JP5223391B2

JP5223391B2 - Sensitization assay method using fluorescent cysteine derivative and fluorescent cysteine derivative

Info

Publication number: JP5223391B2
Application number: JP2008065277A
Authority: JP
Inventors: 昌彦岡本; 晃樹高橋
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2008-03-14
Filing date: 2008-03-14
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2028-03-14
Also published as: JP2009222466A

Description

本発明は、新規ペプチド蛍光誘導体及びそれを用いる感作性検定方法に関するものである。 The present invention relates to a novel peptide fluorescent derivative and a sensitization assay method using the same.

化学物質が皮膚に接触するとアレルギー反応が惹起されることがあることから、例えば医・農薬や化粧品等の化学物質を含む製品を工業的に開発するにあたっては、その化学物質の感作性を検定することが必要となる。近年、従来から行われている動物実験での感作性検定方法の煩雑さを回避するため、システイン誘導体と被験物質との結合物の有無を液体クロマトグラフィー等で判定する方法が報告されている。（例えば、特許文献１及び２、非特許文献１及び２）。しかしながら、従来の方法では、液体クロマトグラフィー分析においてUV検出器を用いているため、製品の微量成分が感作性に関与している場合はペプチドとの結合物が夾雑ピークやベースラインの盛り上がりのため判別しにくく、感度の向上が求められていた。 Since allergic reactions may occur when chemical substances come into contact with the skin, for example, in the industrial development of products containing chemical substances such as medicine, agricultural chemicals, and cosmetics, the sensitization of the chemical substance is tested. It is necessary to do. In recent years, a method for determining the presence or absence of a conjugate of a cysteine derivative and a test substance by liquid chromatography or the like has been reported in order to avoid the complexity of a conventional sensitization assay method in animal experiments. . (For example, Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Documents 1 and 2). However, the conventional method uses a UV detector in liquid chromatography analysis, so if the trace components of the product are involved in sensitization, the conjugate with the peptide will have a peak of contamination or a rise in the baseline. Therefore, it is difficult to discriminate, and improvement in sensitivity has been demanded.

特開２００３−０１４７６１号公報Japanese Patent Laid-Open No. 2003-014761 特開２００７−１８３２０８号公報JP 2007-183208 A The Journal of Toxicological Sciences 2003, 28(1), 19-24.The Journal of Toxicological Sciences 2003, 28 (1), 19-24. Toxicological Sciences 2004, 81,332-343.Toxicological Sciences 2004, 81,332-343.

このような状況のもと、本発明者らは、微量感作性物質を感度良く判別する方法を開発すべく鋭意検討したところ、蛍光基を有する感作性判定試薬を新たに見出すとともに、本感作性判定試薬と感作性化合物を混合した後、蛍光検出器を有する液体クロマトグラフィーで結合物を夾雑物やベースライン盛り上がりの影響を受けることなく高感度に容易に結合物の有無を判別することができることを見出し、本発明に至った。 Under such circumstances, the present inventors diligently studied to develop a method for discriminating a minute amount of a sensitizing substance with high sensitivity.As a result, a new sensitization determination reagent having a fluorescent group has been found. After mixing the sensitizing reagent and the sensitizing compound, the presence or absence of the bound substance can be easily determined with high sensitivity without being affected by contaminants or the rise of the baseline by liquid chromatography with a fluorescence detector. As a result, the present inventors have found out that it can be achieved.

すなわち本発明は、
１．（ａ）蛍光システイン誘導体と感作性物質とを混合させる工程；及び、
（ｂ）結合物の有無を機器分析により判定する工程
を有する化学物質の感作性検定方法。
２．蛍光システイン誘導体が、システインと、該システインを標識する蛍光色素を含む蛍光システイン誘導体であって、該蛍光色素が発色部構造と上記システインと発色部とを結合するスペーサー構造を有することを特徴とする化合物である上記１に記載の感作性検定方法；
３．機器分析の手段が液体クロマトグラフィーである上記１及び２に記載の感作性検定方法；
４．液体クロマトグラフィーの検出器が蛍光検出器である上記１〜３に記載の感作性検定方法；
５．液体クロマトグラフィーの検出器が質量分析装置である上記１〜３に記載の感作性検定方法；
６．式（１）

（式中、R¹,R²は蛍光色素、ヒドロキシル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいフェノキシ基の群から選ばれ、R¹とR²の少なくとも一方が蛍光色素である。）で表される化合物である蛍光システイン誘導体；
７．上記蛍光色素が式（２）

（式中、R³はニトロ基、無置換アミノスルホニル基、スルホン酸基、アンモニウムスルホン酸基のいずれかを表わすか、もしくはアルキルアミノ基や４級アンモニウム基等の置換基を有していても良いアルキルアミノスルホニル基を表わす。x,y,zは、それぞれ独立に0〜20までの整数を表わす。R⁴は直接結合又は、-O-, -CH₂-, -NHCOO-, -CONH-, -COO-, -SO₂NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -S-, -NR-, -NAr-,-CH=CH-, -C≡C-, -Ar-, -CO-Ar-NR-からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を表わす。Rはアルキル基を表わす。Arはアリール基を表わす。R⁵は−ＮＨ−、−Ｏ−又は−Ｓ−を表わす。）で表される上記６に記載の蛍光システイン誘導体；
８．上記蛍光システイン誘導体が、式（3）

で表される上記６又は７記載の蛍光システイン誘導体；
９．上記蛍光システイン誘導体が、式（4）

で表される上記６又は７記載の蛍光システイン誘導体；
１０．蛍光システイン誘導体が上記６〜９に記載の蛍光システイン誘導体である上記１〜５記載の感作性検定方法；を提供するものである。 That is, the present invention
1. (A) mixing a fluorescent cysteine derivative and a sensitizing substance; and
(B) A method for assaying sensitization of a chemical substance, comprising a step of determining the presence or absence of a bound substance by instrumental analysis.
2. The fluorescent cysteine derivative is a fluorescent cysteine derivative containing a cysteine and a fluorescent dye for labeling the cysteine, wherein the fluorescent dye has a coloring part structure and a spacer structure that binds the cysteine and the coloring part. The sensitization assay method according to 1 above, which is a compound;
3. The sensitization assay method according to 1 or 2 above, wherein the instrumental analysis means is liquid chromatography;
4). The sensitization assay method according to any one of the above 1 to 3, wherein the liquid chromatography detector is a fluorescence detector;
5. The sensitization assay method according to any one of 1 to 3 above, wherein the liquid chromatography detector is a mass spectrometer;
6). Formula (1)

(In the formula, R ¹ and R ² are a fluorescent dye, a hydroxyl group, an amino group which may have a substituent, an alkoxy group which may have a substituent, and a phenoxy which may have a substituent. A fluorescent cysteine derivative which is a compound selected from the group of groups and represented by: at least one of R ¹ and R ² is a fluorescent dye;
7). The fluorescent dye is represented by the formula (2)

(In the formula, R ³ represents any of a nitro group, an unsubstituted aminosulfonyl group, a sulfonic acid group, an ammonium sulfonic acid group, or has a substituent such as an alkylamino group or a quaternary ammonium group. Represents a good alkylaminosulfonyl group, x, y and z each independently represents an integer of 0 to 20. R ⁴ represents a direct bond or —O—, —CH ₂ —, —NHCOO—, —CONH— , -COO-, -SO ₂ NH-, -HN-C (= NH) -NH-, -S-, -NR-, -NAr-,-CH = CH-, -C≡C-, -Ar- , -CO-Ar-NR- represents at least one group selected from the group consisting of: R represents an alkyl group, Ar represents an aryl group, R ⁵ represents -NH-, -O- or -S-. The fluorescent cysteine derivative according to the above 6, which is represented by:
8). The fluorescent cysteine derivative is represented by the formula (3)

The fluorescent cysteine derivative according to 6 or 7 represented by:
9. The fluorescent cysteine derivative is represented by the formula (4)

The fluorescent cysteine derivative according to 6 or 7 represented by:
10. The sensitizing assay method according to 1 to 5, wherein the fluorescent cysteine derivative is the fluorescent cysteine derivative according to 6 to 9 above.

本発明によれば、医・農薬や化粧品の感作性判定において、蛍光検出器により微量成分でも高感度に結合物の同定をすることができる。 According to the present invention, in the determination of sensitization of medical / agricultural chemicals and cosmetics, a bound substance can be identified with high sensitivity even with a trace amount of components by a fluorescence detector.

以下、本発明の検定方法について説明する。
本発明の感作性検定方法において使用しうる蛍光システイン誘導体としては、少なくとも、システインと、該システインを標識する蛍光色素を含む蛍光システイン誘導体であって、該蛍光色素が発色部構造と上記システインと発色部とを結合するスペーサー構造を有する蛍光システイン誘導体を挙げることができる。 Hereinafter, the assay method of the present invention will be described.
The fluorescent cysteine derivative that can be used in the sensitization assay method of the present invention is at least a cysteine and a fluorescent cysteine derivative containing a fluorescent dye that labels the cysteine. An example is a fluorescent cysteine derivative having a spacer structure that binds to the coloring portion.

