧＬＮ１（ＰＨＤ１）、ＥＧＬＮ２（ＰＨＤ２）及びＥＧＬＮ３（ＰＨＤ３）のＨＩＦの生理的調節への寄与はまだ不明である（Appelhoff, R. J. et al. (2004) J. Biol. Chem., 279, 38458-38465, No. 37）。全てのＥＧＬＮアイソフォームは異なる細胞特異的及び誘導性挙動を呈し、これが低酸素へのＨＩＦ応答の調節におけるフレキシビリティを可能にすると考えられる。このことは、特定のＥＧＬＮアイソザイムの特異的薬理学的阻害が、治療への応用に有用と思われる、ＨＩＦ応答の選択的調節能を有する可能性があることを意味するものである(Appelhoff, R. J. et al. (2004), 同上)。ＥＧＬＮ２の阻害は、例えば、安静時のさまざまな細胞タイプにわたって広くＨＩＦ応答を活性化するはずである。対照的に、ＥＧＬＮ３の特異的阻害は高レベルの酵素を発現する特定の組織での低酸素への応答を選択的に増加させるはずである(Appelhoff, R. J. et al. (2004), 同上)。このことは、虚血性／低酸素性疾患の治療の可能性を開く可能性がある。ＥＧＬＮ２とＥＧＬＮ３に対して、ＥＧＬＮ１の生理的役割については多くは知られていない。

冠状動脈心疾患の発病と進行におけるＥＧＬＮ２の潜在的関与をより良く理解するために、遺伝子型−表現型関連解析が、本発明に従って、参照番号ＮＭ＿０５３０４６．２として公開されたＥＧＬＮ２参照配列の４７０位におけるＥＧＬＮ２遺伝子の変異に関して、特性が良く分かっている患者群で実施された。ＥＧＬＮ２遺伝子の異なる遺伝的変異体は既にＳＮＰ（一塩基多型）として知られ、そしてhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?locusId=112398)で公開されている。

驚くべきことに、ヒトＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸の４７０位のヌクレオチドの変異、特にシトシンからチミジンへの変異、又はヒトＥＧＬＮ２蛋白質の５８位のアミノ酸への変異、特にセリンからロイシンへの変異は、血栓塞栓性及び冠状動脈性心疾患の発生と相関することが見出された。

従って、本発明の主題は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＧＬＮ２蛋白質、及びＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸、特に配列番号４の核酸配列に関する。優先的には、本発明に記載の核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ、特に二本鎖ＤＮＡである。核酸の配列は、それが少なくとも１つのイントロン及び／又は１つのポリＡ配列を有する点で更に特徴付けられ得る。

発明の更なる実施態様において、核酸は、好ましくはシャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター又は遺伝子治療活性を有するベクターの形態で、ベクターの調製に使用できる。更に、ノックアウト遺伝子構築体又は発現カセットが上記の核酸を用いて調製できる。この発現ベクターは原核生物又は真核生物発現ベクターであって良い。原核生物発現ベクターの例は、E.coliにおける発現では、例えば、ベクターｐＧＥＭ又はｐＵＣ誘導体、Saccharomyces cerevisiaeにおける発現の真核生物発現ベクターの例は、例えば、ベクターｐ４２６Ｍｅｔ２５又はｐ４２６ＧＡＬ１(Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768)、昆虫細胞における発現では、例えば、ＥＰ特許第０１２７８３９号又はＥＰ特許第０５４９７２１号に記載されたようなバキュロウィルスベクター、そして哺乳類細胞における発現では、例えば、全て一般的に入手可能な、ベクターＲｃ／ＣＭＶ及びＲｃ／ＲＳＶ又はＳＶ４０ベクターである。一般的に、発現ベクターは、例えば、E.coliにおける発現ではｔｒｐプロモーター（例えば、ＥＰ特許第０１５４１３３号を参照）、酵母における発現ではＭｅｔ２５、ＧＡＬ１又はＡＤＨ２プロモーター (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682; Mumberg, 同上)、昆虫細胞における発現ではバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター (例えば、ＥＰ特許第０１２７８３９号を参照)などの、各宿主細胞に適切なプロモーターをも含む。哺乳類細胞における発現では、例えば、適切なプロモーターは、真核細胞において構成的、調節可能な、組織特異的又は代謝特異的発現を可能にするものである。本発明の調節要素は、プロモーター、アクチベーター配列、エンハンサー、サイレンサー及び／又はレプレッサー配列である。真核生物における構成的発現を可能にする適切な調節要素の例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーター、又はウイルスプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター（実施例１３をも参照）、ＳＶ４０プロモーター又はＬＴＲプロモーター、例えば、ＭＭＴＶ (マウス乳癌ウイルス; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232) 由来、及び、例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶ又はＨＩＶ由来の更なるウイルスプロモーターとアクチベーター配列である。真核生物における誘導発現を可能にする調節要素の例は、対応のレプレッサーと組合せたテトラサイクリンオペレーターである(Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20)。真核生物における代謝特異的発現を可能にする調節要素の例は、低酸素によって好ましく調節されるプロモーターである。

