JP5225590B2 - 保護及び再生用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、保護及び再生用組成物に関する。本発明は、特に、ブドウの芽の抽出物を含む美容上有効な第一の成分と、エクトイン型又はエクトイン系統の成分（以下「エクトイン成分」）を含む美容上有効な第二の成分との会合物を含む組成物に関する。更に詳細には、上記第二の成分が、エクトイン、ヒドロキシエクトイン及びこれらの混合物から選択される。

更に詳細には、本発明は、皮膚に対して局所的に塗布され、かかる組成物を含む美容用組成物に関する。

更に本発明は、かかる組成物で美容処置を必要とする人の皮膚に対して局所的に施す作業を含む美容処置方法に関する。

特許文献１は、乾燥したブドウの木の芽からレスベラトール及び／又はビニフェリンを抽出する方法を開示している。ビニフェリンはレスベラトールのダイマーとされている。更に特許文献１において、レスベラトールはモノマーの形が一般的であるが、モノマー４つまでを含むオリゴマーとしても存在することを開示している（１頁、１１〜１７行目）。

乾燥した芽を用いるのが重要であると強調されているが、それは芽からのレスベラトール及びビニフェリンの産出量が、新鮮な芽を用いて得られる場合よりも顕著に多いからである（２頁３１行目〜３頁２行目）。

特許文献１では、ブドウから得られる市販の抽出物と比較しレスベラトールを１０００倍以上の濃度で含むブドウのツルの抽出物を得る可能性や、レスベラトール高含有量の液体、粉末又はタブレットの調剤が、かかる物質の一般的な産業的利用に適合することに関する記載、また医薬、食用及び美容（化粧品）の各分野に関する一般的に記載が存在する（５頁２５〜３２行目及び請求項１８）。

更に、上記特許文献ではブドウの木の芽を野外で乾燥させることに関する記載が存在するが、それは４ヶ月以下の期間である（実施例１：４ヶ月の乾燥、実施例２：３ヶ月の乾燥、実施例３：最も長い乾燥が３ヶ月）。
国際公開第０１／０３７１３号パンフレット

本発明の一つの主な課題は、有効成分による相乗効果が見られる会合物を含む新規な組成物、更に詳細には、皮膚に対して局所的に施される美容用組成物を提供することである。

本発明の他の主な課題は、美容上許容される有効成分、すなわち皮膚に対する感知できる毒性のない有効成分から得られる上記の組成物を提供することにあり、かかる有効成分は、美容産業規模での美容用組成物の製造に用いる場合に適正価格で多量に得られる。

本発明の他の主な課題は、レスベラトール、好ましくはそのオリゴマーを一定の含有量で含む組成物を提供することである。

本発明は、美容産業規模での実施が容易な方法で、上記の課題を即座に解決することができる。

すなわち、第一の実施態様によると、本発明は、乾燥させたブドウの木の芽の抽出物を含む美容上有効な第一の成分と、エクトイン型の成分を含む美容上有効な第二の成分との会合物（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を含む組成物を提供する。

本発明において、「エクトイン型の成分」なる用語は、少なくとも１個のＣ_１−Ｃ_６低級アルキル基によって特に２位で置換され、及び／又は少なくとも１個のヒドロキシル基又はメトキシ基によって特に５位で置換されている、（Ｓ）−１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−４−カルボン酸、及びその美容上許容される塩又はエステルを意味すると解される。

上記第二の成分は、エクトイン又は（Ｓ）−１，４，５，６−テトラヒドロ−２−メチルピリミジン−４−カルボン酸、及びヒドロキシエクトイン又は（Ｓ，Ｓ）−１，４，５，６−テトラヒドロ−５−ヒドロキシ−２−メチルピリミジン−４−カルボン酸、並びにそれらの美容上許容される塩又はエステルから選択されるのが好ましい。

本発明における他の特定の実施態様において、かかる組成物は、０．１質量％〜２０質量％、好ましくは０．１質量％〜１０質量％の第一の成分と、０．１質量％〜２０質量％、好ましくは０．１質量％〜１０質量％の第二の成分とを含むが、これら２種類の成分の合計は、組成物の全質量に対して２０質量％以下であるのが好ましく、より好ましくは１０質量％以下である。

本発明における他の実施態様において、第一の成分及び第二の成分それぞれの質量割合は１／１０〜１０／１の範囲であり、特に約１／１である。

本発明における特定の一実施態様において、第二の成分は、エクトインとヒドロキシエクトインとの、実質的に等しい質量割合における混合物である。

第二の実施態様によると、本発明は更に、上記の組成物又は以下の記載から得られる組成物を、美容上許容される賦形剤と共に含む、皮膚に対して局所的に施される美容用組成物に関する。

他の変形例において、上記組成物は、少なくとも１種の美容上有効な他の成分、特に老化防止活性を有する（特に皮膚の老化を予防、修正又は遅延させる（例えばビタミンＡ、ビタミンＥ又はビタミンＣ））美容上有効な他の成分、皮膚の活性化をケアする美容上有効な成分（例えばマデカッソシド（ｍａｄｅｃａｓｓｏｓｉｄｅ））、保湿効果を有する美容上有効な成分（例えばエクジステロイド又はエクジステロイドを含む植物抽出物、例えばＡｊｕｇａ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａの抽出物）、又は化学線から保護するための美容上有効な成分（例えば美容上許容される物理的又は化学的日焼け止め剤、例えばメトキシケイ皮酸エステル）を含む。

