JP5222558B2 - Ｈｃｖ複製の調節 - Google Patents

Description

本発明は、細胞をベースとした系において、特にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のウイルス複製及び／又はウイルス産生の調節剤として作用できるある種の化合物の使用を対象とする。

世界の人口の約３％がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染しているものと思われる（Ｗａｓｌｅｙ他、２０００、Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２０、１〜１６）。ＨＣＶに曝露すると、少数では顕性急性疾患に陥るが、ほとんどの場合、ウイルスは持続感染を確立し、慢性肝炎、肝硬変及び肝不全を引き起こす（Ｉｗａｒｓｏｎ、１９９４、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１４、２０１〜２０４）。さらに、疫学的調査では、肝細胞癌の病理においてＨＣＶが重要な役割を担うことが示された（Ｋｅｗ、１９９４、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１４、２１１〜２２０、Ａｌｔｅｒ、１９９５．Ｂｌｏｏｄ ８５、１６８１〜１６９５）。

ＨＣＶ複製に対する抗ウイルス化合物の効果の研究は、研究用小動物モデル並びに培養細胞において感染を再現する方法がないために困難である。ＨＣＶは、ヒト及びチンパンジーには感染するが、マウス及びラットなどの小動物には感染しない。同様に、ＨＣＶはいかなる培養細胞及び組織においても効率よく増殖しない。

Ｌｏｈｍａｎｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５、１１０〜１１３、１９９９は、ウイルスＲＮＡが形質移入した細胞で効率的に自己複製するＨＣＶ細胞培養系を開示しており、バイシストロニックなＨＣＶサブゲノムレプリコンが肝細胞腫細胞系において複製できる能力を示している。ＨＣＶレプリコンは、培養細胞において自己複製できるＲＮＡ分子であり、検出可能なレベルの１種又は複数のＨＣＶ蛋白質を産生する。

したがって、ＨＣＶレプリコンは、検出可能なレベルのＨＣＶ ＲＮＡ及びＨＣＶ蛋白質をもたらす細胞培養複製系を作製するために使用することができる。しかし、効率的に複製するためには、使用可能なレプリコンの大部分は適応変異の存在を必要とする(例えば、Ｌｏｈｍａｎｎ他、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７、３００７〜３０１９、２００３）。

適応変異は、ＨＣＶレプリコンが宿主細胞で維持され、発現する能力を高めるＨＣＶ ＲＮＡ中の変異である。適応変異の例は、ＵＳ６６３０３４３ Ｂ１；ＷＯ２００２０５９３２１ Ａ２；ＷＯ０１８９３６４ Ａ２；Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ他、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．６０、９１〜１０２、２００３及びその中の参考文献に見いだすことができる。

ある種のフェニルピペラジン誘導体及びフェニルピペリジン誘導体は、当業界で開示されているが、ウイルス複製の調節剤として有用なものは開示されていない。

国際出願公開ＷＯ９８／００１３４号（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．）は、フィブリノーゲン受容体アンタゴニストとして式（Ａ）の化合物
Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ａ−Ｂ （Ａ）
（式中、Ｘは、５、６又は７員芳香環若しくは非芳香環であり、Ｙは、

などの５又は６員芳香環である。）
を開示している。

国際出願公開ＷＯ０３／０７６４２２号（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｎ．Ｖ．）は、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤として式（Ｂ）のスルホニル誘導体

（式中、Ａ、Ｌ、Ｑ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、ｎ及びｔはその中で定義されている。）
を開示している。

国際出願公開ＷＯ９９／３８８４９号（Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａ Ｋａｉｓｈａ、Ｌｔｄ．）は、インテグリンανβ３アンタゴニストとして式（Ｃ）の化合物

（式中、Ａ、Ｑ、Ｘ、Ｚ、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、ｍ、ｎ、ｐ及びｑはその中で定義されている。）
を開示している。

国際出願公開ＷＯ９７／２５３２３号（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、フィブリノーゲン受容体アンタゴニストとして式（Ｄ）の化合物

（式中、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、Ｄ、Ｑ、Ｘ、Ｚ、Ｒ^１、Ｒ^２及びｎはその中で定義されている。）
を開示している。

欧州特許出願公開ＥＰ２７７７２５号（Ａ．Ｈ．Ｒｏｂｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）は、抗アレルギー薬として式（Ｅ）の４−アリール−Ｎ−［２−（ジアルキルアミノ及び複素環アミノ）アルキル］−１−ピペラジンカルボキシアミド

（式中、Ｂ、Ａｒ及びＱはその中で定義されている。）
を開示している。

最近、驚くべきことに、前記で述べた公知の化合物のいくつかを含むある種のフェニルピペラジン誘導体及びフェニルピペリジン誘導体は、適応変異の誘導を必要とせずに細胞培養におけるＨＣＶ ＲＮＡの複製を支持するために使用できることが発見された。このような細胞培養系は、インビボにおける複製に非常によく似ており、天然のＨＣＶ配列の複製を支持するために、かつ培養細胞及び試験動物におけるＨＣＶウイルス感染測定法の確立を助けるために有用である。 さらに、これらの化合物は適応変異のないＨＣＶ ＲＮＡの複製には刺激効果を有するが、ある濃度では、それらはまたＨＣＶ ＲＮＡ、特に適応変異を含有するＨＣＶ ＲＮＡの複製を阻害することができることが発見された。したがって、このような阻害剤は、ＨＣＶに感染した個体を治療するために治療的に適用することができる。

したがって、一態様では、本発明は、細胞、組織又は器官におけるＨＣＶ ＲＮＡの複製及び／又はＨＣＶのウイルス産生を調節するために、式（Ｉ）の化合物、又はそれらの適切な塩の使用を提供する。

他の態様では、本発明は、細胞、組織又は生物に式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩を投与することを含む、細胞、組織又は生物におけるＨＣＶ ＲＮＡの複製及び／又はＨＣＶのウイルス産生を調節する方法を提供する。

当業者であれば、ＨＣＶ ＲＮＡの複製又はＨＣＶのウイルス産生の「調節」などの本明細書での表現は、ＨＣＶ ＲＮＡ複製又はＨＣＶ産生の阻害及び促進を含むものとすることを理解するであろう。

したがって、一実施形態では、細胞におけるＨＣＶ ＲＮＡの複製及び／又はＨＣＶのウイルス産生を促進するために、式（Ｉ）の化合物、又はそれらの適切な塩の使用を提供する。

他の実施形態では、細胞を式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することによって、この培養細胞におけるＨＣＶ ＲＮＡの複製及び／又はＨＣＶのウイルス産生を促進する方法を提供する。

他の態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することによって入手可能な細胞培養物を提供する。

当業者であれば、本明細書のＨＣＶ ＲＮＡという表現はサブゲノムレプリコン及び完全長ＨＣＶ ＲＮＡを含むものとすることを理解するであろう。完全長ＨＣＶ ＲＮＡは、ＨＣＶ ＲＮＡの形質移入によって、又は感染した個体から得られた、若しくは細胞培養で産生されたＨＣＶウイルスを細胞に接種することによって、細胞に導入することができる。

本発明の化合物による細胞中のＨＣＶ ＲＮＡ複製の促進は、以下の、ＨＣＶ ＲＮＡ複製維持の延長、ＨＣＶ ＲＮＡ複製速度の増加、ＨＣＶ ＲＮＡ発現の増加、ＨＣＶ蛋白質発現の増加、ウイルス産生の増加の少なくとも１つをもたらす。

本発明の化合物を使用した細胞培養系におけるＨＣＶ ＲＮＡの複製及び発現の増強には、ＨＣＶ複製及び発現を研究するため、ＨＣＶ及び宿主細胞相互作用を研究するため、ＨＣＶ ＲＮＡを産生するため、ＨＣＶ蛋白質を産生するため、細胞培養におけるＨＣＶウイルス感染の確立を助けるため、並びに１種又は複数のＨＣＶ活性を調節する化合物の能力を測定する系を提供するために使用されることを含めた多種多様な用途がある。

他の態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理されたＨＣＶ細胞培養物への化合物の投与を含む、これらの化合物をＨＣＶ複製に対する効果についてスクリーニングする方法を提供する。

本発明で説明した化合物は、所与の細胞培養条件、細胞系又はＨＣＶウイルス単離物に特異的な適応変異なしに検出可能なレベルのＨＣＶ ＲＮＡ及びＨＣＶ蛋白質をもたらす細胞培養物を生成するために使用することができる。さらに、本発明で記載した化合物は、培養細胞において、様々な単離物及び遺伝子型を表す天然の配列を備えたＨＣＶ ＲＮＡの複製を可能にするために利用することができる。

したがって、他の態様では、本発明は、ＨＣＶ ＲＮＡの適応変異がなくても検出可能なレベルのＨＣＶ ＲＮＡ及びＨＣＶ蛋白質を有する細胞培養物の生成における式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩の使用を提供する。

他の態様では、本発明は、
ａ）組織培養中の細胞を、適応変異を有さないＨＣＶ ＲＮＡ又はＨＣＶウイルスと接触させることと、
ｂ）この細胞を式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することと、
ｃ）この処理細胞をＨＣＶ ＲＮＡ複製について評価することと
によって、ＨＣＶ ＲＮＡ中に適応変異がなくても検出可能なレベルのＨＣＶ ＲＮＡを有する細胞培養物の生成方法を提供する。

他の態様では、本発明は、
ａ）組織培養中の細胞を、適応変異を有さないＨＣＶ ＲＮＡ又はＨＣＶウイルスと接触させることと、
ｂ）この細胞を式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することと、
ｃ）この処理した細胞をＨＣＶ蛋白質発現について評価することと
によって、ＨＣＶ ＲＮＡ中に適応変異がなくても検出可能なレベルのＨＣＶ蛋白質を有する細胞培養物の生成方法を提供する。

他の態様では、本発明は、
ａ）組織培養中の細胞を、適応変異を有さないＨＣＶ ＲＮＡ又はＨＣＶウイルスと接触させることと、
ｂ）この細胞を式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することと、
ｃ）細胞培地中に分泌されたウイルス粒子の量を評価することと
によって、適応変異がなくても検出可能なレベルのウイルスを産生する細胞培養物の生成方法を提供する。

本発明で記載した化合物はまた、培養細胞において検出可能なＨＣＶ ＲＮＡ複製及びＨＣＶ蛋白質発現の確立を助けるために、ＨＣＶ変種に存在する選択された適応変異と組み合わせて使用することができる。

したがって、他の態様では、本発明は、細胞中に選択された適応変異が存在すると検出可能なレベルのＨＣＶ ＲＮＡ及びＨＣＶ蛋白質を有する細胞培養物の生成における、式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩の使用を提供する。

他の態様では、本発明は、
ａ）組織培養中の細胞を、選択された適応変異を有するＨＣＶ ＲＮＡ又はＨＣＶウイルスと接触させることと、
ｂ）この細胞を式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することと、
ｃ）この処理細胞をＨＣＶ ＲＮＡ複製について評価することと
によって、これらの細胞に選択された適応変異が存在すると検出可能なレベルのＨＣＶ ＲＮＡを有する細胞培養物の生成方法を提供する。