本発明に従って使用される核酸の導入、そしてこのようなトランスフェクション、形質転換又は感染による原核又は真核細胞におけるポリペプチドの発現を可能にするために、核酸は、ウイルス又は非ウイルスベクターの一部として、プラスミドとして存在し得る。ここでの適切なウイルスベクターは、特に：バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びヘルペスウイルスである。ここでの適切な非ウイルスベクターは、特に：ビロソーム、リポソーム、カチオン性脂質、又はポリ−リジン−共役ＤＮＡである。

遺伝子治療活性を有するベクターの例は、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである(Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al., 1998, Mol. Cell. 2: 549-58)。真核生物発現ベクターは、裸のＤＮＡが局所適用で皮膚細胞に侵入することができることから、遺伝子治療使用の単離型として適切である(Hengge et al., 1996, J. Clin. Invest. 97: 2911-6; Yu et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 370-5)。遺伝子治療活性を有するベクターは、特に、このように皮膚細胞で非常に高いトランスフェクション効率が達成できることから、リポソームと本発明で使用される核酸とを複合化させることによっても取得できる(Alexander and Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2279-85)。リポフェクションの場合、小単層ベシクルがリポソーム懸濁液の超音波処理によりカチオン性脂質から調製される。このＤＮＡは、正の正味電荷が残りそしてプラスミドＤＮＡがリポソームの１００％に複合化するような割合で、リポソームの表面にイオン的に結合される。Felgner et al.（1987、同上）によって用いられた脂質混合物のＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウムブロミド）とＤＰＯＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）に加えて、その一方で多くの新規脂質製剤が合成され、種々の細胞系のトランスフェクションにおいてその効率が評価された(Behr, J.P. et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986; Felgner, J.H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561; Gao, X. & Huang, L. (1991), Biochim. Biophys. Acta 1189, 195-203)。脂質製剤の例は、ＤＯＴＡＰＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルサルフェート又はＤＯＧＳ（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ；ジオクタ-デシルアミドグリシルスペルミン)である。細胞への核酸の移行を増加させる補助剤は、例えば、細胞の核へ核酸の輸送を可能にするＤＮＡ若しくは合成ペプチド−ＤＮＡ分子に結合する蛋白質又はペプチドであって良い(Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6, 282; Branden et al. (1999) Nature Biotech. 17, 784)。補助剤は、また細胞の細胞質への核酸の放出を可能にする分子 (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem. 8, 213) 又は、例えば、リポソーム (Uhlmann and Peymann (1990), 同上) を含む。遺伝子治療ベクターの別の特に適切な型は、本発明で使用される核酸を金粒子に塗布させ、そしてこれらをいわゆる遺伝子銃を用いて、組織中に、好ましくは皮膚又は細胞中に発射することによって得ることが可能である(実施例１３; Wang et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112: 775-81, Tuting et al., 1998, J. Invest. Dermatol. 111: 183-8) 。

上記の核酸の遺伝子治療利用のために、ポリペプチドをコードする核酸の一部が、好ましくはプロモーターとポリペプチドの開始コドン間にイントロン配列を含む１つ又はそれ以上の非コード配列、及び／又はポリＡ配列、特に遺伝子の３'末端に自然発生的なポリＡ配列又はＳＶ４０ウイルスポリＡ配列を含むならば、ｍＲＮＡの安定化がそれによって達成され得るので、それはまた好都合である(Jackson, R.J. (1993) Cell 74, 9-14 及びPalmiter, R.D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 478-482) 。

ノックアウト遺伝子構築物は、例えば、ＵＳ特許第５,６２５,１２２号；ＵＳ特許第５,６９８,７６５号；ＵＳ特許第５,５８３,２７８号及びＵＳ特許第５,７５０,８２５号から当業者に周知である。

本発明は、更に、本発明のベクター又はノックアウト遺伝子構築物を用いて形質転換される宿主細胞に関する。宿主細胞は原核又は真核細胞であって良いが、原核宿主細胞の例はE.coliであり、真核細胞の例はSaccharomyces cerevisiae又は昆虫細胞である。特に好ましい形質転換宿主細胞はヒト以外のトランスジェニック胚性幹細胞であり、これは本発明に記載のノックアウト遺伝子構築物又は本発明に記載の発現カセットを含むことを特徴としている。宿主細胞及び／又は幹細胞の形質転換の方法は当業者に周知であり、例えば、エレクトロポレーション又はマイクロインジェクションが挙げられる。

