JP5250562B2

JP5250562B2 - 真菌を感染させた動物の被感染爪

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Publication number: JP5250562B2
Application number: JP2009547131A
Authority: JP
Inventors: 信雄久保田; 剛島村; 沙織長坂
Original assignee: Pola Pharma Inc
Current assignee: Pola Pharma Inc
Priority date: 2007-12-25
Filing date: 2008-12-25
Publication date: 2013-07-31
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Description

本発明は、真菌を感染させた動物の被感染爪、該爪を有する動物感染モデル、および該爪または動物感染モデルを用いた感染症治療薬の評価方法に関する。

近年、高齢化が進み、免疫能など生体機能が低下している老人において、感染症の問題が注目されるようになってきている。そのひとつとして、表在性真菌を原因微生物とする爪真菌症が挙げられる。これはトリコフィトン・メンタグロファイテスなどの通常は皮膚に真菌症を起こす真菌が爪で繁殖して起こす真菌症である。このような爪真菌症においては、爪がケラチンで構成される硬い組織であるため、皮膚真菌症で使用される抗真菌剤や抗真菌剤を含有する組成物が、爪の中に吸収されることが困難であり、爪から薬剤を投与し治療することには多くの障害が存する。このため、爪白癬に有用な薬剤の開発がなお困難であるのが現状であるが、その一因として爪白癬の好適な動物モデルが存在しないことが挙げられる。

たとえば、爪白癬症に対する抗真菌剤の効果を評価する動物感染モデルとして、モルモットの爪をサンドペーパーなどで擦過して傷つけ、これに真菌の分節分生子分散液をクローズパッチする方法などが知られているが（特許文献１）、このような方法では爪の表面のみにしか菌が付着せず、爪上に真菌は存在しても、爪内部まで変性を伴い、薬剤の配向性を阻害する爪白癬を再現しているとは言い難かった。このようなモデルにおいては、真菌は爪表面にしか存在しないため、爪に白濁部は生成せず、真菌が爪内で増殖分布している範囲は極めて少なく、かつ爪の深部まで菌の浸潤した爪白癬モデルではなかった。

その他にも、動物に真菌を感染させる方法はいくつか報告されているものの（非特許文献１〜３）、感染までの期間が６０日以上かかるなど非常に長く、しかも感染強度が低く爪の深部まで十分に真菌が浸潤するには至らず、再現性よく臨床病態を反映した感染モデルを作製するといった点では十分ではなかった。これは爪の構造と、白癬菌の宿主および寄生場所の選択特性によるものであると考えられるが、このような爪白癬モデルおよび動物感染モデルでは抗真菌剤の評価系として十分に機能することができない。また、爪真菌症については前述のようにいくつかの課題があり、評価期間や再現性の問題があるにもかかわらず、課題を解決するための動物感染モデルの検討はほとんど行われていない。
一方、動物感染モデルの作製方法として、動物の免疫力をステロイドの投与により低下させ、感染しやすい状態にしてから真菌を感染させる方法が報告されているが（非特許文献４）、これは免疫の低下が感染に影響を与えることが明らかであり、かつ感染の成立が極めて容易な眼球および眼球周辺の粘膜組織などに感染させた動物感染モデルに限られており、爪などに適用した例はない。
このように、爪白癬症などの適切な評価モデルもその的確な評価方法も、未だに確立していないのが現状である。

国際公開２００１／７６４３号公報特開２００１−１３３４４９号公報特開２００２−６５６９５号公報特開２００１−１３３４４９号公報 Antimicrobial agents and chemotherapy, 46(12), p.3797-3801 (2002) Microbiol.Immunol., 47(2), p143-146 (2003) Mycoses, 48, p108-113 (2004) Jpn. J. Infect Dis., 60, p.33-39 (2007)

したがって、本発明は、抗真菌剤の十分な評価に供することができる、真菌を十分に感染させた動物の被感染爪、および該爪を有する動物感染モデルを作製すること、ならびに該爪および該動物感染モデルを用いた爪白癬などの難治性感染症の治療薬の開発に有用な評価方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、抗真菌剤の臨床効果を評価するための、臨床的に観察される爪白癬のモデルとなる被感染爪を求めて鋭意研究を重ねる中で、免疫低下手段により予め動物の免疫能を低下せしめた上で、真菌を爪に接種して感染させた後にこれをパス（ＰＡＳ）染色したところ、驚くべきことに、これまでの評価モデルよりも格段に感染強度が高く、爪の深部にまで真菌が浸潤した、ヒトの爪白癬に近似した動物の被感染爪および動物感染モデルを再現性よく作製できることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させるに至った。