他の態様では、本発明は、
ａ）組織培養中の細胞を、適応変異を有するＨＣＶ ＲＮＡ又はＨＣＶウイルスと接触させることと、
ｂ）この細胞を式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することと、
ｃ）この処理細胞をＨＣＶ蛋白質発現について評価することと
によって、これらの細胞に選択された適応変異が存在すると検出可能なレベルのＨＣＶ蛋白質を有する細胞培養物の生成方法を提供する。

他の態様では、本発明は、
ａ）組織培養中の細胞を、適応変異を有するＨＣＶ ＲＮＡ又はＨＣＶウイルスと接触させることと、
ｂ）この細胞を式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することと、
ｃ）細胞培地中に分泌されたウイルス粒子の量を評価することと
によって、適応変異が存在すると検出可能なレベルのウイルスを産生する細胞培養物の生成方法を提供する。

本発明における使用に適した細胞系には、限定はしないが、初代ヒト細胞、例えば、肝細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び包皮繊維芽細胞、並びに連続継代性ヒト細胞系、例えば、ＨｕＨ７、ＨｅｐＧ２、ＨＵＴ７８、ＨｅＬａ、２９３、ＨＰＢ−ＭＡ、ＭＴ−２、ＭＴ−２Ｃ及びその他のＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶＩＩ感染Ｔ細胞系、Ｎａｍａｌａｗａ、Ｄａｕｄｉ、ＥＢＶ−形質転換ＬＣＬが含まれる。さらに、その他の種類の細胞系、特にフラビウイルス又はペスチウイルスの複製を可能にする細胞系、例えば、ＳＷ−１３、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ−２１、ＣＯＳ、ＰＫ−１５、ＭＢＣＫ、ＭＤＣＫ、Ｈｅｐａ１−６などを使用することができる。

好ましい細胞系は、Ｈｕｈ−７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２及びＨｅＬａなどの肝細胞腫系である。

当業者であれば、本明細書で説明した、細胞培養においてＨＣＶ ＲＮＡ複製及び／又はＨＣＶウイルス産生を調節するための使用及び方法は、試験動物におけるＨＣＶ ＲＮＡ複製、ＨＣＶウイルス感染及び／又はＨＣＶウイルス産生の調節に適用できることを理解するであろう。

本発明での使用に適した試験動物は、齧歯類などの哺乳類を含む。好ましい試験動物は、ラット及びマウスなどの齧歯類である。

複製したＨＣＶ ＲＮＡの存在は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットなどの従来の方法によって、又はＨＣＶ蛋白質若しくはＨＣＶ ＲＮＡ中に操作されたレポーター遺伝子によってコードされた蛋白質の活性及び／又は発現を測定することによって、評価することができる。

ＨＣＶ蛋白質発現は、例えば、ＥＬＩＳＡ測定法、ウェスタンイムノブロット、又は放射活性蛋白質標識後の免疫沈降測定法などの従来方法によって評価することができる。

細胞培地に分泌されたＨＣＶウイルス粒子の存在は、例えば、リアルタイム逆転写ＰＣＲ増幅（ＴａｑＭａｎ）、ｂ−ＤＮＡなどの従来方法によって、又は未処理細胞若しくは実験動物を感染させるために細胞培地を使用することによって、評価することができる。

式（Ｉ）の化合物は、

（式中、Ｘ及びＹは独立してＣＨ又はＨであり、但し、Ｘ及びＹは両方ともＣＨではなく、
Ｒ^１はＣ（Ｏ）ＯＲ^４、Ｃ（Ｏ）ＮＲ^５Ｒ^６、Ｃ（Ｏ）Ｒ^７又はＳ（Ｏ）_２Ｒ^８であり、
Ｒ^２はＣ（Ｏ）ＮＲ^９Ｒ^１０又はＮＲ^９Ｃ（Ｏ）Ｒ^１０であり、
Ｒ^３は存在しないか、又はハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ_１〜６アルキル及びＣ_１〜６アルコキシから選択され、
Ｒ^５及びＲ^９はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１〜６アルキル又はＣ_３〜８シクロアルキルであり、
Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立してＣ_１〜６アルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニル、（ＣＨ_２）_０〜３Ｃ_３〜８シクロアルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、（ＣＨ_２）_０〜３アリール、（ＣＨ）_２アリール、（ＣＨ_２）_０〜３Ｏアリール、（ＣＨ_２）_０〜３ヘテロアリール及び（ＣＨ_２）_０〜３Ｏヘテロアリールから選択され、
場合によって、ヒドロキシ、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ、（ＣＨ_２）_０〜３ＮＲ^１１Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１２、（ＣＨ_２）_０〜３アリール又は（ＣＨ_２）_０〜３ヘテロアリールによって置換されており、
Ｒ^１１及びＲ^１２はそれぞれ独立して水素又はＣ_１〜５アルキルであり、
Ｒ^１０は（ＣＨ_２）_０〜３アリール又は（ＣＨ_２）_０〜３ヘテロアリールであり、場合によってハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜４アルケニル、ＯＲ^１３、Ｃ（Ｏ）Ｒ^１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１３、アリール、（ＣＨ）_２アリール、（ＣＨ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１３又はＮＲ^１３Ｒ^１４によって置換されており、
Ｒ^１３及びＲ^１４はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１〜４アルキル又は（ＣＨ_２）_０〜３アリールであり、
この任意選択の置換基は、さらにヒドロキシ又はハロゲンによって場合によって置換されており、
Ｒ^１０はさらに５又は６員環と融合していてよく、この環は部分的に、又は完全に不飽和であってよく、かつ、この環は１個又は２個のＮ原子を含有していてよく、前記環は場合によってヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ、Ｃ（Ｏ）Ｒ^１５及びＣ（Ｏ）ＯＲ^１５によって置換されており、
Ｒ^１５はＣ_１〜４アルキル又はアリールである。）
と定義される。

式（Ｉ）の化合物の好ましいサブクラスは、式（Ｉｉ）の化合物

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は式（Ｉ）に関して定義した通りであり、
Ｒ^３は存在しないか、又はヒドロキシ、Ｃ_１〜６アルキル及びＣ_１〜６アルコキシから選択される。）
と定義される。

好ましくは、Ｘ及びＹは両方ともＮである。

好ましくは、Ｒ^１はＣ（Ｏ）ＯＲ^４、Ｃ（Ｏ）ＮＲ^５Ｒ^６又はＣ（Ｏ）Ｒ^７であり、
Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６及びＲ^７は既に定義した通りである。より好ましくは、Ｒ^１はＣ（Ｏ）ＯＲ^４である。

好ましくは、Ｒ^４、Ｒ^６及びＲ^７はそれぞれ独立してＣ_１〜６アルキル、アリール及びベンジルから選択され、フッ素、塩素、臭素、ＣＮ、メチル、メトキシ及びＣＦ_３から選択された１個又は２個の置換基によって場合によって置換されている。

より好ましくは、Ｒ^４はＣ_１〜６アルキルであり、最も好ましくはＣ_１〜４アルキルであり、特にエチル、ｓ−ブチル及びｔ−ブチルである。

より好ましくは、Ｒ^６はベンジルであり、場合によってフッ素、塩素又はメチルによって置換されている。

より好ましくは、Ｒ^７は（ＣＨ_２）_０〜２Ｃ_５〜６シクロアルキル、（ＣＨ_２）_０〜２アリール又は（ＣＨ）_２アリールであり、このアリール基は、特にフェニルのとき、場合によってＣＮ又はＣＦ_３によって置換されている。

好ましくは、Ｒ^５は水素である。

好ましくは、Ｒ^２はＣ（Ｏ）ＮＲ^９Ｒ^１０であり、Ｒ^９及びＲ^１０は既に定義した通りである。

好ましくは、Ｒ^９は水素又はメチルである。最も好ましくは、Ｒ^９は水素である。

好ましくは、Ｒ^１０は（ＣＨ_２）_０〜３フェニル又はヘテロアリールであり、ハロゲン、ヒドロキシ、ＣＮ、ＣＦ_３、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜４アルケニル、Ｃ（Ｏ）Ｒ^１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１３又は（ＣＨ_２）フェニルによって場合によって置換されており、Ｒ^１３は以前に定義された通りであり、この任意選択の置換基はさらにヒドロキシ又はハロゲンによって置換されている。より好ましくは、Ｒ^１０はフェニル、−ＣＨ_２ＣＨ_２フェニル又はベンゾチアゾリルであり、ハロゲン、ヒドロキシ、ＣＮ、ＣＦ_３又は

によって場合によって置換されており、
Ｒ^１０はフェニル又は−ＣＨ_２ＣＨ_２フェニルであり、好ましくは、Ｒ^１０は置換されており、最も好ましくは１置換されており、より好ましくは４位が置換されている。

好ましくは、Ｒ^３は存在しないか、又はヒドロキシである。Ｒ^３がヒドロキシのとき、好ましくはＲ^２置換基に隣接した位置で結合している。好ましくは、Ｒ^３は存在しない。

式（Ｉ）の化合物の他の好ましいサブクラスは、式（Ｉａ）の化合物

（式中、Ｒ^４は式（Ｉ）に関して定義した通りであり、Ｒ^１５は存在しなくてよく、又はハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜４アルケニル、ＯＲ^１３、Ｃ（Ｏ）Ｒ^１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１３、アリール、（ＣＨ）_２アリール、（ＣＨ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１３又はＮＲ^１３Ｒ^１４であり、場合によってハロゲン又はヒドロキシによって置換されており、
Ｒ^１３及びＲ^１４は式（Ｉ）に関して定義した通りである。）
である。

好ましくは、Ｒ^４はＣ_１〜６アルキル、Ｃ_２〜６アルケニル又は（ＣＨ_２）_０〜３アリールであり、ハロゲン、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ及び−ＣＨ_２ＮＨＣ（Ｏ）ＯＣ_１〜４アルキルから選択された１個又は２個の置換基によって場合によって置換されている。より好ましくは、Ｒ^４はエチル、ブチル、ペンチル、プロピル、フェニル、ベンジル又は（ＣＨ_２）ナフチルである。最も好ましくは、Ｒ_４はブチル、特にｔ−ブチル又はベンジルである。

Ｒ^４がベンジルのとき、塩素、臭素、メチル、メトキシ及び−ＣＨ_２ＮＨＣ（Ｏ）ＯＣＨ_３から選択された１個又は２個の置換基によって場合によって置換されている。

好ましくは、Ｒ^１５はハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、Ｃ_２〜４アルケニル、フェニル、ヒドロキシ、ＯＡｃ、ＯＢｎ、Ｃ（Ｏ）Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ（Ｏ）フェニル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ_１〜４アルキル、（ＣＨ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＣ_１〜４アルキル、Ｎ（Ｃ_１〜４アルキル）_２又は

である。より好ましくは、Ｒ^１５は臭素、ヨウ素、ＣＦ_３、ビニル、ヒドロキシ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ_３、（ＣＨ_２）Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ_３、ＮＭｅ又は