上記スペーサーは-O-, -CH₂-, -NHCOO-, -CONH-, -COO-, -SO₂NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -S-, -NR-(Rはアルキル基)、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-、-CO-Ar-NR-もしくはアミノ酸及びペプチドの部分構造からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を含む。 The spacers are -O-, -CH _2- , -NHCOO-, -CONH-, -COO-, -SO ₂ NH-, -HN-C (= NH) -NH-, -S-, -NR- ( R represents an alkyl group), —CH═CH—, —C≡C—, —Ar—, —CO—Ar—NR—, or at least one group selected from the group consisting of amino acid and peptide partial structures.

該蛍光システイン誘導体の合成は、通常、両末端がチオール基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボニル基、マレイミド基、もしくは塩素、臭素、ヨウ素などのハロアルキル基、ハロカルボニル基等であるスペーサー原料を用い、順次、該スペーサー原料の一方の末端と蛍光誘導体化試薬のクロロスルホニル基、フルホロスルホニル基、クロロカルボニル基、カルボキシル基、マレイミド基、アミノ基、イソチオシアニル基、塩素、臭素、ヨウ素などのハライドとの反応により発色部と連結し、もう一方の末端をシステイン誘導体のアミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基などとの縮合により連結することにより行うことができる。 The synthesis of the fluorescent cysteine derivative is usually a spacer raw material in which both ends are a thiol group, a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, a carbonyl group, a maleimide group, or a haloalkyl group such as chlorine, bromine, iodine, or a halocarbonyl group. In turn, one end of the spacer raw material and the chlorosulfonyl group, fullholosulfonyl group, chlorocarbonyl group, carboxyl group, maleimide group, amino group, isothiocyanyl group, chlorine, bromine, iodine, etc. of the fluorescent derivatization reagent It can be carried out by linking to the color-developing part by reaction with halide and linking the other end by condensation with an amino group, hydroxyl group, carboxyl group or the like of the cysteine derivative.

発色部としては、ベンゾフラン誘導体、ジヒドロキノキサリノン誘導体、フタルイミジニル誘導体、ダンシル誘導体、クマリン誘導体、アクリジン誘導体、ベンゾチアゾール誘導体、ベンゾキサジアゾール誘導体、フルオロセイン誘導体、ローダミン誘導体、シコニン誘導体等を挙げることができ、通常、スペーサーへの発色部の導入には蛍光誘導体化試薬が用いられ、具体的には、4-(5,6-ジメトキシ-N-フタルイミジニル)ベンゼンスルホン酸クロリド (DPS-Cl)、4-クロロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(NBD-Cl)、フルオロセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミンBイソチオシアネート(RBITC)、4-フルオロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(NDB-F)、4-(N,N-ジメチルアミノスルホニル)-7-フルオロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(DBD-F)、4-(N-フタルイミジニル)ベンゼンスルホン酸クロリド(Phisyl-Cl)、4-アミノスルホニル-7-フルオロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(ABD-F)、N-[4-(6-ジメチルアミノ-2-ベンゾフラニル)フェニル]マレイミド(DBPM)、2-(4-マレイミドフェニル)-6-メチルベンゾチアゾール(MBPM)、N-(9-アクリジニル)マレイミド(NAM)、4-クロロ-7-スルホベンゾフラザンアンモニウム塩(SBD-Cl)、7-フルオロベンゾフラザン-4-スルホン酸アンモニウム塩(SBD-F)、1,2-ジアミノ-4,5-ジメトキシベンゼン(DDB)、4-(N,N-ジメチルアミノスルホニル)-7-ヒドラジノ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(DBD-H)、4-ヒドラジノ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾールヒドラジン(DBD-H)、2,2'-ジチオジ(1-ナフチルアミン) (DTAN)、4-アミノ-3-ペンテン-2-オン(Fluoral-P)、1,2-アミノ-4,5-メチレンジオキシベンゼン(MDB)、4-(5,6-ジメトキシベンゾチアゾール-2-イル)安息香酸ヒドラジド(BHBT)、4-(N,N-ジメチルアミノスルフホニル)-7-(N-ヒドラジノカルボニルメチル-N-メチル)アミノ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール (DBD-CO-Hz)、4-(N-ヒドラジノカルボニルメチル-N-メチルアミノ)-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(NBD-CO-Hz)、3-ブロモメチル-6,7-ジメトキシ-1-メチル-1,2-ジヒドロキノキサリン-2-オン(Br-DMEQ)、4-ブロモメチル-7-メトキシクマリン(Br-MMC)、4-(N,N-ジメチルアミノスルホニル)-7-ピペラジノ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(DBD-PZ)、4-ニトロ-7-ピペラジノ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール (NBD-PZ)、4-(N,N-ジメチルアミノスルホニル)-7-(2-アミノエチルアミノ)-2,1,3-ベンゾキサジアゾール (DBD-ED)、3-クロロカルボニル-6,7-ジメトキシ-1-メチル-2(1H)-キノキサリノン(DMEQ-COCl)、2-(5-クロロカルボニル-2-オキサゾールイル)-5,6-メチレンジオキシベンゾフラン(OMB-COCl)等が挙げられる。 Examples of the coloring portion include benzofuran derivatives, dihydroquinoxalinone derivatives, phthalimidinyl derivatives, dansyl derivatives, coumarin derivatives, acridine derivatives, benzothiazole derivatives, benzoxadiazole derivatives, fluorescein derivatives, rhodamine derivatives, and shikonin derivatives. In general, a fluorescent derivatization reagent is used to introduce the coloring portion into the spacer. Specifically, 4- (5,6-dimethoxy-N-phthalimidinyl) benzenesulfonic acid chloride (DPS-Cl), 4 -Chloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-Cl), fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine B isothiocyanate (RBITC), 4-fluoro-7-nitro-2,1 , 3-Benzoxadiazole (NDB-F), 4- (N, N-dimethylaminosulfonyl) -7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole (DBD-F), 4- (N- Phthalimi Nyl) benzenesulfonic acid chloride (Phisyl-Cl), 4-aminosulfonyl-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole (ABD-F), N- [4- (6-dimethylamino-2- Benzofuranyl) phenyl] maleimide (DBPM), 2- (4-maleimidophenyl) -6-methylbenzothiazole (MBPM), N- (9-acridinyl) maleimide (NAM), 4-chloro-7-sulfobenzofurazane ammonium Salt (SBD-Cl), 7-fluorobenzofurazane-4-sulfonic acid ammonium salt (SBD-F), 1,2-diamino-4,5-dimethoxybenzene (DDB), 4- (N, N-dimethyl) Aminosulfonyl) -7-hydrazino-2,1,3-benzoxadiazole (DBD-H), 4-hydrazino-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole hydrazine (DBD-H), 2 , 2'-dithiodi (1-naphthylamine) (DTAN), 4-amino-3-penten-2-one (Fluoral-P), 1,2-amino-4,5-methylenedioxybenzene (MDB), 4 -(5,6-dimethoxybenzothiazol-2-yl ) Benzoic acid hydrazide (BHBT), 4- (N, N-dimethylaminosulfonyl) -7- (N-hydrazinocarbonylmethyl-N-methyl) amino-2,1,3-benzoxadiazole (DBD) -CO-Hz), 4- (N-hydrazinocarbonylmethyl-N-methylamino) -7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-CO-Hz), 3-bromomethyl-6, 7-dimethoxy-1-methyl-1,2-dihydroquinoxalin-2-one (Br-DMEQ), 4-bromomethyl-7-methoxycoumarin (Br-MMC), 4- (N, N-dimethylaminosulfonyl)- 7-piperazino-2,1,3-benzoxadiazole (DBD-PZ), 4-nitro-7-piperazino-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-PZ), 4- (N, N -Dimethylaminosulfonyl) -7- (2-aminoethylamino) -2,1,3-benzoxadiazole (DBD-ED), 3-chlorocarbonyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-2 (1H ) -Quinoxalinone (DMEQ-COCl), 2- (5-Chlorocarbonyl-2-oxazolyl) -5,6-methylenedioxy Benzofuran (OMB-COCl) and the like.

また、式（１）

で表される蛍光システイン誘導体を用いることができる。 Moreover, Formula (1)

The fluorescent cysteine derivative represented by these can be used.

ここで、R¹,R²は蛍光色素、ヒドロキシル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいフェノキシ基の群から選ばれ、R¹とR²の少なくとも一方が蛍光色素である。 Here, R ¹ and R ² are a fluorescent dye, a hydroxyl group, an amino group which may have a substituent, an alkoxy group which may have a substituent, a phenoxy group which may have a substituent And at least one of R ¹ and R ² is a fluorescent dye.

ここで、上記蛍光色素（FL）が、式（２）

である上記式（１）記載の蛍光システイン誘導体を用いることができる。 Here, the fluorescent dye (FL) is represented by the formula (2)

A fluorescent cysteine derivative described in the above formula (1) can be used.

