JP5269466B2 - 経口摂取用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis、以降「ＮＡＳ
Ｈ」と呼称する)等の肝炎の予防又は治療の少なくとも一方に用いる経口摂取用組成物に
関するものである。

脂肪肝に炎症が加わり、それが持続すると肝硬変まで進行することがある。この病態は非飲酒歴者においてもアルコール性脂肪性肝炎に類似した病状を示すことから、ＮＡＳＨの診断名を与えられ、高血圧、糖尿病、高脂血症と並び新しい生活習慣病として近年俄に注目されているところである。

食生活の欧米化すなわち高脂肪含量の食生活や運動不足による肥満人口の増加と生活習慣病患者の増加に伴い、脂肪肝患者、ＮＡＳＨ患者も増加することが想定される。ゆえに、新たに開発されるＮＡＳＨ治療薬や重症化抑制薬及び/又はＮＡＳＨ発症リスク低減機能食品や重症化リスク低減機能食品の開発及び/又はＮＡＳＨ治療方法や重症化予防法の確立が望まれる。

ヒトにおけるＮＡＳＨは血液生化学的特徴及び/又は病理組織学的特徴により診断できる。未知の機能性素材評価のためのＮＡＳＨ病態モデル実験動物の作出は、例えば、ラットを用いた時、該実験動物の血中酸素分圧を低水準に維持することにより達成できる。

ＮＡＳＨ病態モデル実験動物と酸化ストレスの関連解明の詳細は下記非特許文献１に準拠している。即ち、上記ＮＡＳＨ病態モデル実験動物としてラットを用いた時、該実験動物肝臓ミトコンドリアにおけるヒドロキシルラジカル産生は亢進している。このことは、例えば、肝臓ミトコンドリアにおけるヒドロキシルラジカル消去活性を亢進することによるＮＡＳＨの予防、改善・治療への可能性を示唆している。

一般に、活性酸素種（ＲＯＳ）と疾病との関係は広く認知されており、ガン、白内障、神経疾患、腎疾患の他、アレルギー、糖尿病などのいわゆる生活習慣病にも係っている。一般に、ＲＯＳが関係するこれらの疾病に対しては抗酸化物質の有効性が認められている。

また、ヒトＮＡＳＨ病態に即した該病態モデル実験動物としてラットを用いた時、肝臓ミトコンドリアからの活性酸素ラジカル産生の亢進が認められることから、ＮＡＳＨと酸化ストレスの関係が強く示唆されている(非特許文献１参照)。

一方、乾燥スピルリナ(例えば、学名Spirulina platensis)粉末は健康食品として食用に供されるだけでなく、有効成分としてフィコシアニンを含むことから、食品、化粧品及び医薬品への配合成分として様々な分野で広く利用が考えられてきた(特許文献１〜３参照）。

その保健機能性は該製品のＲＯＳ消去活性、特に、脂質ペルオキシド(非特許文献２参照)、ヒドロキシルラジカル(非特許文献３参照)、ペルオキシナイトライト(非特許文献４参照)等の消去活性に基づく可能性が示唆されている。

また、乾燥スピルリナ製品は各種疾病の予防、治療に有効であることが知られている。例えば、血中コレステロール低減作用(非特許文献５参照)、高脂血症改善作用(非特許文献６参照)、血圧調整(非特許文献７参照)等々への有効性、紫外線吸収作用利用による皮膚外用剤への利用(特許文献２参照)、免疫性機能を高め、アレルギー性炎症を抑制する可能性(非特許文献８及び特許文献３参照)が示唆されている。

また、乾燥スピルリナ製品の食品(特許文献１、４参照)への利用、乾燥スピルリナ製品から得られるフィコシアニンの食用色素への利用(特許文献５、６)が考えられるようになり、一部実用化されている。

しかしながら、高い保健機能性を有する乾燥スピルリナ製品が機能性発揮に必要とするラジカル消去活性のレベルは知られておらず、また、活性酸素種の関係する生活習慣病に対する該発酵物の具体的な用途は確立されていない現状である。