第三の実施態様によると、更に本発明は、美容処置を必要とする人の皮膚に対して、上記の組成物又は上記の美容組成物又は以下の記載より得られる美容組成物を局所的に施す美容処置方法に関する。

上記の方法における特定の一変法において、美容処置は、老化防止処置（特に皮膚の老化を予防、修正又は遅延させるための処置）、及び皮膚の活性化処置からなる群から選択される。そのような皮膚の老化対策は、主として加齢又は化学線による皮膚の老化対策が含まれる。

本発明において、ブドウの木の芽の抽出物を含む美容上有効な第一の成分と、エクトイン型の成分を含む美容上有効な第二の成分との会合物から得られる相乗効果を明らかにすることができる。

本発明において、ブドウの木の芽の抽出物は、ブドウ園で栽培されたブドウの木の芽から得られる抽出物である。種々のブドウの木の芽を用いることが可能であり、特にメルロー種、カベルネ・フラン種、ガメー種、シラー種、セミヨン種及びソーヴィニョン種等が使用可能である。本発明による好ましいブドウの木の芽は、セミヨン種及び／又はソーヴィニョン種の芽である。

特定の一実施態様において、乾燥させたブドウの木の芽を使用する。乾燥させたブドウの木の芽は、芽の水分含量が好ましくは２０質量％未満、より好ましくは５質量％未満となるような乾燥工程を行った芽を意味すると解される。

特定の一変法において、外気若しくは乾燥した場所での自然乾燥、又は中程度の温度、例えば約４０℃を超えない温度の炉中における乾燥法により、水分含量が２０質量％以下、好ましくは５質量％以下となるまで芽を乾燥させる。

例えば、上記特許文献で推奨された方法で、乾燥した場所、外気にて自然に乾燥させ、特に少なくとも２ヶ月、好ましくは少なくとも４ヶ月の期間乾燥させることができる。

外気中でのかかる自然乾燥は、その後の有効成分の抽出、及び特にレスベラトールのオリゴマー形成にとって好ましい。

本発明において用いられるブドウの木の芽の抽出物は、ポリフェノール分子、特に本発明において美容効果を得る場合に必要となるレスベラトールのオリゴマーを豊富に含む抽出物を最終的に産出する方法によって得るのが好ましい。

本発明における好ましい一実施の形態において、その抽出処理は、主として以下の工程を含む：
ａ）ブドウ園からブドウの木の芽を収穫する工程、
ｂ）最低４ヶ月間乾燥させる工程、
ｃ）極性有機溶媒、例えばＣ_１−Ｃ_６低級アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール又はヘキサノールの純粋品、又はその水若しくは水性溶媒との混合物、又はケトン（特にアセトン）、又はケトンと水の混合物を用いて少なくとも１回抽出し、第一の極性溶媒抽出物を形成する工程、
ｄ）第一の極性溶媒抽出物を、非プロトン性有機溶媒、例えばヘキサンで少なくとも１回洗浄して、第二の抽出物（それ自体使用可能）を得る工程、
ｅ）必要に応じて、更に高純度に精製された抽出物を必要とする場合には、カラム、好ましくはシリカカラムを用い、そこに所望の有効物質、主としてポリフェノール物質及び特にレスベラトールのオリゴマーを固定し、次いで適当な溶出混合物、例えば酢酸エチル／ヘキサンの特に８０／２０（ｖ／ｖ）の割合の酢酸エチル／ヘキサン混合液で選択的に溶出し、第三の、高純度に精製された抽出物（それ自体使用可能）を得る工程、及び
ｆ）必要に応じて、上記の溶出溶媒を、特に蒸発により除去してもよく、これにより、本発明の好ましい最終的なブドウの木の芽の抽出物を構成するベージュ色の粉末を得る工程、を含む。

本発明の特定の一変法において、最終の粉末をアルコール／水混合液、例えば８０／２０（ｖ／ｖ）の割合の水／アルコール混合液、特にブチレングリコール／水の８０／２０（ｖ／ｖ）混合液に再溶解してもよい。

８０／２０（ｖ／ｖ）のアルコール／水混合液に再溶解させた粉末を用い、少なくとも約１％、好ましくは少なくとも１０％の、レスベラトールのダイマーであるビニフェリンの最終溶液を得る。

エクトイン型の成分を含む美容上有効な第二の成分は市販されている。例えば、「ＲＯＮＡＣＡＲＥ」（登録商標）ヒドロイン（ｈｙｄｒｏｉｎｅ）という商品名でメルク社から発売されている製品が使用可能である。このようなメルク社の市販品は特に有用である。なぜなら、エクトイン及びヒドロキシエクトインの含有比率が実質的に等しいからである（５０質量％〜６０質量％のエクトイン、４０質量％〜５０質量％のヒドロキシエクトイン）。更に、かかる製品は、酸化防止剤及び防腐剤の添加を必要とすることなく、極めて良好な安定性を有し、また美容的な等級である。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、本発明の実施例に関する以下の説明的な記載から明確に認識されるが、それらは説明のために示されているのみであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