である。最も好ましくは、Ｒ^１５は臭素、ＣＦ_３、ヒドロキシ又は

であり、特にヒドロキシである。

Ｒ^１５が存在するとき、フェニル環の３又は４位、特に４位であることが好ましい。

式（Ｉ）又は任意の置換基に複数回変動が生じるとき、各出現の定義はその他の出現全ての定義と独立している。

本明細書では、基又は基の１部としての「アルキル」又は「アルコキシ」という用語は、その基が直鎖又は分枝鎖であることを意味する。適切なアルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル及びｔ−ブチルを含む。適切なアルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ及びｔ−ブトキシを含む。

本明細書で言及したシクロアルキル基は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシルを表す。

本明細書では、基又は基の１部としての「アルケニル」又は「アルキニル」という用語は、その基が直鎖又は分枝鎖であることを意味する。適切なアルケニル基は、ビニル及びアリルを含む。適切なアルキニル基は、エチニル及びプロパギルである。

本明細書で使用するとき、用語「ハロゲン」はフッ素、塩素、臭素及びヨウ素を意味する。好ましいハロゲンは、フッ素及び塩素である。

本明細書で使用するとき、基又は基の一部としての「アリール」という用語は、炭素環芳香族環を意味する。適切なアリール基の例は、フェニル及びナフチルを含む。

本明細書で使用するとき、基又は基の一部としての「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択された１から４個のヘテロ原子を含有する複素芳香族５員環から１０員環を意味する。このような基の具体的な例は、ピロリル、フラニル、チエニル、ピリジル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアジニル、テトラゾリル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾチアゾリル及びキノリニルを含む。

化合物又は基が「場合によって置換された」と記載されている場合、１個又は複数の置換基が存在していてよい。任意選択の置換基は、様々な方法で置換している化合物又は基に、直接に、又は以下の例のような連結基、アミン、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、スルホンアミド、スルファミド、スルホキシド、ウレア、チオウレア及びウレタンによって結合してよい。適切であれば、任意選択の置換基は他の置換基によってそれ自体置換されていてよく、後者は直接前者に連結しているか、又は前記で例示したものなどの連結基によって連結している。

式（Ｉ）の化合物の範囲内の具体的な化合物は、実施例及び以下の表に挙げたものを含む。

特に興味のある化合物は、ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート（Ｉｂ）である。

式（Ｉ）の化合物の濃度を変化させると、ＨＣＶ ＲＮＡの複製に対する効果を調節することができ、ＨＣＶ ＲＮＡ複製が阻害される程度も調節することができることが発見された。したがって、このような化合物は、ＨＣＶ患者を治療するために治療的に適用することができる。

したがって、他の態様では、本発明は、ＨＣＶ感染を治療するための医薬品の製造における式（Ｉ）の化合物又はそれらの薬剤として許容される塩の使用を提供する。

他の態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はそれらの薬剤として許容される塩の有効量を投与することによるＨＣＶ感染患者の治療又は予防方法を提供する。

薬剤で使用するために、式（Ｉ）の化合物の塩は、非毒性の薬剤として許容される塩である。しかし、その他の塩が、本発明による化合物又はそれらの非毒性の薬剤として許容される塩の調製に有用であってよい。本発明の化合物の適切な薬剤として許容される塩は、例えば、本発明による化合物の溶液と塩酸、フマル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、カルボン酸、リン酸又は硫酸などの薬剤として許容される酸の溶液とを混合することによって形成することができる。アミン基の塩はまた、アミノ窒素原子がアルキル、アルケニル、アルキニル又はアラルキル部分などの適切な有機基を有する４級アンモニウム塩を含む。さらに、本発明の化合物が酸部分を含む場合、それらの適切な薬剤として許容される塩は、ナトリウム又はカリウム塩などのアルカリ金属塩及びカルシウム又はマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩などの金属塩を含むことができる。

本発明の化合物の適切な塩は、前述したようなそれらの薬剤として許容される塩だけでなく、例えば、無機酸及び有機酸から形成された通常の塩又は４級アンモニウム塩を含む。適切な塩は、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から得られた塩、及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、ｍａｐｏｉｃ、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸から調製された塩を含む。

この塩は、例えば、この塩が不溶性である溶媒若しくは媒体中で、又は真空中で、若しくは凍結乾燥によって除去される水などの溶媒中で、この生成物の遊離塩基形態と１価又は複数価の適切な酸とを反応させることによって、或いは既存の塩の陰イオンを適切なイオン交換樹脂上で他の陰イオンに交換することによって、従来の手段によって形成することができる。

本発明は、範囲内に前記の式（Ｉ）の化合物のプロドラッグを含む。一般的に、このようなプロドラッグは必要な式（Ｉ）の化合物にインビボで容易に変換できる式（Ｉ）の化合物の機能的誘導体である。適切なプロドラッグ誘導体の選択及び調製のための従来の方法は、例えば、「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」、Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５に記載されている。

プロドラッグは、活性化薬剤を放出するためには体内で変換することが必要で、親薬剤分子よりも送達特性が改善されている、生物学的に活性のある物質（「親薬剤」又は「親分子」）の薬理学的に不活性な誘導体であってよい。インビトロでの変換は、例えば、カルボン酸、リン酸又は硫酸エステルの化学的又は酵素的加水分解、或いは感受性官能基の還元若しくは酸化などのある種の代謝過程の結果であってよい。

本発明は、範囲内に前記の式（Ｉ）の化合物の溶媒化合物及びそれらの塩、例えば水和物を含む。

本発明はまた、範囲内に式（Ｉ）の化合物の鏡像異性体、ジアステレオマー、幾何異性体及び互変異性体を含む。このような異性体全て及びそれ等の混合物は、本発明の範囲内に包含されると理解されたい。

本発明の他の態様では、ＨＣＶ ＲＮＡの複製の阻害及び／又はＣ型肝炎ウイルスによる疾患の治療又は予防の方法を提供し、この方法は、前述の医薬組成物又は式（Ｉ）の化合物、又は薬剤として許容されるそれらの塩の治療若しくは予防有効量をこの疾患に罹患しているヒト又は動物（好ましくは哺乳類）対象に投与することを含む。「有効量」とは、対象に利益ももたらすために、又は対象の状態に少なくとも変化をもたらすために十分な量を意味する。

本発明の他の実施形態では、抗ウイルス剤などのウイルス感染の治療のための１種又は複数のその他の薬剤、及び／又はα−、β−又はγ−インターフェロンなどの免疫調節剤、特にα−インターフェロンと併用して、Ｃ型肝炎による感染の治療又は予防のための薬剤を製造するための、式（Ｉ）の化合物又はそれらの薬剤として許容される塩の使用を提供する。適切な抗ウイルス剤には、リバビリン及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）複製酵素の阻害剤、例えば、メタロプロテアーゼ（ＮＳ２−３）、セリンプロテアーゼ（ＮＳ３）、ヘリカーゼ（ＮＳ３）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５Ｂ）の阻害剤が含まれる。

本発明の他の態様は、薬剤として許容される担体と関連して、式（Ｉ）の化合物又はそれらの薬剤として許容される塩を含む医薬組成物を提供する。企図する投与方法に応じて、この組成物は適切な形態であってよい。例えば、経口投与用の錠剤、カプセル又は液剤、或いは非経口投与用液体又は懸濁液の形態であってよい。

したがって、本発明の他の態様は、式（Ｉ）の少なくとも１種の化合物又はそれらの薬剤として許容される塩と１種又は複数の薬剤として許容される補助剤、希釈剤又は担体及び／又は１種又は複数のその他の治療若しくは予防活性薬剤を混合することによる医薬組成物の調製方法を提供する。

本発明の他の態様は、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染の治療又は予防など、治療で使用するための式（Ｉ）の化合物又は薬剤として許容されるそれらの塩を提供する。

本発明の他の態様は、式（Ｉ）の化合物又は薬剤として許容されるそれらの塩を提供するが、但し、式（Ｉ）の化合物は、
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート、
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（４−ブロモフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート、
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（３−ブロモフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート、
ｔｅｒｔ−ブチル４−{４−［（｛３−［（１Ｅ）−３−メトキシ−３−オキソプロプ−１−エン−１−イル］フェニル｝アミノ）カルボニル］フェニル｝ピペラジン−１−カルボキシラート、
ｔｅｒｔ−ブチル４−｛４−［（４−ヒドロキシベンゾイル）アミノ］フェニル｝ピペラジン−１−カルボキシラート、又は
ｔｅｒｔ−ブチル４−｛４−［（４−アミノベンゾイル）アミノ］フェニル｝ピペラジン−１−カルボキシラートではない。

この化合物を投与する投与割合は、使用する特定化合物の活性、化合物の代謝安定性及び作用の長さ、患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与様式及び時間、排泄速度、併用薬剤、患者の状態の重症度及び宿主が受けている治療を含む様々な要素に左右される。Ｃ型肝炎ウイルスによる感染を治療又は予防するために、適切な投薬レベルは、１日当たり０．０２ｇから５又は１０ｇの程度で、経口投与量は２から５倍高くてよい。例えば、体重１ｋｇ当たり化合物１０から５０ｍｇで、１日当たり１回から３回の投与が適切であり得る。適切な値は通常の試験によって選択可能である。この化合物は、単独で、又はその他の治療薬と併用して同時に、又は連続して投与してよい。例えば、有効量の抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗感染薬又は当業者に公知のワクチンと併用して投与してよい。経口、静脈内、経皮及び皮下を含む適切な経路によって投与してよい。適切な部位に直接に、又は特定の部位、例えば、ある種の細胞を標的とする方法で投与してよい。適切な標的化方法は、既に公知である。

一般式（Ｉ）の化合物は、前述の文書に開示された方法によって、及び以下に記載したような有機合成の業界で公知の方法によって調製できる。

したがって、本発明は、式（Ｉ）の化合物の調製方法を提供する。一般的方法（ａ）によると、式（Ｉ）の化合物は式（ＩＩ）の化合物と式（ＩＩＩ）の化合物

（式中、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｘ、Ｙ、Ｒ^９及びＲ^１０は式（Ｉ）で定義した通りである。）
との反応によって調製することができる。この反応は、ＮＭＰ又はＤＭＦなどの適切な溶媒の存在下で、Ｐｙ−ＢＯＰなどの結合試薬の存在下で都合良く実施される。

式（Ｉ）の化合物はまた、式（ＩＶ）の化合物と式（Ｖ）の化合物

（式中、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｘ、Ｙ、Ｒ^９及びＲ^１０は式（Ｉ）で定義した通りである。）
との反応によって調製することができる。この反応は、ＮＭＰなどの適切な溶媒の存在下で、Ｐｙ−ＢＯＰなどの結合試薬の存在下で都合良く実施される。

それらが市販されていない場合、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び（Ｖ）の開始物質は、付随するスキーム及び実施例で説明した方法と類似の方法又は当業界で周知の標準的方法によって調製することができる。

一般的合成スキーム
一般的に、この化合物の調製には５種の合成スキームを使用した。

メチル４−アミノ安息香酸をｎ−ブタノール中でビス（２−クロロエチル）アミン塩酸塩と共に７日間加熱還流した。得られたアリールピペラジン産物は室温まで冷却すると沈殿し、濾過によって容易に単離することができた。ＢＯＣ基で２級アミンをキャップした後、エステル官能基の塩基媒介加水分解は異なるアミンとの結合に用いられる遊離酸をもたらした。アミド結合形成は、ＤＭＦ中において、有機塩基存在下でペプチド結合試薬Ｐｙ−ＢＯＰによって媒介された。最終生成物は一般的に、順相カラムクロマトグラフィー又は逆相ＨＰＬＣのいずれかによって単離された。