かかる背景下、高いラジカル消去活性を有する乾燥スピルリナ製品の生活習慣病への利用方法の確立、特に、ＮＡＳＨ等の肝炎への利用方法確立が期待されていた。
特開２００７−２１５５０７号公報 特開２００４−２３８５１９号公報 特開２００４−２５６４７８号公報 特開平７−２８９２０１号公報 特開２００１−１９０２４４号公報 特開２００６−２３０２７２号公報 TAKAYAMAF. et al:J. PharmacologicalSci.,100(1),pp.164(2006). Vadiraja B. Bhat and K. M.Madyastha: Biochem. Biophys. Res. Commum., 275,pp.20-25(2000). Pinero Estrada et al: IlFarmaco.,56,pp.497-500(2001). Vadiraja B. Bhat and K.M.Madyastha: Biochem. Biophys. Res. Commum.,285,pp.262-266(2001)． 加藤敏光他,日本栄養・食糧学会誌，37(4),323-332(1984). 岩田多子他,日本栄養・食糧学会誌，40(6),463-467(1987). 岩田多子他,女子栄養大学紀要，21,63-70(1990). HAYASHIO. et al., J. Nutr. Sci.Vitaminol., 44, 841-851(1998).

本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、その目的はＮＡＳＨ等の肝炎の予防や治療に有用な経口摂取用組成物を提供することにある。

上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を重ね,〔1〕高いラジカル消去活性を有する乾燥スピルリナ製品及びその製造技術の確立、〔2〕乾燥スピルリナ製品を含むスピルリナ含有加工食品の開発、〔3〕乾燥スピルリナ製品のラジカル消去活性とＮＡＳＨの関連解明、に基づき本発明に至った。

本発明に係る経口摂取用組成物は、ＮＡＳＨの予防又は治療の少なくとも一方に用いる経口摂取用組成物であって、スピルリナ粉末を有効成分として含有して成ることを特徴とするものである。

本発明において、乾燥状態のスピルリナ粉末を少なくとも０．１重量％含有して成ることが好ましい。

本発明において、電子スピン共鳴分光−スピントラップ法で測定した時のヒドロキシルラジカル消去能がＩＣ_５０値として３０００乃至１００μｇ／ｍｌであることが好ましい。

本発明によれば、経口より摂取することにより、主にスピルリナ粉末のラジカル消去活性に基づいて、ＮＡＳＨの予防や改善や治療が可能となるものである。

乾燥状態のスピルリナ粉末を少なくとも０．１重量％含有して成ることで、ＮＡＳＨ等の肝炎の予防や改善や治療をより行いやすくなるものである。

電子スピン共鳴分光−スピントラップ法で測定した時のヒドロキシルラジカル消去能がＩＣ _５０ 値として３０００乃至１００μｇ／ｍｌであることで、スピルリナ粉末のラジカル消去活性に基づいて、ＮＡＳＨ等の肝炎の予防や改善や治療をより行いやすくなるものである。

以下、本発明を実施するための最良の形態を説明する。

本発明で用いるスピルリナは、例えば、学名がスピルリナ・コラキアナ（Spirulina corakiana）、スピルリナ・シリスパム（Spirulina crispum）、スピルリナ・ラビリンスフォーミス（Spirulina labyrinthiformis）、スピルリナ・ラクサ（Spirulina laxa）、スピルリナ・ラキシシマ（Spirulina laxissima）、スピルリナ・メイヤー（Spirulina major）、スピルリナ・マキシマ（Spirulina maxima）、スピルリナ・メネグヒニアナ（Spirulina meneghiniana）、スピルリナ・ノルドステドチイ（Spirulina nordstedtii）、スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）、スピルリナ・プリンセプス（Spirulina princeps）、スピルリナ・サブサルサ（Spirulina subsalsa）、スピルリナ・サブチリシシマ（Spirulina subtilissima）、スピルリナ・テネルリマ（Spirulina tenerrima）、スピルリナ・ウェイスシ（Spirulina weissii）、スピルリナ・フシフォーミス（Spirulina fusiformis）、スピルリナ・ジェンネリ（Spirulina jenneri）などである。このようなスピルリナは、例えば、純粋培養したスピルリナの種母をアルカリ性塩水（ｐＨ８〜１１）で満たしたプールにて清浄培養し、培養期間終了後、藻体を分離・濃縮し、洗浄、濾過後、乾燥することにより、食品としての衛生条件を備え、かつ、必要なラジカル消去機能を有する乾燥スピルリナ粉末として取得することができる。

本発明の経口摂取用組成物は、上記乾燥スピルリナ粉末をそのまま用いても良いが、摂取を容易とするため造粒による顆粒化、粉砕による微粉末化、打錠による錠剤化など剤形の変更、また、着色料、フレーバー、調味料など別途に任意の食品混合物を添加することは妨げられない。

本発明の経口摂取用組成物は食品と同等であるので、その摂取量、摂取方法、摂取期間には特段の上限及び下限、又はその他の条件などは設定していない。従って、大量に短期間摂取する場合、少量に長期間摂取する場合、他の保健機能性素材と共に摂取する場合など各種のケースが想定されるが、このこと自体によっては本発明は制限されない。例えば、人の場合では推奨の摂取量は２〜１０ｇ／日にすることができる。