実施例において、特段の断りがない限り、全てのパーセンテージは質量％で示され、温度は摂氏温度であり、また圧力は大気圧である。

Ｉ３と称される本発明のブドウの木の芽の抽出物の製造方法
本発明において、抽出処理は、主として以下の工程を含む。
ａ）１ｋｇの、ソーヴィニョン種によるブドウの木の芽を、ボルドーの南東に位置するブドウ園から３月から４月にかけて収穫する工程。
ｂ）回収されたブドウの木の芽を、乾燥所で空気中にて４ヶ月以下に亘って乾燥させ、水分含量を５質量％未満とする工程。
ｃ）抽出を行うために、乾燥したブドウの木の芽を４ｍｍ未満の平均粒径に粉砕する工程。少なくとも１回の抽出工程は、極性有機溶媒を用いて、アセトンの場合、溶媒に対する粉砕した芽の質量割合が少なくとも１／１０で、室温又は３０℃程度の温度条件下、少なくとも２０時間に亘って行なった。固体の残留物を濾過によって除去した。
抽出物溶液を含むアセトン溶液からアセトンを蒸発させ、実質的に乾燥した、第一の粗抽出物を得て、これを、５０／５０（ｖ／ｖ）の割合のエタノール／水混合液に再溶解させた（約３０ｇを計量した粗抽出物に対して約２２５ｍｌの上記の溶媒を必要とする）。抽出物溶液を含む水／エタノール溶液を室温又は２５〜３０℃の温度で１時間に亘って撹拌し、次いで濾過によって上澄みを分離した。
精製された固体の抽出物は、エタノールの完全な蒸発による除去、又はエタノールの部分的な蒸発除去を行って、精製された抽出物の沈殿を生じさせ、これを一般的な方法で乾燥し、精製された抽出物を粉末の状態で得た。
ｄ）上記の精製された抽出物はその後、これにより得られた粉末を、８０／２０（ｖ／ｖ）の割合のアセトン／水混合物に再溶解して再び精製された。
二層溶液となるまでヘキサンを添加した。有機層は主としてヘキサンからなり、水層は主としてアセトン／水混合物を含んでいた。すなわち、室温条件下で数分間、例えば約１０分間に亘って激しく撹拌し、抽出を行った。
混合物を静置して、デカンテーションによって層を分離した。
所望の精製された芽抽出物を含む水層を回収した。
ｅ）溶媒を蒸発させて、所望の精製した第一の芽抽出物を得て、それをそのままで使用した（本発明における生成物「Ｉ１」）。
ｆ）生成物をシリカカラムで精製するのが好ましく、これにより、所望の有効物質、主としてポリフェノール物質（特にレスベラトールのオリゴマー）が固定される。本実施例で用いられたシリカカラムは、メルク社のタイプ６０シリカの充填されたカラムである。その後、シリカに固定されたポリフェノール物質を、カラムに導入される乾燥抽出物１ｇに対して１Ｌの溶媒の割合で、８０／２０（ｖ／ｖ）の割合の酢酸エチル／ヘキサン混合液を含む溶出溶媒で選択的に溶出した。
ｇ）溶出溶媒を、特に蒸発によって除去し、本発明の第二のブドウの木の芽の最終精製抽出物を構成するベージュ色の粉末を得（「Ｉ２」と称する）、更に、
ｈ）好ましくは、かかる最終粉末Ｉ２をアルコール／水混合液に再溶解（ブチレングリコール／水の場合には、８０／２０（ｖ／ｖ）の割合の混合物に再溶解）させた。なお、それを組成物、特に美容用組成物として使用することが可能である。

本発明による上記の再溶解化粉末（抽出物「Ｉ３」と称する生成物）の分析の結果、約６８％のレスベラトールのオリゴマーを含み、その約２４％がビニフェリンであった。

本発明の組成物
実施例１により得られる、約６８％のレスベラトールのオリゴマーを含む抽出物Ｉ３を５０質量％、及び市販のエクトイン型の成分、すなわちメルク社製のヒドロイン「ＲＯＮＡＣＡＲＥ」（登録商標）を約５０質量％含む組成物を調製した。

かかる組成物を種々の割合で希釈し、以下の実施例に係る実験を行った。

細胞成長実験
［Ａ．細胞成長モデル］
実施例２の組成物に関し、ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ社製の「Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ ＩＩ」と称される市販のＸＴＴ試験キットを用い、細胞増殖に対する組成物の影響を測定した。

かかるモデルでは、テトラゾリウム塩を、ミトコンドリア呼吸鎖に存在する脱水素酵素によってホルマザン（市販の蛍光分光計、例えば「ＴＥＣＡＮ」（商標）分光計で４５０ナノメートルにて検出される橙色の化合物）に変換される。すなわち、生細胞だけがホルマザンを形成することができる。
反応は以下の通りである：

細胞を、本発明による実施例２の組成物で２４時間に亘って処理した。ここでは、２種類の有効成分をそれぞれ１．５６μｇ／ｍｌの濃度に希釈（すなわち、１．５６μｇ／ｍｌの実施例２の組成物、及び１．５６μｇ／ｍｌのメルク社製の「ＲＯＮＡＣＡＲＥ」（登録商標））し、あるいは比較実験として、実施例２の組成物又はヒドロイン製品である「ＲＯＮＡＣＡＲＥ」（登録商標）のみの溶液（濃度は同一の合計濃度を有するように３．５２μｇ／ｍｌとした）を調製したものを用いた。