重要なカルボン酸中間体のアミド結合は、対応する酸塩化物の形成：ＣＨ_２Ｃｌ_２中におけるそのカルボン酸と塩化チオニル：ベンゾトリアゾールの１：１保存溶液との反応によって実施され、得られたベンゾトリアゾール塩酸塩の濾過は酸塩化物の保存溶液をもたらした。ＣＨ_２Ｃｌ_２中におけるＮ−メチルモルホリン存在下でのアミンの反応によって、所望するアミドが生じた。最終生成物は一般的に、順相カラムクロマトグラフィー又は逆相ＨＰＬＣのいずれかによって単離された。

フェノール性ＯＨを酢酸エステルとして保護し、ＢＯＣ基を除去した後、有機塩基存在下での２級アミンと適切なクロロギ酸との反応によってウレタンを調製した。過剰なクロロギ酸試薬を捕捉樹脂に捕捉させて、単純濾過及び揮発物質の留去によってＯ−酢酸保護中間体の単離を可能にした。酸性化後、酢酸保護基を塩基媒介加水分解して標的分子を生成し、一般的に単純濾過及び洗浄又は逆相ＨＰＬＣのいずれかによって十分純粋に単離することができた。

アミド断片は、開始物質としてメチル４−ブロモ安息香酸を使用して調製した。まず、メチルエステルをＮａＯＨで加水分解して、得られた遊離酸をＤＭＦ中においてＮ−メチルモルホリンの存在下で結合剤としてｐｙＢＯＰを使用して４−アミノフェノールと結合させた。ヒドロキシル基の保護は、イミダゾールの存在下でＴＢＤＭＳＣｌで実施した。次にこの断片をアミンのパラジウム媒介Ｎ−アリール化に使用した。後処理及びクロマトグラフィーの後、別々の脱保護段階を必要とすることなく所望するＯ−デ−シリル化物質を直接単離した。

ＤＭＦ中において、４−フルオロ−ニトロベンゼンのフルオロ置換基をｔｅｒｔ−ブチル−１−ピペラジンによって５０℃で一晩求核芳香族置換することによって、ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ニトロフェニル）ピペラジン−１−カルボキシラートを得た。ニトロ基を還元して、対応するアニリンを得るために触媒水素添加した後、アミド結合形成は有機塩基存在下でＤＭＦ中においてＰｙ−ＢＯＰを使用して実施した。最終生成物は、順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテルによる６０％ＥｔＯＡｃ溶液）によって単離した。

代表的実施例

前記の方法のいずれかによって最初に得られた式（Ｉ）の化合物は、適切ならば、当業界で公知の技術によってその後式（Ｉ）の他の化合物に作り上げることができる。

例えば、Ｒ^２がＣ（Ｏ）ＮＨＲ^１０であり、Ｒ^１０が臭素で置換されたフェニルである式（Ｉ）の化合物は、アセトニトリルなどの適切な溶媒中において、Ｐ（ｏ−トリル）_３などのホスフィンリガンド及びトリエチルアミンなどの有機塩基の存在下で、パラジウム媒介架橋結合法によって、Ｒ^２がＣ（Ｏ）ＮＨＲ^１０であり、Ｒ^１０がアクリル酸で置換されたフェニルである式（Ｉ）の化合物に変換することができる。

生成物の混合物が本発明による化合物の調製のための前述の方法のいずれかによって得られる場合、所望する生成物は調製用ＨＰＬＣなどの従来方法によって、又は、例えば、適切な溶媒系と組み合わせてシリカ及び／又はアルミナを使用したカラムクロマトグラフィーによって適切な段階で混合物から分離することができる。

前記合成順序のいずれかにおいて、関与する分子のいずれかの感受性基又は反応基を保護することが必要とされ、かつ／又は所望される可能性がある。これは、例えば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９７３及びＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、３版、１９９９に記載されたものなどの従来の保護基によって実施することができる。この保護基は、当業界で公知の方法を使用してその後の都合の良い段階で除去することができる。

以下の実施例は、本発明を例示する。

結果
式（Ｉ）の化合物のＨＣＶレプリコンに対する阻害効果。適応ＨＣＶレプリコンに対する式Ｉの化合物の効果は、ＨＣＶレプリコンを一時的又は安定的に形質移入した細胞系を使用することによって評価した。ＨＣＶレプリコン及び化合物の効果は、方法の項で説明した細胞−ＥＬＩＳＡ、ベータ−ラクタマーゼ、ノーザンブロット及びｉｎ ｓｉｔｕ ＲＮＡ分解酵素保護測定法を含めたいくつかの様々な方法を使用することによって測定した。式Ｉの化合物は、適応変異を含有するＨＣＶレプリコンの複製に対して阻害効果を有し、ＩＣ_５０値は０．１μＭ未満から約２μＭの範囲であった。一例として、ＨＢＩ１０Ａレプリコン細胞を化合物（Ｉｂ）とインキュベートすると、ＨＣＶ複製の容量依存的阻害が生じ、ＩＣ_５０値は０．１２±０．０６μＭであった。標準的ＭＴＴ細胞毒性測定法及び^１４Ｃチミジン取り込み実験は、化合物（Ｉｂ）に毒性があり、レプリコンに効果的な濃度よりも２桁高い濃度のときのみ細胞増殖を阻害することを示した。化合物（Ｉｂ）の阻害効果はまた、異なるレプリコンを安定的に発現するその他の細胞クローンで、並びに異なるＨＣＶ単離物から生じ、様々な適応変異を含有するレプリコンで一時的に形質転換する実験において確かめられた（表７）。興味深いことに、化合物（Ｉｂ）は適応した完全長ＨＣＶゲノムの複製もまた、比較的強力に阻害した。さらに、化合物（Ｉｂ）はまた、ヒトＨｅＬａ細胞及びマウス肝細胞腫細胞系Ｈｅｐａｌ−６のＣｏｎ１単離物から得られたＨＣＶレプリコンを比較的強力に阻害し、その効果は宿主の種類及び元の組織と独立していることが示された。

式Ｉの化合物の刺激効果。式Ｉの化合物は複製に完全に適格なレプリコンを阻害する一方、それらは複製の効率が悪いレプリコンに対して刺激効果を示した（表８、図１）。この刺激効果は、化合物（Ｉｂ）で詳細に研究された。一時的な形質移入実験では、ＮＳ３にＥ１２０２Ｇ変異を含有するｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１７レプリコンは辛うじて検出可能なレベルで複製した一方、ｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｗｔレプリコンはそれほど複製しなかった。細胞ＥＬＩＳＡ測定法によってモニターすると、これら２種のレプリコンの複製は、用量に依存して化合物（Ｉｂ）によって刺激され、ベル型の活性化曲線を生じた（図１Ａ）。ＥＬＩＳＡシグナルの増加は、ｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｗｔレプリコンよりもｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１７レプリコンの方が高かった。しかし、いずれの場合においても、活性化のピークは約３０ｎＭから約１２０ｎＭの範囲の化合物（Ｉｂ）濃度で認められ、適応性の高いレプリコンで測定されたＩＣ_５０値にほぼ対応した（表７）。この活性化効果は、ノーザンブロット分析によっても確認された（図１Ｂ）。活性化は、ＩＦＮ、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ及びＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤によって、又はＮＳ５Ｂポリメラーゼの遺伝的不活性化によって阻害された。化合物（Ｉｂ）は、対応するレプリコンで認められたものよりも程度は少ないが、適応していない完全長Ｃｏｎ１ゲノムの複製も刺激した。さらに、化合物（Ｉｂ）はまた、ＨＣＶのＢＫ単離物から得られた不適応レプリコンの複製も活性化した。その他の式Ｉの化合物もｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｗｔレプリコンの複製を活性化した。しかし、阻害化合物の部分集団のみが測定可能な活性化を示し、２種の活性を分離できることを示唆している（表９）。

式Ｉの化合物に耐性のレプリコンの選択及び耐性変異の同定。無細胞測定法において、式Ｉの化合物はセリンプロテアーゼ、ＡＴＰアーゼ、ヘリカーゼ及びＮＳ３／４Ａ及びＮＳ５Ｂ蛋白質に関連したポリメラーゼを阻害しなかったので、ウイルス酵素に対するこれらの効果はこれらのウイルス酵素の阻害によって生じるのではないことを示している。これらの化合物の分子標的を同定する目的で、化合物（Ｉｂ）に耐性のレプリコンは、ＮＳ３−４Ａプロテアーゼ及びＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤に耐性の変異体を選択するために既に使用された方法を採用することによって選択された（Ｔｒｏｚｚｉ他、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７、３６６９〜３６７９、２００３）。耐性細胞クローンは、親細胞と表現型が類似であり、同等レベルのウイルスＲＮＡ及び蛋白質を発現し、化合物（Ｉｂ）及び式Ｉのその他の化合物に対する感受性は減少しており、ＩＣ_５０値は親細胞で測定された値よりも少なくとも１０倍高かった（表１０）。これらのクローンは、インターフェロンアルファによる阻害並びにＮＳ５Ｂポリメラーゼ及びＮＳ３／４Ａプロテアーゼのいくつかの阻害剤による阻害にまだ感受性であり、耐性は式Ｉの化合物に特異的であることを示唆した（表１０）。

耐性表現型に関与するウイルスゲノム中の変異を同定するため、レプリコンｃＤＮＡはＲＴ−ＰＣＲ増幅及び配列決定によって耐性クローン１０ＡＢ３及び１０ＡＢ１１からレスキューされた。親クローン中に存在する適応変異の他に、耐性レプリコンはＮＳ５Ａ中にいくつかの異なるアミノ酸置換を含有した（表１１）。これらの変異の役割は、何も含有しないか、親レプリコン（Ｅ１２０２Ｇ及びＫ＠２０３９）に存在する一方又は両方の適応変異を含有するレプリコンベクター中にそれらを分離することによって、及び一時的形質移入測定法で得られたレプリコンを試験することによって調べられた（表８）。ＮＳ５Ａのアラニン９２のバリンによる置換（ＨＣＶポリ蛋白質の残基２０６４に対応し、Ａ９２Ｖ又はＡ２０６４Ｖと称する）、又はＮＳ５Ａのチロシン９３のヒスチジンによる置換（ＨＣＶポリ蛋白質の残基２０６５に対応し、Ｙ９３Ｈ又はＹ２０６５Ｈと称する）、又はＮＳ５Ａのアルギニン１５７のトリプトファンによる置換（ＨＣＶポリ蛋白質の残基２１２９に対応し、Ｒ２１２９Ｗ又はＲ１５７Ｗと称する）を含有する適応レプリコンは、化合物（Ｉｂ）に対して明らかに耐性であった。これらのレプリコンのＩＣ_５０値は、対応する耐性クローンで観察された値と類似しており、これら３種の置換体はそれぞれ、それ自体化合物（Ｉｂ）に対する耐性をもたらすことができることを示している。その他の変異は全て、化合物（Ｉｂ）に対する阻害に対する感受性には見かけ上影響を及ぼさず、この化合物に対する耐性にはおそらく関係ないことを示唆している。予測通り、Ａ２０６４Ｖ、Ｙ２０６５Ｈ又はＲ２１２９Ｗを有する適応レプリコンはまた、式Ｉのその他の化合物に耐性であるが、ＮＳ５Ｂポリメラーゼ及びＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤を含むその他の複製阻害剤には耐性ではなかった。Ａ２０６４Ｖ又はＹ２０６５Ｈを有する非適応レプリコンは、あまり複製せず、式Ｉの化合物によって活性化されず、これらの化合物による阻害及び活性化は同一経路を介して生じることが示唆される。