本発明では乾燥スピルリナ粉末そのものを経口摂取用組成物とすることができるが、公知の食品等の他の成分と混合して経口摂取用組成物とすることができる。上記乾燥スピルリナ粉末を食品へ添加する場合、その添加量は食品に対して０．１重量％以上、望ましくは１．０重量％以上、更に望ましくは５．０重量％以上であり、この場合、官能評価上、経口摂取用組成物が食品として好ましい状態となり，ＮＡＳＨに対する有効な予防改善効果を発揮することができる。食品への添加量には上限はなく、１００重量％乾燥スピルリナ粉末を含む食品（すなわち、本発明の経口摂取用組成物をそのまま食品とした場合）を用いても差し支えない。混合する食品は粉末状、液状、ペースト状など様々な状態が可能である。従って、本発明の経口摂取用組成物の他の食品への添加量や摂取方法は、コスト、官能評価を含む品質的要件、ＮＡＳＨの予防及び／又は治療のために要求される機能、例えば、病態の種類、程度、摂取開始時期、摂取予定期間、併用素材その他の内容によって異なるため、一律には制限されない。

本発明の経口摂取用組成物は、ラジカル消去活性に基づくＮＡＳＨ病態の予防や改善や治療用の組成物として利用するに当たり、そのヒドロキシルラジカル消去能は電子スピン共鳴分光（ＥＳＲ）−スピントラップ法で測定した時、ＩＣ_５０値として３０００〜１００μｇ／ｍｌとすることにより有効に本発明の目的を達成することができる。このＩＣ_５０値が１００μｇ／ｍｌ未満であると、本発明の効果を充分に得ることができず、ＩＣ_５０値が３０００μｇ／ｍｌを超えると、ヒドロキシルラジカル消去能が大きすぎて、生体への悪影響が生じるおそれがある。尚、この濃度はＥＳＲ測定試料中の最終濃度である。このようなヒドロキシルラジカル消去能はＴｒｏｌｏｘ換算した時、ＩＣ_５０値として０．１４〜４．１４μｍｏｌ(Trolox equivalent/mg)に相当する。尚、本発明のように、乾燥スピルリナ粉末のラジカル消去活性に基づくＮＡＳＨ病態の予防、改善、治療用の組成物として利用するに当たり、ヒドロキシルラジカル消去能の大きさは、ＥＳＲで測定した時、ＩＣ_５０値としてＴｒｏｌｏｘを超えない範囲であることが望ましい。これは、Ｔｒｏｌｏｘ以上のヒドロキシルラジカル消去能を有する食品を無制限に摂取した場合の生体への影響を予測できないことによる。

本発明においてヒドロキシルラジカル消去活性は以下のように定義することができる。本発明の経口摂取用組成物のヒドロキシルラジカル消去能の評価は、電子スピン共鳴分光（ＥＳＲ）−スピントラッピング法にて実施する。ＥＳＲ装置はＸ−Ｂａｎｄ ＥＳＲ装置（日本電子株式会社製ＲＸ型）にデジタル高速掃引ユニット（ラジカルリサーチ社）を組み込み改良したラジカル検出装置にＥＳＲ装置用ＷＩＮ−ＲＡＤシステムＲＤＡ−０３Ｗ ＥＳＲデータナライザー（ラジカルリサーチ社）を接続したシステムから構成される。

スピントラップ剤として、5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide（ＤＭＰＯ、ラボテック社）又は2-(5,5-Dimethyl-2-oxo-2-λ5-[1,3,2]dioxaphosphinan-2-yl)-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide（ＣＹＰＭＰＯ、ラジカルリサーチ社）を用いる。また、ＥＳＲ測定条件は，掃引磁場領域；ＤＭＰＯの場合，３３６．５±５ｍＴ（ＣＹＰＭＰＯの場合，３３１．５±１０ｍＴ），磁場変調Ｆｉｅｌｄ Ｍｏｄ；０．０７９，Ｔｉｍｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ；０．１０秒，掃引時間；ＤＭＰＯの場合，１分（ＣＹＰＭＰＯの場合，４分）、出力；８．０ｍＷで行い、結果はＤＭＰＯまたはＣＹＰＭＰＯによりトラップされたスピンアダクトの相対強度として示される。