ここで、R³はニトロ基、無置換アミノスルホニル基、スルホン酸基、アンモニウムスルホン酸基のいずれかを表わすか、もしくはアルキルアミノ基や４級アンモニウム基等の置換基を有していても良いアルキルアミノスルホニル基を表わす。x,y,zは、それぞれ独立に0から20の整数を表わす。R²は直接結合又は、-O-, -CH₂-, -NHCOO-, -CONH-, -COO-, -SO₂NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -S-, -NR-, -CH=CH-, -C≡C-, -Ar-, -CO-Ar-NR-からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を表わす。Rはアルキル基を表わす。Arはアリール基を表わす。R⁵は−ＮＨ−、−Ｏ−又は−Ｓ−を表わす。
Here, R ³ represents any of a nitro group, an unsubstituted aminosulfonyl group, a sulfonic acid group, and an ammonium sulfonic acid group, or may have a substituent such as an alkylamino group or a quaternary ammonium group. Represents an alkylaminosulfonyl group; x, y, and z each independently represent an integer of 0 to 20. R ² is a direct bond or -O-, -CH _2- , -NHCOO-, -CONH-, -COO-, -SO ₂ NH-, -HN-C (= NH) -NH-, -S-, It represents at least one group selected from the group consisting of —NR—, —CH═CH—, —C≡C—, —Ar—, and —CO—Ar—NR—. R represents an alkyl group. Ar represents an aryl group. R ⁵ represents —NH—, —O— or —S—.

かくして、本発明の感作性検定方法において使用し得る蛍光システイン誘導体を具体的に示すと、γ-グルタミル-システイニル-グリシニル-N-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-アミド、システイニル-N-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-アミド、｛4-アミノ-4-[2-(7-ニトロベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチルカルバモイル]-ブチリル｝-システイニル−グリシン、フェニルアラニル-トレオニル-ロイシニル-システイニル-フェニルアラニル-アルギニル-N-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-アミド、アセチル-アルギニル-フェニルアラニル-アラニル-アラニル-システイニル-アラニル-アラニル-N-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-アミド、 Thus, specific examples of fluorescent cysteine derivatives that can be used in the sensitization assay method of the present invention include γ-glutamyl-cysteinyl-glycinyl-N- [2- (7-nitro-benzo [1,2,5] Oxadiazol-4-ylamino) -ethyl] -amide, cysteinyl-N- [2- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -ethyl] -amide, {4 -Amino-4- [2- (7-nitrobenzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -ethylcarbamoyl] -butyryl} -cysteinyl-glycine, phenylalanyl-threonyl-leucinyl-cysteinyl-phenyl Alanyl-arginyl-N- [2- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -ethyl] -amide, acetyl-arginyl-phenylalanyl-alanyl-alanyl-cysteinyl -Alanyl-alanyl-N- [2- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -Ethyl] -amide,

γ-グルタミル-システイニル-グリシニル-N-[3-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピル]-アミド、システイニル-N-[3-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピル]-アミド、｛4-アミノ-4-[3-(7-ニトロベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピルカルバモイル]-ブチリル｝-システイニル−グリシン、フェニルアラニル-トレオニル-ロイシニル-システイニル-フェニルアラニル-アルギニル-N-[3-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピル]-アミド、アセチル-アルギニル-フェニルアラニル-アラニル-アラニル-システイニル-アラニル-アラニル-N-[3-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピル]-アミド、 γ-glutamyl-cysteinyl-glycinyl-N- [3- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -propyl] -amide, cysteinyl-N- [3- (7- Nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -propyl] -amide, {4-amino-4- [3- (7-nitrobenzo [1,2,5] oxadiazole-4 -Ylamino) -propylcarbamoyl] -butyryl} -cysteinyl-glycine, phenylalanyl-threonyl-leucinyl-cysteinyl-phenylalanyl-arginyl-N- [3- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxa Diazol-4-ylamino) -propyl] -amide, acetyl-arginyl-phenylalanyl-alanyl-alanyl-cysteinyl-alanyl-alanyl-N- [3- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxa Diazol-4-ylamino) -propyl] -amide,

γ-グルタミル-システイニル-グリシニル-N-[5-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチル]-アミド、システイニル-N-[5-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチル]-アミド、｛4-アミノ-4-[5-(7-ニトロベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチルカルバモイル]-ブチリル｝-システイニル−グリシン、フェニルアラニル-トレオニル-ロイシニル-システイニル-フェニルアラニル-アルギニル-N-[5-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチル]-アミド、アセチル-アルギニル-フェニルアラニル-アラニル-アラニル-システイニル-アラニル-アラニル-N-[5-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチル]-アミド、 γ-glutamyl-cysteinyl-glycinyl-N- [5- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -3-oxa-pentyl] -amide, cysteinyl-N- [5 -(7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -3-oxa-pentyl] -amide, {4-amino-4- [5- (7-nitrobenzo [1,2 , 5] oxadiazol-4-ylamino) -3-oxa-pentylcarbamoyl] -butyryl} -cysteinyl-glycine, phenylalanyl-threonyl-leucinyl-cysteinyl-phenylalanyl-arginyl-N- [5- (7 -Nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -3-oxa-pentyl] -amide, acetyl-arginyl-phenylalanyl-alanyl-alanyl-cysteinyl-alanyl-alanyl-N- [ 5- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -3-oxa-pentyl] -amide,

γ-グルタミル-システイニル-グリシニル-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-エステル、システイニル-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-エステル、｛4-アミノ-4-[2-(7-ニトロベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エトキシカルボニル]-ブチリル｝-システイニル−グリシン、フェニルアラニル-トレオニル-ロイシニル-システイニル-フェニルアラニル-アルギニル-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-エステル、アセチル-アルギニル-フェニルアラニル-アラニル-アラニル-システイニル-アラニル-アラニル-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-エステル、等を挙げることができる。 γ-glutamyl-cysteinyl-glycinyl- [2- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -ethyl] -ester, cysteinyl- [2- (7-nitro-benzo [ 1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -ethyl] -ester, {4-amino-4- [2- (7-nitrobenzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino)- Ethoxycarbonyl] -butyryl} -cysteinyl-glycine, phenylalanyl-threonyl-leucinyl-cysteinyl-phenylalanyl-arginyl- [2- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino ) -Ethyl] -ester, acetyl-arginyl-phenylalanyl-alanyl-alanyl-cysteinyl-alanyl-alanyl- [2- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino)- And ethyl] -ester.

かかる蛍光システイン誘導体を、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩の無機塩類や、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム等の酢酸塩などの有機酸塩等を含む水性緩衝液、もしくは水、又はこれらとアセトニトリルなどの有機溶媒との混合溶媒に、例えば、約0.01μmol/L〜約1mol/L程度の濃度、通常、約0.1μmol/L〜約10mmol/L程度の濃度となるように溶解する。被験物質は、例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンなどの有機溶媒又はこれらの混合溶媒に、例えば、約0.01μmol/L〜約1mol/L程度の濃度、通常、約0.1μmol/L〜約50mmol/L程度の濃度となるように溶解する。次いで、上記のペプチド蛍光誘導体溶液と被験物質溶液とを、ペプチド蛍光誘導体と被験物質のモル濃度比が例えば1:100〜100:1となるように混合し反応させる。該反応には、蛍光システイン誘導体溶液と被験物質との混合液を、例えば約４℃〜約60℃程度の温度範囲にて保温しながら、通常約10分間〜約2日間程度振とう、撹拌、もしくは静置する。 An aqueous buffer containing such a fluorescent cysteine derivative, for example, an inorganic salt of an alkali metal phosphate such as sodium phosphate or potassium phosphate, or an organic acid salt such as sodium acetate, potassium acetate or ammonium acetate Or a mixed solvent of water or an organic solvent such as acetonitrile with, for example, a concentration of about 0.01 μmol / L to about 1 mol / L, usually a concentration of about 0.1 μmol / L to about 10 mmol / L. Dissolve to The test substance is, for example, a concentration of about 0.01 μmol / L to about 1 mol / L, usually about 0.1 μmol / L to about 50 mmol in an organic solvent such as methanol, ethanol, acetonitrile, acetone or a mixed solvent thereof. Dissolve to a concentration of about / L. Next, the peptide fluorescent derivative solution and the test substance solution are mixed and reacted so that the molar concentration ratio of the peptide fluorescent derivative and the test substance is, for example, 1: 100 to 100: 1. In the reaction, the liquid mixture of the fluorescent cysteine derivative solution and the test substance is kept in a temperature range of, for example, about 4 ° C. to about 60 ° C., and is usually shaken for about 10 minutes to about 2 days, stirred, Or leave it alone.