本発明の別の主題は、本発明に従う核酸又はベクターを含むトランスジェニック動物に関する。

トランスジェニック動物、特にマウスの調製方法は、ＤＥ第１９６２５０４９号及びＵＳ特許第４,７３６,８６６号；ＵＳ特許第５,６２５,１２２号；ＵＳ特許第５,６９８,７６５号；ＵＳ特許第５,５８３,２７８号及びＵＳ特許第５,７５０,８２５号から当業者に周知であり、例えば、胚又は精母細胞への発現ベクター（上記を参照）の直接注入、又は胚性幹細胞への発現ベクターのトランスフェクションを用いて創り出されるトランスジェニック動物が挙げられる(Polites and Pinkert: DNA microinjection and Transgenic Animal Production, page 15-68, Pinkert, 1994: Transgenic animal technology: a laboratory handbook, Academic Press, London, UK; Houdebine, 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Doetschman: Gene Transfer in Embryonic Stem Cells; page 115-146, Pinkert, 1994, 同上; Wood: Retrovius-Mediated Gene Transfer; page 147-176, Pinkert, 1994, 同上; Monastersky: Gene Transfer Technology; Alternative Techniques and Applications, page 177-220, Pinkert, 1994, 同上)。本発明で使用される核酸類が、いわゆるターゲッティングベクターに組込まれた場合（Pinkert，1994，同上）、胚性幹細胞のトランスフェクション及び相同的組換え後に、例えば、一般的にヘテロ接合性マウスとして核酸の発現が低下したノックアウトマウスを創り出すことが可能であるが、ホモ接合性マウスはもはや核酸の発現を示さない。このように創り出されたトランスジェニック及びノックアウト細胞又は動物も、遺伝子治療活性を有する薬学的活性物質ベクターのスクリーニング及び同定に使用し得る。

本発明の別の主題は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＧＬＮ２蛋白質に特異的に結合する抗体に関する。

本発明によれば、「特異的」の用語は、抗体が配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＧＬＮ２蛋白質に結合するが、配列番号２のアミノ酸配列を含むＥＧＬＮ２蛋白質には本質的に結合しないことを意味し、言い換えれば、この抗体は、５８位にセリンを有するＥＧＬＮ２蛋白質と５８位にロイシンを有するＥＧＬＮ２蛋白質を識別するのに適切である。

この抗体はポリクローナルか又はモノクローナルであり、好ましくはモノクローナル抗体である。抗体という用語は、本発明によれば、遺伝子工学により調製された抗体又はその抗原結合部位、及び場合により改変された抗体例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能性抗体、二−又はオリゴ特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ）₂フラグメントをも意味するものとして理解される(例えば、ＥＰ特許第０３６８６８４号、ＵＳ特許第４,８１６,５６７号、ＵＳ特許第４,８１６,３９７号、ＷＯ第８８／０１６４９号、ＷＯ第９３／０６２１３号、ＷＯ第９８／２４８８４号を参照）。

抗体の製造方法は、当業者に周知の方法に従って、例えば、ウサギのような哺乳類を、上記ポリペプチド又はその述べた部位を用いて、適切な場合、例えば、フロインドアジュバント及び／又は水酸化アルミニウムゲルの存在下に、免疫化することによって実施される(例えば, Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349を参照)。免疫反応の結果として動物に生成されたポリクローナル抗体は、その後一般的に知られている方法に従って血液から容易に単離され、そして、例えば、カラムクロマトグラフィーによって精製される。モノクローナル抗体は、例えば、Winter & Milsteinの既知の方法によって製造され得る (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299)。組換え抗体は、上記で特定した特許公報に記載されたようにして製造することができる。

本発明の別の主題は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＧＬＮ２蛋白質を製造する方法に関わり、ここで、上述の細胞は適切な培地中で培養され、場合によりＥＧＬＮ２蛋白質は細胞又は培地から単離される。

ＥＧＬＮ２蛋白質は、例えば、適切な発現系において、上記の核酸の発現により、既に上記で説明したように、当業者に周知の方法に従って調製される。適切な宿主細胞は、例えば、E.coli株ＤＨＳ、ＨＢ１０１又はＢＬ２１、酵母株Saccharomyces cerevisiae、例えば、Spodoptera frugiperdaからの昆虫細胞系Lepidoptera、又は動物細胞ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、２９３、ＨａＣａｔ、及びＨｅＬａであり、これらは全て一般的に入手可能である。ＥＧＬＮ２蛋白質はまた融合蛋白質の一部でもあっても良い。融合蛋白質は、本明細書では上記で説明したように調製され、それは上記のポリペプチドを含み、融合蛋白質はそれ自体既に上記したポリペプチドの機能を有するか、又はその特異的な機能は融合蛋白質の切断後にのみ機能的に活性である。特に本明細書に含められるものは、約１〜３００、好ましくは約１〜２００、特に約１〜１００、とりわけ約１〜５０の割合の外来性アミノ酸を有する融合蛋白質である。そのようなペプチド配列の例は、例えば、E.coliのガラクトシダーゼから導かれ得る原核生物ペプチド配列である。更に、例えば、バクテリオファージＭ１３などのウイルスペプチド配列も、当業者に周知のファージディスプレイ法用の融合蛋白質を製造するために使用され得る。融合蛋白質のペプチド配列の更に適切な例は、融合蛋白質の検出を容易にするペプチドであり、これらは、例えば、「緑色蛍光蛋白質」又はその変異体である。