本発明においては、ヒドロキシルラジカル消去活性は試料(経口摂取用組成物)を含まない対照ＥＳＲ測定時の信号相対強度を５０％減弱させる経口摂取用組成物の濃度をIＣ５０値(μｇ／ｍｌ、最終濃度)として定義することができる。または、上記ヒドロキシルラジカル消去活性に相当する、即ち、同一のラジカル消去活性を発揮するTrolox((±)-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid、アルドリッチ社)の濃度を求め、経口摂取用組成物のＩＣ５０値(μｇ／ｍｌ、最終濃度)に相当する単位(μmol Trolox equivalent/mg)として示している。換言すると、Ｔｒｏｌｏｘをヒドロキシルラジカル消去活性評価のための標品として用い、試料(乾燥スピルリナ粉末からなる経口摂取用組成物)のヒドロキシルラジカル消去活性に相当するＴｒｏｌｏｘの化学当量を求めることにより評価を行うことができる。そして、このことにより、ＥＳＲ機種の違い、手法の違い、試薬類純度の違いなどによるデータのバラツキを最小限に留め、データに客観性、定量性を与えることが可能となるものである。

以上説明したように、本発明は高いラジカル消去能を有する乾燥スピルリナ粉末を有効成分として含有する経口摂取用組成物を提供し、これを経口摂取して用いることによりＮＡＳＨの有効な予防や改善や治療を図ることができるものである。

以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明をいかなる意味においても限定するものではない。

＜本発明に係る経口摂取用組成物（実施例１）及びＴｒｏｌｏｘのヒドロキシルラジカル消去活性の測定＞
本発明に係る経口摂取用組成物として実施例１を製造した。この実施例１の経口摂取用組成物はスピルリナ１００％の粉末を使用した。

上記のようにして製造された実施例１のフリーラジカルおよび活性酸素種消去能は、電子スピン共鳴分光（ＥＳＲ）-スピントラッピング法にて評価した。ＥＳＲ装置はＸ−Ｂａｎｄ ＥＳＲ装置（日本電子株式会社製ＲＸ型）にデジタル高速掃引ユニット（ラジカルリサーチ社）を組込み高感度高速化の改良を施したフリーラジカル検出装置にＥＳＲ装置用ＷＩＮ−ＲＡＤシステムＲＤＡ−０３Ｗ ＥＳＲデータナライザ（ラジカルリサーチ社）を接続したシステムにて構成されている。スピントラップ剤として、ＣＹＰＭＰＯを用いた。

ＥＳＲ分析に際して、ＥＳＲ装置は、掃引磁場領域：ＤＭＰＯの場合、３３６．５±５ｍＴ（ＣＹＰＭＰＯの場合、３３１．５±１０ｍＴ）、磁場変調Ｆｉｅｌｄ Ｍｏｄ：０．０７９ｍＴ、ＴｉｍｅＣｏｎｓｔａｎｔ：０．１０秒、掃引時間：ＤＭＰＯの場合、１分（ＣＹＰＭＰＯの場合、４分）、出力：８．０ｍＷに設定し、測定試料中の活性酸素・フリーラジカル種をＤＭＰＯ又はＣＹＰＭＰＯにより捕捉し形成するスピンアダクトに固有のＥＳＲスペクトルをＥＳＲ分析で検出した。測定試料における活性酸素・フリーラジカル種の量はスピンアダクトによるＥＳＲスペクトルの信号強度により計測することができる。遷移金属のマンガン（Ｍｎ）はＥＳＲスペクトルを生じることを利用し、この信号を基準信号とし、活性酸素・フリーラジカル種とＤＭＰＯ又はＣＹＰＭＰＯとのスピンアダクトによるＥＳＲスペクトルのＭｎのＥＳＲスペクトルに対する信号強度の比、すなわち、Ｍｎ信号に対する相対強度で定量的な精度を向上させた。以下に、更に具体的に示す。