ＮＳ５Ａ蛋白質の生合成に対する化合物（Ｉｂ）の効果。ＮＳ５Ａ蛋白質における耐性変異の局在は、この化合物の刺激活性及び阻害活性がいずれも、ＮＳ５Ａ蛋白質の機能を直接的、又は間接的に妨害することによって生じることを示している。したがって、ＮＳ５Ａ蛋白質の生合成に対する化合物（Ｉｂ）の効果は、パルスチェイス標識／免疫沈殿実験によって調べられた（図２）。既に報告したように、阻害剤がないと、成熟ＮＳ５Ａ蛋白質は時間に依存した様式でポリ蛋白質から放出され、まず５６ｋＤａ形態（ｐ５６）として出現し、顕著な５６ｋＤａ過剰リン酸化形態（ｐ５８）を含む分子量のより大きな形態に順次変換した。化合物（Ｉｂ）の存在下で、ｐ５６からｐ５８への変換の速度及び程度は減少し、この化合物はおそらく過剰リン酸化の程度が減少することによってＮＳ５Ａの生合成に影響を及ぼすことを示唆している。

材料及び方法
細胞及び細胞培養。Ｈｕｈ−７細胞は、Ｒａｌｆ Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ博士（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ大学、ドイツ）から恵与された。ＳＬ１及びＭＨ１細胞は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ Ｓｅｅｇｅｒ博士（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ；ＵＳＡ）から恵与された。ＨＢＩ１０Ａ及びその他のレプリコンを含有する細胞系は、ＷＯ２００２０５９３２１ Ａ２；Ｍｏｔｔｏｌａ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９３、３１〜４３、２００２及びＴｒｏｚｚｉ他、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７、３６６９〜３６７９、２００３で記載されたようなＨｕｈ−７細胞から得られた。ＨＢＩ１０、ＳＬ１及びＭＨ１細胞用の培地にはＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）０．８ｍｇ／ｍｌを補給した以外は、細胞は全て、１０％ＦＣＳを補給したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変基礎培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）で増殖させた。通常の実験では、細胞は１×トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）を使用して、１週間から５週間毎に２回継代した。インターフェロン（１０ＡＩＦＮ）処理によって内在性レプリコンを回復させた細胞の調製、インビトロ転写及びＲＮＡ形質移入並びに試験化合物に耐性のクローンの選択は、Ｔｒｏｚｚｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３、７７：３６６９〜７９）に記載されたように実施した。

プラスミド構築。ｃＤＮＡ断片は、適切な制限部位を備えた合成オリゴヌクレオチドを使用して、標準的ＤＮＡプロトコール又は関心のある領域のＰＣＲ増幅によって所望する発現ベクターにクローニングした。プラスミドＤＮＡはＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉブロスで一晩培養して、Ｑｉａｇｅｎカラムを指示にしたがって使用して調製した。全プラスミド配列は、自動配列決定によって確認した。

プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｗｔ、ｐＨＣＶＮｅｏ１７．Ｂ（本明細書ではｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１０と称する）、ｐＢＫ−ＳＩ、ｐＢＫ−ＲＭＳＩ、ｐＦＬ．ｗｔ及びｐＦＬ．Ｂ（本明細書ではｐＦＬ．ｍ１０と称する）は既に、Ｔｒｏｚｚｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３、７７：３６６９〜７９、Ｇｒｏｂｌｅｒ他 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３ ２７８（１９）：１６７４１〜４６及びＰａｃｉｎｉ他、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４、３３１：４６〜５９に記載されている。ｐＨＣＶＮｅｏ ｐｒｅｆｉｘと称したその他のレプリコンは全てｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｗｔと同一であるが、表８に示した変異を含有する。ｐＨＣＶｂｌａ ｐｒｅｆｉｘと称したプラスミドは、ＷＯ２００３０８９６７２ Ａ１及びＭｕｒｒａｙ他、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７、２９２８〜２９３５、２００３に記載されたように、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子をβ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子で置換することによって、対応するｐＨＣＶＮｅｏプラスミドから得られた。

インビトロＲＮＡ転写及びＲＮＡ形質移入は、ＷＯ２００２０５９３２１ Ａ２；Ｍｏｔｔｏｌａ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９３、３１〜４３、２００２及びＴｒｏｚｚｉ他、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７、３６６９〜３６７９、２００３に記載されたように実施した。簡単に説明すると、プラスミドをＳｃａＩ及びＸｂａＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化して、Ｔ７ Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）でインビトロで転写した。転写混合物は、鋳型ＤＮＡを完全に除去するためにＤＮアーゼＩ（０．１Ｕ／ｍｌ）で３７℃で３０分間処理して、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ他、１９８７．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２、１５６〜１５９）の方法に従って抽出して、ＲＮアーゼを含まないリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。ＲＮＡ形質移入は、エレクトロポレーションによって実施した。

耐性レプリコンの配列決定。全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙ ミニキットを使用して製造者の指示に従って選択クローンから抽出した。レプリコンＲＮＡ（全細胞ＲＮＡの２〜１０μｇ）は、オリゴヌクレオチドＨＣＶＧ３４（５’−ＡＣＡＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴ−３’）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）を使用して、製造者の指示に従ってレトロ転写し、その後リボヌクレアーゼＨ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）２Ｕ／ｍｌで消化した。ＥＭＣＶ ＩＲＥＳからＨＣＶ３’末端に及ぶｃＤＮＡ領域は、オリゴヌクレオチドＨＣＶＧ３９（５’−ＧＡＣＡＳＧＣＴＧＴＧＡＴＡＷＡＴＧＴＣＴＣＣＣＣＣ−３’）及びＣＩＴＥ３（５’−ＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣＧＴＡＴＴＣ−３’）及びＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を使用してＰＣＲによって増幅した。増幅したｃＤＮＡは、直接配列決定するか、又は適切な制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｗｔ、ｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ５又は同エンドヌクレアーゼで消化したｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１０にクローニングした。所望するＤＮＡ挿入部分の存在は、制限消化によって確認し、各プラスミドのＮＳ領域のヌクレオチド配列は自動配列決定によって決定した。ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列は、ベクターＮＴＩソフトウェアを使用して整列させた。

代謝標識及び免疫沈降法
Ｈｕｈ−７及びＨＢＩ１０Ａ細胞を４ｘ１０^５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。^３５Ｓアミノ酸で代謝標識するパルスチェイスのため、透析ＦＣＳ１％を添加したメチオニン／システインを含まないＤＭＥＭ中で細胞を１時間インキュベートして、２００μＣｉ／ｍｌ（^３５Ｓ）蛋白質標識混合物（Ｄｕ−Ｐｏｎｔ ＮＥＮ）を含有する同培地で３０分間標識し、次に溶解するか、又は１０倍過剰なメチオニン／システインを添加した完全培地中で様々な時間（１〜３〜６時間）追跡した。完全プロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含有するＴＮＥ溶解緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、１％ＳＤＳ）０．２ｍｌで細胞を溶解した。核及び残渣を除去するために、上清及び細胞溶解物を４℃で１４０００ｒｐｍで１５分間遠心した。免疫沈降法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析は、Ｔｒｏｚｚｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３、７７：３６６９〜７９に記載されたように実施した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓシステムによる定量分析のためにゲルをＸ線フィルム又はｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇスクリーンに曝露した。

ノーザンブロットハイブリダイゼーション。ウイルス複製に対する試験化合物の効果及び変異レプリコンの複製向上は、Ｔｒｏｚｚｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３、７７：３６６９〜７９に記載されたようにノーザンブロットハイブリダイゼーションによってＨＣＶレプリコンＲＮＡの発現をモニターすることによって評価した。

細胞ＥＬＩＳＡ測定法。ウイルス複製に対する試験化合物の効果及び変異レプリコンの複製向上は、Ｔｒｏｚｚｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３、７７：３６６９〜７９に記載されたように抗ＮＳ３ ｍａｂ １０Ｅ５／２４による細胞ＥＬＩＳＡによってＮＳ３蛋白質の発現をモニターすることによって評価した。化合物を溶解し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）最終濃度が１％になるような方法でＤＭＳＯで連続的に希釈した。一時的形質移入測定法は、１０ＡＩＦＮ細胞で実施し、Ｔｒｏｚｚｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３、７７：３６６９〜７９に記載されたように準備してエレクトロポレーションによって形質移入した。形質移入後１から４時間の間で細胞に化合物を補給した。

ベータラクタマーゼ遺伝子レポーター測定法（ＢＬＡ測定法）。ウイルス複製に対する試験化合物の効果及び変異レプリコンの複製向上は、Ｍｕｒｒａｙ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７７、２９２８〜３５、２００３に従ってベータラクタマーゼ酵素の発現をモニターすることによって評価した。ベータラクタマーゼ活性は、４０５ｎｍの光で刺激された細胞によって放射される緑（５３０ｎｍ）又は青（４６０ｎｍ）の蛍光量を定量する蛍光プレートリーダーで測定した。

一般的方法
溶媒は全て商用の供給源（Ｆｌｕｋａ、ｐｕｒｉｓｓ．）から購入し、さらに精製することなく使用した。通常の脱保護及び結合段階を除いて、反応は乾燥オーブン（１１０℃）ガラス器内において窒素雰囲気下で実施した。有機抽出物は、硫酸ナトリウム上で乾燥し、（乾燥剤を濾過した後）減圧下で操作したロータリーエバポレーターで濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーは、公表された方法（Ｗ．Ｃ．Ｓｔｉｌｌ他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７８、４３、２９２３）に従ってシリカゲルで実施するか、又は予め充填したカラムを使用した市販のフラッシュクロマトグラフィーシステム（Ｂｉｏｔａｇｅ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ Ｆｌａｓｈｍａｓｔｅｒ ＩＩ）で実施した。

試薬は通常、商用の供給業者から直接購入し（指示通り使用し）たが、社内製品の化合物は数を限って使用した。後者の場合、科学文献で報告されているか、又は当業者に公知の通常の合成段階を使用して、これらの試薬は容易に入手できる。