上記の蛋白質の単離及び／又は精製のために、(a)更なるポリペプチド(タグ)を付けることが出来る。適切な蛋白質タグは、例えば、マトリックスへの高親和性吸着、顕著な程度に複合体を溶離させない適切な緩衝液による厳密な洗浄、及びそれに続く吸着複合体の標的溶離を可能にする。当業者に周知の蛋白質タグの例は、（Ｈｉｓ）₆タグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、赤血球凝集素タグ、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、アフィニティキチン結合タグを有するインテイン又はマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）タグである。これらの蛋白質タグは、Ｎ−又はＣ−末端及び／又は内部に位置し得る。

本発明の更なる主題は、ＥＧＬＮ２蛋白質のモジュレーターのスクリーニング方法に関し、その方法は以下の工程：
（ａ）ＥＧＬＮ２蛋白質又はＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸を供し；
（ａ）試験化合物を供し；そして
（ｃ）ＥＧＬＮ２蛋白質又はＥＧＬＮ２遺伝子に対する試験化合物の影響を測定するか又は検出する；
からなる。

一般的に、ＥＧＬＮ２蛋白質又はＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸は、例えば、１つのアッセイ系に供せられ、そして試験化合物、特に生化学的又は化学的試験化合物と、例えば、化合物ライブラリーの形態で直接的又は間接的に接触させられる。次いで、ＥＧＬＮ２蛋白質又はＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸に対する試験化合物の影響を測定又は検出する。その後、適切なモジュレーター、例えば、活性化剤又は阻害剤が、解析及び／又は単離される。化合物ライブラリーのスクリーニングには、当業者に周知の又は市販されているハイスループット・アッセイの使用が好ましい。

本発明に記載の「化合物ライブラリー」という用語は、化学合成分子及び天然物を含むあらゆる多様な供給源から集められた、又はコンビナトリーケミストリー法によって生成された多くの化学物質に関わる。

一般的に、ＥＧＬＮ２又はＥＧＬＮ２遺伝子に対する試験化合物の影響は、ヘテロジニアス又はホモジニアス分析で測定又は検出される。本明細書で使用されるように、ヘテロジニアス分析は１つ又はそれ以上の洗浄工程を含む分析法であるが、一方ホモジニアス分析ではそのような洗浄工程は必要ではない。試薬と化合物はただ混合して測定される。

適切な機能分析はＥＧＬＮ２の遺伝子発現、ＥＧＬＮ２の直接活性化又は阻害に基づくものでよい。ＥＧＬＮ２の遺伝子発現のモジュレーターとして試験する生化学又は化学物質の存在下、直接活性化若しくは阻害又は他の蛋白質、例えば細胞蛋白質との複合体形成は、当業者に公知の、又はAppelhoff, R. J. et al. (2004), 同上及び／又は Jaakkola,
P. et al. (2001) Science, 292, 468-472, No. 5516.に記載された手段によって測定し得る。

例えば、プロリルヒドロキシラーゼ活性は、プロリルヒドロキシラーゼ若しくはＨＩＦ−１αサブユニットのＰｒｏ、例えば、Ｐｒｏ⁵⁶⁴の酸化が検出できる質量分光分析により、又は当業者に周知の酵素的分析、例えば、in vitro試験分析及び／又はヒト細胞、動物細胞、細菌細胞若しくは酵母細胞を用いるin vitro全細胞試験分析で測定し得る。

固相結合ポリペプチドもアレイの一部になり得る。固相化学と光解離性保護基を用いるこのようなアレイを調製する方法は、例えば、ＵＳ特許第５,７４４,３０５号に記載されている。これらのアレイは、また試験化合物又は化合物ライブラリーと接触させることができ、そして、例えば立体配座を結合させたり又は変化させる相互作用を試験することができる。

本発明の別の実施態様において、その方法は全細胞を用いて実施される。通常、マルチウエルプレートの底に増殖する細胞は固定化、透過化及びブロックされ次いで、例えば興味のある基質に対する１次（Ｐ）特異抗体によりインキュベートされる。次に、例えば、特異的化学発光又は発色物質と連結したユウロピウム標識又はＨＲＰ結合２次抗体が、例えば上記のように、シグナルを発生させるために利用される。顕微鏡の使用との組合せにより、（Ｐ）−特異抗体の量が単細胞レベルで定量し得るだけでなく、基質のリン酸化誘導転移又は細胞の形態変化もまた定量できる。