ＥＳＲ測定試料溶液は、充分に窒素置換された２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中に、１００μＭ硫酸第一鉄と、１００μＭ diethylenetriaminepenta-acetic acid（ＤＥＴＡＰＡＣ）と、５ｍＭ ＣＹＰＭＰＯと、各種濃度の実施例１又はＴｒｏｌｏｘと、１００μＭ過酸化水素とを配合して調製させるものである。この場合、予め過酸化水素以外の成分を混和し、最後に過酸化水素を添加し、過酸化水素と鉄イオンとのフェントン反応でヒドロキシルラジカルを発生させる。過酸化水素添加１分後に掃引を開始することで反応時間を一定にし、ヒドロキシルラジカルを一定量発生させ、ＥＳＲ測定試料溶液中のＣＹＰＭＰＯにより捕捉し、形成するＣＹＰＭＰＯ-ヒドロキシルラジカルのスピンアダクト（ＣＹＰＭＰＯ-ＯＨ）のＥＳＲスペクトルは全８本の信号ピークを持つ。低磁場から４番目のＥＳＲ信号ピークと、Ｍｎによる６本のＥＳＲ信号中、低磁場側から２番目のＭｎ信号ピークを比較し、ＣＹＰＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号相対強度によりのＥＳＲ測定試料溶液中のヒドロキシルラジカル量を定量化した。実施例１及びＴｒｏｌｏｘを添加せずに実施した対照ＥＳＲ測定で観察されたＣＹＰＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度を１００％とした。そして、実施例１を添加したＥＳＲ測定試料溶液について、ＣＹＰＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化（減弱）で、実施例１のヒドロキシルラジカルに対する消去活性を検討した。

その結果，対照ＥＳＲ測定時の相対信号強度を５０％減弱させる実施例１の濃度をＩＣ_５０値（μｇ／ｍｌ）として求めたところ、９６０μｇ／ｍｌ（ＥＳＲ測定試料溶液中での最終濃度）であった。同様にして、上記のヒドロキシルラジカル消去活性に相当するＴｒｏｌｏｘの相当当量を測定したところ、０．４３μｍｏｌ Trolox equivalent/mgであった。すなわち、実施例１では目的とする保健機能性を発揮するに足る充分な活性が確認された。

＜本発明の経口摂取用組成物として、乾燥スピルリナ粉末を含有する食品の例（実施例２、３）＞
乾燥スピルリナ粉末を分離型ドレッシングに配合することにより、実施例２の経口摂取用組成物とした。乾燥スピルリナ粉末は株式会社スピルリナ研究所製造のスピルリナパウダーであり、分離型ドレッシングはキューピー株式会社の市販品を使用した。乾燥スピルリナ粉末は分離型ドレッシングの全量に対して、０．０１重量％、０．１重量％、１．０重量％、５．０重量％の各割合で添加したものを製造した。

また、乾燥スピルリナ粉末を市販の麺類に配合することにより、実施例３の経口摂取用組成物とした。乾燥スピルリナ粉末は上記と同様のものであった。この場合も乾燥スピルリナ粉末は麺類の全量に対して、０．０１重量％、０．１重量％、１．０重量％、５．０重量％の各割合で添加したものを製造した。

そして、上記実施例２、３について、１０名の官能評価者により試食を行った。その結果、乾燥スピルリナ粉末を添加した全ての分離型ドレッシング及び麺類に関して、全員が食品として摂取可能と評価し、本発明が官能評価的に優れた品質を有することが確認された。

しかし，０．０１重量％添加品はＮＡＳＨに対する必要な機能を発揮するために大量の摂食が必要と評価された。即ち，保健機能性を向上させるため，製品そのものの絶対的摂取量を上げる必要性に対し、０．０１重量％添加品の利用は現実的ではないと評価された。従って、本発明においては乾燥スピルリナ粉末を少なくとも０．１重量％以上含有する経口摂取用組成物であることが必要と結論した。

＜本発明の経口摂取用組成物のＮＡＳＨへの効果＞
実験的に調整された脂肪肝担持ラットに対し、酸化ストレス（ＯＳ）を負荷し、生体内低酸素状態を形成させることによりＮＡＳＨの生化学的・病理組織学的特徴を有する病態モデルラットを作出し、このものに対し、本発明の経口摂取用組成物を投与し、該ラットの血液の生化学的特徴変化、肝臓ミトコンドリアからのＲＯＳ派生の変化、肝臓組織の病理組織学的変化を観察することにより、ＮＡＳＨに対する本発明の経口摂取用組成物の有効性評価を行った。

ＮＡＳＨ病態モデルは高山らの方法(非特許文献1参照)に準拠して作成した。すなわち、実験動物として、６週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット(１８０−２００ｇ／匹)を用いた。脂肪肝作成のため、４週間、自由摂取にてコリン欠乏食(ＣＤＨＦ、オリエンタル酵母)を与えた。その後も病態維持のため実験終了までＣＤＨＦを与えた。

動物はポリプロピレン不透明ケージ(Ｗ２２０×Ｌ３２０×Ｈ１３５、夏目製作所)内で２〜３匹ずつ飼育した。飼育室は,湿度４０〜５０％、室温２０〜２５℃に維持し、１２時間の明暗サイクル(点灯；ＡＭ８：００、消灯；ＰＭ８：００)に設定した。