ＸＴＴ試験で３時間毎に測定し、細胞増殖動態を追跡した。

実験開始後、考慮に入れる最初の時間、すなわち６時間目を、１００％の細胞とすることに留意すべきである。Ｔ０又はＴ３を使用することは不可能であり、その理由はおそらく培地の変更による摂動に起因して、標準偏差が極めて大きくなるからである。

［Ｂ．処理の手順］
Ｄ０日
Ｄ０日に、当業者等に周知の、ＨａＣａｔ型の不死化形質転換ヒトケラチノサイト（Ｊｏｕｒｎｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２００４， ２７巻， Ｎｏ２， １４７−１４９頁におけるＰＯＺＺＩ等の記事を引用したｈｔｔｐ：／ｃａｔ．ｉｎｉｓｔ．ｆｒ／？ａＭｏｄｅｌｅ＝ａｆｆｉｃｈｅＮ＆ｃｐｓｉｄｔ＝１５６８８１３２？を参照されたい）を、９６穴マイクロプレートに、１ウェル当たり１０，０００個の細胞で培養した。

Ｄ２４日
Ｄ２４日に、表示された濃度にて上記の所望の生成物での処理を開始し、細胞を増殖させた。

［Ｃ．３時間＝Ｔ３、６時間＝Ｔ６、９時間＝Ｔ９、１５時間＝Ｔ１５及び１８時間＝Ｔ１８での処理による効果の観察］
上記の標題に示されている処理の各段階で、培地（Ｇｉｂｃｏ社製の補完ＫＳＦＭ）を取り除いた。

細胞を、本発明の実施例２の組成物、又は抽出物Ｉ３のみ、又はメルク社から市販されているヒドロイン製品の「ＲＯＮＡＣＡＲＥ」（登録商標）で処理した。

その際、１／１６及び１／３２の希釈溶液を、非滅菌条件下、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）の５％原液を用い最初に調製し、単一の生成物の場合には３．１２ｍｇ／ｍｌに、会合物の場合には各生成物を１．５６ｍｇ／ｍｌに調整した。

その後、培地における１／１０００の希釈溶液をドラフト中で、会合物の場合は３．１２μｇ／ｍｌの最終濃度、各成分単独で１．５６μｇ／ｍｌに調整した。

すなわち、試験を行う際、以下の処理を行った。
−実施例１では、抽出物Ｉ３が３．１２μｇ／ｍｌであり、
−メルク社製のヒドロイン製品の「ＲＯＮＡＣＡＲＥ」（登録商標）が３．１２μｇ／ｍｌであり、
−会合物を含む本発明の実施例２の組成物の場合、実施例１のＩ３が１．５６μｇ／ｍｌ、メルク社製のヒドロイン製品の「ＲＯＮＡＣＡＲＥ」（登録商標）が１．５６μｇ／ｍｌである。

［Ｄ．試験の進行］
試験を進行させるために、マイクロプレートを反転させて培地を取り除いた。

細胞を１回リンス：２００μｌ／ウェルにて、細胞を３７℃のＰＢＳでリンスした。

補完ＫＳＦＭ培地での通常使用に向けて調製されている０．２ｍｇ／ｍｌ濃度のＸＴＴ溶液（１ｍｇ／ｍｌの原液を１／５に希釈した溶液）を、１００μｌ／ウェルの割合で添加した。

細胞のないブランクを準備した。

マイクロプレートをアルミニウム紙で包み、５％のＣＯ_２濃度のインキュベーター内にて３７℃で３時間培養した。

３時間の培養後、４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を市販のＴｅｃａｎ蛍光分光計で測定した。

得られた結果を以下に示す。
［Ｅ．結果の表示］
６時間＝Ｔ６の処理時間におけるウェル中の細胞を１００％とする。
生存率を、以下の式によって示す：
生存率％＝（ＯＤ×１００）／（ＯＤ対照−１００）

［結果］
結果を以下の表１に示す。

得られた結果を、図１の曲線において示す。

これらの結果より、優位のレスベラトールのオリゴマーを含む本発明の生成物Ｉ３と、ヒドロイン型の生成物との会合物を含む本発明による実施例２の組成物で処理された細胞の場合、無処理細胞又は実施例１の生成物Ｉ３又はメルク社製のヒドロイン製品の「ＲＯＮＡＣＡＲＥ」（登録商標）のみで処理された細胞と比較して、より持続的な増殖が観察された。

しかしながら、実施例１の生成物Ｉ３及びヒドロイン型の製品も、それぞれが低い活性を示すということに留意すべきである。

更に、本発明の組成物により、細胞成長のダイナミクスは、同一の１８時間の最終点と比較して、極めて良好である。

図２は、１８時間の処理時間における結果の比較を示し、本発明の会合物が相乗作用を有し、かかる作用は当業者等にとって全く予想されないものであることが明確に表されている。

抗フリーラジカル保護試験
モデル：３Ｄ試験（ＡＥＳ研究所）
かかる試験により、過酸化水素により生成されたヒドロキシルラジカルに対する分子のＤＮＡ保護効果を実証することができる。