^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、３００と６００ＭＨの間の（報告された）周波数で操作したＢｒｕｋｅｒ ＡＭシリーズ分光計で記録した。非交換性プロトン（及び視認できる場合は交換性プロトン）に対応するシグナルの化学シフト（δ）は、テトラメチルシランに対する百万分率（ｐｐｍ）で記録し、参照として残存する溶媒ピークを使用して測定した。シグナルは、多重度（ｓ、一重線、ｄ、二重線、ｔ、三重線、ｑ、四重線、ｍ、多重線、ｂｒ、幅が広く重なっている、及びこれらの組み合わせ）、ヘルツ（Ｈｚ）で表した結合定数、プロトンの数の順に表にする。質量スペクトル（ＭＳ）データは、負（ＥＳ⁻）又は正（ＥＳ^＋）のイオン化様式で操作したＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＰＩ １００、又はＷａｔｅｒｓ ＭｉｃｒｏＭａｓｓ ＺＱによって得られ、結果は親イオンについてのみ質量電荷比（ｍ／ｚ）として記録する。調製規模のＨＰＬＣ分離は、Ｗａｔｅｒｓ ４８６吸収検出器を装備しているか、又はＧｉｌｓｏｎ調製システムのＷａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ４０００分離装置で実施した。いずれの場合も、化合物はＴＦＡ０．１％を含有した、水及びアセトニトリルの直線勾配で、１５ｍＬ／分と２５ｍＬ／分との間の流速で溶出した。

以下の略語は実施例、スキーム及び表で使用した。

Ａｃ_２Ｏ：無水酢酸、ＢＩＮＡＰ：（＋／−）−１，１’−ビ−２−ナフトール、（ＢＯＣ）_２Ｏ：ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート、ＢｕＯＨ：ｎ−ブタノール、ＣｂｚＣｌ：ベンジルクロロホルマート、ＣＤＣｌ_３：クロロホルム−Ｄ、ＤＣＭ：ジクロロメタン、ＤＩＥＡ：ジイソプロピルアミン、ＤＭＥ：ジメトキシエタン、ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド、ｅｑ：当量、Ｅｔ_３Ｎ：トリエチルアミン、ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル、Ｅｔ_２Ｏ：ジエチルエーテル、ＥｔＯＨ：エタノール、ｈ：時間、ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホファート（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｐｈａｔｅ）、Ｍｅ：メチル、ＭｅＣＮ：アセトニトリル、ＭｅＯＨ：メタノール、ｍｉｎ：分、ＮＢＳ：Ｎ−ブロモスクシニミド、ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン、Ｐｄ_２（ｄｂａ）３：トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）、ＰＥ−石油エーテル、Ｐｈ：フェニル、ＰＳ：ポリスチレン、ＰｙＢｏｐ：（１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）（トリピロリジン−１−イル）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート、ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー、ＲＴ：室温、ＴＢＤＭＳＣＩ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸、ＴＨＦ：テトラヒドロフラン、ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー、ＴＭＳ：トリメチルシリル、Ｔｏｌ：トルエン。

ｔｅｒｔ−ブチル４−［４−（アリール／アルキルアミノカルボニル）フェニル］ピペラジン−１−カルボキシラートの調製の一般的方法
段階１：ｔｅｒｔ−ブチル４−［４−（クロロカルボニル）フェニル］ピペラジン−１−カルボキシラート
乾燥ＤＣＭ（１．５Ｍ）に溶かしたＳＯＣｌ_２−ベンゾトリアゾールの保存溶液は、乾燥ＤＣＭ（１．５Ｍ）で塩化チオニル（１当量）及びベンゾトリアゾール（１当量）の大量の粘稠な透明溶液を形成することによって調製した−Ｓｙｎｌｅｔｔ １９９９、１７６３参照。この保存溶液１．２５当量を、乾燥ＤＣＭ（０．０５Ｍ）に溶かした（国際特許出願公開ＷＯ９８／００１３４に記載されたように調製した）４−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）安息香酸（１当量）の溶液に添加した。この添加によって、塩化アシル形成の指標となる沈殿物が形成した。この反応をＲＴで１０分間行い、その後無水硫酸ナトリウムのパッドで濾過した。

段階２：ｔｅｒｔ−ブチル４−［４−（アリール／アルキルアミノカルボニル）フェニル］ピペラジン−１−カルボキシラート形成
乾燥ＤＣＭ（０．３Ｍ）中での結合で使用するアリール又はアルキルアミンの溶液（１当量）及びＮ−メチルモルホリン（２．５当量）に、ＤＣＭ（０．０５Ｍ）に溶かした（前記の段階１からの）塩化アシル（１当量）の溶液を添加した。この反応物を撹拌しながら４０℃で一晩加熱した。得られた混合物をＲＴまで冷却して、ＥｔＯＡｃで希釈して、ＨＣｌ水溶液（１Ｎ）、飽和Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液及び食塩水で洗浄した。次に有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させて、濾過して真空中で濾過した。精製は、自動化ＲＰ−ＬＣＭＳによって行った。条件：Ｘ−Ｔｅｒｒａ（Ｗａｔｅｒｓ）Ｃ１８カラム ５μｍ、１９×１００ｍｍ；流速：２０ｍｌ／ｍｉｎ；勾配：Ａ Ｈ_２Ｏ＋０．１％ ＴＦＡ；Ｂ：ＭｅＣＮ＋０．１％ ＴＦＡ。純粋な生成物を含有する画分を集め、凍結乾燥して、表題化合物を得た（２０％〜６８％）。

ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６、３００Ｋ）δ１．４２（ｓ、９Ｈ）、３．２９〜３．３２（ｍ、４Ｈ）、３．４５〜３．４８（ｍ、４Ｈ）、７．０３（ｄ、Ｊ８．８、２Ｈ）、７．７８（ｄ、Ｊ８．８、２Ｈ）、７．８９（ｄ、Ｊ８．８、２Ｈ）、７．９８（ｄ、Ｊ８．８、２Ｈ）、１０．３２（ｓ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ４０７（Ｍ＋Ｈ）^＋

ｔｅｒｔ−ブチル４−｛４−［（１，３−ベンゾトリアゾール−２−イルアミノ）カルボニル］フェニル｝ピペラジン−１−カルボキシラート
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６、３００Ｋ）δ１．４３（ｓ、９Ｈ）、３．３５〜３．３７（ｍ、４Ｈ）、３．４５〜３．４７（ｍ、４Ｈ）、７．０３（ｄ、Ｊ８．８、２Ｈ）、７．３１（ｍ、１Ｈ）、７．４５（ｍ、１Ｈ）、７．７５（ｄ、Ｊ８．０、１Ｈ）、７．９９（ｄ、Ｊ８．０、１Ｈ）、８．０６（ｄ、Ｊ８．８、２Ｈ）、１２．５３（ｓ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ４３９（Ｍ＋Ｈ）^＋

イソブチル４−（４−｛［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート
段階１：ｔｅｒｔ−ブチル４−［４−（１−｛［４−（アセチルオキシ）フェニル］アミノ｝ビニル）フェニル］ピペラジン−１−カルボキシラート
Ｅｔ_３Ｎ１．１当量及びＡｃ_２Ｏ２当量を乾燥ＤＣＭ（０．１Ｍ）（国際特許出願公開ＷＯ９８／００１３４に記載されたように調製した）ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラートの溶液に添加して、この溶液を窒素雰囲気下でＲＴで１６時間撹拌した。この反応混合物をＤＣＭで希釈して、有機層をＨＣｌ水溶液（１Ｎ）（２回）、飽和Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液及び食塩水で洗浄した。この有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させて、濾過して、溶媒を真空中で留去して、表題化合物を白色固形物として得た（９０％）。ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ４４０（Ｍ＋Ｈ）^＋

段階２：４−［４−（｛［４−（アセチルオキシ）フェニル］アミノ｝カルボニル）フェニル］ピペラジン−１−イウムトリフルオロアセタート
ＤＣＭ／ＴＦＡ（２／３）の溶液に溶かしたｔｅｒｔ−ブチル４−［４−（１−｛［４−（アセチルオキシ）フェニル］アミノ｝ビニル）フェニル］ピペラジン−１−カルボキシラート（０．１Ｍ）をＲＴで３０分間撹拌した。有機溶媒を真空中で留去して、粗残渣をＥｔ_２Ｏでこすり取った。得られた白色固形沈殿物を濾過して、表題化合物（９５％）を得た。ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ３３９（Ｍ＋Ｈ）^＋

段階３：イソブチル４−（４−｛［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート
イソブチル−クロロホルマート２当量及びＥｔ_３Ｎ３．５当量を乾燥ＴＨＦに溶かした４−［４−（｛［４−（アセチルオキシ）フェニル］アミノ｝カルボニル）フェニル］ピペラジン−１−イウムトリフルオロアセタートの溶液（０．０５Ｍ）に添加し、この溶液をＮ_２下でＲＴで３時間撹拌させた。ＰＳ−トリスアミン樹脂（過剰）を添加し、この反応混合物を１６時間撹拌した。樹脂及び白色の沈殿を濾過した。過剰なＮａＯＨ水溶液（１Ｍ）をこの有機溶液に添加し、この反応混合物を２時間撹拌した。有機溶媒を真空中で除去して、白色固形物が沈殿するまでＨＣｌ水溶液（１Ｍ）を添加し、濾過して、洗浄して真空中で乾燥して、表題化合物を得た（９０％）。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６、３００Ｋ）δ０．８９（ｄ、Ｊ６．６、６Ｈ）、１．８０〜１．９３（ｍ、１Ｈ）、３．２０〜３．３９（ｍ、４Ｈ、水のピークによって不明瞭である）、３．４〜３．６（ｍ、４Ｈ）、３．８１（ｄ、Ｊ６．３、２Ｈ）、６．７０（ｄ、Ｊ９．０、２Ｈ）、７．００（ｄ、Ｊ９．０、２Ｈ）、７．４８（ｄ、Ｊ８．７、２Ｈ）、７．８４（ｄ、Ｊ８．７、２Ｈ）、９．１５（ｓ、１Ｈ）、９．７０（ｓ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ３９８（Ｍ＋Ｈ）^＋

ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−｛［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペリジン−４−カルボキシラート
段階１： ４−ブロモ安息香酸
ＮａＯＨ水溶液（１Ｍ溶液）１．１当量をＴＨＦに溶かしたメチル４−ブロモ安息香酸の溶液（０．５Ｍ）に添加し、この反応物をＲＴで一晩撹拌した。ＴＨＦを真空中で除去して、ＨＣｌ水溶液（６Ｍ）を添加し、この塩基性溶液に０℃で滴下して、ｐＨをｐＨ２に調節した。得られた水性混合物をＥｔＯＡｃ（３×）で抽出して、一緒にした有機層を食塩水で洗浄して、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過して、溶媒を真空中で留去した。表題化合物は定量的な収率で得られた。ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ２０１（Ｍ＋Ｈ）^＋、ｍ／ｚ２０３（Ｍ＋Ｈ）^＋

段階２：４−ブロモ−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）ベンズアミド
ＤＭＦに溶かした４ブロモ安息香酸の溶液（０．１０Ｍ）に、ＮＭＭ３当量、Ｐｙ−ＢＯＰ１．５当量及び４−アミノフェノール１．１当量を添加し、この混合物をＲＴで２０分間撹拌した。ＤＭＦを真空中で濃縮して、残渣をＥｔＯＡｃ及びＨＣｌ水溶液（１Ｎ）で希釈した。得られた沈殿物を濾過して、真空中で乾燥して、表題化合物（７３％）を得た。ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ２９２（Ｍ＋Ｈ）^＋、ｍ／ｚ２９４（Ｍ＋Ｈ）^＋