かかる反応により生成した被験物質と蛍光システイン誘導体との結合物の有無は、蛍光システイン誘導体溶液と被験物質溶液との混合液を次のようにして分析することにより測定される。混合液の分析方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロマトグラフィー(GC)、薄層クロマトグラフィー（TLC）、質量分析（MS）等を挙げることができる。特にHPLC,TLCの検出器としては紫外吸光度検出器、可視吸光度検出器、蛍光検出器等を挙げることができる。また、HPLC、GC、TLCのいずれかとMSとを組み合わせた分析方法(LC-MS、GC-MS、TLC-MS)等を用いることもできる。該方法によれば、試料に複数成分が含まれていてもそれらを個々に分離し、それぞれについて質量分析することができる。上記のHPLC又はTLCに用いることのできるクロマトグラフ手法としては、逆相、順相、イオン交換などを挙げることができる。このようなクロマトグラフ手法に使用可能な市販HPLCカラムやTLCプレートとしては、例えば、HPLCカラムとしては、SUMIPAX ODSA-212（住化分析センター製）、L-column ODS(財団法人化学物質評価研究機構)、ワコーシル5C18(和光純薬製)、コスモシール5C18-AR-II（ナカライテスク製）、SUMIPAX SIL S-05(住化分析センター製)、LiChrosorb Si 60 (メルク製)、TLCプレートとしては、Silica gel 60 Plate (メルク製)、ＴＬＣプレートＲＰ‐１８Ｆ２５４Ｓ（メルク製）などを挙げることができる。また、質量分析で利用することのできるイオン化法としては、例えば、マトリクス支援レーザーイオン化(MALDI)法、エレクトロスプレーイオン化(ESI)法、大気圧イオン化(API)法、電子衝突イオン化(EI)法、高速電子衝撃イオン化(FAB)法などを挙げることができる。このようなイオン化法に使用可能な市販のイオン源としては、MALDI法の場合、島津/KRATOS製、PEバイオシステム製、マイクロマス製、Bruker製等のイオン源が挙げられる。また、ESIの場合、Finnigan Mat製、マイクロマス製、サイエックス製、Hewlett-Packard製、PEバイオシステム製等のイオン源が挙げられる。質量分析計としては、磁場型、四重極型、イオントラップ型、フーリエー変換-イオンサイクロトロン型、飛行時間型の質量分析計を挙げることができる。上記のようにして得られた混合液の分析結果を、例えば、蛍光システイン誘導体溶液のみを保温した試料及び被験物質溶液のみを保温した試料各々の分析結果とを比較し、蛍光システイン誘導体溶液のみを保温した試料及び被験物質溶液のみを保温した試料からは検出されず、かつ保温後の蛍光システイン誘導体溶液と被験物質溶液の混合溶液からのみ検出される成分の有無を調べることにより、蛍光システイン誘導体と被験物質との結合物の有無を測定することができる。かかる分析に、MS、LC-MS、GC-MS、TLC-MS等の質量分析法を用いると、各成分について、質量スペクトルから得られる情報に基いて質量、構造等を解析してその組成や構造を確認することにより、蛍光システイン誘導体と被験物質との結合物を特定することもできる。 The presence / absence of a conjugate of the test substance and the fluorescent cysteine derivative produced by such a reaction is measured by analyzing a mixed solution of the fluorescent cysteine derivative solution and the test substance solution as follows. Examples of the method for analyzing the mixed liquid include high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography (GC), thin layer chromatography (TLC), mass spectrometry (MS) and the like. In particular, examples of HPLC and TLC detectors include an ultraviolet absorbance detector, a visible absorbance detector, and a fluorescence detector. In addition, an analysis method (LC-MS, GC-MS, TLC-MS) in which any one of HPLC, GC, TLC and MS is combined can also be used. According to this method, even if a sample contains a plurality of components, they can be separated individually and subjected to mass spectrometry for each. Examples of chromatographic techniques that can be used for the above HPLC or TLC include reverse phase, normal phase, ion exchange, and the like. Examples of commercially available HPLC columns and TLC plates that can be used for such chromatographic methods include SUMIPAX ODSA-212 (manufactured by Sumika Chemical Analysis Center), L-column ODS (Chemicals Evaluation and Research Institute, Japan). ), Wakosil 5C18 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), Cosmo Seal 5C18-AR-II (manufactured by Nacalai Tesque), SUMIPAX SIL S-05 (manufactured by Sumika Chemical Analysis Center), LiChrosorb Si 60 (manufactured by Merck), TLC plate, Silica gel 60 Plate (made by Merck), TLC plate RP-18F254S (made by Merck), etc. can be mentioned. Examples of ionization methods that can be used in mass spectrometry include matrix-assisted laser ionization (MALDI), electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure ionization (API), electron impact ionization (EI), Examples thereof include a fast electron impact ionization (FAB) method. Examples of commercially available ion sources that can be used for such ionization methods include ion sources such as Shimadzu / KRATOS, PE Biosystems, Micromass, and Bruker in the case of MALDI. In the case of ESI, ion sources such as Finnigan Mat, Micromass, SciX, Hewlett-Packard, and PE biosystems are listed. Examples of the mass spectrometer include a magnetic field type, a quadrupole type, an ion trap type, a Fourier transform-ion cyclotron type, and a time-of-flight type mass spectrometer. Compare the analysis results of the mixture obtained as described above with, for example, the analysis results of each of the sample in which only the fluorescent cysteine derivative solution is kept warm and the sample in which only the test substance solution is kept warm. By examining the presence or absence of a component that is not detected from a sample that has been kept warm and a sample that has been kept warm only for the test substance solution and that is detected only from the mixed solution of the fluorescent cysteine derivative solution and the test substance solution after the incubation, The presence or absence of a bound substance with the test substance can be measured. When mass spectrometry such as MS, LC-MS, GC-MS, and TLC-MS is used for such analysis, each component is analyzed for mass, structure, etc. based on information obtained from the mass spectrum, and its composition and By confirming the structure, a conjugate of the fluorescent cysteine derivative and the test substance can also be specified.

本蛍光システイン誘導体の製造方法は、例えば、公知化合物から公知の合成方法等を利用すればよいが、以下に、代表的な化合物の製造方法について、説明する。 For example, a known synthesis method from a known compound may be used as the method for producing the present fluorescent cysteine derivative, but a typical method for producing a compound will be described below.

たとえば、式（5）及び式（6）

For example, Equation (5) and Equation (6)

(式中、R³,R⁴,R⁵,x,y及び,zは、前記と同じ意味を表わす。)
で示される蛍光グルタチオン誘導体を製造する場合、
グルタチオンに保護基を導入した、式（7）及び式（8）

(Wherein R ³ , R ⁴ , R ⁵ , x, y, and z represent the same meaning as described above.)
When producing a fluorescent glutathione derivative represented by:
Formula (7) and Formula (8) in which a protecting group is introduced into glutathione

で示される保護グルタチオン誘導体と、式（9）

(式中、R⁴,R⁵,x,y及びzは、前記と同じ意味を表わす。)
で示される両末端に求核性官能基をもちかつ少なくとも一方の末端がアミノ基であるリンカー化合物の共存溶液中、式（10）

（R³は前記と同じ意味を表わす。Hal、はフッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン原子を表わす。）
で示されるベンゾキサジアゾール誘導体とを加え、
系内に式（11）

(式中、R³,R⁴,R⁵,x,y及び,zは、前記と同じ意味を表わす。)
で表わされる蛍光基と求核性官能基とを有するリンカー化合物を調製した後、式（11）を単離することなく脱水縮合剤を系内に加え前記式（7）及び式（8）で示される保護システイン誘導体のカルボキシル基と縮合反応を行い、式（12）及び式（13）

(式中、R³,R⁴,R⁵,x,y及び,zは、前記と同じ意味を表わす。)

(式中、R³,R⁴,R⁵,x,y及び,zは、前記と同じ意味を表わす。)
で示される保護蛍光グルタチオン誘導体を調整した後、脱保護することにより製造することができる（下記スキーム１参照）。

A protected glutathione derivative represented by formula (9)

(Wherein R ⁴ , R ⁵ , x, y and z represent the same meaning as described above).
In a coexisting solution of a linker compound having a nucleophilic functional group at both ends represented by and having at least one amino group as an amino group, the compound of formula (10)

(R ³ represents the same meaning as described above. Hal represents a halogen atom such as fluorine, chlorine, bromine or iodine.)
And a benzoxadiazole derivative represented by
Formula (11) in the system

(Wherein R ³ , R ⁴ , R ⁵ , x, y, and z represent the same meaning as described above.)
After preparing a linker compound having a fluorescent group represented by the formula (I) and a nucleophilic functional group, a dehydrating condensing agent is added to the system without isolating the formula (11), and the formula (7) and the formula (8) Condensation reaction is performed with the carboxyl group of the protected cysteine derivative shown in formula (12) and formula (13)

(Wherein R ³ , R ⁴ , R ⁵ , x, y, and z represent the same meaning as described above.)

(Wherein R ³ , R ⁴ , R ⁵ , x, y, and z represent the same meaning as described above.)
After preparing a protected fluorescent glutathione derivative represented by the following formula, it can be produced by deprotection (see Scheme 1 below).

グルタチオンに保護基を導入する場合、Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 2544-2545、Synthesis 1994,1063-1066等に記載の方法に準じ保護基を導入する。保護基としては、通常、チオール基に対してはトリフェニルメチル基（Tｒｔ基）、アミノ基に対してはtert-ブトキシカルボニル基（Boc基）、カルボキシル基に対しては、tert-ブチル基(t-Bu基)を用いる。また、保護する順序は、通常、まず、チオール基、次にアミノ基、最後にカルボキシル基の順で行う。 When a protecting group is introduced into glutathione, the protecting group is introduced according to the method described in Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 2544-2545, Synthesis 1994, 1063-1066 and the like. As a protecting group, a triphenylmethyl group (Trt group) for a thiol group, a tert-butoxycarbonyl group (Boc group) for an amino group, and a tert-butyl group (for a carboxyl group) t-Bu group). The order of protection is usually performed in the order of thiol group, then amino group, and finally carboxyl group.