すなわち本発明は、白癬菌を感染させた動物（ヒトを除く）の被感染爪であって、白癬菌が、爪甲側および爪床側の夫々の、爪の先端側、爪の中間部および爪母側の全部に存在し、かつ、パス（ＰＡＳ）染色を行った場合に、被染色部分が、該爪の断面積の４％以上である、被感染爪に関する。
また、前記被染色部分が、爪の深さ方向の下半分に、上半分よりも多く存在している、被感染爪に関する。
さらに、前記白癬菌が、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes）である、被感染爪に関する。
さらに、前記動物が、ウサギ、モルモット、ラット、イヌおよびサルから選ばれる1種または２種以上である、被感染爪に関する。
また、爪白癬症治療用薬の評価に用いる、前記被感染爪に関する。
さらに、前記被感染爪を用いる、爪白癬症治療薬の評価方法に関する。

本発明は、感染が成立しにくい爪の爪甲および爪床に真菌を十分に感染させた、臨床病態を反映した動物の被感染爪および動物感染モデルを、再現性よく提供することを可能にするものである。
本発明の動物の被感染爪は、爪の奥深くまで真菌が浸潤しているため、臨床的に観察される爪白癬のモデルとなり、抗真菌剤の開発用評価モデルとして従来では不可能であった、爪白癬などの難治性感染症の治療薬の開発に有用で正確な評価システムを確立できるものである。

本発明の動物の爪に感染させる真菌としては、感染後において薬剤の治療効果の低い疾病の真菌が好ましく、表在性真菌および深在性真菌などが例示され、爪の疾病を想定した場合には、表在性真菌がより好ましい。表在性真菌としては、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes）、トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）、トリコフィトン・ビオラセウム（Trichophyton violaceum）、トリコフィトン・ベルコスム（Trichophyton verrucosum）、トリコフィトン・トンスランス（Trichophyton tonsurans）、ミクロスポルム・カニス（Microsporum canis）、ミクロスポルム・ジプシウム（Microsporum gypseum）、エピデルモフィトン・フロコッサム（Epidermophyton floccosum）、ホルタエア・ベルネッキ（Hortaea werneckii）、アルタナリア・アルタナータ（Alternaria alternata）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、パエチロマイセス・リラシヌス（Paecilomyces lilacinus）、フサリウム・ソラニ（Fusarium solani）、スコプラリオプシス・ブレビカウリス（Scopulariopsis brevicaulis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）およびトリコスポロン・アサヒ（Trichosporon asahii）から選択されるものが例示され、爪白癬症の評価には原因菌として有望なTrichophyton属が好ましく、さらに発芽分生子、分節分生子および小分生子などの分生子、とくに分節分生子および小分生子の形成しやすさなどを考慮するとトリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes）がより好ましい。

感染させる真菌の形態としては、菌体、菌糸、胞子、発芽分生子、分節分生子および小分生子などが例示されるが、局所での易感染性の点から、発芽分生子、分節分生子および小分生子が好ましく、分生子の採取、菌数カウントおよび接種のしやすさの点から、分節分生子および小分生子がより好ましい。

本発明の動物の爪とは、動物の手または足の指先の背面にあるハードケラチンからなる板状組織であり、爪の深さ方向の上半分を爪の爪甲側といい、下半分を爪の爪床側という。また、爪を長径方向に先端から３等分した場合に、それぞれを爪の先端側、爪の中間部、および爪の爪母側という。

本発明では、爪へ真菌を接種して感染させた後に、後述するパス（ＰＡＳ）染色を行い、爪の断面積に対する被染色部分の面積の割合、すなわち真菌の菌体が占める面積の割合を百分率で算出する。ヒトの爪白癬症などの臨床病態を反映した評価モデルという観点から、好ましくは、爪の断面積に対して被染色部分の面積が４％以上であり、より好ましくは４．５％以上であり、さらに好ましくは５％以上であり、特に好ましくは６％以上である。爪の断面積に対する被染色部分の面積の割合が４％に満たない場合、すなわち真菌の菌体が占める面積の割合が４％に満たない場合には、爪中における菌感染の正確な解析が困難となる。