段階３：４−ブロモ−Ｎ−（４−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝フェニル）ベンズアミド
ＤＭＦに溶かした４−ブロモ−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）ベンズアミドの溶液（１．３Ｍ）の溶液に、イミダゾール２．５当量及びＴＢＤＭＳＣｌ１．２当量を添加し、この溶液をＲＴで３０分間撹拌した。得られた混合物をＥｔＯＡｃで希釈した。この有機層をＨＣｌ水溶液（１Ｎ）、飽和Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液及び食塩水で洗浄した。有機層をＮａＳＯ_４で乾燥して、濾過して、真空中で濃縮して、表題化合物（９５％）を得た。ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ４０６（Ｍ＋Ｈ）^＋、ｍ／ｚ４０８（Ｍ＋Ｈ）^＋

段階４：１−［（ベンジルオキシ）カルボニル］ピペリジン−４−カルボン酸
Ｈ_２Ｏ／ジオキサン１：１混合物に溶かしたピペリジン−４−カルボン酸の溶液（０．４Ｍ）に、Ｋ_２ＣＯ_３５当量を添加してからベンジルクロロホルマート１．１当量を０℃で滴下導入した。この反応物をＲＴで一晩撹拌した。この反応物をまずＥｔ_２Ｏで洗浄した。水層をＨＣｌ水溶液（６Ｎ）でｐＨ２まで酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×）で抽出した。一緒にした有機物を食塩水で洗浄して、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥して、濾過して、真空中で濃縮して、生成物（９１％）を得た。ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ２６４（Ｍ＋Ｈ）^＋

段階５：１−ベンジル４−ｔｅｒｔ−ブチルピペリジン−１，４−ジカルボキシラート
ＤＣＭに溶かした１−［（ベンジルオキシ）カルボニル］ピペリジン−４−カルボン酸の溶液（０．２Ｍ）に、ｔｅｒｔ−ブチルＮ，Ｎ’−ジイソプロピルイミドカルバマート３当量を添加し、この混合物をＲＴで撹拌した。３０分後、ｔｅｒｔ−ブチルＮ，Ｎ’−ジイソプロピルイミドカルバマートをさらに１．５当量添加し、この溶液をさらに１時間撹拌した。この溶液をセライトのパッドで、次にシリカゲルのパッドで濾過して、生成物を得た（８３％）；ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ３２０（Ｍ＋Ｈ）^＋

段階６：ｔｅｒｔ−ブチルピペリジン−４−カルボキシラート
ＥｔＯＡｃに溶かした１−ベンジル４−ｔｅｒｔ−ブチルピペリジン−１，４−ジカルボキシラートの溶液（０．１Ｍ）に、触媒量のＰｄ／Ｃ（５％）を添加し、反応容器の雰囲気はＨ_２を充填した（１気圧）。反応混合物をＲＴで８時間激しく撹拌した。この溶液を濾過して、濾液を真空中で濃縮して、表題化合物（７６％）を得た。ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ１８６（Ｍ＋Ｈ）^＋

段階７：ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−｛［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペリジン−４−カルボキシラート
乾燥機で乾燥させたフラスコにＣｓ_２ＣＯ_３１．４当量を充填し、次にＰｄ_２（ｄｂａ）_３０．０１当量及びＢＩＮＡＰ０．０１５当量を添加して、次いで４−ブロモ−Ｎ−（４−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝フェニル）ベンズアミド１当量及びｔｅｒｔ−ブチルピペリジン−４−カルボキシラート１．２当量を添加した。この混合物に、トルエンを添加して４−ブロモ−Ｎ−（４−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝フェニル）ベンズアミドの０．１６Ｍ溶液を得た。フラスコ中の雰囲気を排出し、アルゴンを充填し直し、次いで溶液を還流しながら一晩加熱した。この反応混合物を真空中で濃縮して、粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＰＥ＝３：７）によって直接精製し、表題化合物を得た（３３％）。

^１Ｈ ΝＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６、３００Ｋ）δ１．４３（ｓ、９Ｈ）、１．６０〜１．６７（ｍ、２Ｈ）、１．８５〜１．９３（ｍ、２Ｈ）、２．４１〜２．４９（ｍ、１Ｈ）、２．８８〜３．１５（ｍ、２Ｈ）、３．７５〜３．８２（ｍ、２Ｈ）、６．７２（ｄ、Ｊ９．０、２Ｈ）、６．９７（ｄ、Ｊ９．０、２Ｈ）、７．５０（ｄ、Ｊ８．６、２Ｈ）、７．８４（ｄ、Ｊ８．６、２Ｈ）、８．９９（ｓ、１Ｈ）、９．５７（ｓ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ３９７（Ｍ＋Ｈ）^＋

ｔｅｒｔ−ブチル４−｛４−［（４−ヒドロキシベンゾイル）アミノ］フェニル｝ピペラジン−１−カルボキシラート
段階１：ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ニトロフェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート
ＤＭＦに溶かしたｔｅｒｔ−ブチル−ピペラジン（１当量）及び４−フルオロ−ニトロベンゼン（１．１当量）の溶液（０．４３Ｍ）に、Ｋ_２ＣＯ_３（１．１当量）を添加した。この混合物を撹拌しながら５０℃で一晩加熱した。このとき、反応物をＲＴまで冷却して、ＥｔＯＡｃ及び１Ｎ ＨＣｌ水溶液の間で分画した。水性画分をＥｔＯＡｃで抽出して、一緒にした有機物を食塩水で洗浄し、その後Ｎａ_２Ｓｏ_４で乾燥して、濾過して、真空中で留去して、表題化合物を黄色固形物（９７％）として得た。ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ３０８（Ｍ＋Ｈ）^＋。

段階２：ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノフェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート
Ｃ上のＰｄ１０％（０．３％ｐ／ｐ）を、ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃの混合物（１：１比）に溶かしたｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ニトロフェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート（１当量）の溶液（０．０３Ｍ）に添加した。反応容器中の雰囲気にＨ_２を充填し（１気圧）、この反応物を２時間激しく撹拌した。このとき、反応混合物をセライトのパッドで濾過して、真空中で濃縮して表題化合物を得た（定量的）。ＭＳ（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ２７８（Ｍ＋Ｈ）^＋

段階３：ｔｅｒｔ−ブチル４−｛４−［（４−ヒドロキシベンゾイル）アミノ］フェニル｝ピペラジン−１−カルボキシラート
乾燥ＤＭＦに溶かしたｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノフェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート）（１当量）、４−ヒドロキシ安息香酸（１．１当量）、Ｎ−メチルモルホリン（３当量）の溶液（０．１６Ｍ）に、ＰｙＢｏｐ（１．５当量）を添加した。この反応混合物を撹拌しながら６０℃で６０時間加熱した。このとき、反応物をＲＴまで冷却して、ＥｔＯＡｃ及び１Ｎ ＨＣｌ水溶液の間で分画した。水性画分をＥｔＯＡｃで抽出して、一緒にした有機物を飽和Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液、食塩水で洗浄し、その後Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥して、濾過して、真空中で留去した。シリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ（４：６））のフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を得た（２４％）。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６、３００Ｋ）δ１．４（ｓ、９Ｈ）、３．０３〜３．０５（ｍ、４Ｈ）、３．４０〜３．４５（ｍ、４Ｈ）、６．８３（ｄ、Ｊ８．７、２Ｈ）、６．９２（ｄ、Ｊ８．７、２Ｈ）、７．５８（ｄ、Ｊ８．７、２Ｈ）、７．８１（ｄ、Ｊ８．７、２Ｈ）、９．７８（ｓ、１Ｈ）、１０．０（ｓ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ⁻）ｍ／ｚ３９６（Ｍ−Ｈ）⁻。

以下の表は他の実施例を示す。

ｗｔ及び適応レプリコンの複製に対する化合物（Ｉｂ）の効果を示した図である。１０ＡＩＦＮ細胞に、野生型ｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｗｔレプリコン（灰色）、Ｅ１２０２Ｇ及びＫ＠２０３９変異を有する完全適応ｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１０レプリコン（白）、Ｅ１２０２Ｇ変異のみを有する部分適応ｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１７レプリコン（黒）又はＥ１２０２Ｇ、Ｋ＠２０３９及びＡ２０６４Ｖ変異を有する化合物（Ｉｂ）耐性ｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ２９レプリコンを形質移入した。形質移入した細胞を化合物（Ｉｂ）の非存在下で、又は化合物（Ｉｂ）の指示した濃度の存在下で培養した。ＨＣＶレプリコンは、細胞ＥＬＩＳＡ（Ａ）又はノザンブロット（Ｂ）によって、方法の項で指示したようにモニターした。 ＮＳ５Ａ蛋白質の生合成に対する化合物（Ｉｂ）の効果を示した図である。Ｈｕｈ−７（列１から４）及びＨＢＩ１０Ａ（列５から１２）を、^３５Ｓアミノ酸によって３７℃で２０秒パルス標識し、その後それぞれの列の上に指示した時間（時間）追跡した。飢餓を指示した場合、標識及び追跡は化合物（Ｉｂ）２μＭの存在下で実施した。標識した蛋白質を５５ＩＶ抗ＮＳ５Ａ抗血清で免疫沈降させて、ＳＤＳ−１０％ＰＡＧＥによって分析した。分子量標準物、ＮＳ５Ａ型及び非開裂前駆体の位置（キロダルトン）を示す。

Claims (15)

1. ＨＣＶ感染を治療するための医薬品の製造における、式（Ｉ）の化合物又はそれらの薬剤として許容される塩の使用。
   

   