グルタチオンへの保護基導入は、まず、チオール基をトリフルオロ酢酸存在下、トリフェニルメタノールと反応させ、式（１４）

で表わされるチオール保護体に変換し、チオール基を保護する（スキーム２参照）。

For introducing a protecting group into glutathione, first, a thiol group is reacted with triphenylmethanol in the presence of trifluoroacetic acid to obtain a compound of formula (14)

To protect the thiol group (see Scheme 2).

次に、トリエチルアミン存在下ジ-tert-ブチルジカルボネートと反応させ、式(15)

で示されるチオール／アミン保護体に変換しアミノ基を保護する（スキーム３参照）

Next, it is reacted with di-tert-butyl dicarbonate in the presence of triethylamine to obtain a compound of formula (15)

To protect the amino group (see Scheme 3)

さらに、チオール／アミン保護体をテトラヒドロフラン-tert-ブタノール溶媒中、ジメチルアミノピリジン存在下、ジ-tert-ブチルジカルボネートと反応させ、式(5)及び／又は式(6)で示される保護グルタチオン誘導体を得ることができる（スキーム４参照）。
なお、ジ-tert-ブチルジカルボネートは、通常、２倍当量用いる。

Further, the protected thiol / amine derivative is reacted with di-tert-butyl dicarbonate in the presence of dimethylaminopyridine in a tetrahydrofuran-tert-butanol solvent to give a protected glutathione derivative represented by formula (5) and / or formula (6) Can be obtained (see Scheme 4).
Di-tert-butyl dicarbonate is usually used in an equivalent amount of 2 times.

式（９）

(式中,R⁴,R⁵,x,y,及びzは、前記と同じ意味を表わす。)
で示される両末端に求核性官能基をもちかつ少なくとも一方の末端がアミノ基であるリンカー化合物としては、1,2-ジアミノエタン、1,3-ジアミノプロパン、2-アミノエタノール、2,2'-オキシビス(エチルアミン)、4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミン等が挙げられ、通常市販されているものが用いられる。 Formula (9)

(Wherein, R ⁴ , R ⁵ , x, y, and z have the same meaning as described above.)
As linker compounds having a nucleophilic functional group at both ends and an amino group at least one end, 1,2-diaminoethane, 1,3-diaminopropane, 2-aminoethanol, 2,2 Examples include '-oxybis (ethylamine), 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine and the like, which are usually commercially available.

両末端に求核性官能基をもちかつ少なくとも一方の末端がアミノ基であるリンカー化合物の使用量は、保護グルタチオン誘導体のカルボキシル基に対して、通常０．５〜５モル倍以上であり、好ましくは0.8〜1.2モル倍である。 The amount of the linker compound that has a nucleophilic functional group at both ends and at least one end is an amino group is usually 0.5 to 5 mol times or more with respect to the carboxyl group of the protected glutathione derivative, preferably Is 0.8 to 1.2 mole times.

ベンゾキサジアゾール誘導体としては、4-クロロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(NBD-Cl)、4-フルオロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(NBD-F)、4-(N,N-ジメチルアミノスルホニル)-7-フルオロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(DBD-F)、4-アミノスルホニル-7-フルオロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(ABD-F)、4-クロロ-7-スルホベンゾフラザンアンモニウム塩(SBD-Cl)、7-フルオロベンゾフラザン-4-スルホン酸アンモニウム塩(SBD-F)、4-(ジメチルアミノエチルアミノスルホニル)-7-クロロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(DAABD-Cl)、7-クロロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール-4-スルホニルアミノエチルトリメチルアンモニウム塩酸塩(TAABD-Cl)等が挙げられる。
通常市販されているものが用いられ、使用量は両末端に求核性官能基をもちかつ少なくとも一方の末端がアミノ基であるリンカー化合物と同じモル量を用い、保護グルタチオン誘導体中の無保護カルボキシル基に対して、通常１〜５モル倍以上であり、好ましくは0.8〜1.2モル倍である。 Benzoxadiazole derivatives include 4-chloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-Cl), 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-F), 4- (N, N-dimethylaminosulfonyl) -7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole (DBD-F), 4-aminosulfonyl-7-fluoro-2,1 , 3-Benzoxadiazole (ABD-F), 4-chloro-7-sulfobenzofurazane ammonium salt (SBD-Cl), 7-fluorobenzofurazane-4-sulfonic acid ammonium salt (SBD-F), 4- (Dimethylaminoethylaminosulfonyl) -7-chloro-2,1,3-benzoxadiazole (DAABD-Cl), 7-chloro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonylaminoethyl And trimethyl ammonium hydrochloride (TAABD-Cl).
A commercially available product is used, and the amount used is the same molar amount as that of a linker compound having a nucleophilic functional group at both ends and at least one end being an amino group, and an unprotected carboxyl in a protected glutathione derivative. It is 1-5 mol times or more with respect to group normally, Preferably it is 0.8-1.2 mol times.

脱水縮合剤としては、例えばN,N′-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、N,N′-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、テトラフルオロほう酸２-（１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-イル）-１，１，３，３-テトラメチルウロニウム(TBTU)、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト（PyBOP）が挙げられ、その使用量は、保護グルタチオン誘導体中の無保護カルボキシル基に対して、通常１〜１０モル倍以上であり、好ましくは１〜３モル倍である。 Examples of the dehydrating condensing agent include N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N, N′-diisopropylcarbodiimide (DIC), and tetrafluoroboric acid 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3. , 3-tetramethyluronium (TBTU), benzotriazol-1-yl-oxy-tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), and the amount used is based on the unprotected carboxyl group in the protected glutathione derivative. On the other hand, it is 1-10 mol times or more normally, Preferably it is 1-3 mol times.

両末端に求核性官能基をもちかつ少なくとも一方の末端がアミノ基であるリンカー化合物とベンゾキサジアゾール誘導体の反応による蛍光基と求核性官能基とを有するリンカー化合物の合成は、通常保護グルタチオン誘導体と両末端に求核性官能基をもちかつ少なくとも一方の末端がアミノ基であるリンカー化合物を溶媒中混合し、ベンゾキサゾール誘導体を加えることにより実施される。次に、この系内に脱水縮合剤を加えることにより、系内で調製された蛍光基と求核性官能基とを有するリンカー化合物と未反応で残っている保護グルタチオン誘導体とで縮合反応が起こり、保護蛍光グルタチオン誘導体が生成する。 Synthesis of linker compounds having a nucleophilic functional group at both ends and a fluorescent group and a nucleophilic functional group by a reaction of a linker compound having a nucleophilic functional group at least one end with an amino group and a benzoxadiazole derivative is usually protected. This is carried out by mixing a glutathione derivative and a linker compound having a nucleophilic functional group at both ends and at least one end of which is an amino group in a solvent, and adding a benzoxazole derivative. Next, by adding a dehydrating condensing agent in the system, a condensation reaction occurs between the linker compound having a fluorescent group and a nucleophilic functional group prepared in the system and the protected glutathione derivative remaining unreacted. A protected fluorescent glutathione derivative is produced.

溶媒としては、例えばテトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒、例えばトルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、例えばクロロホルム等のハロゲン化炭化水素系溶媒、例えばアセトニトリル等のニトリル系溶媒、例えば酢酸エチル等のエステル系溶媒等の単独もしくは混合溶媒が挙げられる。かかる溶媒の使用量は特に制限されない。 Examples of the solvent include ether solvents such as tetrahydrofuran, aromatic hydrocarbon solvents such as toluene, halogenated hydrocarbon solvents such as chloroform, nitrile solvents such as acetonitrile, and ester solvents such as ethyl acetate. Or a single or mixed solvent. The amount of such solvent used is not particularly limited.

反応温度は、通常−５０〜１００℃である。 The reaction temperature is usually −50 to 100 ° C.

反応終了後、反応液をそのままもしくは濃縮処理した後、水及び必要に応じて水に不溶の有機溶媒を加えて抽出処理し、得られる有機層を濃縮処理することにより、保護蛍光システイン誘導体を取り出すことができる。取り出した保護蛍光グルタチオン誘導体は、例えば再結晶、カラムクロマトグラフィ等の通常の精製手段によりさらに精製してもよい。 After completion of the reaction, the reaction solution is directly or concentrated, extracted with water and, if necessary, an insoluble organic solvent in water, and the resulting organic layer is concentrated to extract the protected fluorescent cysteine derivative. be able to. The removed protected fluorescent glutathione derivative may be further purified by ordinary purification means such as recrystallization and column chromatography.