また、臨床における爪白癬症の分類と同様なモデルであるという点では、爪の深さ方向の上半分よりも下半分に、より多くの被染色部分が存在しているもの、すなわち爪甲側よりも爪床側により多くの真菌が分布しているものが好ましい。
同様に、臨床における爪白癬症の分類と同様なモデルであるという点では、爪を長径方向へ３等分した場合に、爪の先端側、爪の中間部および爪の爪母側の全部に被染色部分が存在しているもの、すなわち爪の全部に真菌が分布しているものが好ましい。また、先端側もしくは爪母側など特定の部位により多くの被染色部分が存在しているもの、すなわち爪の先端側もしくは爪母側など特定の部位により多くの真菌が分布しているものも、臨床病態を反映している場合があり好ましい。

爪白癬症における爪中の菌の局在は様々であり、遠位爪下型（爪の先端から感染するタイプ）、近位爪下型（爪上皮（甘皮）側から感染するタイプ）、表在性型（爪甲側の浅い部分に感染しているタイプ）、全層型（爪の全域に感染しているタイプ）などが挙げられるが、本発明により、爪の深部の爪床側にまで十分に真菌が浸潤し、かつ爪の全体に真菌が感染した感染モデル、または先端側もしくは爪母側などの特定の部位により多くの真菌が感染した感染モデルの作製が可能となり、全層型、遠位爪下型および近位爪下型などの臨床病態を反映した、爪白癬の動物感染モデルの作製がはじめて可能となったものである。

本発明の作製に用いる動物としては、標的である爪に真菌を塗布可能な動物が使用され、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなどの齧歯類や犬などのイヌ科の動物、猫などのネコ科の動物、羊、山羊、牛などの家畜類、ミドリザルやカニクイザル、およびヨザル等の霊長類（但し、ヒトは除外する）などの確立された実験動物種が例示され、遺伝的な均質性、入手のしやすさおよび取扱いなどの点から、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌおよびサルなどが例示され、使いやすさの点から、より好ましくは、モルモット、ウサギが例示され、爪白癬症のモデルとしては、感染部位の大きいことからウサギがさらに好ましい。かかる動物における性別としては、雌雄の別なく使用することができる。これは爪や爪における真菌の感染に性差が存しないためである。

本発明の動物の被感染爪および動物感染モデルは、免疫低下手段により動物の免疫を低下せしめた後、表在性真菌を爪および／または爪周辺の皮膚に接種して感染させることにより得られる。

動物の免疫を低下させる免疫低下手段としては、好ましくは、免疫抑制剤の投与、血流の局所的な制限、栄養摂取制限、放射線の照射、免疫不全を起こすウイルスの感染などが例示され、免疫低下の調整および操作の簡便性の点から、より好ましくは、免疫抑制剤の投与および血流の局所的な制限などが例示され、とくに好ましくは、免疫抑制剤の投与である。

免疫低下の判断の指標としては、たとえば、免疫抑制剤投与後の体重の一過性増加後の減少の度合い、リンパ系細胞などの各種血球成分数の変化、ＣＤ４／ＣＤ８比の変化、免疫機構に関与する各種サイトカイン量の変化などが例示されるが、再現性や動物の種に依存しない指標の点から、より好ましくは、免疫抑制剤投与後の体重の一過性増加後の減少の度合いなどが例示される。免疫抑制剤投与後の体重変化の作用機序は複雑であり必ずしも明らかではないが、種に依存せず多くの動物に認められる現象であり、免疫抑制剤の薬理効果発現の間接的な指標として用いることができる。
免疫低下の判断は、十分な免疫低下と動物の過度の衰弱を防止する観点から、動物の摂餌行動など免疫低下に伴う動物への影響を観察しながら、慎重に行う必要がある。典型的には、免疫抑制剤投与後の体重の一過性増加後の減少の度合いが、投与前の体重から１〜３０％減の範囲が好ましく、十分な免疫低下と動物の過度の衰弱防止を考慮すると、より好ましくは３〜３０％減、さらに好ましくは５〜３０％減、特に好ましくは５〜２０％減である場合に、免疫低下の度合いが感染症微生物の接種に好適であると判断される。
なお、複数の個体に同一の免疫低下手段を同時に行う場合には、複数の個体の平均体重の一過性増加後の減少の度合いを、免疫低下の判断の指標としてもよい。