酸化防止性又は抗フリーラジカル性を有する分子又は混合物を同定し、これによりヒトの細胞を活性酸素種（ＲＯＳ）に起因する酸化的損傷から保護する際、Ｂａｒｒｙ Ｈａｌｌｉｗｅｌｌにより確立された以下の３種類の基準を考慮に入れる必要がある。
−細胞中において分子が活性であることが証明されなければならず、純粋に化学的な試験は、示唆はするものの、実証はしないこと；
−分子は、生物学的酸化剤、すなわち細胞中に存在する酸化剤（オキシダント）に対して効果的でなければならず、所定の酸化防止剤が、所定の酸化剤に対して特定の保護作用を有していること；及び
−使用される酸化剤の濃度は、生体内で用いられる濃度に匹敵する必要があること。

酸化剤の専門家であるＢａｒｒｙ Ｈａｌｌｉｗｅｌｌによるこのような説明は、”Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃｈｅｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ”と題されたｊｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｙ（第４９巻、１３４１−１３４８頁）で１９９５年に発表された記事から引用されたものである。

すなわち、３Ｄ試験により、ＦｅＣｌ_２の存在下で過酸化水素により生成されたヒドロキシルラジカルに対する分子のＤＮＡ保護効果を実証することができる。

更に、細胞での３Ｄ試験は、Ｂａｒｒｙ Ｈａｌｌｉｗｅｌｌの基準を完全に満たす。

原理：
Ｓ．Ｆ．Ｒ．Ｉ．及びＩ．Ｐ．Ｂ．Ｓ． ＣＮＲＳのＴｏｘｉｃｏ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅチーム（トゥールーズ）は、マイクロプレートに回収されたＤＮＡに対する損傷を検出するシステム（３Ｄ試験）を開発した（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９５， ２３２， ３７−４２頁）。

ＤＮＡを感作させたウェルに吸着させ、その後に酸化剤を用いて培養する（過酸化水素＋鉄）。ヒト由来の精製された細胞抽出物に含まれる特異的なタンパク質複合体により生じた損傷が認識され、その後修復される。損傷の修復においては、損傷切除段階、及びその後の、ＤＮＡフラグメント又は切除された塩基の再合成が行われる。

修復合成段階中、修飾ヌクレオチド（ビオチン結合ｄＵＴＰ）がＤＮＡに取り込まれる。その後、かかるビオチン化ヌクレオチドを、ペルオキシダーゼ結合アビジン分子によって識別する。その後、ペルオキシダーの化学発光基質を転換し、放出されたシグナルを光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒｐｈｌｕｓ， Ｔｅｃａｎ）で測定する。測定されたシグナルの強度（以下「ＲＬＵ」と称する）は、ＤＮＡでの修復された損傷数の関数である。投与効果は、大部分の損傷の場合、６キロベースに対して１〜１５個の損傷が観察される。

かかるシステムは、全ての種類の損傷の修復が可能である。なぜなら、かかる調査の場合に調製され使用された細胞抽出物において、相互に異なるＤＮＡ損傷修復経路（ＮＥＲ及びＢＥＲ）が存在し、且つ活性を有するからである。従って、酸化的損傷はかかるシステムにおいて認識される。

［材料及び方法］
１． 材料
使用される試薬は、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９５， ２３２，３７−４２頁の記事に記載されている。

化学発光シグナルを、蛍光分光光度計（Ｔｅｃａｎ）を用いて測定した。

２． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ３Ｄ試験法
２．１ 試験サンプルの希釈
芽抽出物Ｉ３及びヒドロインのサンプルを、メタノールに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのストック濃度とした。

試験における濃度を、精製水を用いたストック液の連続希釈により調製した。全ての希釈溶液を２倍の濃度に調製し、過酸化水素＋ＦｅＣｌ_２の酸化溶液を１容添加することにより、所望の濃度とした。

修復シグナルの減少の特異性を検証するために、同一の希釈溶液（１倍）を、過酸化水素＋ＦｅＣｌ_２により損傷を与えたＤＮＡを同一とする条件において培養した。酸化剤の存在下で修復シグナルの落下が観察され、予め損傷を与えたＤＮＡにおいて十分なシグナル修正が見られなかった場合にのみ、希釈溶液は保護効果を示すとした。損傷を与えたＤＮＡでの修復シグナルの阻害は、例えば、サンプルとＤＮＡとの直接相互作用により説明可能であり、これらは修復タンパク質の複合体が、損傷に対してアクセスするのを遮断する効果を有する。

２．２ マイクロプレートのウェルに対する標的ＤＮＡの吸着
精製したプラスミドＤＮＡ（ｐＢＳ）（スーパーコイル状が大部分を占める）を、３０℃の条件下、穏やかに振動させながら感作されたウェルに３０分間接触させた。かかる条件下、ＤＮＡの吸着は定量的であった。

Ｈ_２Ｏ_２＋ＦｅＣｌ_２で予め損傷を与えたプラスミドＤＮＡからなる陽性修復対照を添加した。

２．３ 反応性酸素種に対するサンプルの保護作用に関する試験
ヒドロキシルラジカルＯＨ゜を、フェントン反応（過酸化水素＋ＦｅＣｌ_２）によって調製する。

フェントン反応：Ｈ_２Ｏ_２＋ＦｅＣｌ_２の混合物を添加することによって行う。

強力な電子親和性を有するこのラジカルは、極めて短い寿命である（１０^−９秒程度）。ゆえに、かかるラジカルはＤＮＡ塩基と極めて迅速に反応し、相互に異なる種類の損傷、例えば塩基の修飾又は損失を生じさせる。これらの極めて遺伝毒性の損傷を、修復システムによって認識する。