保護蛍光グルタチオン誘導体の保護基を除去する場合、例えば、Tetrahedron Letter 1989, 30, 2739に準じ、トリアルキルシランが含有した含水トリフルオロ酢酸と混合することにより実施できる。トリアルキルシランとして、トリエチルシラン、トリイソプロピルシラン等を挙げることができ、通常、トリフルオロ酢酸に対して体積比0.01〜0.5体積部使用する。目的物である蛍光グルタチオン誘導体は、ジエチルエーテル等の有機溶媒を加えて沈殿させることで、容易に取り出すことが可能である。取り出した保護蛍光グルタチオン誘導体は、例えば再結晶、カラムクロマトグラフィ等の通常の精製手段によりさらに精製してもよい。 When the protective group of the protected fluorescent glutathione derivative is removed, for example, according to Tetrahedron Letter 1989, 30, 2739, it can be carried out by mixing with hydrous trifluoroacetic acid containing a trialkylsilane. Examples of the trialkylsilane include triethylsilane and triisopropylsilane, and the volume ratio is usually 0.01 to 0.5 parts by volume with respect to trifluoroacetic acid. The objective fluorescent glutathione derivative can be easily taken out by adding an organic solvent such as diethyl ether to cause precipitation. The removed protected fluorescent glutathione derivative may be further purified by ordinary purification means such as recrystallization and column chromatography.

以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
S-トリチルグルタチオンの合成

Crichらの方法（Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 2544-2545.）に従い調製した。還元型グルタチオン（25g, 81.3mmol）とトリフェニルメタノール(21.2 g, 81.3 mmol)を１Ｌフラスコに仕込み、トリフルオロ酢酸(150mL)を室温で滴下した。1時間室温で攪拌後、ジエチルエーテル(300mL)を仕込み、析出した白色固体をろ過した。ジエチルエーテル(300mL)で固体を洗浄しS-トリチルグルタチオン(S-trityl glutathione)の粗生成物40gを得た。 EXAMPLES The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[Example 1]
Synthesis of S-trityl glutathione

It was prepared according to the method of Crich et al. (Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 2544-2545.). Reduced glutathione (25 g, 81.3 mmol) and triphenylmethanol (21.2 g, 81.3 mmol) were charged into a 1 L flask, and trifluoroacetic acid (150 mL) was added dropwise at room temperature. After stirring at room temperature for 1 hour, diethyl ether (300 mL) was charged, and the precipitated white solid was filtered. The solid was washed with diethyl ether (300 mL) to obtain 40 g of a crude product of S-trityl glutathione.

［実施例２］
N-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオンの合成

Crichらの方法（Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 2544-2545.）に若干の変更を加え調製した。前記実施例１で得られたS-トリチルグルタチオンの粗生成物全量をトリエチルアミン(50mL)−水(150mL)に溶かし、ジ-tert-ブチルジカルボナート(20 g, 90.4 mmol)のエーテル溶液(200mL)を滴下した。18時間室温で攪拌した後、飽和重曹水(200mL)でクエンチした。水層を3回酢酸エチル(100mL×3)で洗浄した後、固体の硫酸水素カリウムを加えて水層のpHを酸性に合わせた。3回酢酸エチル(100mL×3)で抽出し、有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮乾固した。ヘキサンで結晶化し、N-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオン(32g, 2ステップ収率61%)の白色固体を得た。 [Example 2]
Synthesis of N- (tert-butoxycarbonyl) -S-tritylglutathione

Prepared with slight modifications to the method of Crich et al. (Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 2544-2545.). The whole crude product of S-tritylglutathione obtained in Example 1 was dissolved in triethylamine (50 mL) -water (150 mL), and an ether solution (200 mL) of di-tert-butyl dicarbonate (20 g, 90.4 mmol) was dissolved. ) Was added dropwise. The mixture was stirred at room temperature for 18 hours and then quenched with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate (200 mL). The aqueous layer was washed 3 times with ethyl acetate (100 mL × 3), and then solid potassium hydrogen sulfate was added to adjust the pH of the aqueous layer to acidic. The mixture was extracted 3 times with ethyl acetate (100 mL × 3), and the organic layers were combined, dried over sodium sulfate, and concentrated to dryness. Crystallization from hexane gave a white solid of N- (tert-butoxycarbonyl) -S-tritylglutathione (32 g, 2-step yield 61%).

［実施例３］

N-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオンモノ-tert-ブチルエステルの合成

Takedaらの報告（Synthesis 1994, 1063-1066）と同様の反応条件で合成した。前記実施例２で調製したN-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオン(1g, 1.54mmol)とジ-tert-ブチルジカルボナート(0.67g, 3.08 mmol)のtert-ブタノール-THF溶液(1：1、40mL)にN,N-ジメチルアミノピリジン(0.062g, 0.51mmol)を加え、室温で撹拌した。18時間後、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、1mmol/mL硫酸水素カリウム水溶液（50mL）と酢酸エチル(50mL)を加えて分液操作を行った。有機層を2回1mmol/mL硫酸水素カリウム水溶液（2×50mL）で洗浄した後、エバポレーターで濃縮乾固し、N-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオン tert-ブチルエステルの異性体混合物を得た。 [Example 3]

Synthesis of N- (tert-butoxycarbonyl) -S-tritylglutathione mono-tert-butyl ester

Synthesis was performed under the same reaction conditions as Takeda et al. (Synthesis 1994, 1063-1066). A solution of N- (tert-butoxycarbonyl) -S-tritylglutathione (1 g, 1.54 mmol) and di-tert-butyldicarbonate (0.67 g, 3.08 mmol) prepared in Example 2 above ( 1: 1, 40 mL) was added N, N-dimethylaminopyridine (0.062 g, 0.51 mmol) and stirred at room temperature. After 18 hours, the solvent was distilled off using an evaporator, and 1 mmol / mL aqueous potassium hydrogen sulfate solution (50 mL) and ethyl acetate (50 mL) were added to carry out a liquid separation operation. The organic layer was washed twice with 1 mmol / mL aqueous potassium hydrogen sulfate solution (2 x 50 mL), concentrated to dryness with an evaporator, and an isomer mixture of N- (tert-butoxycarbonyl) -S-tritylglutathione tert-butyl ester Got.

［実施例４］
N-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオンモノ−tert-ブチルエステルモノ−N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノエチルアミドの合成

前記実施例３で調製したN-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオンモノtert-ブチルエステル(1.0g, 1.54mmol)及び1,2-エチレンジアミン(0.19g, 3.08mmol)のテトラヒドロフラン溶液(30mL)に7-クロロ-4-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾール（0.61g, 3.08mmol）のTHF溶液(20mL)溶液を滴下した。1時間室温で撹拌後、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド(0.39g, 3.08mmol)を加え、さらに18時間室温で撹拌した。エバポレータ−で溶媒を除去後、クロロホルムを加え不溶物をろ過により除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル60、クロロホルム→クロロホルム−メタノール50:1→25:1）で精製しN-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオンモノtert-ブチルエステルモノN-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノエチルアミドの異性体混合物（0.40g, 29%）を得た。
ESI(+)-MS: m/z 911 [MH⁺ calcd. for C46H54N8O10S 911.37] [Example 4]
Synthesis of N- (tert-butoxycarbonyl) -S-tritylglutathione mono-tert-butyl ester mono-N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) aminoethylamide

A tetrahydrofuran solution (30 mL) of N- (tert-butoxycarbonyl) -S-tritylglutathione monotert-butyl ester (1.0 g, 1.54 mmol) and 1,2-ethylenediamine (0.19 g, 3.08 mmol) prepared in Example 3 above. ) Was added dropwise a solution of 7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (0.61 g, 3.08 mmol) in THF (20 mL). After stirring at room temperature for 1 hour, N, N′-diisopropylcarbodiimide (0.39 g, 3.08 mmol) was added, and the mixture was further stirred at room temperature for 18 hours. After removing the solvent with an evaporator, chloroform was added and insolubles were removed by filtration, followed by purification by silica gel column chromatography (silica gel 60, chloroform → chloroform-methanol 50: 1 → 25: 1) and N- (tert-butoxy Carbonyl) -S-trityl glutathione mono tert-butyl ester Mono N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) aminoethylamide isomer mixture (0.40 g, 29%) was obtained. It was.
ESI (+)-MS: m / z 911 [MH ⁺ calcd. For C46H54N8O10S 911.37]

グルタチオン N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノエチルアミドの合成

前記実施例４で調製したN-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオンモノtert-ブチルエステルモノN-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノエチルアミド3mgとトリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：水(100:5:5)の混液 0.1mLを混合し、20分間室温で撹拌した。ジエチルエーテル1mLを加え、遠心分離により沈殿した結晶を残して上澄みを除去した。同様にジエチルエーテル洗浄を3回繰り返した後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣプレートＲＰ-１８Ｆ_２５４Ｓ、THF−H₂O １：２）により精製し、グルタチオン N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノエチルアミド(1.2 mg, 71%)を得た。 ESI(+)-MS:m/z 513 [MH⁺ calcd. for C18H24N8O8S 513.14] Synthesis of glutathione N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) aminoethylamide