免疫抑制剤としては、臓器移植などに際して、免疫学的拒否反応を抑制する目的で使用されるシクロスポリン、タクロリムス、ＩＳＰ−１などの免疫抑制剤、または副作用として免疫抑制作用を有するメチルプレドニゾロン等のステロイドなどを使用することが好ましい。これらは何れも市販品が存し、購入し使用することができるが、より好ましくは、シクロスポリン、タクロリムス、および酢酸メチルプレドニゾロン等のステロイドなどが例示され、ステロイドのうちさらに酢酸メチルプレドニゾロンがとくに好ましく、市販のデポ・メルコート（富士製薬社製）を使用することができる。

免疫抑制剤の動物への投与量は、十分な免疫低下と動物の過度の衰弱を防止する観点から、前述の免疫低下の判断の指標、および動物の摂餌行動など免疫低下に伴う動物への影響を観察しながら、適宜調整して設定する必要がある。
たとえば、酢酸メチルプレドニゾロンの１回分の投与量は、０．１〜１００ｍｇ/ｋｇの範囲が好ましく、免疫低下の度合いおよび動物への負担を考慮すると、より好ましくは１〜１０ｍｇ/ｋｇであり、さらに好ましくは２〜５ｍｇ/ｋｇである。また、シクロスポリンの１回分の投与量は、０．１〜５０ｍｇ/ｋｇの範囲が好ましく、免疫低下の度合いおよび動物への負担を考慮すると、より好ましくは１〜２５ｍｇ/ｋｇであり、さらに好ましくは２〜１０ｍｇ/ｋｇである。さらに、タクロリムスの１回分の投与量は、０．００１〜１０ｍｇ/ｋｇの範囲が好ましく、免疫低下の度合いおよび動物への負担を考慮すると、より好ましくは０．００５〜５ｍｇ/ｋｇであり、さらに好ましくは０．０１〜３ｍｇ/ｋｇである。

免疫抑制剤の投与回数、投与間隔および投与期間は、同様に十分な免疫低下と動物の過度の衰弱を防止する観点から、前述の免疫低下の判断の指標、および動物の摂餌行動など免疫低下に伴う動物への影響を観察しながら、適宜調整して設定する必要がある。
投与回数は、単回投与でも繰り返し投与でもよいが、免疫低下の度合いおよび動物への負担を考慮すると、より好ましくは２回以上の繰り返し投与である。
投与間隔は、好ましくは２〜２１日に１回であり、動物への負担および評価期間を考慮すると、より好ましくは７〜１４日に１回である。
投与開始から免疫低下させるまでの投与期間は、好ましくは１６週間以内であり、動物への負担および評価期間を考慮すると、より好ましくは６週間以内である。
投与方法は、好ましくは、経口投与、静脈内投与、経皮投与、筋肉内および皮下投与などが例示できるが、投与の確実性から、より好ましくは筋肉注射および経皮投与などが例示できる。

具体的には、たとえば、酢酸メチルプレドニゾロンの投与は、１回分の投与量２〜４ｍｇ/ｋｇを、７〜１４日に１回の投与間隔で、単回または２〜６回繰り返し投与することなどが好適に例示される。
また、シクロスポリンの投与は、１回分の投与量２〜１０ｍｇ/ｋｇを、１〜１４日に１回の投与間隔で、単回または２〜６回繰り返し投与することなどが好適に例示される。
さらに、タクロリムスの投与は、１回分の投与量０．０１〜３ｍｇ/ｋｇを、１〜１４日に１回の投与間隔で、単回または２〜６回繰り返し投与することなどが好適に例示される。

また、たとえば、酢酸メチルプレドニゾロンを２〜２４ｍｇ/ｋｇ投与した後に、体重の一過性増加後の減少の度合いが、投与前の体重から５〜２０％減である場合に、免疫低下の度合いが感染症微生物の接種に好適であると判断される。
また、シクロスポリンを２〜６０ｍｇ/ｋｇ投与した後に、体重の一過性増加後の減少の度合いが、投与前の体重から５〜２０％減である場合に、免疫低下の度合いが感染症微生物の接種に好適であると判断される。
さらに、タクロリムスを０．０１〜１８ｍｇ/ｋｇ投与した後に、体重の一過性増加後の減少の度合いが、投与前の体重から５〜２０％減である場合に、免疫低下の度合いが感染症微生物の接種に好適であると判断される。