酸化ストレス(ＯＳ)を付加し、生体内低酸素状態を形成させ、ＮＡＳＨ病態を作出するため、上記脂肪肝担持ラットに対し、生理食塩水に溶解させた亜硝酸ナトリウムを３０ｍｇ／Ｋｇ(体重)／日で６週間にわたり腹腔内投与した。投与期間中は２週間ごとに尾静脈から採血し、病態の確認を行い、病態の進行状況に問題がないことを確認した。

ＮＡＳＨに対する本発明の経口摂取用組成物の有効性評価のため、上記亜硝酸ナトリウム投与群に対し、同時に本発明の経口摂取用組成物（実施例１）を２ｇ／Ｋｇ（体重）／日、又は６ｇ／Ｋｇ（体重）／日で６週間にわたり自由飲水にて経口投与した。

投与期間終了後、犠牲死させ、該ラットの血液の生化学的特徴変化、肝臓ミトコンドリアにおける活性酸素・フリーラジカル種（ＲＯＳ）派生の変化、肝臓組織の病理組織学的変化を観察した。

本実施例においては、（１）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）、（２）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋実施例１を２ｇ／Ｋｇ）、（３）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋実施例１を６ｇ／Ｋｇ）に関して詳述する。なお，各群８匹（ｎ＝８）とした。

血漿中ＡＳＴ、ＡＬＴ値はトランスアミナ−ゼＣII−テストワコー（和光純薬工業株式会社）にて測定した。

肝臓ミトコンドリア由来活性酸素・フリーラジカル種（ＲＯＳ）派生の検出は以下の手順で行った。肝臓試料は、下大静脈より１．１５％塩化カリウム溶液（５ｍＭベンズアミジン含む）にて灌流後採取した。肝臓組織１ｇに対しトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４，０．２５Ｍシュクロース、０．１Ｍ塩化カリウムを含む）と共にホモジェナイズし、このものの３０００×ｇ（１０分間，４℃）上清を９０００×ｇ（２０分間，４℃）にて遠心分離し、沈殿物をトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．２５Ｍシュクロース、０．１Ｍ塩化カリウムを含む）にて２回遠心洗浄しミトコンドリア画分とした。該画分１４．２８ｍｇに対し、１ｍｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．２５Ｍシュクロース、０．１Ｍ塩化カリウムを含む）で希釈し、試料溶液とした。この濃度はミトコンドリアのタンパク量に換算すると、５００μｇ／ｍｌに相当する。

活性酸素・フリーラジカル種（ＲＯＳ）派生量計測のため，上記肝臓ミトコンドリア溶液３５μｌ、０．１％dodecyl maltoside、５ｍＭ glutamate、５ｍＭ malate、２００ｍＭ succinateを含む溶液２５μｌ、４．６Ｍ ＤＭＰＯ溶液２０μｌ、２ｍＭ ＮＡＤＨ溶液２０μｌ、合計１００μｌを３７℃、５分間インキュベーションした。インキュベーション後、直ちにＥＳＲ装置（ＪＥＳＲＥＩＸ／ＨＲ，日本電子株式会社）にて常温で測定した。

測定に当たり，予め、キャビティ内に挿入したＭｎＯのＭｎ^２＋によるＥＳＲスペクトル信号強度に対するＤＭＰＯスピンアダクト（ＤＭＰＯ−ＯＨ）によるＥＳＲスペクトル信号の強度すなわち相対強度を算出し定量化した。即ち、ＥＳＲ信号強度（ＤＭＰＯ−ＯＨ／Ｍｎ）で算定した。

統計学的処理として、全ての結果は平均値±標準誤差で示した。得られたデータは一元配置分散分析（Analysis of variance，ＡＮＯＶＡ）後、Turkeyの多重比較検定法を用いて統計学的処理を行った。２群間の比較にはStudent`s t-testを用い、危険率５％以下を有意差有りと判定した。

投与期間終了後、犠牲死させ、該ラットの血液の生化学的特徴変化、肝臓ミトコンドリアにおけるＲＯＳ産生変化、肝臓組織の病理組織学的変化を観察した結果を以下に示す。

乾燥スピルリナ製品を投与しなかった（１）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）における投与前と投与期間終了後における生化学的測定結果は以下の通りであった。

血漿中ＡＳＴ値(units/ml)は、２３±２ＩＵ／Ｌから１４０±７ＩＵ／Ｌに上昇。

血漿中ＡＬＴ値(units/ml)は、７±２ＩＵ／Ｌから１６±２ＩＵ／Ｌに上昇。

上記結果から、酸化ストレスに伴うＮＡＳＨ症状が発現していることが認められた。

上記（１）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）に対し、上記実施例１の２ｇ／Ｋｇ（体重）を投与した（２）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋実施例１を２ｇ／Ｋｇ）における投与前と投与期間終了後における生化学的測定結果は以下の通りであった。