N- (tert-butoxycarbonyl) -S-tritylglutathione mono tert-butyl ester prepared in Example 4 Mono N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) aminoethylamide 3 mg and 0.1 mL of a mixed solution of trifluoroacetic acid: triisopropylsilane: water (100: 5: 5) were mixed and stirred at room temperature for 20 minutes. 1 mL of diethyl ether was added, and the supernatant was removed leaving crystals precipitated by centrifugation. Similarly, after washing with diethyl ether three times, purification by thin layer chromatography (TLC plate RP-18F _254S , THF-H ₂ O 1: 2), glutathione N- (7-nitrobenz-2-oxa-1 , 3-Diazol-4-yl) aminoethylamide (1.2 mg, 71%) was obtained. ESI (+)-MS: m / z 513 [MH ⁺ calcd. For C18H24N8O8S 513.14]

［実施例６］
シンナムアルデヒド(皮膚感作性陽性。質量132)を0.2mg/mL(1.5mM)となるようアセトニトリルに溶解した溶液0.1mLと、グルタチオン蛍光誘導体(以下、n-GSHと記す。質量512)を0.7mg/mL(1.4mM)となるよう0.1M NaHPO₄-Na₂HPO₄水溶液(pH7)に溶解した溶液0.1mLとを混合し、44℃で保温した後、水−アセトニトリル混液（１：１）1.5mLで希釈し、その10μLを以下に記載の条件にてHPLCに供した。得られたクロマトグラムを（図３）を、上記のn-GSH溶液のみ保温したもの及びシンナムアルデヒド溶液のみを保温したものそれぞれを同様に分析して得られたクロマトグラム（図１及び図２）と比較した。その結果、n-GSH溶液のみ保温したもの及びシンナムアルデヒド溶液のみを保温したものを分析して得られるクロマトグラムには認められないピークが検出された。上記のn-GSH溶液とシンナムアルデヒド溶液との混合液を、以下に記載の条件にてLC-MSに供したところ。上記のn-GSH溶液とシンナムアルデヒド溶液との混合液のみに認められるピークに相当するMSスペクトル（図４）から、これらのピークに相当する化合物の質量数は626と推定された。該質量数はn-GSHとシンナムアルデヒドとが脱水縮合してなる化合物の質量数と一致する。 [Example 6]
0.1 mL of a solution of cinnamaldehyde (positive skin sensitization, mass 132) in acetonitrile to a concentration of 0.2 mg / mL (1.5 mM), and glutathione fluorescent derivative (hereinafter referred to as n-GSH, mass 512) 0.7 0.1 mL of a solution dissolved in 0.1M NaHPO ₄ -Na ₂ HPO ₄ aqueous solution (pH 7) so as to be mg / mL (1.4 mM) was mixed and kept at 44 ° C., then water-acetonitrile mixture (1: 1) The product was diluted with 1.5 mL, and 10 μL thereof was subjected to HPLC under the conditions described below. Chromatograms obtained by analyzing the obtained chromatograms (FIG. 3) in the same manner for the above-described n-GSH solution alone and the cinnamaldehyde solution alone, respectively (FIGS. 1 and 2). Compared with. As a result, a peak that was not recognized in the chromatogram obtained by analyzing the sample in which only the n-GSH solution was kept warm and the sample in which only the cinnamaldehyde solution was kept warm was detected. A mixture of the n-GSH solution and the cinnamaldehyde solution was subjected to LC-MS under the conditions described below. From the MS spectrum corresponding to the peaks observed only in the mixed solution of the n-GSH solution and the cinnamaldehyde solution (FIG. 4), the mass number of the compound corresponding to these peaks was estimated to be 626. The mass number corresponds to the mass number of a compound obtained by dehydration condensation of n-GSH and cinnamaldehyde.

[HPLC測定条件]
島津製作所製LC-10Avp
カラム：L-column(4.6μm，5mmφ×15cm)
カラム温度：40℃
流量：1mL/min
ピーク検出：紫外吸光度検出器（検出波長：220nm）の次に蛍光検出器(励起波長：470nm、蛍光波長：530nm)を直列に繋いで行った。
溶出液A：蒸留水にトリフルオロ酢酸を0.1%添加した溶液
溶出液B：アセトニトリルにトリフルオロ酢酸を0.1%添加した溶液
溶出条件：溶出液Aが90%、溶出液Bが10%の割合で混合された溶出液で平衡化されたカラムにサンプルを注入した後、15分かけて溶出液Bの割合を10%から99%に上げながら溶出液Aと溶出液Bの混合液を流し、溶出液Bが99%の割合に達してから5分間その割合を保持した。
[LC-MS設定条件]
LC装置：アジレント製Agillent1100
その他LC条件：上記[HPLC測定条件]に同じ
MS装置：サーモフィッシャーサイエンティフィック製LCQ DECA XP Plus
イオン化：ESI法
スプレー電圧：5kV
キャピラリー温度：250℃ [HPLC measurement conditions]
Shimadzu LC-10Avp
Column: L-column (4.6μm, 5mmφ × 15cm)
Column temperature: 40 ° C
Flow rate: 1mL / min
Peak detection: An ultraviolet absorbance detector (detection wavelength: 220 nm) was followed by a fluorescence detector (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 530 nm) connected in series.
Eluent A: Solution containing 0.1% trifluoroacetic acid in distilled water Eluent B: Solution containing 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile Elution conditions: 90% eluent A and 10% eluent B After injecting the sample into the column equilibrated with the mixed eluate, the mixture of eluent A and eluent B is allowed to flow while increasing the ratio of eluent B from 10% to 99% over 15 minutes. The ratio was maintained for 5 minutes after liquid B reached 99%.
[LC-MS setting conditions]
LC system: Agilent 1100 made by Agilent
Other LC conditions: Same as above [HPLC measurement conditions]
MS equipment: Thermo Fisher Scientific LCQ DECA XP Plus
Ionization: ESI spray voltage: 5kV
Capillary temperature: 250 ° C

［比較例１］
シンナムアルデヒド(皮膚感作性陽性。質量132)を2mg/mL(15mM)となるようアセトニトリルに溶解した溶液0.1mLと、グルタチオン(以下、GSHと記す。質量307)を10mg/mL(33mM)となるよう0.1M NaHPO₄-Na₂HPO₄水溶液(pH7)に溶解した溶液0.1mLとを混合し、44℃で保温した後、水−アセトニトリル混液（１：１）1.5mLで希釈し、その10μLを実施例１に記載の条件にてHPLCに供した。得られたクロマトグラムを（図７）を、上記のGSH溶液のみを保温したもの及びシンナムアルデヒド溶液のみを保温したものそれぞれを同様に分析して得られたクロマトグラム（図５及び図６）と比較した。その結果、GSH溶液のみ保温したもの及びシンナムアルデヒド溶液のみを保温したものを分析して得られるクロマトグラムには認められないピークが検出された。上記のGSH溶液とシンナムアルデヒドとの溶液の混合液を、実施例6に記載の条件にてLC-MSに供したところ。上記のGSH溶液とシンナムアルデヒド溶液との混合液のみに認められるピークに相当するMSスペクトル（図８）から、これらのピークに相当する化合物の質量数は439と推定された。該質量数はn-GSHとシンナムアルデヒドとがマイケル付加してなる化合物の質量数と一致する。
GSHとn-GSHの結合物同定能力を比較するため実施例6及び比較例１における結合物の合計ピーク面積を比較した（表１）。混合実験に使用したn-GSH又はGSH及びシンナミルアルデヒドとの使用量(mmol)でそれぞれ除した値を比較したところ、結合物を同定する際にn-GSHを用いて蛍光検出した場合は、UV検出を用いた場合と比較して約１００倍の感度が得られると計算できる。
さらに、結合物の判断の容易さを比較すると、n-GSHを用いて蛍光検出した場合はクロマトグラム上に認められるピークは結合物と未反応のn-GSH由来ピークのみであり、結合物を容易に判定できる。
一方、GSHを用いてUV検出で結合物を同定する場合は被験物質であるシンナムアルデヒド中の夾雑物やグラジエント溶出によるベースラインの盛り上がり、ブランクピークの存在などにより感作性物質が微量であれば結合物を判定することは難しい。 [Comparative Example 1]
Cinnamaldehyde (positive skin sensitization. Mass 132) dissolved in acetonitrile to 2 mg / mL (15 mM) and 0.1 mL of glutathione (hereinafter referred to as GSH. Mass 307) were 10 mg / mL (33 mM). After mixing with 0.1 mL of a solution dissolved in 0.1M NaHPO ₄ -Na ₂ HPO ₄ aqueous solution (pH 7) and incubating at 44 ° C., diluted with 1.5 mL of a water-acetonitrile mixture (1: 1), 10 μL Was subjected to HPLC under the conditions described in Example 1. The obtained chromatogram (FIG. 7) is a chromatogram (FIGS. 5 and 6) obtained by analyzing the above-described GSH solution alone and the cinnamaldehyde solution alone, respectively. Compared. As a result, a peak that was not recognized in the chromatogram obtained by analyzing the sample in which only the GSH solution was kept warm and the sample in which only the cinnamaldehyde solution was kept warm was detected. A mixture of the above GSH solution and cinnamaldehyde solution was subjected to LC-MS under the conditions described in Example 6. From the MS spectrum (FIG. 8) corresponding to the peaks observed only in the mixed solution of the GSH solution and the cinnamaldehyde solution, the mass number of the compound corresponding to these peaks was estimated to be 439. The mass number corresponds to the mass number of the compound formed by Michael addition of n-GSH and cinnamaldehyde.
In order to compare the binding ability of GSH and n-GSH, the total peak areas of the binding materials in Example 6 and Comparative Example 1 were compared (Table 1). When n-GSH or GSH and cinnamylaldehyde used in the mixing experiment were each divided by the amount used (mmol), the fluorescence was detected using n-GSH when identifying the bound product. It can be calculated that about 100 times the sensitivity is obtained compared to the case of using UV detection.
Furthermore, when comparing the ease of judgment of the bound product, when fluorescence detection is performed using n-GSH, the peak observed on the chromatogram is only the peak derived from the bound product and unreacted n-GSH. Easy to judge.
On the other hand, when using UV detection with GSH to identify binding substances, if the sensitizing substance is in a trace amount due to contamination in the test substance cinnamaldehyde, the rise of the baseline due to gradient elution, the presence of a blank peak, etc. It is difficult to determine the binding.