前記前処置を行った動物に前記表在性真菌を感染させ、本発明の動物の爪および動物感染モデルを作製するが、かかる感染においては、感染を微生物の用量としてコントロールすることが好ましく、具体的には、感染させたい真菌を予め通常の寒天培地で培養し、これを白金耳でかき取り、菌体自身或いは分生子などの菌体の一部を取り出して、これを生理食塩水に加え、１×１０^７〜１×１０^９conidia/ｍLとなるように菌液を調製し、好ましくは菌体乃至はその一部の分散性を高めるために、非イオン界面活性剤、たとえば、トリトンＸ或いはツィーン８０（和光純薬社製）を０．０１〜０．１％加える。この菌液を前記のように免疫能の低下した動物の爪に１０〜１０００μL投与する。投与部位の大きさにあわせ、菌液の投与量を調整し、ウサギやモルモットの爪に投与する場合は、１００〜５００μLが好適に例示できる。

菌液の接種方法としては、表面への塗布や皮下注射などが例示できるが、標的の爪への確実な接種や操作の簡便性の点から、爪表面へ直接塗布することが好ましい。菌液を塗布する部位としては、標的の爪のほかに、爪の周辺組織へ塗布することも、短期間で確実に感染を成立させる点で有効である。たとえば、爪甲への塗布のみならず、爪と皮膚の境目にある側爪郭、後爪郭および爪上皮（甘皮）へも塗布することにより、爪甲側のみならず、爪の側面側などからも真菌がうまく入り込み、短期間で爪床側へも十分に感染させることができる。

感染症原因微生物を標的組織に接種して増殖させる感染期間としては、典型的には１〜１６週間であるが、動物への負担及び評価期間を考慮すると２〜６週間の感染期間が好ましい。このような感染は開放系でも行うことができるが、微生物汚染の防止と、感染の均質性を向上させるために、密封状態で行うことが有用である。このような密封方法としては、たとえば、市販のパッチ絆創膏、包帯などを用いることができる。また、パッチ絆創膏に代えて、指サックなどを用いて閉塞し、感染させることも可能である。指サックなどで閉塞する場合には、適宜水分を患部に補給して、湿潤状態に保っておくことは、感染を促進するので好ましい。
また、密封状態で一定期間増殖させた後、指サックなどを除いて開放状態にし、何もせずに放置した状態で続けて菌を組織中で増殖させてもよい。放置期間としては、１〜８週間が好適に例示できるが、動物への負担および評価期間を考慮すると２〜６週間がより好ましい。
上記感染期間および放置期間を適宜調整して組み合わせることにより、爪内での菌の感染部位や感染強度を制御して、種々の被感染爪を作製することが可能である。

このような感染工程は、感染による感染部位の状態変化を観察しながら、そのエンドポイントを決定する。感染終了の指標としては、感染部位に菌が一様に分布し、感染していない部位と異なった性状を示すことを用いる。爪白癬の場合には、爪の黄色がかった白濁が爪全体に及んだことを以て感染終了と判断することができる。勿論、顕微鏡や拡大鏡により観察して、組織における増殖状態や菌数を目視で確認することや、組織の一部を採取し、培地に播種し、そこからの菌の生育を見ることによって、感染の度合いを判別することも可能である。

本発明では、爪へ真菌を接種して感染させた後に、爪の薄切標本を作製してパス（ＰＡＳ：Periodic acid Schiff stain）染色を行い、染色した薄切標本の光学顕微鏡写真の画像を解析することにより、爪の断面積に対する被染色部分の面積の割合を百分率で算出することができる。

標本の薄切の具体的な方法としては、たとえば、前述した感染操作後の動物を麻酔下で安楽死させ、爪を含む指部を切断採取し、ホルマリン溶液（マイルドホルム２０Ｎ和光純薬社製）に入れ固定し、その後、脱灰、中和処理をしてパラフィン包埋を行う。そしてこの標本を滑走式ミクロトーム（LS-113 大和光機製）で６〜８μｍ程度の厚さに薄切し、テープによりスライドガラス上に固定して５分以上放置した後、紫外線照射器（東京インスツルメンツ社製）で３〜５分間紫外線を照射し、その後ＴＰＣ液（東京インスツルメンツ社製）に浸してテープを剥がして作製する方法などが好適に例示される。

パス（ＰＡＳ）染色の具体的な方法としては、たとえば、上記の薄切標本をキシレンとエタノールで洗浄してパラフィンを除き、水で洗浄する。この標本を過ヨウ素酸溶液（武藤化学社製）で１５分間酸化処理し、流水中で３分間洗浄後、シッフ試薬（武藤化学社製）で１５分間染色する。さらに亜硝酸水（武藤化学社製）で５分間２回処理し、流水で３分間洗浄する。その後、マイヤー・ヘマトキシリン溶液（和光純薬社製）で４０秒染色し、流水で１５分間色だしする。エタノールで脱水後、レモゾール（和光純薬社製）で３分間３回透徹し、ソフトマウント（和光純薬社製）およびカバーグラスで封入する方法などが好適に例示される。