有利なことに、本発明の方法は、例えば、ロボット式プレーティング及びロボット式液体移送システムを含む、ロボットシステムにおいて、例えば、マイクロ流体工学、すなわちチャンネル型構造物を用いて実施される。

本発明の別の実施態様において、この方法はハイスループット・スクリーニングシステムの形式で実施される。このようなシステムにおいては、有利なことに、このスクリーニング方法は自動化及び小型化され、特に、ロボット制御の小型ウェル及びマイクロ流体工学が使用される。

本発明の別の主題は、血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患の予防又は治療のための医薬品を製造するための、配列番号２若しくは３のアミノ酸配列を含むＥＧＬＮ２蛋白質、又はＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸の使用に関する。特に、血栓塞栓性疾患は、脳卒中、遷延性可逆性虚血性神経欠損（ＰＲＩＮＤ）及び／又は一過性脳虚血性発作（ＴＩＡ）である。更に、冠状動脈性心疾患は、特に心筋梗塞である。具体的には、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＧＬＮ２蛋白質、又はこのＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸が、発作、ＰＲＩＮＤ及び／又はＴＩＡの予防又は治療のための医薬品の製造に使用され、そして配列番号２のアミノ酸配列を含むＥＧＬＮ２蛋白質又はこのＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸が、心筋梗塞、特に早期心筋梗塞の予防又は治療のための医薬品の製造に使用される。

詳細には、４７０位のヌクレオチドが染色体ＤＮＡ中でチミジン若しくはｍＲＮＡ中でウラシルであるか、又は５８位のアミノ酸がロイシンの場合、脳卒中、ＰＲＩＮＤ及び／又はＴＩＡの高いリスクが存在する。しかし、もし４７０位のヌクレオチドがシチジンであるか、又は５８位のアミノ酸がセリンの場合、心筋梗塞、特に早期心筋梗塞の高いリスクが存在する。

本発明によれば、「ＥＧＬＮ２−Ｃ４７０Ｃ」の用語は、対応蛋白質の５８位でアミノ酸セリンになる、参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２の４７０位でＥＧＬＮ２をコードする遺伝子の両方の対立遺伝子にシチジンを有する人のグループを意味する。これらの人々は、このＥＧＬＮ２変異体に関してホモ接合性である。従って、「ＥＧＬＮ２−Ｃ４７０Ｔ」の用語は、ＥＧＬＮ２をコードする遺伝子の１つの対立遺伝子に対応蛋白質の５８位がセリンとなるシチジンを、そしてＥＧＬＮ２をコードする遺伝子の他の対立遺伝子に対応蛋白質の５８位がロイシンとなるチミジン有する人のグループを意味する。これらの人々は、このＥＧＬＮ２変異体に関してヘテロ接合性である。

ヒトＥＧＬＮ２蛋白質をコードする参照配列の核酸配列は、好ましくは配列番号１の核酸配列を有し、そしてヒトＥＧＬＮ２蛋白質のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を有する。しかしながら、本発明はまたヒトＥＧＬＮ２及びヒト以外のそのホモログ、例えば、他の哺乳類のＥＧＬＮ２ホモログ、又はCaenorhabdidis elegans、マウス若しくはラット由来のＥＧＬＮ２ホモログなどを含むが、ただし、前述の参照配列の４７０位に対応する位置においてシチジンからチミジンへのヌクレオチド変換、及び／又は前述の参照配列の５８位に対応する位置においてセリンからロイシンのアミノ酸変換が存在し、そして更に対応の蛋白質がプロリルヒドロキシラーゼ活性、特にＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性を有するという条件の場合である。前述の酵素活性は、例えば上記で既に説明した質量分光分析によって測定し得る。

一般的に、４７０位の特異的ヌクレオチドは、核酸配列決定法、核酸の質量分光分析、ハイブリダイゼーション法及び／又は増幅法によって測定し得る。核酸配列決定法の例は、ピロ配列決定、及び／又は、放射性及び／又は蛍光標識ヌクレオチドを用いる配列決定である。ハイブリダイゼーション法の例は、サザンブロット解析、ノーザンブロット解析及び／又はＤＮＡマイクロアレイによるハイブリダイゼーション法である。増幅法の例は、TaqMan解析、差次的ＲＮＡ発現分析及び／又は表現差異解析である (Shi M. M. (2002) Am J Pharmacogenomics., 2(3), 197-205; Kozian & Kirschbaum (1999) Trends Biotechnol., 17(2), 73-8.)。

更に、５８位のアミノ酸配列は、特異的蛋白質の量を測定する方法及び／又は特異蛋白質の活性を測定する方法によって決定できる。特異蛋白質の量を測定する方法の例は、ウェスタンブロット法及び／又はＥＬＩＳＡである。特異蛋白質の活性を測定する方法は、当業者に周知のin vitro試験分析及び／又はヒト細胞、動物細胞、細菌細胞又は酵母細胞によるin vitro全細胞試験分析である。