蛍光グルタチオン溶液のみ保温したものの液体クロマトグラムである。n-GSHは蛍光グルタチオンのピークを示す。It is a liquid chromatogram of only the fluorescent glutathione solution kept warm. n-GSH shows the peak of fluorescent glutathione. シンナムアルデヒド溶液のみ保温したものの液体クロマトグラムである。It is a liquid chromatogram of only the cinnamaldehyde solution kept warm. 蛍光グルタチオン溶液とシンナムアルデヒド溶液の混合液を保温したものの液体クロマトグラムである。シンナムアルデヒド・n-GSH結合物は、蛍光グルタチオン溶液のみ保温したもの及びシンナムアルデヒド溶液のみ保温したものの液体クロマトグラムでは検出されなかったピークである。It is a liquid chromatogram of what kept the liquid mixture of a fluorescent glutathione solution and a cinnamaldehyde solution. The cinnamaldehyde / n-GSH conjugate is a peak that was not detected in the liquid chromatogram of the one that was kept warm only for the fluorescent glutathione solution and the one that was kept warm only for the cinnamaldehyde solution. シンナムアルデヒド・n-GSH結合物のESI-MSスペクトルである。It is an ESI-MS spectrum of a cinnamaldehyde / n-GSH conjugate. グルタチオン溶液のみ保温したものの液体クロマトグラムである。GSHはグルタチオンのピークを示す。It is a liquid chromatogram of only the glutathione solution kept warm. GSH indicates a glutathione peak. シンナムアルデヒド溶液のみ保温したものの液体クロマトグラムである。It is a liquid chromatogram of only the cinnamaldehyde solution kept warm. グルタチオン溶液とシンナムアルデヒド溶液の混合液を保温したものの液体クロマトグラムである。シンナムアルデヒド・GSH結合物は、グルタチオン溶液のみ保温したもの及びシンナムアルデヒド溶液のみ保温したものの液体クロマトグラムでは検出されなかったピークである。It is a liquid chromatogram of what kept the liquid mixture of a glutathione solution and a cinnamaldehyde solution. The cinnamaldehyde / GSH conjugate is a peak that was not detected in the liquid chromatogram of the one that was kept warm only for the glutathione solution and the one that was kept warm only for the cinnamaldehyde solution. シンナムアルデヒド・GSH結合物のESI-MSスペクトルである。It is an ESI-MS spectrum of a cinnamaldehyde / GSH conjugate.

Claims

(A) mixing the fluorescent cysteine derivative and the test substance; and
(B) A method for sensitizing a chemical substance comprising a step of determining the presence or absence of a bound substance by instrumental analysis , wherein the fluorescent cysteine derivative is represented by formula (1)

(In the formula, R ¹ and R ² are the same or different, and represent a fluorescent dye, a hydroxyl group, an amino group which may have a substituent, an alkoxy group which may have a substituent, and a substituent. It is selected from the group of phenoxy groups that may be present , at least one of R ¹ and R ² is a fluorescent dye, and the fluorescent dye is represented by the formula (2)

(Wherein R ³ represents any of a nitro group, an unsubstituted aminosulfonyl group, a sulfonic acid group, and an ammonium sulfonic acid group, or has a substituent such as an alkylamino group or a quaternary ammonium group) Represents a good alkylaminosulfonyl group, X, Y and Z each independently represents an integer of 0 to 20. R ⁴ represents a direct bond or —O—, —CH ₂ —, —NHCOO—, —CONH—; , —COO—, —SO ₂ NH—, —HN—C (═NH) —NH—, —S—, —NR—, —NAr—, —CH═CH—, —C≡C—, —Ar -Represents at least one group selected from the group consisting of -CO-Ar-NR-, wherein R represents an alkyl group, and Ar represents an aryl group.
R ⁵ represents —NH—, —O— or —S—. )
It is a fluorescent dye represented by. )
A cysteine derivative represented by the formula: cysteinyl-N- [2- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -ethyl] -amide, {4-amino-4- [ 2- (7-Nitrobenzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -ethylcarbamoyl] -butyryl} -cysteinyl-glycine, phenylalanyl-threonyl-leucinyl-cysteinyl-phenylalanyl-arginyl-N -[2- (7-Nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -ethyl] -amide, acetyl-arginyl-phenylalanyl-alanyl-alanyl-cysteinyl-alanyl-alanyl-N -[2- (7-Nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -ethyl] -amide, cysteinyl-N- [3- (7-nitro-benzo [1,2,5 ] Oxadiazol-4-ylamino) -propyl] -amide, {4-amino-4- [3- (7-nitrobenzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino)- Propylcarbamoyl] -butyryl} -cysteinyl-glycine, phenylalanyl-threonyl-leucinyl-cysteinyl-phenylalanyl-arginyl-N- [3- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazole-4 -Ylamino) -propyl] -amide, acetyl-arginyl-phenylalanyl-alanyl-alanyl-cysteinyl-alanyl-alanyl-N- [3- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazole-4 -Ylamino) -propyl] -amide, cysteinyl-N- [5- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -3-oxa-pentyl] -amide, {4- Amino-4- [5- (7-nitrobenzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -3-oxa-pentylcarbamoyl] -butyryl} -cysteinyl-glycine, phenylalanyl-threonyl-leucinyl- Cysteinyl-phenylalanyl-arginyl-N- [5- (7-nitro-ben [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -3-oxa-pentyl] -amide, acetyl-arginyl-phenylalanyl-alanyl-alanyl-cysteinyl-alanyl-alanyl-N- [5- (7 -Nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -3-oxa-pentyl] -amide, cysteinyl- [2- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazole -4-ylamino) -ethyl] -ester, {4-amino-4- [2- (7-nitrobenzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -ethoxycarbonyl] -butyryl} -cysteinyl- Glycine, phenylalanyl-threonyl-leucinyl-cysteinyl-phenylalanyl-arginyl- [2- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-ylamino) -ethyl] -ester or acetyl- Arginyl-phenylalanyl-alanyl-alanyl-cysteinyl-alanyl-alanyl- [2- (7-nitro-benzo [1, 2,5] Oxadiazol-4-ylamino) -ethyl] -ester .

The sensitization assay method according to claim 1, wherein the instrumental analysis means is liquid chromatography.

The sensitization assay method according to claim 1 or 2 , wherein the liquid chromatography detector is a fluorescence detector.

The sensitization assay method according to claim 1, wherein the liquid chromatography detector is a mass spectrometer.

Formula (1)

(In the formula, R ¹ and R ² are the same or different, and represent a fluorescent dye, a hydroxyl group, an amino group which may have a substituent, an alkoxy group which may have a substituent, and a substituent. It is selected from the group of phenoxy groups that may be present, at least one of R ¹ and R ² is a fluorescent dye, and the fluorescent dye is represented by the formula (2)

(Wherein R ³ represents any of a nitro group, an unsubstituted aminosulfonyl group, a sulfonic acid group, and an ammonium sulfonic acid group, or has a substituent such as an alkylamino group or a quaternary ammonium group) Represents a good alkylaminosulfonyl group, X, Y and Z each independently represents an integer of 0 to 20. R ⁴ represents a direct bond or —O—, —CH ₂ —, —NHCOO—, —CONH—; , —COO—, —SO ₂ NH—, —HN—C (═NH) —NH—, —S—, —NR—, —NAr—, —CH═CH—, —C≡C—, —Ar -Represents at least one group selected from the group consisting of -CO-Ar-NR-, wherein R represents an alkyl group, and Ar represents an aryl group.
R ⁵ represents —NH—, —O— or —S—. )
It is a fluorescent dye represented by. )
A fluorescent cysteine derivative represented by:

The fluorescent cysteine derivative has the formula (3)

The fluorescent cysteine derivative according to claim 5 , which is a compound represented by the formula:

The fluorescent cysteine derivative has the formula (4)

The method for assaying sensitization according to any one of claims 1 to 4 , wherein the fluorescent cysteine derivative is the fluorescent cysteine derivative according to any one of claims 5 to 7 .