血漿中ＡＳＴ値(units/ml)は、２５±２ＩＵ／Ｌから１００±２０ＩＵ／Ｌに上昇。

血漿中ＡＬＴ値(units/ml)は、８±２ＩＵ／Ｌから１４±３ＩＵ／Ｌに上昇。

上記結果から，酸化ストレスに伴うＮＡＳＨ症状が、本発明の経口摂取用組成物（実施例１）の２ｇ／Ｋｇ（体重）投与により改善される傾向が認められた。

上記（１）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）に対し、上記実施例１の６ｇ／Ｋｇ（体重）を投与した（３）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋実施例１を６ｇ／Ｋｇ）における投与前と投与期間終了後における生化学的測定結果は以下の通りであった。

血漿中ＡＳＴ値(units/ml)は、２１±３ＩＵ／Ｌから３５±５ＩＵ／Ｌに上昇。

血漿中ＡＬＴ値(units/ml)は、７±３ＩＵ／Ｌから１０±２ＩＵ／Ｌ（変化なし）。

上記結果から，酸化ストレスに伴うＮＡＳＨ症状が、本発明の経口摂取用組成物（実施例１）の６ｇ／Ｋｇ（体重）投与により改善される傾向が認められた。

肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため、公知の手法に基づきヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行い、大滴脂肪の沈着状態を観察し下記結果を得た。

（１）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）は多くの大滴性の脂肪滴および大きな肝細胞配列の乱れ有り。

（２）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋実施例１を２ｇ／Ｋｇ）は中程度の大滴性の脂肪滴および中程度の肝細胞配列の乱れ有り。

（３）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋実施例１を６ｇ／Ｋｇ）は小程度の大滴性の脂肪滴および小程度の肝細胞配列の乱れ有り。

本結果から、ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓組織における大滴性の脂肪滴増大および肝細胞配列の乱れ増大が実施例１の投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。

肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため、公知の手法に基づきマッソン・トリクローム染色により膠原線維を染色し、線維化状態を観察し下記結果を得た。

（１）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）は門脈域から中心静脈域の架橋形成が生じ偽小葉形成が認められた（Ｆ３〜Ｆ４）。

（２）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋実施例１を２ｇ／Ｋｇ）は軽度の門脈域から中心静脈域の架橋形成が認められた（Ｆ２〜Ｆ３）。

（３）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋実施例１を６ｇ／Ｋｇ）は門脈域と中心静脈周囲に繊維化が認められるが，架橋形成は認められない（Ｆ２）。

本結果から、ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓組織における架橋形成および繊維化増大が実施例１の投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。

肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため、公知の手法に基づきベルリン・ブルー染色により鉄イオンを染色し、鉄イオン沈着状態を観察し下記結果を得た。

（１）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）は門脈域から中心静脈域に大きな鉄の沈着が認められた。

（２）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋実施例１を２ｇ／Ｋｇ）は門脈域から中心静脈域に軽度の鉄の沈着が認められた。

（３）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋実施例１を６ｇ／Ｋｇ）は鉄の沈着は殆んど認められなかった。

本結果から，ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓組織における鉄の沈着増大が本発明になる乾燥スピルリナ製品投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。

以上の結果から，抗酸化治療の有効な代表的生活習慣病の一つであるＮＡＳＨモデル実験動物に対する乾燥スピルリナ製品の有効性が確認された。
＜本発明の経口摂取用組成物による肝臓ミトコンドリアからのフリーラジカル産生抑制効果＞
本発明の経口摂取用組成物によるＮＡＳＨ病態モデル動物の肝臓ミトコンドリアのエネルギー代謝からの活性酸素・フリーラジカルの派生増大に対する是正効果をみるため、下記試験を実施した。

上記で得られた（１）〜（３）の各群のラットを実験に供した。ＮＡＳＨ病態モデルは上記の高山らの方法(非特許文献1参照)に準拠して作成した。

各群のラットから、肝臓ミトコンドリアを分画した（Egashira T. etal:Toxicology Letter, 117, 115-119(2000).参照）。即ち、肝臓試料は、下大静脈より１．１５％塩化カリウム溶液（５ｍＭベンズアミジン含む）にて灌流後採取した。肝臓組織１ｇに対しトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４，０．２５Ｍシュクロース、０．１Ｍ塩化カリウムを含む）と共にホモジェナイズし、このものの３０００×ｇ（１０分間，４℃）上清を９０００×ｇ（２０分間，４℃）にて遠心分離し、沈殿物をトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．２５Ｍシュクロース、０．１Ｍ塩化カリウムを含む）にて２回遠心洗浄しミトコンドリア画分とした。