画像解析の具体的な方法としては、たとえば、上記の薄切およびパス（ＰＡＳ）染色操作後の爪の標本を、光学顕微鏡で４０〜４００倍の拡大率で写真撮影し、その画像を画像解析用コンピュータソフトウェアに読み込み、ソフト上でこの画像中の爪の断面全体を特定し、その範囲内の被染色部分と染色されていない部分を２値化することにより区別する。２値化の閾値は、サンプル毎に病理組織像を確認しながら、もっとも正確に菌体と爪組織を区別できる最適な値に設定する。そして、爪の断面全体の面積と被染色部分の面積をそれぞれ算出することにより、爪の断面積に対する被染色部分の面積の割合を百分率として求める方法などが好適に例示される。

また、爪の深さ方向の下半分に上半分よりも多くの被染色部分が存在していることの具体的な判断方法は、たとえば、光学顕微鏡で４０〜４００倍の拡大率で写真撮影し、簡便に目視で評価して爪床側の下半分と爪甲側の上半分の被染色部分の多い少ないを判断する方法や、上記と同様に、写真撮影した画像を画像解析用コンピュータソフトウェアに読み込み、ソフト上でこの画像中の爪の断面を深さ方向に２等分して特定し、爪床側の下半分と爪甲側の上半分の範囲内の被染色部分と染色されていない部分とを２値化することにより区別し、両者の被染色部分の面積を比較する方法などが好適に例示される。

斯くの如くの手順で作製された、本発明の動物の被感染爪および動物感染モデルは、人における難治性感染症の症状に近似しており、かかる被感染爪および動物感染モデルに被験物質を投与し、感染部位が正常部位に近づく過程を観察することにより、該被験物質の爪白癬に対する抗真菌作用などを判別することができ、爪白癬症治療薬などの評価方法として極めて有用である。即ち、本発明の動物の被感染爪および動物感染モデルに被験物質を投与した場合と非投与の場合で投与の場合の方が正常状態への回帰を示し、非投与の場合が正常への回帰を示さないときには、被験物質は爪白癬に対して有効性を有すると判別できる。また、２種の被験物質を同様に試験し、一方が正常状態への回帰の度合いの蓋然性が高い場合には、爪白癬に対して、該被験物質の方が他方より優れた抗真菌治療効果を有すると判別することができる。また、被験物質の投与量を変えて、それに対する反応性を観察することにより、被験物質の抗真菌効果の濃度依存性を判別することもできる。

このような判別に際しては、治療部位の一部を採取し、電子顕微鏡にて菌の形態変化を観察することや、これを培地などに播種し、残存した菌の生育度合いを指標に、生育度合いが著しければ被験物質の効果は低く、生育度合いが低ければ、被験物質の効果は高いと判別することもできる。この場合、生育度合いの判別は、別途播種する分生子数を変えて、培養の結果得られるコロニー面積を計測し、このデータより、予め分生子数−コロニー面積の検量線を作製しておき、この検量線を用いて、播種した治療部位の一部に残存していた生存菌を分生子数として推定し、該推定分生子数が少ないほど優れた抗真菌効果を被験物質が奏したと判別することもできる。このような判別においては定量的な抗真菌効果の比較が行える。また、播種に用いる培地には、予めリン脂質０．１〜１０質量％と、「ツィーン８０」などの非イオン界面活性剤を０．１〜１０質量％含有させておき、残存する被験物質を不活性化し、ノイズを減らすことも好ましい。このような判別により、定量的な被験物質の効果の比較を行うことができる。特に、爪白癬のような難治性の感染症においては、短期間では完治することが少ないため、推定生存菌数が重要な効果の評価ポイントとなる。完治状態でなくとも抗真菌効果の比較がなし得るためである。

他の難治性感染症においても、前記の爪白癬と同様に処置し、被感染爪および動物感染モデルを作製し、被験物質の投与による、その感染の治癒過程を観察することにより、治療効果を定量的に知ることができる。