過酸化水素を、精製水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製の「ＭｉｌｌｉＱ」（登録商標））を用い４Ｍの濃度で調製した。ＦｅＣｌ_２を精製水を用い２Ｍの濃度で調製した。２種類の溶液を使用直前に同じ体積で希釈した。

かかる溶液を、使用直前に、同体積の、試験サンプルの異なる濃度の希釈溶液と混合した。吸着プラスミドＤＮＡを含むウェルに、５０μｌの該混合物を添加した。その後、全体を穏やかに振とうしながら３０℃にて３０分間培養した。

その後、酸化剤で多少の損傷を与えたＤＮＡのみを保持するようにリンス工程を行った。

その後、特異的修復複合体で損傷修復工程を行った。切除されたＤＮＡ鎖の再合成段階中に、ビオチン標識ヌクレオチドがＤＮＡに取り込まれる（振とうせずに、３０℃で３時間培養する）。

その後、リンス工程を行い、ＤＮＡに取り込まれなかったビオチンを除去した。

その後、ペルオキシダーゼ分子と結合させたアビジン分子でビオチンを認識する工程を行った（３０℃で１５分間穏やかに振とう）。

その後、更にリンス工程を行い、ビオチンに固定されず、ペルオキシダーゼ分子と結合したアビジンを除去した。

最後にペルオキシダーゼの化学発光基質を添加（３０℃で５分間穏やかに振とう）して修復反応を展開させる工程を行い、その後発光を測定した。

［結果の解析］
ＤＮＡに対する酸化的損傷の形成の保護割合又は阻害割合として示すことにより、結果を視覚化した。なお、０％の値は酸化剤単独で損傷を与えたＤＮＡの修復シグナルに相当する。

ＲＯＳの存在下での保護割合は、ＯＨ°又は^１Ｏ_２ラジカルに起因する損傷作用の相対的低下として以下のように算出される。

修復シグナルの非特異的阻害（ＲＯＳの不存在下）がしばしば観察された。これは、化合物とＤＮＡとの直接反応に起因すると考えられる（ウェルからのＤＮＡの脱離や、ＤＮＡと非特異的会合することによりその領域を覆い、その結果損傷修復タンパク質から遠ざけること等）。ゆえに、培養において試験化合物を予め損傷を与えたＤＮＡと共に含んだ対照群を加えている。かかる条件下でのシグナルの減少は、化合物の非特異的阻害を反映し、すなわち化合物の想定される抗フリーラジカル性とは無関係である。

ＲＯＳの存在下における修復の阻害は、以下の結果が考えられる。
−真の保護；
−試験分子とＤＮＡ又は処理されたマイクロプレートとの直接反応に起因する、損傷を与えたＤＮＡの修復効果の減少；及び
−これらの２種類の現象の同時発生。

ゆえに、非特異的な阻害を評価した。これは、予め損傷を与えたＤＮＡにより培養されたサンプルにおいて得られた結果から算出する。

特異的阻害又は特異的保護は、ＲＯＳの存在下での阻害と非特異的阻害との差に等しい。これは、分子単独に起因する抗フリーラジカル活性を反映する。

抗フリーラジカル保護試験
芽抽出物Ｉ３及びヒドロインのサンプルは、フリーラジカルに対する保護活性を示した。保護効果は本発明の組成物による処理において約４０％増大していた。

すなわち、２種類の分子の間で実際に相乗作用が存在することを示した。

推奨される投与は、芽抽出物／ヒドロイン成分の１／１会合物が０．１〜１０％の態様であった。

表２及び添付の図面３から、生成物Ｉ３及びヒドロイン生成物は、それぞれフリーラジカルに対する保護活性を示すことが明らかである。

対照的に、生成物Ｉ３及びヒドロイン生成物を組み合わせた本発明の組成物により、保護の効果が約４０％増大し、すなわち２種類の分子間における相乗作用が実証されたが、これは当業者等にとって全く予期しないことである。

本発明の会合物による抗フリーラジカル活性の証明
酸素フリーラジカル種が、様々な攻撃的な要因、例えば紫外線、ストレス及び炎症反応により皮膚内に形成される。

このような酸化的分子は、皮膚成分、例えば脂質、タンパク質、多糖類及び細胞ＤＮＡを攻撃し、これにより生物学的機能をかく乱する。

ブドウの木の芽の抽出物とエクトイン型の成分との、本発明による会合物の、皮膚への塗布後における保護作用を証明するために本実施例で用いられる試験は、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂｌ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９９８，２６，９９−１０７頁の、Ｐ．Ｇｉｒａｒｄ，Ｌ．Ｌｅｍｐｅｒｅｕｒ，Ｐ．Ｂｕｃｈｅ及びＬ．Ｖｉｏｌｉｎ等による”Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ， ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ， ｔｈｅ ｂａｓａｌ ｏｒ ＵＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｅｒｏｘｙｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｕｍ ｃｏｒｎｅｕｍ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｆｒｅｅ−ｒａｄｉｃａｌ−ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｓ”に記載の試験に基づく。