続いて、下記測定系(Yudong Wang et al:Free Radical Biology and Medicine, 36(11),1434-1443(2004).参照)にて各群ミトコンドリアから派生する活性酸素・フリーラジカル種をスピントラップ剤ＤＭＰＯで捕捉し、形成するＤＭＰＯスピンアダクトをＥＳＲ−分光法にて検出した。即ち、ＤＭＰＯ、ミトコンドリア及びＮＡＤＨは氷冷、これら以外は予め３７℃に温めておいたものを用いた。アッセイ系は、５ｍＭトリスアミノメタン、０．２５ｍＭシュクロース、０．１ｍＭ塩化カリウムを含む緩衝液中（ｐＨ７．４）に、３５μｌミトコンドリア懸濁液（０．５ｍｇタンパクを含む）、９２０ｍＭ ＤＭＰＯ、０．１％ドデシルマルトシド、１０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸カリウム、１０ｍＭ Ｌ（−）−リンゴ酸ナトリウム、２００ｍＭ コハク酸二ナトリウム、１００μＭ ＮＡＤＨから構成されるよう、試料および試薬溶液を調製し、３７℃、５分間インキュベーション後、ＥＳＲ分析を行った。

各群のミトコンドリア画分は０．０３Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．２５Ｍシュクロース、０．１Ｍ塩化カリウムを含む）で縣濁後、直ちに冷凍保存（−８０℃）したものをＥＳＲ分析に供した。

また、上記実施例１をＥＳＲ測定試料溶液に添加し、ＤＭＰＯ−活性酸素・フリーラジカルのアダクトによるＥＳＲスペクトルの信号強度の減弱効果により、ミトコンドリア機能障害による活性酸素・フリーラジカル（ＲＯＳ）派生増大に対する改善効果を検討した(Takayama F. et al:Japanese Journal of Pharmacology, 85,227-233(2001).参照)。具体的には、検出されたＤＭＰＯとヒドロキシルラジカルとのアダクト（ＤＭＰＯ−ＯＨ）に特徴的なｇ値と微細定数を持つＥＳＲスペクトル（ＤＭＰＯ−ＯＨ）の信号強度でミトコンドリアから派生する活性酸素・フリーラジカル種（ＲＯＳ）を計測した。乾燥スピルリナ製品をＮＡＳＨ病態ミトコンドリアによるアッセイ系に添加し、ＤＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化で、ＮＡＳＨ病態エネルギ−代謝から派生する活性酸素・フリーラジカル種の発生増大への制御能を検討した。その結果、相対信号強度を５０％減弱させる抽出物の濃度をＩＣ_５０値（μｇ／ｍｌ）として示してある。ＥＳＲ測定条件、操作条件は上記＜本発明の経口摂取用組成物のＮＡＳＨへの効果＞に示す場合と同様である。

肝臓ミトコンドリア由来ＲＯＳ産生値（シグナル相対強度）に関し下記結果が得られた。酸化ストレス（ＯＳ）付加前のシグナル相対強度０．５±０．１に対し，（１）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）は１．０±０．１、（２）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋実施例１を２ｇ／Ｋｇ）は０．８±０．１、（３）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋実施例１を６ｇ／Ｋｇ）は０．６±０．１であった。本結果から、ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓ミトコンドリア由来ＲＯＳ産生が実施例１の投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。

これにより、本発明の経口摂取用組成物はＮＡＳＨ病態モデル動物の肝臓ミトコンドリアにおけるエネルギー代謝からのラジカル派生を抑制・制御することが実証された。従って、本発明の経口摂取用組成物は経口的に摂取することによりＮＡＳＨの予防、改善、治療に有効であることが示唆された。

Claims (3)

1. 非アルコール性脂肪性肝炎の予防又は治療に用いる経口摂取用組成物であって、スピルリナを有効成分として含有して成ることを特徴とする経口摂取用組成物。
2. 乾燥状態のスピルリナを少なくとも０．１重量％含有して成ることを特徴とする請求項１に記載の経口摂取用組成物。
3. 電子スピン共鳴分光−スピントラップ法で測定した時のヒドロキシルラジカル消去能がＩＣ_５０値として３０００乃至１００μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１又は２に記載の経口摂取用組成物。