個々の変異体の検出用試料の例は、細胞、組織又は体液、特に血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞である。好ましくは、試料は、更なる解析用の、試料の核酸若しくは染色体ＤＮＡ又は蛋白質を単離及び／又は精製するために、当業者に周知の従来法によって前処理される。

本発明に従う変異体の同定の好ましい方法は、以下の工程を含む：
（ａ）核酸プローブ、特に試料、特に、例えば検査すべき人又は患者由来の細胞、組織、体液、血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞から、ＤＮＡプローブを単離し；
（ｂ）プライマー、特に実施例に明記されたプライマーを用いて、ＥＮＧＬ２遺伝子の４７０位を包含する特異的領域を増幅し；
（ｃ）増幅された領域の配列を決定し；そして
（ｄ）配列決定された領域を解析する。

本発明に従う変異体の測定の代わりの方法は、以下の工程を含む：
（ａ）試料、特に、例えば検査すべき人又は患者由来の細胞、組織、体液、血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞から、ＥＮＧＬ２蛋白質を単離し;そして
（ｂ）ＥＧＬＮ２蛋白質の５８位のアミノ酸を決定する。

より好ましい工程は実施例において個々に又は集合的に規定されており、各工程を参照することによって本明細書に組み入れられている。

最後に、本発明の主題は、血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患の治療薬を製造する方法に関し、ここで、その方法は以下の工程：
（ａ）上記のスクリーニング法を実施し；
（ｂ）血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患の治療に適切な、測定又は検出した試験化合物を単離し；そして
（ｃ）１つ又はそれ以上の薬学的に許容される担体又は補助物質により測定又は検出した試験化合物を製剤化する；
を含む。

上記方法の工程（ｃ）に従って、検出した試験化合物は、例えば、塩化ナトリウム溶液などの生理学的緩衝液、脱塩水、安定剤、ε−アミノカプロン酸若しくはペプスタチンＡ又はＥＤＴＡなどの金属イオン封鎖剤、白色ワセリン、低粘度パラフィン及び／又は黄ろうなどのゲル製剤など、通常１つ又はそれ以上の薬学的に許容される添加剤又は補助物質により、投与の種類に応じて製剤化される。

例えば、適切な更なる添加剤は、例えば、Triton X−100又はデオキシコール酸ナトリウムなどの界面活性剤、及び、例えばポリエチレングリコール又はグリセロールなどのポリオール、例えば、蔗糖又はグルコースなどの糖類、例えば、グリシンなどのアミノ酸又は特にタウリン若しくはベタインなどの双性イオン化合物、及び／又は、例えば、ウシ又はヒト血清アルブミンなどの蛋白質である。界面活性剤、ポリオール及び／又は双性イオン化合物が好ましい。

生理的緩衝液は、好ましくは約６.０〜８.０のｐＨ、とりわけ約６.８〜７.８のｐＨ、特に約７.４のｐＨ、及び／又は約２００〜４００ミリオスモール／Ｌ、好ましくは約２９０〜３１０ミリオスモール／Ｌの浸透圧を有する。医薬品のｐＨは、一般的に適切な有機又は無機緩衝液、例えば、好ましくはリン酸緩衝液、トリス緩衝液（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（［４（２−ヒドロキシエチル)ピペラジノ）−エタンスルホン酸)又はＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸)を用いて調整される。それぞれの緩衝液の選択は、一般的に所望の緩衝液モル濃度に依存する。リン酸緩衝液は、例えば、注射又は輸液に適切である。

医薬品は、従来の方法、例えば、本発明の医薬品を含む、例えば錠剤又はカプセル剤などの経口剤形によって、粘膜、例えば鼻又は口腔を介した皮下に埋め込んだデポ剤(dispositories)の形態で、注射剤、輸液又はゲルによって投与できる。更に、上記のような特殊な関節疾患を治療するために本医薬品を局所的及び局部的に、適切な場合、リポソーム複合体の形態で投与することが可能である。更に、治療は、医薬品の時間制御型放出を可能にする経皮治療システム（ＴＴＳ）を用いて実施することが可能である。ＴＴＳは、例えばＥＰ公開第０９４４３９８号、ＥＰ公開第０９１６３３６号、ＥＰ公開第０８８９７２３号又はＥＰ公開第０８５２４９３号から公知である。

注射液は、一般的に、比較的少量だけ、例えば約１から約２０ｍｌの溶液又は懸濁液が体内に投与される場合に使用される。輸液は、一般的に、例えば１リットル以上のやや多い溶液又は懸濁液が投与される場合に使用される。輸液と対照的に、注射液ではほんの数ミリリットルが投与されるだけなので、注射時の血液又は組織液のｐＨ及び浸透圧の小さな変化は、それ自体顕著ではないか又は単に痛覚について目立たない程度のものである。従って、使用前の本発明に従う製剤の希釈は一般的に不要である。しかしながら、比較的大量の投与の場合には、本発明に従う製剤は、少なくともほぼ等張液が得られる程度まで、投与前に手短に希釈されるべきである。等張液の例は、０.９％強度の食塩溶液である。輸液の場合には、希釈は、例えば滅菌水を用いて実施され、一方投与は、例えばいわゆるバイバスを介して行われ得る。