以下、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲で、種々の変更が可能である。

〔実施例１〕
（ウサギ免疫抑制）
１４週齢の日本白色種兎（Kbl:JW、北山ラベス）を１週間検疫馴化させた。馴化後、免疫抑制剤として持続性酢酸メチルプレドニゾロン製剤（デポ・メルコート富士製薬社製）を大腿筋に、１回分の投与量４ｍｇ/ｋｇを計３回、１週間に１回の間隔で投与した。免疫抑制剤投与後の個々のウサギの体重を測定し、免疫抑制剤投与後の免疫能低下により、体重が一過性に増加し、その後減少したことを確認した。ウサギ計１５匹の平均体重が投与前の体重から約６％減じた、投与開始から２週間後の時点で菌液を接種した。ウサギ計１５匹の平均体重の変化を図１に示す。

（菌液の調製）
４℃で保存していたトリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes）を安全キャビネット中で生理食塩水１．５ｍＬに加え、菌懸濁液を調製した。サブロー培地（FLUID SABOURAUD MEDIUM）１．８ｇとアガー（Bacto Agar）４．５ｇに３００ｍＬの水を加え、撹拌後オートクレーブにて滅菌処理し、傾斜台で静置して斜面培地を作製した。該培地に菌懸濁液を加え、２８℃で培養した。培養した菌を一部採取し、ツィーン８０（和光純薬社製）を０．０５％含有する溶液２〜２０ｍＬに加えた。血球計算盤（東京エルマ社製）を用いて菌の分生子液中の濃度を測定し、１．１×１０^８〜１．３×１０^８conidia/ｍＬになるように調製した。ツィーン８０の溶液量を調整し、最終的に１.０×１０^８conidia/ｍＬとして感染実験に用いた。

（ウサギ感染モデル）
前述の免疫能の低下したウサギ（日本白色種兎）に局所麻酔をかけて、前記で調製した菌液を爪の甘皮部分とカーゼに２００μL塗布し、ガーゼをウサギの爪に被せテープで固定した。さらに指サックをウサギの指にはめ、湿潤させるための水を垂らすための孔をあけた。その後、２週間毎日ウサギの状態及び爪部分の乾燥状態を確認し、爪の乾燥が認められた時は精製水を滴下し湿潤させた。
上記の２週間の感染操作をしたウサギ感染モデルの他に、２週間の感染操作後に指サックなどを外してさらに２週間または６週間何もせずに放置したウサギ感染モデルを作製した。それぞれ１群、２群、および３群とした。

（標本の薄切）
上記の１群〜３群のウサギを、麻酔下で安楽死させ、爪を含む指部を切断採取し、ホルマリン溶液（マイルドホルム２０Ｎ和光純薬社製）に入れ固定した。その後、脱灰、中和処理を行い、パラフィン包埋を行い包埋皿に指を入れてパラフィンを流し込み冷却して固化した。これを滑走式ミクロトーム（LS-113 大和光機製）で６μｍ程度の厚さに薄切しテープによりスライドガラス上に貼付し５分間放置した後、紫外線照射器（東京インスツルメンツ社製）で２分間紫外線を照射し、ＴＰＣ液（東京インスツルメンツ社製）に浸してテープを剥がした。

（標本の染色）
前記の薄切標本をキシレンとエタノールで洗浄し、パラフィンを除き、水で洗浄した。過ヨウ素酸溶液（武藤化学社製）で１５分間酸化処理し、流水中で３分間洗浄後、シッフ試薬（武藤化学社製）で１５分間染色した。亜硝酸水（武藤化学社製）で５分間２回処理し、流水で３分間洗浄した。マイヤー・ヘマトキシリン溶液（和光純薬社製）で４０秒染色し、流水で１５分間色だしした。エタノールで脱水後、レモゾール（和光純薬社製）で３分間３回透徹し、ソフトマウント（和光純薬社製）およびカバーグラスで封入した。

（被染色部分の面積測定）
上記パス（ＰＡＳ）染色操作後の爪の組織標本の全体像を、光学顕微鏡で１００倍に拡大して写真撮影し、この画像をAdobe社のフォトショップに読み込み、ソフト上で画像中の爪の断面全体を特定し、その範囲内の被染色部分と染色されていない部分を２値化することにより区別した。２値化の閾値は、サンプル毎に病理組織像を確認しながら、１００〜２００の間で、もっとも正確に菌体と爪組織を区別できる最適な値に設定した。爪の断面全体の面積と被染色部分の面積を算出することにより、爪の断面積に対する被染色部分の面積の割合を百分率として求めた。