この試験の原理は、皮膚の表面に存在する酸素フリーラジカルと、ＤＣＦ＊で示される蛍光性の生成物をもたらすＤＣＦ（Ｈ）−ＤＡ（２’７’ジクロロフルオレシンジアセテート）により構成されるマーカーとの反応に基づいており、その蛍光を光度計で測定する。この蛍光を測定することにより、フリーラジカルの存在を定量化することができ、それにより保護生成物の活性の程度を測定することが可能となる。

健康な白人女性３０人を被験者とした。

試験される生成物を、前腕の内部の領域に２μｌ／ｃｍ^２の量で塗布する。それぞれ２時間おきに４回塗布するのが好ましい。

その後、被験者に、被験者が通常使用している洗浄物質を使用させ、あらゆるスキンケア製品を除去させた。

試験生成物を最初に塗布してから２４時間後、「Ｄ−Ｓｑｕａｍｅｓ」（登録商標）という商品名で市販されている透明な標準吸盤を用いて剥ぎ取るのが好ましい。

上記より除去される角質細胞の数を、「Ｓｑｕａｍｅｔｅｒ」という商品名で市販されている装置を用いて「Ｄ−Ｓｑｕａｍｅｓ」（登録商標）から透過する赤外線により測定し、測定された結果の統計的分析において角質の数を考慮に入れた。

その後、それぞれの「Ｄ−Ｓｑｕａｍｅｓ」（登録商標）の吸盤を、３７℃の条件下、ＤＣＦ＊を含むｐＨ７．４の６６ｍＭのリン酸緩衝溶液にて３２時間インキュベートした。「Ｆｌｕｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ」という商品名の光度計（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）で培養した後、この溶液の蛍光を定量した。

以下の生成物を試験した。
−生成物１（本発明）：質量換算で、１％の抽出物Ｉ３及び１％のメルク社のヒドロインである「ＲＯＮＡＣＡＲＥ」（登録商標）（以下「ヒドロイン」）を含むエマルジョン（クリーム）、
−生成物２（本発明）：１％の抽出物Ｉ３及び１．５％のヒドロインを含むローション、
−生成物３：ブドウの種子のポリフェノールを含むエマルジョン、
−生成物４：酸化防止剤として周知のイデベノンを０．５％含むエマルジョン、
−生成物５：１％のイデベノンを含むエマルジョン。

蛍光性の測定結果を以下の表３に示す。

すなわち、蛍光性と、存在するフリーラジカルの量との相関が見られ、上記の結果より、フリーラジカルの量が本発明の生成物の存在下で顕著に低下したことが明らかとなった。ゆえに、本発明の生成物は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける極めて良好な抗ラジカル活性を提供する。

本発明の組成物を用いた美容用の組成物に関する種々の実施例を以下に示すが、当業者は常法により異なる成分を用いて製剤化する。

本発明によるクリーム状の美容組成物
Ｓｔｅａｒｅｔｈ−２１（Ｂｒｉｊ７２１） ２．５％
ステアリン酸グリセリル（Ｔｅｇｉｎ） １．１
ステアリルアルコール ５
グリセリルトリカプレート／カプリレート １１．５
ブチレングリコール ３
グリセロール ２
防腐剤 ０．５
香料濃縮物 ０．５
水 ６２．４
実施例２の組成物 ５
メトキシケイ皮酸オクチル ７．５

ジェル状の美容組成物
グリセロール ３％
ＡＭＰＳポリマー（Ｓｅｐｉｇｅｌ ３０５） ３
水素化ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＣＯ−６０） ２
ポリエチレングリコール １．５
防腐剤 ０．５
香料濃縮物 ０．３
水 ８５．７
実施例２の組成物 ３
ベンゾフェノン４ １

ローション状の美容組成物
ブチレングリコール ３％
ＥＤＴＡ ０．１
可溶化剤 １
香料濃縮物 ０．３
アルコール ５
水 ８０．４７
実施例２の組成物 １０
ベンゾフェノン４ ０．１３

ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ社製の「細胞増殖キットＩＩ」として市販されているＸＴＴ試験キットを用いて行った細胞成長実験に記載の結果を示す。それぞれ、無処理のコントロール、ブドウの芽抽出物Ｉ３単独、「ヒドロイン」製品（メルク社製、「ＲＯＮＡＣＡＲＥ」）、抽出物Ｉ３及びヒドロインの組み合わせについての細胞増殖動態を、６時間、９時間、１５時間及び１８時間（横軸にプロット）の細胞増殖カイネティクスの測定値として示し、６時間目の細胞数（１００％とする）に対するパーセンテージ（縦軸にプロット）を示す（実施例３）。 図１に由来するグラフであり、無処理のコントロール、抽出物Ｉ３、「ヒドロイン」製品（メルク社製の「ＲＯＮＡＣＡＲＥ」）及び本発明による最終会合物（抽出物Ｉ３及びヒドロイン製品が混合している）による１８時間の細胞処理後の細胞数をパーセンテージとしてそれぞれ示す棒グラフであり、その会合物の相乗効果を示すものである。 抽出物Ｉ３、「ヒドロイン」製品（メルク社製、「ＲＯＮＡＣＡＲＥ」）及び２つの活性成分の会合物（横軸にプロット）に関する抗−フリーラジカル試験における保護の度合（％）（縦軸にプロット）を示す棒グラフであり、個々の生成物単独による場合と比較した、会合物により得られる予想以上の保護効果を示す。（実施例４）