以下の図、表、配列及び実施例は、発明の範囲を制限することなく本発明を説明するものである。

配列決定と解析によるＳＮＰ検出
増幅のためのオリゴヌクレオチド(プライマー)：
以下のプライマーが、参照番号ＮＭ＿０５３０４６．２に示されるＥＧＬＮ２配列中の４７０位におけるＣからＴへのヌクレオチド変換の検出に使用された：
プライマー１：5'- CTGTCCAGGAGTGCCTAGTG -3' (参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２; 配列番号５のヌクレオチド４４４−４６３)；
プライマー２：5'- GGGCTGGCAGTGGTAGAG -3' (参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２; 配列番号６の塩基５０４−５２１の相補配列)。

増幅のためのＰＣＲプロトコール：
使用した試薬はApplied Biosystems (Foster City、USA)製：２０ｎｇのゲノムＤＮＡ；１単位TaqGold ＤＮＡポリメラーゼ；１×Taq ポリメラーゼ緩衝液；５００μＭのｄＮＴＰｓ；２.５ｍＭのＭｇＣｌ₂；前掲の２００ｎＭの各増幅プライマー対；Ｈ₂Ｏを加えて（ａｄ）５μｌにする。

遺伝子型特定のためのＰＣＲの増幅プログラム：
９５℃１０分間 ×１サイクル；

９５℃３０秒間
７０℃３０秒間 ×２サイクル；

９５℃３０秒間
６５℃３０秒間 ×２サイクル；

９５℃３０秒間
６０℃３０秒間 ×２サイクル；

９５℃３０秒間
５６℃３０秒間
７２℃３０秒間 ×４０サイクル；

７２℃１０分間
４℃３０秒間 ×１サイクル；

ＳＮＰのミニ配列決定と検出のためのプロトコール
使用した試薬はApplied Biosystems 社 (Foster City、USA)製。２μｌ精製ＰＣＲ産物、１.５μｌのBigDye−Terminatorキット、前掲の２００ｎＭの配列決定プラマー；Ｈ₂Ｏで１０μｌにする。

配列決定のための増幅プログラム：
９６℃２分間 ×１サイクル；

９６℃１０秒間
５５℃１０秒間
６５℃４分間 ×３０サイクル；

７２℃７分間
４℃３０秒間 ×１サイクル；

配列決定生成物の解析
配列は、まず予備データを得るためにSequenz Analyse ソフトウエア（Applied Biosystems社、Foster City、USA）で解析され、次いでPhred、Phrap、Polyphred及びConsedソフトウェアで処理された。Phred、Phrap、Polyphred及びConsedは、Washington大学のPhil Greenによって作成されたものである(http://www.genome.washington.edu)。

結果
被験者群の特性
表１は研究対象者群の特性を示す。

ＥＧＬＮ２遺伝子の変異体の頻度と分布
表２は、検討した患者群の参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２の４７０位におけるＥＧＬＮ２遺伝子の遺伝的変異体の頻度と分布を示す。

以下では、ＥＧＬＮ２−Ｃ４７０Ｃ（ＥＧＬＮ２Ｓｅｒ５８Ｓｅｒ）及びＥＧＬＮ２−Ｃ４７０Ｔ（ＥＧＬＮ２Ｓｅｒ５８Ｌｅｕ）を有する個人だけが考慮に入れられる。

早期心筋梗塞の発症に対するＥＧＬＮ２の変異体の影響
表３は、検討した患者群において早期心筋梗塞（男性では５５歳未満、女性では６０歳未満）及び発作／ＰＲＩＮＤ(遷延性可逆性虚血性神経欠損)／ＴＩＡ（一過性虚血性発作）の発症に対する参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２の４７０位におけるＥＧＬＮ２の遺伝子型の影響を示す。０.０５未満のＰ値は統計的に有意性ありを示す。

結果：
１．ＥＧＬＮ２―Ｃ４７０Ｃを有する患者は、ＥＧＬＮ２―Ｃ４７０Ｔを有する患者に比べて早期心筋梗塞に対し統計的に高い発生率を示した。
２．ＥＧＬＮ２―Ｃ４７０Ｔを有する患者は、ＥＧＬＮ２―Ｃ４７０Ｃを有する患者に比べて発作、ＰＲＩＮＤ及び／又はＴＩＡの罹患リスクの有意な増加を示した。

冠状動脈性心疾患の患者年齢に対するＥＧＬＮ２の変異体の影響
図５は、患者群における冠状動脈性心疾患の発症年齢に対する、参照配列ＮＭ＿０５３０４２．２の４７０位におけるＥＧＬＮ２の遺伝子型の影響を示す。