   （式中、
   Ｘ及びＹは独立してＣＨ又はＮであり、但し、Ｘ及びＹは両方ともＣＨではなく、
   Ｒ^１はＣ（Ｏ）ＯＲ^４、Ｃ（Ｏ）ＮＲ^５Ｒ^６、Ｃ（Ｏ）Ｒ^７又はＳ（Ｏ）_２Ｒ^８であり、
   Ｒ ^２ はＣ（Ｏ）ＮＲ ^９ Ｒ ^１０ であり、
   Ｒ^３は存在しないか、又はハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ_１〜６アルキル及びＣ_１〜６アルコキシから選択され、
   Ｒ^５及びＲ^９はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１〜６アルキル又はＣ_３〜８シクロアルキルであり、
   Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立してＣ_１〜６アルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニル、（ＣＨ_２）_０〜３Ｃ_３〜８シクロアルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、（ＣＨ_２）_０〜３アリール、（ＣＨ）_２アリール、（ＣＨ_２）_０〜３Ｏアリール、（ＣＨ_２）_０〜３ヘテロアリール及び（ＣＨ_２）_０〜３Ｏヘテロアリールから選択され、
   場合によって、ヒドロキシ、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ、（ＣＨ_２）_０〜３ＮＲ^１１Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１２、（ＣＨ_２）_０〜３アリール又は（ＣＨ_２）_０〜３ヘテロアリールによって置換されており、
   Ｒ^１１及びＲ^１２はそれぞれ独立して水素又はＣ_１〜６アルキルであり、
   Ｒ^１０は（ＣＨ_２）_０〜３アリール又は（ＣＨ_２）_０〜３ヘテロアリールであり、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜４アルケニル、ＯＲ^１３、Ｃ（Ｏ）Ｒ^１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１３、アリール、（ＣＨ）_２アリール、（ＣＨ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１３又はＮＲ^１３Ｒ^１４によって場合によって置換されており、
   Ｒ^１３及びＲ^１４はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１〜４アルキル又は（ＣＨ_２）_０〜３アリールであり、
   この任意選択の置換基は、さらにヒドロキシ又はハロゲンによって場合によって置換されており、
   Ｒ^１０はさらに５又は６員環と融合していてよく、この環は部分的に、又は完全に不飽和であってよく、かつ、この環は１個又は２個のＮ原子を含有していてよく、前記環は場合によってヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ、Ｃ（Ｏ）Ｒ^１５及びＣ（Ｏ）ＯＲ^１５によって置換されており、
   Ｒ^１５はＣ_１〜４アルキル又はアリールであり、
   但し、式（Ｉ）の化合物は、
   ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート、
   ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（４−ブロモフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート、
   ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（３−ブロモフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート、又は
   ｔｅｒｔ−ブチル４−{４−［（｛３−［（１Ｅ）−３−メトキシ−３−オキソプロプ−１−エン−１−イル］フェニル｝アミノ）カルボニル］フェニル｝ピペラジン−１−カルボキシラートではない。）
2. 請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することによって得られる細胞培養物。
3. 請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理されたＨＣＶ細胞培養物への化合物の投与を含む、前記化合物のＨＣＶ複製に対する効果についてスクリーニングする方法。
4. ＨＣＶ ＲＮＡに適応変異がなくても検出可能なレベルのＨＣＶ ＲＮＡ及びＨＣＶ蛋白質を有する細胞培養物の生成における、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩の使用。
5. ａ）組織培養中の細胞を、適応変異を有さないＨＣＶ ＲＮＡ又はＨＣＶウイルスと接触させることと、
   ｂ）前記細胞を請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することと、
   ｃ）前記処理細胞をＨＣＶ ＲＮＡ複製について評価することと
   によって、検出可能なレベルのＨＣＶ ＲＮＡに適応変異がなくてもＨＣＶ ＲＮＡを有する細胞培養物を生成する方法。
6. ａ）組織培養中の細胞を、適応変異を有さないＨＣＶ ＲＮＡ又はＨＣＶウイルスと接触させることと、
   ｂ）前記細胞を請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することと、
   ｃ）前記処理細胞をＨＣＶ蛋白質発現について評価することと
   によって、検出可能なレベルのＨＣＶ ＲＮＡに適応変異がなくてもＨＣＶ蛋白質を有する細胞培養物を生成する方法。
7. ａ）組織培養中の細胞を、適応変異を有さないＨＣＶ ＲＮＡ又はＨＣＶウイルスと接触させることと、
   ｂ）前記細胞を請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することと、
   ｃ）細胞培地中に分泌されたウイルス粒子の量を評価することと
   によって、適応変異がなくても検出可能なレベルのウイルス生成を有する細胞培養物を生成する方法。
8. 細胞中に選択された適応変異が存在し、検出可能なレベルのＨＣＶ ＲＮＡ及びＨＣＶ蛋白質を有する細胞培養物の生成における、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩の使用。
9. ａ）組織培養中の細胞を、選択された適応変異を有するＨＣＶ ＲＮＡ又はＨＣＶウイルスと接触させることと、
   ｂ）前記細胞を請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することと、
   ｃ）前記処理細胞をＨＣＶ ＲＮＡ複製について評価することと
   によって、細胞中に選択された適応変異が存在し、検出可能なレベルのＨＣＶ ＲＮＡを有する細胞培養物を生成する方法。
10. ａ）組織培養中の細胞を、適応変異を有するＨＣＶ ＲＮＡ又はＨＣＶウイルスと接触させることと、
    ｂ）前記細胞を請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することと、
    ｃ）前記処理細胞をＨＣＶ蛋白質発現について評価することと
    によって、細胞中に選択された適応変異が存在し、検出可能なレベルのＨＣＶ蛋白質を有する細胞培養物を生成する方法。
11. ａ）組織培養中の細胞を、適応変異を有するＨＣＶ ＲＮＡ又はＨＣＶウイルスと接触させることと、
    ｂ）前記細胞を請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物又はそれらの適切な塩で処理することと、
    ｃ）細胞培地中に分泌されたウイルス粒子の量を評価することと
    によって、適応変異が存在して、検出可能なレベルのウイルス生成を有する細胞培養物を生成する方法。
12. 式（Ｉｉ）の化合物
    

    

    （式中、
    Ｘ及びＹはいずれもＮであり、
    Ｒ^１はＣ（Ｏ）ＯＲ^４、Ｃ（Ｏ）ＮＲ^５Ｒ^６、Ｃ（Ｏ）Ｒ^７又はＳ（Ｏ）_２Ｒ^８であり、
    Ｒ ^２ はＣ（Ｏ）ＮＲ ^９ Ｒ ^１０ であり、
    Ｒ^３は存在しないか、又はヒドロキシ、Ｃ_１〜６アルキル及びＣ_１〜６アルコキシから選択され、
    Ｒ^５及びＲ^９はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１〜６アルキル又はＣ_３〜８シクロアルキルであり、
    Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立してＣ_１〜６アルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニル、（ＣＨ_２）_０〜３Ｃ_３〜８シクロアルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、（ＣＨ_２）_０〜３アリール、（ＣＨ）_２アリール、（ＣＨ_２）_０〜３Ｏアリール、（ＣＨ_２）_０〜３ヘテロアリール及び（ＣＨ_２）_０〜３Ｏヘテロアリールから選択され、
    場合によって、ヒドロキシ、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ、（ＣＨ_２）_０〜３ＮＲ^１１Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１２、（ＣＨ_２）_０〜３アリール又は（ＣＨ_２）_０〜３ヘテロアリールによって置換されており、
    Ｒ^１１及びＲ^１２はそれぞれ独立して水素又はＣ_１〜６アルキルであり、
    Ｒ^１０は（ＣＨ_２）_０〜３アリール又は（ＣＨ_２）_０〜３ヘテロアリールであり、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜４アルケニル、ＯＲ^１３、Ｃ（Ｏ）Ｒ^１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１３、アリール、（ＣＨ）_２アリール、（ＣＨ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１３又はＮＲ^１３Ｒ^１４によって場合によって置換されており、
    Ｒ^１３及びＲ^１４はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１〜４アルキル又は（ＣＨ_２）_０〜３アリールであり、
    この任意選択の置換基は、さらにヒドロキシ又はハロゲンによって場合によって置換されており、
    Ｒ^１０はさらに５又は６員環と融合していてよく、この環は部分的に、又は完全に不飽和であってよく、かつ、この環は１個又は２個のＮ原子を含有していてよく、前記環は場合によってヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ、Ｃ（Ｏ）Ｒ^１５及びＣ（Ｏ）ＯＲ^１５によって置換されており、
    Ｒ^１５はＣ_１〜４アルキル又はアリールであり、
    但し、式（Ｉｉ）の化合物は、
    ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ｝カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート、
    ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（４−ブロモフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート、
    ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（３−ブロモフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート、
    ｔｅｒｔ−ブチル４−｛４−［（｛３−［（１Ｅ）−３−メトキシ−３−オキソプロプ−１−エン−１−イル］フェニル｝アミノ）カルボニル］フェニル｝ピペラジン−１−カルボキシラート、
    メチル３−（４−（４−（４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）フェニルカルボニルアミノフェニル）プロパノエート、
    ３−（４−（４−（４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）フェニルカルボニルアミノフェニル）プロパン酸、
    Ｎ−（５−インドリル）−４−（４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）ベンズアミド、
    ３−（３−（４−（４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル））フェニル）カルボニルアミノフェニル）プロパン酸、
    メチル（３−（３−（４−（４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル））フェニル）カルボニルアミノフェニル）プロパノエート、
    Ｎ−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−４−（４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）ベンズアミド、
    ２−（４−（４−（１−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジニル）フェニルカルボニルアミノ）フェノキシ）エタノール、
    ２−（３−メチル−４−（４−（１−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジニル）フェニルカルボニルアミノ）フェノキシ）エタノール、
    ２−（２，６−ジブロモ−３−メチル−４−（４−（Ｎ−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）−ピペラジン−４−イル）フェニルカルボキサミド）フェノキシ）エタノール、又は
    Ｎ−［４−（５−ブチル−２−メトキシフェニル）−１，３−チアゾール−２−イル］−４−（（Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ではない）
    又は薬剤として許容されるそれらの塩。
13. 式（Ｉａ）の化合物
    

    

    （式中、
    Ｒ^４は請求項１で定義した通りであり、Ｒ^１５は存在しないか、又はハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜４アルケニル、ＯＲ^１３、Ｃ（Ｏ）Ｒ^１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１３、アリール、（ＣＨ）_２アリール、（ＣＨ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１３又はＮＲ^１３Ｒ^１４であり、ハロゲン又はヒドロキシによって場合によって置換され、
    Ｒ^１３及びＲ^１４は請求項１で定義した通りであり、
    但し、式（Ｉａ）の化合物は、
    ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ｝カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート、
    ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（４−ブロモフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート、
    ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−｛［（３−ブロモフェニル）アミノ］カルボニル｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキシラート、
    ｔｅｒｔ−ブチル４−｛４−［（｛３−［（１Ｅ）−３−メトキシ−３−オキソプロプ−１−エン−１−イル］フェニル｝アミノ）カルボニル］フェニル｝ピペラジン−１−カルボキシラート、
    メチル３−（４−（４−（４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）フェニルカルボニルアミノフェニル）プロパノエート、
    ３−（４−（４−（４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）フェニルカルボニルアミノフェニル）プロパン酸、
    Ｎ−（５−インドリル）−４−（４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）ベンズアミド、
    ３−（３−（４−（４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル））フェニル）カルボニルアミノフェニル）プロパン酸、
    メチル（３−（３−（４−（４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル））フェニル）カルボニルアミノフェニル）プロパノエート、
    Ｎ−（４−ベンジルオキシフェニル）−２−メチル−４−（４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）ベンズアミド、
    ２−（４−（４−（１−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジニル）フェニルカルボニルアミノ）フェノキシ）エタノール、
    ２−（３−メチル−４−（４−（１−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジニル）フェニルカルボニルアミノ）フェノキシ）エタノール、又は
    ２−（２，６−ジブロモ−３−メチル−４−（４−（Ｎ−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）−ピペラジン−４−イル）フェニルカルボキサミド）フェノキシ）エタノールではない）
    又は薬剤として許容されるそれらの塩。
14. 薬剤として許容される担体と組み合わせて請求項１２又は１３に記載の化合物又は薬剤として許容されるそれらの塩を含む、医薬組成物。
15. 治療に使用するための、請求項１２又は１３に記載の化合物又は薬剤として許容されるそれらの塩。

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