（感染の確認）
前記の染色した標本を光学顕微鏡を用い、下記表１の評価基準を基に評価スコア０（−）〜３（＋＋＋）で評価した。評価は、爪の深さ方向に上半分の爪甲側および下半分の爪床側、ならびに爪を長径方向に３等分した、先端側、中間部および爪母側の計６箇所の各々の部位について行った。

実施例１第１群〜３群のウサギ感染モデルの爪２９〜３０本（６本×５匹分）の各々について、爪の組織標本全体の被染色部分の面積測定を行った。測定結果を表１に示す。

また、実施例１第１群〜３群のウサギ感染モデルの爪２９〜３０本（６本×５匹分）各々について、前述の計６箇所の部位について感染の確認を行った。評価スコア１（＋）以上の感染箇所を有する感染陽性の部位数を、確認した部位数（２９〜３０本）で除した値を百分率で表した部位別の感染率を表３に示す。

さらに、実施例１第２群の表在性真菌感染前後のウサギの爪の状態を写真撮影したものを図２に示す。図２において、左図の丸で囲った部分は感染しておらず赤みをおびているが、右図の丸で囲った部分は白濁して赤みが認められない。この白濁が真菌の感染を示している。
また、実施例１第２群の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の染色した標本を、光学顕微鏡で４０倍に拡大して写真撮影したものを図３に示す。図３において、矢印の部分が爪の部分であり、ＰＡＳ染色により紫色に染色されている部分が菌糸であり、爪の中に真菌が広く感染している事が示されている。特に丸で囲った部分は顕著に感染している。
さらに、実施例１第３群の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の染色した標本を、光学顕微鏡で１００倍に拡大して写真撮影したものを図４に示す。ＰＡＳ染色により紫色に染色されている部分が菌糸であり、爪の全層にわたり真菌が感染している事が示されている。
また、実施例１第２群の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の染色した標本を、光学顕微鏡で１００倍に拡大して写真撮影したものを図５に示す。丸で囲った部分のＰＡＳ染色により紫色に染色されている部分が菌糸であり、真菌が顕著に感染している事が示されている

上記表２および図３〜５の結果より、爪の断面積に対する被染色部分の面積の割合が４％以上、すなわち真菌の菌体が占める面積の割合が４％以上の、爪内に十分に真菌が感染した、真菌感染の解析が容易で抗真菌剤の正確な評価に用いることができる被感染爪モデルを、免疫抑制剤の投与後４〜１０週間という短期間で作製できることが分かる。
また、上記表３および図３〜５の結果より、爪のほぼ全域にわたって表在性真菌の感染が認められ、とくに爪全体としては爪甲側よりも爪の深部である爪床側へより多くの真菌が浸潤していることが分かる。さらに、表３の結果より、１群では爪母側、２群では爪母側および爪床側全域、ならびに３群では先端側および中間部により多くの真菌の感染が認められ、放置期間を設けることにより感染率の高い部位がシフトし、爪の先端側および爪母側などの特定の部位に真菌がより多く感染した爪感染モデルとなることが分かる。
以上の結果より、爪は血流から遮断され免疫細胞も存しないといわれているが、免疫抑制作用を有するステロイドを投与して免疫を低下せしめた後、表在性真菌を接種して感染させることにより、従来作製することが不可能であった、感染率が高く爪の深部である爪床側へも真菌が十分に浸潤した、再現性がよくかつ臨床病態を反映した爪の表在性真菌感染モデルを、短期間で作製できることを確認した。

実施例１の免疫抑制剤投与後のウサギの体重変化を示す図である。実施例１第２群の表在性真菌感染前後のウサギの爪の状態を示す写真図である。実施例１第２群の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の病理組織学的な写真図である。実施例１第３群の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の病理組織学的な写真図である。実施例１第２群の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の病理組織学的な写真図である。

Claims

白癬菌を感染させた動物（ヒトを除く）の被感染爪であって、白癬菌が、爪甲側および爪床側の夫々の、爪の先端側、爪の中間部および爪母側の全部に存在し、かつ、パス（ＰＡＳ）染色を行った場合に、被染色部分が、該爪の断面積の４％以上である、前記被感染爪。
被染色部分が、爪の深さ方向の下半分に、上半分よりも多く存在している、請求項１に記載の被感染爪。
白癬菌が、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes）である、請求項１または２に記載の被感染爪。
動物が、ウサギ、モルモット、ラット、イヌおよびサルから選ばれる1種または２種以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の被感染爪。
爪白癬症治療用薬の評価に用いる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の被感染爪。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の被感染爪を用いる、爪白癬症治療薬の評価方法。