結果：
冠状動脈性心疾患の早期発症に対するＥＧＬＮ２―Ｃ４７０Ｃ（ＥＧＬＮ２Ｓｅｒ５８Ｓｅｒ) を有する患者の年齢の有意な依存性が、ＥＧＬＮ２−Ｃ４７０Ｔ（ＥＧＬＮ２Ｓｅｒ５８Ｌｅｕ）を有する患者の年齢に比べて認められた。

結論：
前掲のＥＧＬＮ２をコードする遺伝子及び／又は蛋白質ＥＧＬＮ２の遺伝的変異体の間の統計的に有意な相関は、血栓性及び／又は冠状動脈性心疾患の発症における前述の遺伝的変異体の関与を示唆するものである。その結果として、前述の遺伝的変異体は、血栓性及び／又は冠状動脈性心疾患の予後、特に早期心筋梗塞及び脳卒中、ＰＲＩＮＤ及び／又はＴＩＡの予後の生物学的マーカーとなる。

ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿０５３０４６を有するヒトＥＧＬＮ２遺伝子の核酸配列を示す。４７０位における遺伝的変異Ｃ→Ｔ(太字)を有する遺伝子断片の増幅に使用されるプライマーは下線で示される。ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿０５３０４６を有する核酸配列から導かれるヒトＥＧＬＮ２のアミノ酸配列を示す。ＥＧＬＮ蛋白質中の５８位のアミノ酸を太字で示す。５８位にロイシンを含むヒトＥＧＬＮ２変異体のアミノ酸配列を示す。ＥＧＬＮ蛋白質中の５８位のアミノ酸を太字で示す。４７０位にトレオニンを含むヒトＥＧＬＮ変異体遺伝子の核酸配列を示す。患者群の冠状動脈性心疾患の発症年齢に対する、ＥＧＬＮ蛋白質の５８位のアミノ酸変換をもたらす参照配列ＮＭ＿０５３０４２．２の４７０位におけるＥＧＬＮ２の遺伝子型の影響を示す。

配列の説明
配列番号１は、ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿０５３０４６を有するヒトＥＧＬＮ２蛋白質の核酸配列を示す。
配列番号２は、ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿０５３０４６を有する核酸配列から導かれるヒトＥＧＬＮ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、５８位にロイシンを含むヒトＥＧＬＮ２変異体遺伝子の核酸配列を示す。
配列番号４は、４７０位にトレオニンを含むヒトＥＧＬＮ変異体の核酸配列を示す。
配列番号５は、参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２のヌクレオチド４４４−４６３の第１プライマー配列を示す。
配列番号６は、参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２の塩基５０４−５２１の相補配列の第２プライマー配列を示す。

Claims

配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＥＧＬＮ２蛋白質。
請求項１に記載のＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸。
配列番号４に記載の核酸配列を含む、請求項２に記載の核酸。
請求項２又は３に記載の核酸を含む、ベクター。
発現ベクターである、請求項４に記載のベクター。
請求項２又は３に記載の核酸を含む、又は請求項４又は５に記載のベクターを含む宿主細胞。
請求項２又は３に記載の核酸を含む、又は請求項４又は５に記載のベクターを含む非ヒトトランスジェニック動物。
請求項１に記載のＥＧＬＮ２蛋白質を産生する方法であって、請求項６に記載の細胞を適切な培養培地で培養する方法。
ＥＧＬＮ２蛋白質が細胞又は培養培地から単離される、請求項８に記載の方法。
配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＥＧＬＮ２蛋白質のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）ＥＧＬＮ２蛋白質又はＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸を供し；
（ｂ）試験化合物を供し；そして
（ｃ）ＥＧＬＮ２蛋白質又はＥＧＬＮ２遺伝子に対する試験化合物の影響を測定又は検出する、ここで、影響はＥＧＬＮ２の遺伝子発現又はプロリルヒドロキシラーゼ活性の活性化又は阻害である
を含む方法。
試験化合物が化学物質ライブラリーの形態で供せられる、請求項１０に記載の方法。
ＥＧＬＮ２蛋白質又はＥＧＬＮ２遺伝子に対する試験化合物の影響がヘテロジニアス又はホモジニアスアッセイにおいて測定又は検出される、請求項１０又は１１に記載の方法。
アレイ上で実施される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
全細胞を用いて実施される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
ロボットシステムにおいて実施される、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
マイクロ流体工学を用いて実施される、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
ハイスループット・スクリーニングの方法である、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
早期心筋梗塞、脳卒中、遷延性可逆性虚血性神経欠損（PRIND）又は一過性脳虚血性発
作（TIA）の検出のための、被験体に由来する試料における配列番号４に記載の核酸配列
を含む核酸を同定する核酸の解析方法。