Claims (22)

1. 乾燥したブドウの芽の抽出物を含む第一の美容活性成分と、エクトイン成分を含む第二の美容活性成分とを含み、前記エクトイン成分は非置換、又は少なくとも一つのＣ _１ −Ｃ _６ 低級アルキル基により置換され、及び／又は少なくとも一つのヒドロキシル基若しくはメトキシ基により置換された（Ｓ）−１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−４−カルボン酸、又はその美容上許容される塩若しくはエステルである、組成物。
2. 前記Ｃ _１ −Ｃ _６ 低級アルキル基が２−位に存在し、又は前記ヒドロキシル基若しくはメトキシ基が５−位に存在する、請求項１記載の組成物。
3. 前記第二の成分が、エクトイン、ヒドロキシエクトイン及びそれらの美容上許容される塩又はエステルから選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記第二の成分が、エクトインと、実質的に同等の質量割合のヒドロキシエクトインとの混合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記第一の成分を０．１質量％〜２０質量％、及び前記第二の成分を０．１質量％〜２０質量％含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記第一の成分を０．１質量％〜１０質量％、及び前記第二の成分を０．１質量％〜１０質量％含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記第一の成分及び前記第二の成分の合計が２０質量％以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記第一の成分及び前記第二の成分の質量割合が１／１０〜１０／１の間である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 乾燥ブドウの芽の抽出物を含む第一の美容活性成分と、エクトイン成分を含む第二の美容活性成分とを、美容上許容される賦形剤と共に含み、前記エクトイン成分は非置換、又は少なくとも一つのＣ _１ −Ｃ _６ 低級アルキル基により置換され、及び／又は少なくとも一つのヒドロキシル基若しくはメトキシ基により置換された（Ｓ）−１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−４−カルボン酸、又はその美容上許容される塩若しくはエステルである、皮膚への局所的な塗布のための美容用組成物。
10. 前記Ｃ _１ −Ｃ _６ 低級アルキル基が２−位に存在し、又は前記ヒドロキシル基若しくはメトキシ基が５−位に存在する、請求項９記載の組成物。
11. 前記第二の成分が、エクトイン、ヒドロキシエクトイン及びそれらの美容上許容される塩又はエステルから選択される、請求項９又は１０に記載の組成物。
12. 前記第一の成分を０．１質量％〜２０質量％、前記第二の成分を０．１質量％〜２０質量％含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 老化防止活性を有する美容活性成分、皮膚活性化に影響を及ぼす美容活性成分、保湿効果を有する美容活性成分、及び化学線から保護するための美容活性成分からなる群から選択される、少なくとも一つの更なる美容活性成分を含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 老化防止活性を有する前記美容活性成分がビタミンＡ、ビタミンＥ及びビタミンＣから選択され、皮膚活性化に影響を及ぼす前記美容活性成分がマデカッソシドであり、保湿効果を有する前記美容活性成分がエクジステロイド、エクジステロイドを含む植物抽出物及びＡｊｕｇａ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ抽出物から選択され、化学線から保護するための前記美容活性成分が美容上許容される物理的日焼け止め及び美容上許容される化学的日焼け止めから選択される、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記美容上許容される化学的日焼け止めがメトキシケイ皮酸エステルである、請求項１４に記載の組成物。
16. 乾燥ブドウの芽の抽出物を含む第一の美容活性成分と、エクトイン成分を含む第二の美容活性成分とを、美容上許容される賦形剤と共に含み、前記エクトイン成分は非置換、又は少なくとも一つのＣ _１ −Ｃ _６ 低級アルキル基により置換され、及び／又は少なくとも一つのヒドロキシル基若しくはメトキシ基により置換された（Ｓ）−１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−４−カルボン酸、又はその美容上許容される塩若しくはエステルである、皮膚への局所的な塗布のための美容用組成物を、美容処置を望む者の皮膚に対して局所的に施すことを含む、美容処置方法。
17. 前記Ｃ _１ −Ｃ _６ 低級アルキル基が２−位に存在し、又は前記ヒドロキシル基若しくはメトキシ基が５−位に存在する、請求項１６記載の方法。
18. 前記第二の成分がエクトイン、ヒドロキシエクトイン及びそれらの美容上許容される塩又はエステルから選択される、請求項１６又は１７に記載の方法。
19. 前記第一の成分を０．１質量％〜２０質量％、及び前記第二の成分を０．１質量％〜２０質量％含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記美容用組成物が、老化防止活性を有する美容活性成分、皮膚活性化に影響を及ぼす美容活性成分、保湿効果を有する美容活性成分及び化学線から保護するための美容活性成分からなる群から選択される、少なくとも一つの更なる美容活性成分を含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 老化防止活性を有する前記美容活性成分がビタミンＡ、ビタミンＥ及びビタミンＣから選択され、皮膚活性化に影響を及ぼす前記美容活性成分がマデカッソシドであり、保湿効果を有する前記美容活性成分がエクジステロイド、エクジステロイドを含む植物抽出物及びＡｊｕｇａ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ抽出物から選択され、化学線から保護するための前記美容活性成分が美容上許容される物理的日焼け止め及び美容上許容される化学的日焼け止めから選択される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記美容処置が老化防止処置及び皮膚活性化処置からなる群から選択される、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。

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